Summary
Этот протокол описывает метод культивирования первичных нейронов гиппокампа из эмбрионального мозга мыши. Выражение основных гистосовместимости сложного класса I на внеклеточной поверхности культурных нейронов затем оценивается с помощью цитометрического анализа потока.
Abstract
Увеличение доказательств подтверждает гипотезу о том, что нейроиммунерные взаимодействия влияют на функцию нервной системы как в гомеостатических, так и в патологических условиях. Хорошо изученной функцией основных гистосовместимости комплексного класса I (MHCI) является представление пептидов, полученных клетками, для адаптивной иммунной системы, особенно в ответ на инфекцию. Совсем недавно было показано, что выражение молекул MHCI на нейронах может модулировать деятельность зависимых изменений в синаптической связи во время нормального развития и неврологических расстройств. Важность этих функций для здоровья мозга поддерживает необходимость чувствительного анализа, который легко обнаруживает выражение MHCI на нейронах. Здесь мы описываем метод первичной культуры нейронов гиппокампа мурина, а затем оценку экспрессии MHCI с помощью цитометрического анализа потока. Гиппокамп Мурина микродисципирован из пренатальных щенков мыши в эмбриональный день 18. Ткань разобщается в одноклеточную подвеску с использованием энзиматических и механических методов, а затем культурируется в безотхвосточном средстве массовой информации, что ограничивает рост не нейрональных клеток. После 7 дней в пробирке, выражение MHCI стимулируется путем лечения культурных клеток фармакологически с бета-интерферона. Молекулы MHCI помечены на месте флуоресцентно помеченными антителами, затем клетки не мезизматически разобщены в одноклеточную подвеску. Чтобы подтвердить нейронную идентичность, клетки фиксируются параформальдегидом, проницаемы и помечены флуоресцентно помеченными антителами, которые распознает нейрональный ядерный антиген NeuN. Выражение MHCI затем количественно на нейроны по потоку цитометрического анализа. Нейронными культурами можно легко манипулировать либо генетическими модификациями, либо фармакологическими вмешательствами для проверки конкретных гипотез. С небольшими изменениями, эти методы могут быть использованы для культуры других популяций нейронов или для оценки выражения других белков, представляющих интерес.
Introduction
Центральная нервная система (ЦНС) когда-то считалась лишенной иммунного наблюдения, именуемого «иммуннымпривилегированным 1». Теперь ясно, что эта привилегия не приравнивается к абсолютному отсутствию иммунных компонентов, а, скорее, специализированные регулирования, которые функции по ограничению ущерба, связанного симмунопатологией 1. В самом деле, связь между ЦНС и иммунной системы является постоянный разговор, который необходим для здорового развития мозга и ответна инфекции 2,3.
Основные молекулы комплекса гистосовости I (MHCI) являются полигенными и полиморфными трансмембранными белками, наиболее известными своей функцией в представлениях антигенных пептидов CD8и Т-клеток во времяинфекции 4. Классические комплексы MHCI состоят из трансмембрана α цепи и внеклеточной световой цепи, называемой q2-микроглобулин. В α содержит полиморфную канавку, которая связывает антигенный пептид для представления5. Правильное выражение MHCI на внеклеточной мембране требует скоординированного действия молекулярных сопровождающихся в эндоплазмической цитулуме для обеспечения правильного складывания α-цепного и 2-микроглобулина вместе с загрузкой пептидного лигандавысокого сродства 5. Только после сборки комплексов MHCI они экспортируются из эндоплазмической цитулумы в плазменную мембрану6. После взаимодействия рецептора cognate T клеток с пептид-нагруженным комплексом MHCI,CD8 и T клетки опосредуют убийство клетки путем выпускать lytic гранулы содержа перфорин и granzymes или путем индуцировать апоптоз через связывая приемный устройства Fas на мембранеклетки цели 7. Кроме того, CD8и Т-клетки производят цитокины, такие как гамма-интерферон (ИФНЗ) и фактор некроза опухоли альфа (ТНФЗ), которые могут активировать противовирусные механизмы в инфицированных клетках без цитопатическихэффектов 8,9. Для многих нейротропных вирусов,CD8 и Т-клеток, необходимых для очищения инфекции от ЦНС10,11,12.
Ранее считалось, что нейроны выражают MHCI только в условиях повреждения, вирусной инфекции, или с стимуляцией цитокинов in vitro. Недавно исследования выявили роль для нейронального выражения MHCI в синаптической реконструкции ипластичности 13,14. Хотя точные механизмы, лежащие в основе регулирования синапса, не очень хорошо изучены, данные указывают на то, что уровень экспрессии MHCI регулируетсясинаптической активностью 15,16. Одна из гипотез утверждает, что нейроны выражают парный иммуноглобулин-как рецептор B (PirB) пресинаптически, который связывает MHCI трансинаптически13,17. Это взаимодействие инициирует сигнальный каскад PirB, который противостоит путям, участвующим в синаптической реконструкции, тем самым укрепляя и стабиливсинаптической связи 17,18,19. При отсутствии нейронной активности экспрессия MHCIснижается на 14,а потеря MHCI приводит к неполноценной ликвидации синапса и неправильной синаптическойсхеме 20,21.
Анализ, описанный здесь, который был адаптирован из Шевалье и др.9, использует поток цитометрического анализа для количественной оценки внеклеточного экспрессии белка MHCI на первичных культурах нейронов гиппокампа мурина. Этот протокол иллюстрирует первоначальные методы микродиссекции ткани гиппокампа от эмбриональных щенков мыши. Затем в нем подробно процессы для энзиматической и механической диссоциации тканей в одноклеточную подвеску и методы поддержания культур впробирке. Потому что они не делят, как только они находятся в культуре, нейроны должны быть помыты в тарелке и плотности подходит для их экспериментальной конечной точки. Далее в нем излагаются шаги по индуцированию экспрессии MHCI с помощью бета-интерферона (ИФНЗ), иммунолабеля для MHCI и маркера нейронных ядер NeuN, а также анализ клеток с помощью цитометрии потока. Наконец, в нем описаны процедуры оценки цитометрии потока для идентификации MHCI-положительных нейронов и количественной оценки уровня экспрессии MHCI. Также отмечены в этом протоколе небольшие корректировки, которые могут быть сделаны для того, чтобы культура корковых нейронов в дополнение к или вместо гиппокампа нейронов. Этот протокол может быть легко изменен для проверки конкретных гипотез с использованием генетических вариаций или фармакологических методов лечения.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии с рекомендациями, содержащимися в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и в соответствии с Международными руководящими принципами биомедицинских исследований с участием животных. Протокол был одобрен Университетом Северной Каролины в Шарлотте институционального ухода за животными и использования комитета (протокол #19-020).
1. Подготовка к культуре
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти процедуры должны быть сделаны в стерильных условиях в ткани культуры назначенных биобезопасности кабинета. Смотрите таблицу 1 для средств массовой информации и решений.
- Стерилизовать все инструменты вскрытия путем автоклавирования в самозапечатывания стерилизации мешки.
- Подготовка рабочих запасов поли-D-лизина для лечения 12-колодец культуры блюд.
- Растворите поли-D-лизин в 1x буфере бората до концентрации 100 мкг/мл (10x концентрированный). Храните приблизительно 1 мл aliquots при -20 градусов по Цельсию до необходимости.
- Разбавить 10x концентрированный поли-D-лизин в dPBS до 10 мкг/мл (1x) и фильтр стерилизовать.
- Лечить 12-хорошо культуры пластин с 0,5 мл на колодец 1x поли-D-лизин при комнатной температуре, по крайней мере 1 ч или на ночь для использования на следующий день. Убедитесь, что объем поли-D-лизина достаточно, чтобы полностью покрыть дно культурной зоны.
- Непосредственно перед использованием, удалить поли-D-лизин из культуры пластины, промыть 3x в стерильной воде, и держать в стерильной воде, пока не готовы пластины клеток. Удалите все следы жидкости путем тщательного аспирации до покрытия клеток.
- Подготовьтесь к мультимедиа роста нейронов и буферу FACS. Фильтр стерилизовать и хранить при 4 градусов по Цельсию до использования. Нейрон рост СМИ могут храниться в течение примерно 2 WKS; Буфер FACS может храниться в течение примерно 4 wks.
2. Рассекая эмбриональный гиппокамп
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура может быть выполнена на скамейке, поскольку она требует использования стерео микроскопа для удаления опоясывающего ликования и микроперепись гиппокампа. Придерживайтесь строгой асептической техники, чтобы свести к минимуму потенциальное загрязнение.
- Euthanize время беременности C57BL/6J самка мыши в эмбриональный день 18 в камере CO2.
- Спрей брюшной кожи и меха с 70% EtOH, а затем щепотку кожи с ткани щипцы и сделать небольшой разрез с хирургическими ножницами. Incise брюшной полости подвергать внутренности и матки.
- Возьмите матку со стандартными миппами шаблона, поднимите из полости, и сократить связь с мезометрием с мелкими ножницами. Перенос матки с эмбрионами на 100 мм стерильной пластиковой культуры блюда помещают на лед.
- Используя тонкие ножницы и тонкие миппы, тщательно вырезать матку и удалить эмбриональные мешки, чтобы освободить эмбрионы. Перенос эмбрионов на новое 100-мм стерильное пластиковое культурное блюдо, содержащее dPBS, помещенное на лед.
- Обезглавить эмбриональных щенков с помощью тонких ножниц, и передать головы на новые 100 мм стерильные пластиковые культуры блюдо, содержащее Hibernate-E среды размещены на льду.
- Чтобы удалить мозг, держите голову с парой тонких типсов в одной руке. Используя изогнутые #7 щипцы в другой руке, вставьте кончик щипцы у основания черепа и ущипнуть кость и чрезмерно кожи движущихся впереди вдоль средней линии без пирсинга мозга.
- Использование изогнутых типсов тянуть друг от друга кожу и череп, чтобы разоблачить мозг. Подметать изогнутые миппы под мозгом от подвергаются обонятельной лампы мозжечка, чтобы поднять мозг из черепа. Перенесите мозг на новое 100-мм стерильное пластиковое блюдо культуры, содержащее средство Hibernate-E, помещенное на лед. Повторите для каждого мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все мозги могут быть собраны в одном блюде культуры, если не должны быть отделены для экспериментов конкретных целей. - Под стерео рассечением микроскоп, работая с одним мозгом за один раз и двумя парами стерильных щипцы Дюмона #5, отщипните обонятельные луковицы и вытащите менинги. Тщательное удаление околения необходимо, чтобы избежать загрязнения культуры другими клетками и позволить дальнейшее вскрытие.
- После того, как опоясывания должным образом удалены, превосходная сторона коры открывается боковой, которая будет подвергать гиппокампа. Используя щипца #5, ущипните гиппокамп от прикрепленной коры и тщательно перенесите изолированный гиппокамп в стерильную коническую трубку длиной 15 мл, содержащую 5 мл среды Hibernate-E на льду.
- Повторите вскрытие для обоих полушарий мозга для каждого эмбрионального щенка мыши и объединить все гиппокампа в одну 15 мл конической трубки, если это необходимо отдельно для эксперимента конкретных целей.
- Для культуры корковых нейронов, кора может быть отделена от подкортекса и обрабатываются идентично гиппокампа нейронов.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол может быть приостановлен. Храните мозги или расчлененный гиппокамп в среде Hibernate-E, дополненной B27 (2%) при 4 градусах по Цельсию на срок до 1 месяца, хотя расширенная задержка может поставить под угрозу количество жизнеспособных ячеек.
- Для культуры корковых нейронов, кора может быть отделена от подкортекса и обрабатываются идентично гиппокампа нейронов.
3. Диссоциация и культивирование нейронов гиппокампа
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны выполняться в стерильных условиях в тканевой культуре, назначенной биобезопасности кабинета.
- Подготовка 0,5 мл раствора диссоциации папаина на эмбрион для гиппокампа диссоциации. Объем необходимого раствора диссоциации будет варьироваться в зависимости от количества вскрытых эмбриональных мозгов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для корковой культуры нейронов, подготовить 1,0 мл раствора папаина на эмбрион.- Растворите 20 МКЛ подвески папаина на 1 мл среды Hibernate E путем вихря в течение примерно 3 мин.
- После растворения папаина добавьте 1 мл DNase I на 1 мл раствора. Не вихрь раствор после DNase я был добавлен, как это может деактивировать фермент.
- Центрифуга 15 мл конической трубки, содержащей гиппокамп ткани (шаг 2,10) на 1000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и добавьте раствор папаина. Повторное приостановление ткани путем инвертирования несколько раз. Инкубационный при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, инвертирование для повторного перерасхода ткани каждые 10 минут.
- При культивировании корковых нейронов, передать все кортисы в новый 100 мм стерильной культуры блюдо, тщательно аспирировать средства от пластины, и фарш ткани с мелкими ножницами или лезвием бритвы. Добавьте раствор папаина в культурную тарелку и перенесите корковую ткань с раствором папаина в коническую трубку 15 мл с помощью стерильной трубоубийки. Инкубационный раствор ткани и фермента при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут, агитирует каждые 10 минут.
- В течение 30 минут инкубации, подготовить 3 огнеполированной стекла Пастер пипетки: 1 полностью открыт, 1 половина открыта, и 1 квартал открыт.
- После 30-минутной инкубации центрифуга конической трубки 15 мл, содержащей переваренные ткани мозга при 125 х г в течение 10 мин. Удалите ферментный раствор и замените равным объемом свежей среды Hibernate E.
- Используя полностью открытый Пастер пипетки, тритурировать ткани 10x. Пусть ткани оседают в течение 2 минут, а затем передать супернатантной клеточной подвески в стерильной 50 мл конической трубки. Добавьте равный объем среды Hibernate E обратно в ткань.
- Использование половины открытой пастер пипетки, тритурат ткани 10x. Пусть ткани оседают в течение 2 минут, а затем передать супернатантной клеточной подвески в той же 50 мл конической трубки, как и на предыдущем этапе. Добавьте равный объем среды Hibernate E обратно в ткань.
- Использование четверти открытой пастер пипетки, тритурат ткани 10x. Пусть ткани оседают в течение 2 минут, а затем передать супернатантной клеточной подвески снова в том же 50 мл конической, как и в предыдущих шагах. Откажитесь от оставшихся тканей, которые не разобщены.
- Центрифуга конической трубки 50 мл, содержащей супернатант из клеточной подвески при 125 x g в течение 5 мин. Если еще не сделано, мыть поли-D-лизин покрытием пластин со стерильной водой и удалить все следы жидкости путем тщательного аспирации во время центрифугации.
- После центрифугации отбросьте супернатант и повторно посовестийте клеточные гранулы в 5 мл нейронов Growth Media. Подсчитайте живые клетки, используя трипан синий и гемоцитометр.
- Если культивирование корковых нейронов, добавить по крайней мере 10 мл нейронов роста СМИ для менее плотных клеток и более точного подсчета.
- Разбавить клетки с Neuron Growth Media для окончательного покрытия плотность 5 х 105 жизнеспособных клеток на мл и добавить 1 мл разбавленной клеточной подвески к каждому хорошо 12 пластины хорошо. Поддерживайте нейроны при 37 градусах Цельсия с 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, гиппокамп из 1 эмбрионального мозга мыши, т.е. 2 гиппокампа, дают примерно 1 х 106 жизнеспособных клеток. Это число предоставляется только для целей планирования экспериментов и не должно рассматриваться как замена для подсчета ячеек для каждой культуры. - Измените средства роста на следующий день после культуры, удалив половину объема мультимедиа из каждой колодец, т.е. 0,5 мл, и добавьте равное количество свежих средств массовой информации в сторону колодец, чтобы избежать нарушения культурных клеток. Завершите половину изменений мультимедиа два раза в неделю для продолжительности жизни культуры.
4. Оценка экспрессии MHCI по цитометрии потока
- Подготовка лечения путем разбавления интерферона бета (IFN) или равного объема разбавления в нейронах роста средств массовой информации. Поскольку изменение средств массовой информации будет в два раза больше объема изменения, подготовить лечение средств массовой информации с 2x концентрированной ИФН. т.е. для лечения 3 скважины из 12 скважин с 100 U/mL ИФН, подготовить 1,5 мл с 200 U/mL IFN или равного объема разминочных средств для средств массовой информации обработанных элементов управления.
- Удалите 0,5 мл из каждой колодец нейронов и добавьте 0,5 мл средств роста нейронов с или без ИФН К каждой хорошо. Инкубация в нормальных условиях роста (37 градусов по Цельсию, 5% CO2) для6-72 ч, в зависимости от экспериментальных условий и оптимизации сигнала.
- После лечения, удалить все средства культуры и осторожно мыть один раз в холодных Neurobasal средств массовой информации не хватает добавок (B27, L-глутамин, Pen-Strep).
- Добавьте 0,5 мл не дополнили холодные нейробазальные средства массовой информации, содержащие 1 мкг/мл блока Fc и 1 мкг/мл флуоресцентных конъюгированных антител против MHCI к каждой хорошо. Инкубационный при 4 градусов по Цельсию защищен от света в течение 45 мин.
- Удалить антитела содержащие средства массовой информации и тщательно мыть один раз в холодной DPBS. Добавьте буфер диссоциации клеток без комнатной температуры 0,5 мл и агитив за вытеснение клеток. Следите за диссоциацией с помощью перевернутого микроскопа культуры тканей.
- После того, как клетки отделены от культуры блюдо, добавить 0,5 мл буфера FACS к каждой хорошо, тритурат клеток для разгона сгустков, и передать общий объем каждого хорошо отдельных 1,7 мл микроцентрифуг труб.
- Центрифуга при 1000 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант, повторно посовестийте гранулы клетки в 100 мкл буфера FACS и перенесите общий объем каждой трубки в отдельные скважины 96 скважин U-нижней пластины.
- Добавьте 100 йл фиксаторного реагента к каждой хорошо. Тритурат несколько раз, чтобы избежать слипания клеток и инкубации в течение 15 минут при комнатной температуре защищены от света.
- Центрифуга по 500 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторное течение 200 мкл буфера FACS.
- Центрифуга по 500 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторное использование в 100 МКЛ реагента протеабилизации, содержащего флуоресцентные конъюгированные анти-NeuN антитела (1:100 разбавления) к каждой хорошо. Хорошо перемешать, затем инкубировать при комнатной температуре, защищенной от света с качания в течение 20 мин.
- После инкубации центрифугу по 500 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторное время в 100 йл буфера FACS. Повторите 2x.
- После окончательной стирки, повторное течение клеток в 100 йл 2% параформальдегида разбавлены в буфере FACS. Хорошо перемешать, чтобы предотвратить слипание клеток. Хранить при 4 градусах Цельсия, защищенных от света до готовности к считывку на цитометре потока. Прочитайте образцы как можно скорее, в течение 1 недели.
5. Количественная оценка и оценка данных
- Измерьте контроль компенсации для каждого флуоресцентного красителя и исправьте любые спектральные перекрытия. Идеальный контроль компенсации включают культурные нейроны, которые не окрашены, окрашенные анти-MHCI только, и окрашенные анти-NeuN только.
- Если возможно, завехать 100 000 событий для каждой выборки (не менее 10 000) и сохранить в качестве файлов FCS.
- Для анализа данных, используя соответствующее программное обеспечение анализа, назначайте последовательные ворота, как по рисунку 1A-C, чтобы выбрать для NeuN-положительных нейронов.
- Участок SSC-A (журнал) против FSC-A (линейный). Нарисуйте ворота на клеточной популяции (P1) для устранения клеточного мусора из анализа.
- В пределах клеточной популяции P1 участок FSC-H (линейный) против FSC-A (линейный). Нарисуйте ворота на одноклеточной популяции.
- В пределах одной популяции ячеек участок SSC-A (журнал) против NeuN (журнал). Нарисуйте ворота на NeuN-положительной популяции, используя незапачканные или MHCI только окрашенные клетки в качестве руководства.
- Участок гистограммы флуоресценции MHCI с клеточными событиями нормализовался в режиме по у-оси. Используя необличенные или только окрашенные нейроны NeuN в качестве руководства, нарисуйте горизонтальные ворота, чтобы количественно определить процент нейронов, положительных для MHCI.
- Экспорт процентных ячеек положительный для MHCI, а также медианной интенсивности флуоресценции (МФО) для MHCI на NeuN-положительной популяции для статистической оценки и графического рисования.
Representative Results
Используя представленную здесь процедуру, ткань гиппокампа была расчленена из пренатальных щенков мышей в эмбриональный день 18. Ткань была разобщена в одноклеточную суспензию с использованием энзиматических и механических методов, а затем отработалась в 12 хорошо пластин, которые были предварительно обработаны поли-D-лизин. После 7 дней в пробирке, клетки были обработаны с 100 U/mL ИФН или средств массовой информации только для 72 ч, которые стимулировали выражение MHCI. Нейроны были окрашены на месте для MHCI, прежде чем быть не-энзиматично разобщены в одной клеточной подвески. Нейроны были зафиксированы и проницаемы, затем окрашены внутриклеточно для нейрональных ядер маркер NeuN. Образцы оценивались по цитометрии потока, а данные анализировались с помощью связанного программного обеспечения. Нейроны были выявлены путем последовательного gating общих событий, чтобы исключить клеточный мусор и дублеты (Рисунок 1A,B). Нейроны были окончательно определены NeuN-положительность (Рисунок 1C). Клетки NeuN были дополнительно проанализированы на МХКИ-позитив путем построения клеток на гистограмме с количеством клеток, нормализованных в режиме на йосе и флуоресценции MHCI на х-оси. Ворота MHCIи были нарисованы в точке, где положительные и отрицательные пики разошлись(рисунок 1D). Из этого, процент нейронов положительный для окрашивания MHCI(рисунок 1E) и медианной интенсивности флуоресценции (МФО; Рисунок 1F) были рассчитаны. Результаты показывают, что лечение ИФНС значительно улучшило процент нейронов, положительных для внеклеточного окрашивания MHCI, а также уровень экспрессии, как указано МФО. Статистический анализ и графическое представление были сделаны с использованием коммерчески доступного статистического программного обеспечения.
Рисунок 1: Репрезентативная стратегия гэтинга и количественная оценка MHCI.
Первичные гиппокамповые нейроны лечились только 100 U/mL ИФН или мультимедиа. После 72 ч, нейроны были окрашены внеклеточно с Pacific Blue-спряженных MHCI (1 мкг / мл H2-Kb), а затем внутриклеточно помечены PE-спряженных NeuN (1:100 разбавления). Клеточная флуоресценция оценивалась цитометрией потока, анализировались данные. (A) Всего событий были построены как SSC-A (журнал) против FSC-A (линейный), и клетки (P1) были закрыты, чтобы исключить мусор. (B)В популяции P1 ячейки были построены как FSC-H (линейный) против FSC-A (линейный) для ворот одной популяции клеток. (C)В пределах одноклеточной популяции ячейки были построены SSC-A (журнал) против NeuN-PE (журнал). NeuNклетки были закрыты для идентификации нейронов. (D)В популяции нейронов, клетки были построены на гистограмме с MHCI-PacBlu на x-оси и номера клеток нормализовались, чтобы режим на оси. Горизонтальные ворота были нарисованы для количественной оценки процент нейронов положительные для окрашивания MHCI. (E ) Количественная оценка процентов MHCIи NeuN- клеток только в средствах массовой информации и IFN- обработанных нейронов. (F)Количественная оценка средней интенсивности флуоресценции (МФО) MHCI на NeuNи клетках в средствах массовой информации (черный) и IFN- обработанных (красных) нейронов. Статистическая значимость была рассчитана неоплаченным тестом t. Вопрос, P < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Средства роста нейронов (50 мл) | |||
| реагент | Окончательная концентрация | Концентрация запасов | За 50 мл |
| Дополнение B27 | 2% | 100% | 1,0 мл |
| L-глутамин | 2 мМ | 200 мМ | 0,5 мл |
| Пенициллин-Стрептомицин | 100 U/мл | 10 000 U/ml | 0,5 мл |
| Нейробазальные средства массовой информации | 48,0 мл | ||
| Буфер FACS (500 мл) | |||
| реагент | Окончательная концентрация | Концентрация запасов | За 500 мл |
| Сыворотка из плода крупного рогатого скота | 2% | 100% | 10 мл |
| Эдта | 1 мМ | 500 мМ | 1 мл |
| dPBS | 489 мл | ||
| Решение о диссоциации папайна | |||
| реагент | Окончательная концентрация | Концентрация запасов | На 1 мл |
| Подвеска Папаин | 20 U/мл | 1000 U/мл | 0,020 мл |
| DNase I | 2,5 U/мл | 2500 U/мл | 0,001 мл |
| Спячка-E | 1,0 мл | ||
| Примечание: Объем необходимого раствора диссоциации папаина будет варьироваться в зависимости от количества вскрытых эмбриональных мозгов. Подготовка 0,5 мл на мозг для гиппокампа нейронов или 1,0 мл на мозг для корковых нейронов. | |||
| Примечание: Подготовьте решение диссоциации путем вихревой подвески папаина в Hibernate-E в течение 3 мин. После того, как папаин тщательно растворяется, добавьте DNase I. Не вихрь DNase I. | |||
Таблица 1: Средства массовой информации и решения.
Discussion
Этот протокол описывает вскрытие и культуру первичных гиппокампа нейронов от пренатальных щенков мыши в эмбриональный день 18. Использование первичных нейронов, выуфрапаемых у грызунов, является одним из наиболее фундаментальных методологий, разработанных в современнойнейробиологии 22. Хотя увековеченные клеточные линии могут моделировать определенные аспекты нейронов, их природа как опухолевые клетки, неспособность разработать определенные аксоны, и продолжающееся деление клеток вызывает сомнения в том, что они точно подысовывляют свойства постмитотических нейронов in vivo23. Другой альтернативой первичным нейронам является использование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (HiPSCs). Технология использования HiPSCs, особенно те, которые являются пациентом полученных, быстро продвинулась в последние годы24. Тем не менее, есть еще ограничения для работы с HiPSCs в том числе изменчивость между линиями клеток, отсутствие функциональной зрелости, и различия в эпигенетическихпрофилей 25. Хотя существуют также ограничения на работу с демоционистской моделью первичных нейронов грызунов, культурные нейроны сохраняют постмитотическую природу нейронов in vivo. Кроме того, экспансивные инструменты молекулярной биологии и генетические модификации, доступные для мышей, благоприятствуют использованию первичных нейронов над HiPSCs для многих применений, и исследования мышей могут быть легко переведены на более сложный организм in vivo, не теряя экспериментальной генетической системы. По этим причинам, многие исследователи используют первичные нейроны грызунов для проверки ключевых аспектов, если не основная часть, их исследований.
Для некоторых анализов, нейроны могут быть проанализированы непосредственно после изоляции от мозга ex vivo. Это особенно желательно для экспериментов с участием взрослых мышей, которые могут подвергаться определенным экспериментальным условиям или которые могут зависеть от взаимодействия нескольких типов клеток; однако существует ряд вопросов, которые ограничивают тип анализов, которые могут быть сделаны. Это технически сложно подготовить одноклеточную подвеску нейронов из мозга взрослых мышей, потому что нейроны однозначно взаимосвязаны и оболочки миелина26. Неизиматические методы тритурации тканей неэффективны при диссоциации тканей и вызывают гибель клеток, в то время как энзиматические препараты часто расщепляют поверхностныеантигены клеток 27. Кроме того, в то время как миелин в значительной степени отсутствует у эмбриональных мышей, он составляет около 20% взрослого мозга, и может ухудшить жизнеспособную изоляцию клеток и препятствовать анализуцитометрии потока 28. Многие из методов, которые были разработаны в конечном итоге полосы нейронов их цитозола и оставить небольшие, округлые тела клеток, которые состоят в основном изядер 29. Хотя это приемлемо для некоторых анализов, это не подходит для количественной оценки цитоплазмической или внеклеточной экспрессии белка. Кроме того, система культуры клеток-двойственных клеток позволяет тестировать конкретные механистические вопросы в более коротком масштабе времени, чем это часто возможно с системой in vivo.
В этом протоколе также описаны методы стимулирования фармакологическиго выражения MHCI с помощью ИФНЗ, а также количественная оценка внеклеточного выражения MHCI по цитометрии потока. Стимулирование СФНЗ является полезным положительным контролем для тестирования других экспериментальных условий, но можно отметить, что ИФНЗ и кайновая кислота также могут стимулировать выражение MHCIв нейронах 9,30, в то время как тетродотоксин уменьшает выражение MHCI14. Предыдущие методы обнаружения выражения MHCI опирались на гибридизацию на месте и иммуногистохимический анализ14,15,20,31. В то время как анализы на основе мРНК, такие как гибридизация на месте и qRT-PCR, могут определить патиотемпоральную локализацию, специфичность типа клеток и уровни транскрипции генов, эти анализы не могут оценить перевод белка или транспортировку к плазменной мембране. Иммуногистохимический и западный анализ помарки может определить различия в экспрессии белка и потенциально клеточной локализации, но может быть трудно точно количественно. Кроме того, многие антитела MHCI распознают третичную структуру комплекса и очень чувствительны к конформативным изменениям. Таким образом, проницаемость или денатурации условия приводят к потере иммунореактивности MHCI32. Представленный здесь метод использует иммуностимунизацию на месте для MHCI, что позволяет распознавание белка антителом в его родной конформации, а затем методы фиксации и пермеабилизации.
С небольшими изменениями, методы, описанные здесь могут быть использованы для культуры других популяций нейронов или для оценки выражения других внеклеточных белков, представляющих интерес. В этом протоколе отмечены простые изменения, которые могут быть сделаны для того, чтобы культура корковых нейронов, но методы, описанные здесь также могут быть использованы для культуры других нейронных популяций, таких как стриатальные нейроны33. Кроме того, хотя этот протокол определяет иммуностимунирование MHCI и NeuN, другие клеточные маркеры могут быть определены аналогичным образом. В целом, внеклеточные маркеры можно рассматривать как MHCI и внутриклеточные маркеры можно рассматривать как NeuN. Однако следует отметить, что во время клеточной диссоциации от сомы отодряются аксональные проекции. Поскольку стратегия гэтинга, определенная здесь, отсеив клеточный мусор и фокусируется на маркере ядер нейронов NeuN, белки, которые выражаются исключительно в аксональных проекциях, могут не быть обнаружены.
До недавнего времени считалось, что нейроны выражают MHCI только в ответ на повреждение, инфекцию или стимуляцию цитокинов in vitro, чтобы задействовать цитотоксические CD8и Т-клетки 9. Новое исследование прояснит другую функцию MHCI в регулировании синаптических связей во время разработки13. Описанный здесь протокол использует IFN для стимулирования экспрессии MHCI в культурных нейронах wildtype, но аналогичные методы могут быть использованы с различными клеточными стимулами или генетическими модификациями для проверки конкретных гипотез. Этот метод позволит исследователям исследовать молекулярные механизмы, которые регулируют выражение MHCI, что улучшит понимание дихотомиозной роли MHCI на этих двух различных клеточных функций.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIA R00 AG053412 (KEF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
| 100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
| 50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
| 70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
| 96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
| B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
| Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
| Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
| DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
| dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
| Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
| Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
| Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
| Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
| Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
| Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
| Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
| Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |
References
- Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. What is immune privilege (not). Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).
- Morimoto, K., Nakajima, K. Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System. Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).
- Klein, R. S., et al. Neuroinflammation During RNA Viral Infections. Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).
- Janeway, C. A. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).
- Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).
- Donaldson, J. G., Williams, D. B. Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules. Traffic. 10 (12), Copenhagen, Denmark. 1745-1752 (2009).
- Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. T cell-mediated cytotoxicity. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).
- Guidotti, L. G., Chisari, F. V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).
- Chevalier, G., et al. Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection. PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).
- Shrestha, B., Diamond, M. S. Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection. Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).
- Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells. Virology. 449, 235-243 (2014).
- Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection. Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).
- Shatz, C. J. MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity. Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).
- Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity. Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).
- Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).
- Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).
- Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex. Science. 313 (5794), New York, N.Y. 1795-1800 (2006).
- Atwal, J. K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science. 322 (5903), New York, N.Y. 967-970 (2008).
- Takai, T. Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition. Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).
- Lee, H., et al. Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db. Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).
- Ribic, A., et al. Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey. Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).
- Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S., Castrén, E. Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex. Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).
- Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease. Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).
- Ho, H., et al. A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).
- Panchision, D. M., et al. Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Snaidero, N., Simons, M. Myelination at a glance. Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).
- Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).
- Lv, D., et al. Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling. PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).
- Barco, A., et al. Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture. Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).
- Glynn, M. W., et al. MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections. Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons. Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).
