Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم التعبير عن الهستو التوافق الكبرى مجمع الفئة الأولى على الخلايا العصبية الأولية مورين فرس النهر عن طريق قياس التدفق الخلوي

doi: 10.3791/61436 Published: May 19, 2020

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة لزراعة الخلايا العصبية الأولية فرس النهر من دماغ الفأر الجنيني. ثم يتم تقييم التعبير عن فئة معقدة الهستوناتية الرئيسية الأولى على السطح خارج الخلية من الخلايا العصبية المستزرعة عن طريق تحليل التدفق الخلوي.

Abstract

تدعم الأدلة المتزايدة فرضية أن التفاعلات العصبية المناعية تؤثر على وظيفة الجهاز العصبي في كل من الحالات الهوستاتيكية والباثولوجية. وظيفة مدروسة جيدا من الدرجة الأولى المعقدة الهستو التوافق الرئيسية (MHCI) هو تقديم الببتيدات المستمدة من الخلايا إلى الجهاز المناعي التكيفي، لا سيما في الاستجابة للعدوى. في الآونة الأخيرة وقد ثبت أن التعبير عن جزيئات MHCI على الخلايا العصبية يمكن تعديل التغيرات التي تعتمد على النشاط في الاتصال متشابك خلال التنمية الطبيعية والاضطرابات العصبية. أهمية هذه الوظائف لصحة الدماغ يدعم الحاجة إلى الفحص الحساس الذي يكشف بسهولة التعبير MHCI على الخلايا العصبية. هنا نحن نصف طريقة للثقافة الأولية للخلايا العصبية فرس النهر مورين ومن ثم تقييم التعبير MHCI عن طريق تحليل تدفق الخلايا الخلوية. يتم استئصال قرن آمون مورين من جراء الفئران قبل الولادة في اليوم الجنيني 18. يتم فصل الأنسجة إلى تعليق خلية واحدة باستخدام التقنيات الأنزيمية والميكايكية، ثم استزراعها في وسائط خالية من المصل تحد من نمو الخلايا غير العصبية. بعد 7 أيام في المختبر ، يتم تحفيز تعبير MHCI عن طريق علاج الخلايا المستزرعة دوائيا مع الإنترفيرون بيتا. تسمى جزيئات MHCI في الموقع بأجسام مضادة موسومة بالفلورسنت ، ثم يتم فصل الخلايا بشكل غير أنزيمي إلى تعليق خلية واحدة. لتأكيد هوية الخلايا العصبية، يتم إصلاح الخلايا مع بارافورمالديهايد، permeabilized، ووصفت مع الأجسام المضادة الموسومة الفلورية التي تعترف مستضد النووية العصبية نيون. ثم يتم قياس التعبير MHCI على الخلايا العصبية عن طريق تحليل تدفق القياسات الخلوية. يمكن بسهولة التلاعب بالثقافات العصبية إما عن طريق التعديلات الوراثية أو التدخلات الدوائية لاختبار فرضيات محددة. مع تعديلات طفيفة، يمكن استخدام هذه الأساليب زراعة مجموعات الخلايا العصبية الأخرى أو لتقييم التعبير عن البروتينات الأخرى ذات الاهتمام.

Introduction

كان يعتقد أن الجهاز العصبي المركزي (CNS) كان يعتقد ذات مرة أنه خال من المراقبة المناعية ، ويشار إليه باسم "المناعة المتميزة1". ومن الواضح الآن أن هذا الامتياز لا يعادل الغياب المطلق للمكونات المناعية ، بل هو تنظيم متخصص يعمل على الحد من الأضرار المرتبطة بعلم الأمراض المناعية1. في الواقع، التواصل بين الجهاز العصبي المركزي والجهاز المناعي هو محادثة مستمرة ضرورية لتنمية الدماغ السليمة والاستجابة للعدوى2،3.

كبرى الجسيمات المعقدة الهستوبوليتيتي من الفئة الأولى (MHCI) هي بروتينات متعددة النسل وتعدد الأشكال عبر المعادن اشتهرت بوظيفتها في تقديم الببتيدات المضادة للجينات إلى خلايا CD8+ T أثناء العدوى4. تتكون مجمعات MHCI الكلاسيكية من سلسلة α عبر الميمبران وسلسلة ضوء خارج الخلية ، تسمى β2-microglobulin. سلسلة α يحتوي على الأخدود متعدد الأشكال الذي يربط الببتيد المضادة للجينات للعرض5. التعبير السليم من MHCI على الغشاء خارج الخلية يتطلب عمل منسق من المرافقين الجزيئية في reticulum endoplasmic لضمان للطي السليم للسلسلة α وβ2-microglobulin جنبا إلى جنب مع تحميل ليغاند الببتيد تقارب عالية5. مرة واحدة فقط يتم تجميعها مجمعات MHCI، يتم تصديرها من reticulum endoplasmic إلى غشاء البلازما6. عند الاشتباك من مستقبلات الخلايا التائية cognate مع مجمع MHCI محملة الببتيد، CD8+ T الخلايا التوسط قتل الخلايا عن طريق الإفراج عن حبيبات الليسيت التي تحتوي على perforin و granzymes أو عن طريق تحفيز موت الخلايا المبرمج من خلال ملزمة مستقبلات فاس على غشاء الخليةالمستهدفة 7. بالإضافة إلى ذلك، تنتج خلايا CD8+ T السيتوكينات، مثل إنترفيرون غاما (IFNа) وعامل نخر الورم ألفا (TNFα)، والتي يمكن أن تنشط آليات مضادة للفيروسات في الخلايا المصابة دون آثار الاعتلال الخلوي8،9. بالنسبة للعديد من الفيروسات العصبية، CD8+ T الخلايا ضرورية لمسح العدوى من الجهاز العصبي المركزي10،11،12.

كان يعتقد سابقا أن الخلايا العصبية التعبير عن MHCI فقط في ظل ظروف الضرر, العدوى الفيروسية, أو مع تحفيز السيتوكين في المختبر. في الآونة الأخيرة، وقد حددت البحوث دورا للتعبير العصبية من MHCI في إعادة عرض متشابك واللدونة13،14. على الرغم من أن الآليات الدقيقة الكامنة وراء تنظيم المشبك ليست مفهومة جيدا، تشير البيانات إلى أن يتم تنظيم مستوى التعبير MHCI من قبل النشاط متشابك15،16. فرضية واحدة تفترض أن الخلايا العصبية التعبير عن مستقبلات تشبه الغلوبولين المناعي B (PirB) presynaptically, الذي يربط MHCI عبر متشابك13,17. هذا التفاعل يبدأ سلسلة الإشارات من قبل PirB التي تعارض المسارات المشاركة في إعادة عرض متشابك, وبالتالي تعزيز وتحقيق الاستقرار في اتصال متشابك17,18,19. في غياب نشاط الخلايا العصبية، وانخفض التعبير MHCI14، وفقدان النتائج MHCI في القضاء على المشبك معيبة والدوائر متشابك غير منظم20،21.

يستخدم المقايسة الموصوفة هنا ، والتي تم تكييفها من Chevalier et al.9، تحليل التدفق الخلوي لتقييم تعبير البروتين خارج الخلية كميا عن MHCI على الثقافات الأولية للخلايا العصبية فرس النهر مورين. يوضح هذا البروتوكول التقنيات الأولية لاستئصال الأنسجة النهرية الدقيقة من جراء الفئران الجنينية. ثم تفاصيل عمليات الانزيمية والميكايكية تفكك الأنسجة في تعليق خلية واحدة وأساليب للحفاظ على الثقافات في المختبر. لأنها لا تنقسم، بمجرد أن تكون في الثقافة، يجب أن تكون مطلية الخلايا العصبية في طبق وكثافة مناسبة لنقطة النهاية التجريبية الخاصة بهم. بعد ذلك ، يحدد خطوات لتحفيز تعبير MHCI مع الإنترفيرون بيتا (IFNа) ، ووضع العلامات المناعية ل MHCI وعلامة النوى العصبية NeuN ، وتحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. وأخيرا، فإنه يصف إجراءات لتقييم بيانات قياس التدفق الخلوي لتحديد الخلايا العصبية الإيجابية MHCI وتحديد مستوى التعبير MHCI. كما لوحظ في هذا البروتوكول هي التعديلات الصغيرة التي يمكن إجراؤها من أجل زراعة الخلايا العصبية القشرية بالإضافة إلى أو بدلا من الخلايا العصبية فرس النهر. يمكن تعديل هذا البروتوكول بسهولة لاختبار فرضيات محددة باستخدام الاختلافات الجينية أو العلاجات الدوائية.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات امتثالا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمعاهد الوطنية للصحة ووفقا للمبادئ التوجيهية الدولية للبحوث الطبية الحيوية التي تشمل الحيوانات. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل جامعة نورث كارولينا في شارلوت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (البروتوكول #19-020).

1. الاستعداد للثقافة

ملاحظة: يجب أن تتم هذه الإجراءات في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة الحيوية المعينة زراعة الأنسجة. انظر الجدول 1 للاطلاع على الوسائط والحلول.

  1. تعقيم جميع أدوات تشريح عن طريق الالاستعباد الذاتي في أكياس التعقيم الختم الذاتي.
  2. إعداد مخزون العمل من البولي-د-ليسين لعلاج الأطباق ثقافة 12 جيدا.
    1. حل بولي-د-ليسين في 1x بورات العازلة إلى تركيز 100 ميكروغرام/مل (10x مركزة). تخزين ما يقرب من 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية حتى الحاجة.
    2. تمييع 10x مركزة بولي-D-ليسين في dPBS إلى 10 ميكروغرام/مل (1x) ومرشح تعقيم.
    3. علاج لوحات الثقافة 12 جيدا مع 0.5 مل لكل بئر من 1x بولي مد ليسين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها لاستخدام في اليوم التالي. تأكد من حجم بولي مد ليسين يكفي لتغطية الجزء السفلي تماما من منطقة الثقافة.
    4. قبل الاستخدام مباشرة، قم بإزالة البولي-د-ليسين من لوحة الثقافة، وشطف 3x في الماء العقيم، والحفاظ عليها في الماء العقيم حتى تصبح جاهزة للخلايا لوحة. إزالة جميع آثار السائل عن طريق طموح شامل قبل طلاء الخلايا.
  3. إعداد وسائل الإعلام نمو الخلايا العصبية وFACS العازلة. تصفية التعقيم وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام. يمكن الاحتفاظ وسائل الإعلام نمو الخلايا العصبية لحوالي 2 wks; يمكن الاحتفاظ المخزن المؤقت FACS لحوالي 4 wks.

2. تشريح قرن آمون الجنينية

ملاحظة: يمكن إجراء هذا الإجراء على مقاعد البدلاء لأنه يتطلب استخدام مجهر ستيريو لإزالة السحائي والتشتيت الدقيق للقرن آمون. الالتزام بتقنية صارمة العقيم للحد من التلوث المحتمل.

  1. القتل الرحيم في الوقت المناسب حامل C57BL/6J فأر أنثى في اليوم الجنيني 18 في غرفة CO2.
  2. رش الجلد البطن والفراء مع 70٪ EtOH، ثم قرصة الجلد مع ملقط الأنسجة وجعل شق صغير مع مقص الجراحية. انسي الصفاق لكشف الأحشاء والرحم.
  3. فهم الرحم مع ملقط نمط القياسية، ورفع من تجويف، وقطع الاتصال إلى المايومتريوم مع مقص غرامة. نقل الرحم مع الأجنة إلى 100 مم طبق ثقافة بلاستيكية معقمة وضعت على الجليد.
  4. باستخدام مقص غرامة والمملقط الدقيق، وقطع الرحم بعناية وإزالة الحويصلات الجنينية لإطلاق الأجنة. نقل الأجنة إلى طبق جديد من البلاستيك 100 ملم العقيمة التي تحتوي على dPBS وضعت على الجليد.
  5. قطع رؤوس الجراء الجنينية باستخدام مقص غرامة، ونقل رؤساء إلى طبق جديد 100 ملم ثقافة بلاستيكية معقمة تحتوي على السبات-E المتوسطة وضعت على الجليد.
  6. لإزالة الدماغ، أمسك الرأس بزوج من ملقط ناعم في يد واحدة. باستخدام ملقط #7 المنحني دومون في ناحية أخرى، إدراج غيض من ملقط في قاعدة الجمجمة وقرصة العظام والجلد overlying تتحرك بشكل مسبق على طول خط الوسط دون ثقب الدماغ.
  7. باستخدام ملقط منحني سحب بعيدا الجلد والجمجمة لفضح الدماغ. كنس ملقط منحني تحت الدماغ من لمبة الشم المكشوفة إلى المخيخ لرفع الدماغ من الجمجمة. نقل الدماغ إلى طبق جديد 100 ملم ثقافة بلاستيكية معقمة تحتوي على السبات-E المتوسطة وضعت على الجليد. كرر لكل دماغ.
    ملاحظة: يمكن جمع جميع الأدمغة في طبق ثقافة واحد ما لم تكن هناك حاجة إلى أن تكون منفصلة لأغراض خاصة بالتجربة.
  8. تحت مجهر تشريح ستيريو، والعمل مع دماغ واحد في وقت واحد واثنين من أزواج من ملقط #5 دومون العقيمة، قرصة قبالة المصابيح الشمية وسحب السحائيات بعيدا. إزالة شاملة من السحايا ضروري لتجنب التلوث الثقافي من قبل الخلايا الأخرى والسماح بمزيد من تشريح.
  9. بمجرد إزالة السحايا بشكل صحيح ، يفتح الجانب المتفوق من القشرة أفقيا ، مما سيكشف قرن آمون. باستخدام ملقط #5 دومون، قرصة قرن آمون بعيدا عن القشرة المرفقة، ونقل بعناية قرن آمون معزولة إلى أنبوب مخروطي معقم 15 مل تحتوي على 5 مل من السبات-E المتوسطة على الجليد.
  10. كرر تشريح نصفي الدماغ لكل جرو فأر جنيني والجمع بين جميع فرس النهر في أنبوب مخروطي واحد 15 مل ، ما لم تكن هناك حاجة بشكل منفصل لأغراض محددة للتجربة.
    1. لثقافة الخلايا العصبية القشرية، يمكن فصل القشرة من القشرة الفرعية ومعالجتها بشكل مماثل للخلايا العصبية فرس النهر.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، قد يكون البروتوكول مؤقتا. تخزين العقول أو تشريح فرس النهر في السبات-E المتوسطة تكملها B27 (2٪) عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد، على الرغم من أن التأخير الممتد قد يعرض للخطر عدد الخلايا القابلة للحياة.

3. فصل وزراعة الخلايا العصبية فرس النهر

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة في زراعة الأنسجة المعينة خزانة السلامة البيولوجية.

  1. إعداد 0.5 مل من محلول فصان الباباين لكل جنين للتفكك فرس النهر. حجم محلول الانفصال اللازمة سوف تختلف تبعا لعدد من العقول الجنينية التي يجري تشريحها.
    ملاحظة: لثقافة الخلايا العصبية القشرية، وإعداد 1.0 مل من محلول الباباين لكل جنين.
    1. حل 20 ميكرولتر من تعليق papain لكل 1 مل من المتوسط السبات E عن طريق الدوامة لمدة 3 دقائق تقريبا.
    2. بعد حل الباباين، أضف 1 ميكرولتر من DNase I لكل 1 مل من الحل. لا دوامة الحل بعد DNase لقد أضيفت لأن هذا يمكن تعطيل الانزيم.
  2. جهاز الطرد المركزي 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على أنسجة فرس النهر (الخطوة 2.10) في 1, 000 x ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant وإضافة محلول papain. إعادة إنفاق الأنسجة عن طريق عكس عدة مرات. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، عكس لإعادة إنفاق الأنسجة كل 10 دقيقة.
    1. إذا زراعة الخلايا العصبية القشرية، نقل جميع القشريات إلى طبق ثقافة عقيمة جديدة 100 ملم، يستنشق بعناية وسائل الإعلام من لوحة، والأنسجة المفروم مع مقص غرامة أو شفرة الحلاقة. إضافة محلول papain إلى طبق الثقافة ونقل الأنسجة القشرية مع محلول papain إلى أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام ماصة نقل معقمة. احتضان الأنسجة ومحلول الانزيم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، والتحريض كل 10 دقيقة.
  3. خلال 30 دقيقة حضانة، وإعداد 3 مصصات باستور الزجاج المصقول النار: 1 مفتوحة تماما، 1 نصف مفتوحة، و 1 ربع مفتوحة.
  4. بعد حضانة 30 دقيقة، والطرد المركزي أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على أنسجة الدماغ هضم في 125 × ز لمدة 10 دقيقة. إزالة محلول الانزيم واستبدالها مع حجم متساو من المتوسطة E السبات الطازجة.
  5. باستخدام ماصة باستور مفتوحة تماما، triturate الأنسجة 10x. دع الأنسجة تستقر لمدة دقيقتين، ثم نقل تعليق الخلية الفائقة إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. إضافة حجم متساو من السبات E المتوسطة مرة أخرى إلى الأنسجة.
  6. باستخدام نصف ماصة باستور مفتوحة، الأنسجة تريتورات 10x. دع النسيج يستقر لمدة 2 دقيقة، ثم نقل تعليق الخلية الفائقة إلى نفس الأنبوب المخروطي 50 مل كما هو الحال في الخطوة السابقة. إضافة حجم متساو من السبات E المتوسطة مرة أخرى إلى الأنسجة.
  7. باستخدام ربع ماصة باستور مفتوحة، الأنسجة تريتورات 10x. السماح للأنسجة تسوية لمدة 2 دقيقة، ثم نقل تعليق الخلية العملاقة مرة أخرى إلى نفس مخروطية 50 مل كما هو الحال في الخطوات السابقة. تجاهل أي أنسجة متبقية لم تتفكك.
  8. الطرد المركزي أنبوب مخروطي 50 مل التي تحتوي على supernatant من تعليق الخلية في 125 × ز لمدة 5 دقائق. إذا لم يكن قد تم ذلك بالفعل، اغسل الصفائح المغلفة بولي-د-ليسين بالماء العقيم وأزل جميع آثار السائل عن طريق الطموح الشامل أثناء الطرد المركزي.
  9. بعد الطرد المركزي، تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 5 مل من وسائل الإعلام نمو الخلايا العصبية. عد الخلايا الحية باستخدام تريبان الأزرق ومقياس الدم.
    1. إذا زراعة الخلايا العصبية القشرية, إضافة ما لا يقل عن 10 مل من وسائل الإعلام نمو الخلايا العصبية للخلايا أقل كثافة والعد أكثر دقة.
  10. تمييع الخلايا مع وسائل الإعلام نمو الخلايا العصبية لكثافة الطلاء النهائي من 5 × 105 خلايا قابلة للحياة لكل مل وإضافة 1 مل من تعليق الخلية المخفف إلى كل بئر من لوحة بئر 12. الحفاظ على الخلايا العصبية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: عادة، فرس النهر من دماغ فأر جنيني واحد، أي 2 فرس النهر، تسفر عن ما يقرب من 1 × 106 خلايا قابلة للحياة. يتم توفير هذا الرقم لأغراض تخطيط التجارب فقط ولا ينبغي اعتباره بديلا عن عد الخلايا لكل ثقافة.
  11. تغيير وسائل الإعلام النمو في اليوم التالي للثقافة عن طريق إزالة نصف حجم وسائل الإعلام من كل بئر، أي 0.5 مل، وإضافة حجم متساو من وسائل الإعلام الطازجة إلى جانب البئر لتجنب تعطيل الخلايا المثقفة. إكمال نصف الوسائط يتغير مرتين أسبوعيا لعمر الثقافة.

4. تقييم التعبير MHCI حسب قياس التدفق الخلوي

  1. إعداد العلاج عن طريق تخفيف إنترفيرون بيتا (IFNβ) أو حجم متساو من مخفف في وسائل الإعلام نمو الخلايا العصبية. بما أن تغيير الوسائط سيكون تغييرا بنصف الحجم ، فجهز وسائط العلاج مع IFNβ المركزة 2x. أي، لعلاج 3 آبار من 12 لوحة بئر مع 100 U/mL من IFNβ، وإعداد 1.5 مل مع 200 U/mL IFNβ أو الحجم المتساوي من الذوبان IFNβ لضوابط وسائل الإعلام المعالجة.
  2. إزالة 0.5 مل من كل بئر من الخلايا العصبية وإضافة 0.5 مل من وسائل الإعلام نمو الخلايا العصبية مع أو بدون IFNа إلى كل بئر. احتضان في ظروف النمو الطبيعي (37 درجة مئوية، 5٪ CO2) لمدة 6-72 ساعة، اعتمادا على الظروف التجريبية وتحسين الإشارة.
  3. بعد وقت العلاج، وإزالة جميع وسائل الإعلام الثقافة وغسل بلطف مرة واحدة في وسائل الإعلام الباردة العصبية التي تفتقر إلى ملاحق (B27، L-الجلوتامين، القلم بكتيريا).
  4. إضافة 0.5 مل من وسائل الإعلام العصبية الباردة غير المكملة التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل من كتلة Fc و 1 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة للفلورسنت المترافقة المضادة MHCI لكل بئر. حضانة في 4 درجة مئوية محمية من الضوء لمدة 45 دقيقة.
  5. إزالة الوسائط المحتوية على الأجسام المضادة وغسل بعناية مرة واحدة في dPBS الباردة. إضافة 0.5 مل غرفة درجة حرارة خالية من الانزيم الخلية العازلة الفصام إلى كل بئر والتحريض على طرد الخلايا. مشاهدة للتفكك باستخدام المجهر زراعة الأنسجة المقلوبة.
  6. بمجرد فصل الخلايا عن طبق الثقافة ، أضف 0.5 مل من العازلة FACS إلى كل بئر ، والخلايا تريتورات لتفريق الكتل ، ونقل الحجم الإجمالي لكل بئر إلى أنابيب الطرد الدقيق الفردية 1.7 مل.
  7. جهاز طرد مركزي عند 1,000 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant، resuspend بيليه الخلية في 100 ميكرولتر من العازلة FACS، ونقل الحجم الإجمالي لكل أنبوب إلى الآبار الفردية من لوحة يو أسفل 96 جيدا.
  8. إضافة 100 ميكرولتر من الكاشف المثبت لكل بئر. تريتورات عدة مرات لتجنب تكتل الخلايا واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.
  9. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant وإعادة الإنفاق في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  10. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant و resuspend في 100 ميكرولتر من كاشف permeabilization تحتوي على الفلورسنت المترافق المضادة للنيون الأجسام المضادة (1:100 التخفيف) إلى كل بئر. تخلط جيدا، ثم احتضان في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء مع هزاز لمدة 20 دقيقة.
  11. بعد الحضانة، والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant وإعادة الإنفاق في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. كرر 2x.
  12. بعد الغسيل النهائي، يتم تخفيف خلايا إعادة الإنفاق في 100 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد في العازلة FACS. تخلط جيدا لمنع الخلايا من التكتل. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية محمي من الضوء حتى يصبح جاهزا للقراءة على مقياس تدفق الخلايا. قراءة العينات في أقرب وقت ممكن، في غضون أسبوع واحد.

5. تحديد وتقييم البيانات

  1. قياس ضوابط التعويض عن كل صبغة فلورية وتصحيح أي تداخل الطيفية. وتشمل ضوابط التعويض المثالي الخلايا العصبية المستزرعة التي هي غير ملطخة، ملطخة المضادة MHCI فقط، وملطخة المضادة للN NeuN فقط.
  2. إذا كان ذلك ممكنا، سجل أحداث 100,000 لكل عينة (على الأقل 10,000) وحفظ ملفات FCS.
  3. لتحليل البيانات، وذلك باستخدام برامج التحليل المناسبة، وإعداد بوابات متتابعة، كما هو مبين في الشكل 1A-C لتحديد الخلايا العصبية إيجابية نيون.
    1. رسم SSC-A (سجل) مقابل FSC-A (خطي). رسم بوابة على السكان الخلوية (P1) للقضاء على الحطام الخلوي من التحليل.
    2. ضمن السكان الخلية P1، مؤامرة FSC-H (خطي) مقابل FSC-A (خطي). رسم بوابة على السكان خلية واحدة.
    3. ضمن مجموعة خلايا مفردة، رسم SSC-A (سجل) مقابل NeuN (سجل). رسم بوابة على السكان نيون إيجابية باستخدام الخلايا الملطخة أو MHCI فقط كدليل.
    4. رسم رسم بياني للفلورسينس MHCI مع الأحداث الخلوية تطبيع إلى وضع على محور ص. باستخدام الخلايا العصبية الملطخة غير الملطخة أو NeuN فقط كدليل ، رسم بوابة أفقية لتحديد الخلايا العصبية في المئة إيجابية لMHCI.
    5. تصدير الخلايا في المئة إيجابية لMHCI، فضلا عن كثافة الفلورسينس المتوسط (MFI) لMHCI على السكان إيجابية نيون للتقييم الإحصائي والرسم الرسومي.

Representative Results

باستخدام الإجراء المعروض هنا ، تم تشريح أنسجة فرس النهر من جراء الفئران قبل الولادة في اليوم الجنيني 18. تم فصل الأنسجة إلى تعليق خلية واحدة باستخدام الطرق الأنزيمية والميكايكية ، ثم تم استزراعها في 12 لوحة بئر تم علاجها مسبقا ب poly-D-lysine. بعد 7 أيام في المختبر، عولجت الخلايا مع 100 U/mL من IFNβ أو وسائل الإعلام فقط لمدة 72 ساعة، مما حفز التعبير عن MHCI. كانت الخلايا العصبية ملطخة في الموقع لMHCI قبل أن يتم فصلها بشكل غير أنزيمي إلى تعليق خلية واحدة. تم إصلاح الخلايا العصبية و permeabilized، ثم ملطخة داخل الخلايا لعلامة نواة الخلايا العصبية نيون. تم تقييم العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي وتم تحليل البيانات باستخدام البرامج المرتبطة بها. تم تحديد الخلايا العصبية من خلال gating متسلسلة من مجموع الأحداث لاستبعاد الحطام الخلوي وdededts (الشكل 1A, B). تم تحديد الخلايا العصبية بشكل نهائي من قبل NeuN الإيجابية (الشكل 1C). تم تحليل خلايا NeuN+ كذلك ل MHCI الإيجابية عن طريق رسم الخلايا على المدرج التكراري مع عدد الخلايا التي تم تطبيعها إلى الوضع على المحور ص وفلورسيون MHCI على المحور س. تم رسم بوابة MHCI+ عند النقطة التي اختلفت فيها القمم الإيجابية والسلبية(الشكل 1D). من هذا, النسبة المئوية الخلايا العصبية إيجابية لتلطيخ MHCI (الشكل 1E) وكثافة الفلورسينس المتوسط (MFI; الشكل 1F) تم حسابها. تظهر النتائج أن العلاج IFNβ رفع بشكل كبير النسبة المئوية للخلايا العصبية إيجابية لتلطيخ خارج الخلية من MHCI، فضلا عن مستوى التعبير، كما هو مبين من قبل MFI. وقد تم إجراء التحليل الإحصائي والتمثيل البياني باستخدام البرمجيات الإحصائية المتاحة تجاريا.

Figure 1
الشكل 1: استراتيجية الصياغة التمثيلية والتحديد الكمي لل MHCI.
عولجت الخلايا العصبية فرس النهر الأولية مع 100 U/mL من IFNβ أو وسائل الإعلام فقط. بعد 72 ح, كانت ملطخة الخلايا العصبية خارج الخلية مع المحيط الهادئ الأزرق المقترن MHCI (1 ميكروغرام / مل H2-Kب),ثم وصفت داخل الخلية مع PE-اقتران NeuN (1:100 تخفيف). تم تقييم الفلورسينس الخلوي عن طريق قياس التدفق الخلوي، وتم تحليل البيانات. (أ)تم رسم إجمالي الأحداث كما SSC-A (سجل) مقابل FSC-A (خطي)، وبوابات الخلايا (P1) لاستبعاد الحطام. (ب)ضمن السكان P1، تم رسم الخلايا كما FSC-H (خطي) مقابل FSC-A (خطي) لبوابة السكان خلية واحدة. (C) ضمن مجموعة خلايا مفردة، تم رسم الخلايا SSC-A (سجل) مقابل NeuN-PE (سجل). تم بوابات نيون+ الخلايا لتحديد الخلايا العصبية. (د)ضمن مجموعة الخلايا العصبية، تم رسم الخلايا على مخطط بياني مع MHCI-PacBlu على المحور س وأرقام الخلايا تطبيع إلى وضع على المحور ص. تم رسم بوابة أفقية لتحديد نسبة الخلايا العصبية الإيجابية لتلطيخ MHCI. (E) تحديد كمي من النسبة المئوية MHCI+ من نيون+ الخلايا في وسائل الإعلام فقط والخلايا العصبية IFNβ المعالجة. (F)تحديد كمي لشدة الفلورسينس المتوسطة (MFI) من MHCI على نيون+ الخلايا في وسائل الإعلام (أسود) والخلايا العصبية (الحمراء) المعالجة IFNа. تم حساب الأهمية الإحصائية عن طريق اختبار t غير المدفوع. **، ص < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الخلايا العصبية نمو وسائل الإعلام (50 مل)
الكاشف التركيز النهائي تركيز المخزون ل 50 مل
ملحق B27 2% 100% 1.0 مل
إل-الجلوتامين 2 مليون متر 200 متر م 0.5 مل
البنسلين ستربتوميسين 100 U/مل 10,000 U/ml 0.5 مل
وسائل الإعلام العصبية 48.0 مل
العازلة FACS (500 مل)
الكاشف التركيز النهائي تركيز المخزون ل 500 مل
مصل الأبقار الجنينية 2% 100% 10 مل
EDTA 1 مليون متر 500 مليون متر 1 مل
dPBS 489 مل
حل الانفصال باباين
الكاشف التركيز النهائي تركيز المخزون ل 1 مل
تعليق باباين 20 U/مل 1000 U/مل 0.020 مل
DNase I 2.5 U/مل 2500 U/مل 0.001 مل
إسبات-E 1.0 مل
ملاحظة: يختلف حجم حل فصل باباين المطلوب اعتمادا على عدد الأدمغة الجنينية التي يتم تشريحها. إعداد 0.5 مل لكل دماغ للخلايا العصبية فرس النهر أو 1.0 مل لكل دماغ للخلايا العصبية القشرية.
ملاحظة: إعداد حل الانفصال عن طريق دوامة تعليق papain في السبات-E لمدة 3 دقائق. بعد حل الباباين تماما، إضافة DNase I. لا دوامة DNase I.

الجدول 1: وسائط الإعلام والحلول.

Discussion

يصف هذا البروتوكول تشريح وثقافة الخلايا العصبية فرس النهر الأولية من جراء الفئران قبل الولادة في اليوم الجنيني 18. استخدام الخلايا العصبية الأولية المستزرعة من القوارض هي واحدة من المنهجيات الأساسية التي وضعت في علم الأعصاب الحديث22. على الرغم من أن خطوط الخلايا الخالدة يمكن أن نموذج جوانب معينة من الخلايا العصبية, طبيعتها كخلايا مشتقة من الورم, الفشل في تطوير محاور عصبية محددة, واستمرار انقسام الخلايا يثير الشكوك حول ما إذا كانت خلاصة بأمانة خصائص الخلايا العصبية ما بعد ميتوتيك في الجسم الحي23. بديل آخر للخلايا العصبية الأولية هو استخدام الخلايا الجذعية المستحثة من قبل الإنسان (HiPSCs). التكنولوجيا لاستخدام HiPSCs، وخاصة تلك التي هي مشتقة من المريض، تقدمت بسرعة في السنوات الأخيرة24. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود على العمل مع HiPSCs بما في ذلك التباين بين خطوط الخلية، وعدم النضج الوظيفي، والاختلافات في التشكيلات اللاجينية25. على الرغم من أن هناك أيضا قيود على العمل مع النموذج الاختزالي للخلايا العصبية القوارض الأولية، تحتفظ الخلايا العصبية المستزرعة طبيعة ما بعد ميتوتيك من الخلايا العصبية في الجسم الحي. أيضا، أدوات البيولوجيا الجزيئية توسعية والتعديلات الوراثية المتاحة للفئران تفضل استخدام الخلايا العصبية الأولية على HiPSCs للعديد من التطبيقات، ودراسات الماوس يمكن ترجمتها بسهولة إلى الكائن الحي أكثر تعقيدا في الجسم الحي دون أن تفقد النظام الوراثي التجريبي. لهذه الأسباب، يستخدم العديد من الباحثين الخلايا العصبية القوارض الأولية للتحقق من الجوانب الرئيسية، إن لم يكن الجزء الأكبر، من أبحاثهم.

لبعض المقايسات, ويمكن تحليل الخلايا العصبية مباشرة بعد عزلة من الدماغ ex vivo. وهذا أمر مرغوب فيه بشكل خاص للتجارب التي تشمل الفئران البالغة التي يمكن أن تخضع لظروف تجريبية محددة أو التي قد تعتمد على تفاعلات أنواع خلايا متعددة؛ ومع ذلك، هناك العديد من القضايا التي تحد من نوع التحليلات التي يمكن القيام بها. ومن الصعب تقنيا لإعداد تعليق خلية واحدة من الخلايا العصبية من أدمغة الفئران الكبار لأن الخلايا العصبية مترابطة بشكل فريد وensheathed من قبل المايلين26. الطرق غير الأنزيمية لتريتور الأنسجة غير فعالة في فصل الأنسجة وتسبب موت الخلايا ، في حين أن الاستعدادات الأنزيمية غالبا ما تلتصق مستضدات سطح الخلية27. وعلاوة على ذلك، في حين المايلين غائبة إلى حد كبير من الفئران الجنينية، فإنه يشكل حوالي 20٪ من الدماغ البالغ، ويمكن أن يضعف عزل الخلايا قابلة للحياة وعرقلة تحليل قياس التدفقالخلوي 28. العديد من التقنيات التي تم تطويرها في نهاية المطاف تجريد الخلايا العصبية من السيتوسول وترك الصغيرة, الهيئات الخلية المستديرة التي تتكون في المقام الأول من نواة29. على الرغم من أن هذا مقبول لبعض التحليلات، وهذا ليس مناسبا لقياس التعبير عن البروتين السيتوبلازمي أو خارج الخلية. وعلاوة على ذلك، يسمح نظام ثقافة الخلايا الاختزالية باختبار أسئلة ميكانيكية محددة على مقياس زمني أقصر مما هو ممكن في كثير من الأحيان مع نظام في الجسم الحي.

كما هو موضح في هذا البروتوكول هي أساليب لتحفيز التعبير MHCI الدوائية مع IFNβ، وتكميم التعبير MHCI خارج الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. التحفيز من قبل IFNβ هو عنصر تحكم إيجابي مفيد لاختبار الظروف التجريبية الأخرى، ولكن يمكن ملاحظة أن IFNа وحمض كاينيك يمكن أن تحفز أيضا التعبير MHCI في الخلايا العصبية9،30، في حين يقلل tetrodotoxin التعبير MHCI14. اعتمدت الطرق السابقة للكشف عن التعبير MHCI على التهجين في الموقع والتحليل الكيميائي المناعي14،15،20،31. في حين أن المقايسات المستندة إلى الحمض النووي الريبي ، مثل التهجين في الموقع وqRT-PCR ، يمكن أن تحدد التعريب الصدغي ، وخصوصية نوع الخلية ، ومستويات النسخ الجيني ، فإن هذه المقايسات لا يمكنها تقييم ترجمة البروتين أو نقله إلى غشاء البلازما. يمكن للتحليل المناعي الكيميائي والغربي أن يحدد الاختلافات في التعبير عن البروتين وتوطين الخلايا المحتمل ولكن يمكن أن يكون من الصعب تحديده بدقة. وعلاوة على ذلك، فإن العديد من الأجسام المضادة MHCI تعترف بالهيكل الثالث للمجمع، وهي حساسة للغاية للتغيرات التركيبية. وبالتالي البيرميلات أو الظروف النافورة يؤدي إلى فقدان النشاط المناعي MHCI32. تستخدم الطريقة المعروضة هنا في الاحتواء المناعي الموقعي ل MHCI ، والذي يسمح بالاعتراف بالبروتين من قبل الجسم المضاد في تشكيله الأصلي ، تليها طرق التثبيت والتأهيل.

مع تعديلات طفيفة، يمكن استخدام الأساليب الموصوفة هنا زراعة مجموعات الخلايا العصبية الأخرى أو لتقييم التعبير عن البروتينات خارج الخلية الأخرى ذات الاهتمام. وأشار في هذا البروتوكول هي التعديلات السهلة التي يمكن إجراؤها من أجل زراعة الخلايا العصبية القشرية, ولكن الأساليب المذكورة هنا يمكن أن تستخدم أيضا لثقافة مجموعات الخلايا العصبية الأخرى, مثل الخلايا العصبية سترياتال33. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن هذا البروتوكول يحدد الاحتواء المناعي ل MHCI و NeuN، يمكن تحديد علامات خلوية أخرى بطريقة مماثلة. بشكل عام ، يمكن التعامل مع العلامات خارج الخلية مثل MHCI ويمكن التعامل مع العلامات داخل الخلايا مثل NeuN. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه خلال خطوة الانفصال الخلوي ، يتم قطع الإسقاطات المحورية من سوما. لأن استراتيجية gating المحددة هنا شاشات الحطام الخلوي ويركز على علامة نواة الخلايا العصبية نيون، قد لا يتم الكشف عن البروتينات التي يتم التعبير عنها حصرا في التوقعات المحورية.

حتى وقت قريب, ويعتقد أن الخلايا العصبية للتعبير عن MHCI فقط استجابة للتلف, عدوى, أو تحفيز السيتوكين في المختبر من أجل إشراك CD8 السامة للخلايا+ T الخلايا9. وقد أوضح بحث جديد وظيفة أخرى من MHCI في تنظيم الاتصالات متشابك خلال التنمية13. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا IFNβ لتحفيز تعبير MHCI في الخلايا العصبية المستزرعة من النوع البري ، ولكن يمكن استخدام طرق مماثلة مع مجموعة متنوعة من المحفزات الخلوية أو التعديلات الوراثية لاختبار فرضيات محددة. ستمكن هذه الطريقة الباحثين من التحقيق في الآليات الجزيئية التي تنظم التعبير MHCI ، مما سيحسن فهم الدور الثنائي ل MHCI على هاتين الوظيفتين الخلويتين المتميزتين.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل NIA R00 AG053412 (KEF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Laboratory Supplies
100 mm sterile culture dish Fisher FB012924 Tissue Culture Supplies
15 ml Centrifuge Tubes Genesee 21-103 Laboratory Supplies
50 ml centrifuge tube Genesee 21-108 Laboratory Supplies
500 mM EDTA Invitrogen AM9260G FACS Buffer Reagent
70% Ethanol Fisher BP82031Gal Tissue Culture Supplies
96 well U-bottom plate Genesee 25-221 Flow Cytometry Supplies
B27 Gibco 17504044 Neuron Culture Reagent
Borate Buffer Thermo Scientific 28341 Tissue Culture Supplies
Borosilicate Glass Pasteur Pipette Fisher 13 678 20C Laboratory Supplies
Cell Dissociation Buffer Gibco 13 151 014 Flow Cytometry Supplies
DNase I Thermo 90083 Dissociation Solution Reagent
dPBS Gibco 14190-235 Tissue Culture Supplies
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 Dissection Tool
Dumont #7 Forceps Fine Science Tools 91197-00 Dissection Tool
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079 Tissue Culture Supplies
Fine Forceps Fine Science Tools 91113-10 Dissection Tool
Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11 Dissection Tool
Fix and Perm Cell Permeabilization Kit Invitrogen GAS003 Flow Cytometry Supplies
Glutamax Gibco 35050061 Neuron Culture Reagent
Hibernate-E Medium Gibco A1247601 Neuron Culture Reagent
Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher 181254 Tissue Culture Supplies
Interferon Beta PBL Assay Science 12405-1 Flow Cytometry Supplies
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 MilliporeSigma FCMAB317PE Flow Cytometry Antibody
Neurobasal Media Gibco 21103049 Neuron Culture Reagent
Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody BioLegend 116513 Flow Cytometry Antibody
Papain Solution Worthington LS003126 Dissociation Solution Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714 Fixative
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Neuron Culture Reagent
Poly-D-Lysine Sigma P7280 Neuron Culture Reagent
Standard Pattern Forceps Fine Science Tools 91100-12 Dissection Tool
Stereo dissection microscope Swift M29TZ-SM99CL-BTW1 Dissection Tool
Surgical Scissors Fine Science Tools 91401-10 Dissection Tool
Transfer Pipets Corning 357575 Laboratory Supplies
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody BioLegend 101319 Flow Cytometry Antibody
Trypan Blue Sigma T8154-100ML Tissue Culture Supplies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. What is immune privilege (not). Trends in Immunology. 28, (1), 12-18 (2007).
  2. Morimoto, K., Nakajima, K. Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System. Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).
  3. Klein, R. S., et al. Neuroinflammation During RNA Viral Infections. Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).
  4. Janeway, C. A. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).
  5. Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).
  6. Donaldson, J. G., Williams, D. B. Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules. Traffic. 10, (12), Copenhagen, Denmark. 1745-1752 (2009).
  7. Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. T cell-mediated cytotoxicity. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. (2001).
  8. Guidotti, L. G., Chisari, F. V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).
  9. Chevalier, G., et al. Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection. PLoS Pathogens. 7, (11), 1002393 (2011).
  10. Shrestha, B., Diamond, M. S. Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection. Journal of Virology. 78, (15), 8312-8321 (2004).
  11. Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells. Virology. 449, 235-243 (2014).
  12. Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection. Journal of Virology. 77, (4), 2775-2778 (2003).
  13. Shatz, C. J. MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity. Neuron. 64, (1), 40-45 (2009).
  14. Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity. Neuron. 21, (3), 505-520 (1998).
  15. Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (16), 6828-6833 (2007).
  16. Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, (39), 16999-17004 (2010).
  17. Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex. Science. 313, (5794), New York, N.Y. 1795-1800 (2006).
  18. Atwal, J. K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science. 322, (5903), New York, N.Y. 967-970 (2008).
  19. Takai, T. Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition. Immunology. 115, (4), 433-440 (2005).
  20. Lee, H., et al. Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db. Nature. 509, (7499), 195-200 (2014).
  21. Ribic, A., et al. Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey. Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).
  22. Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S., Castrén, E. Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex. Neuronal Signaling. 3, (2), (2019).
  23. Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
  24. Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866, (4), 165431 (2020).
  25. Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease. Cells, Tissues, Organs. 205, (5-6), 331-349 (2018).
  26. Ho, H., et al. A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).
  27. Panchision, D. M., et al. Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25, (6), 1560-1570 (2007).
  28. Snaidero, N., Simons, M. Myelination at a glance. Journal of Cell Science. 127, (14), 2999-3004 (2014).
  29. Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain. ACS Chemical Neuroscience. 8, (2), 356-367 (2017).
  30. Lv, D., et al. Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling. PLoS One. 10, (8), 0135223 (2015).
  31. Barco, A., et al. Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture. Neuron. 48, (1), 123-137 (2005).
  32. Glynn, M. W., et al. MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections. Nature Neuroscience. 14, (4), 442-451 (2011).
  33. Facci, L., Skaper, S. D. Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons. Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).
تقييم التعبير عن الهستو التوافق الكبرى مجمع الفئة الأولى على الخلايا العصبية الأولية مورين فرس النهر عن طريق قياس التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Funk, K. E., Lotz, S. K. Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e61436, doi:10.3791/61436 (2020).More

Funk, K. E., Lotz, S. K. Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e61436, doi:10.3791/61436 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter