Summary
Detta protokoll beskriver en metod för odling av primära hippocampal nervceller från embryonala mus hjärnan. Uttrycket av stora histocompatibility komplexa klass I på den extracellulära ytan av odlade nervceller utvärderas sedan genom flöde cytometrisk analys.
Abstract
Ökande bevis stöder hypotesen att neuro-immun interaktioner påverkar nervsystemet funktion i både homeostatic och patologiskt villkor. En välstuderad funktion av stora histocompatibility komplexa klass I (MHCI) är presentationen av cell-härledda peptider till det adaptiva immunsystemet, särskilt som svar på infektion. På senare tid har det visat sig att uttrycket av MHCI-molekyler på nervceller kan modulera aktivitetsberoende förändringar i synaptisk anslutning under normal utveckling och neurologiska störningar. Betydelsen av dessa funktioner för hjärnans hälsa stöder behovet av en känslig analys som lätt upptäcker MHCI-uttryck på nervceller. Här beskriver vi en metod för primär kultur av murin hippocampal nervceller och sedan bedömning av MHCI uttryck genom flöde cytometrisk analys. Murine hippocampus är mikrodisksekerad från prenatala musvalpar på den embryonala dag 18. Vävnaden dissocieras till en enda cellupphängning med enzymatiska och mekaniska tekniker, sedan odlas i ett serumfritt medium som begränsar tillväxten av icke-neuronala celler. Efter 7 dagars in vitro stimuleras MHCI-uttrycket genom att odlade celler behandlas farmakologiskt med betainterferon. MHCI-molekyler är märkta på plats med en fluorescerande märkt antikropp, sedan avskildes celler icke-enzymatiskt till en enda cellupphängning. För att bekräfta neuronal identitet, celler är fixerade med paraformaldehyd, permeabilized och märkt med en fluorescerande taggad antikroppar som känner igen neuronal nukleära antigen NeuN. MHCI uttryck kvantifieras sedan på nervceller genom flöde cytometrisk analys. Neuronala kulturer kan lätt manipuleras genom antingen genetiska modifieringar eller farmakologiska ingrepp för att testa specifika hypoteser. Med små modifieringar kan dessa metoder användas för att odla andra neuronala populationer eller för att bedöma uttryck för andra proteiner av intresse.
Introduction
Centrala nervsystemet (CNS) ansågs en gång sakna immunövervakning, kallad "immunprivilegierad1". Det är nu uppenbart att detta privilegium inte motsvarar den absoluta frånvaron av immunkomponenter, utan snarare en specialiserad förordning som fungerar för att begränsa skadorna i samband med immunopatologi1. Faktum är att kommunikation mellan CNS och immunsystemet är ett pågående samtal som är nödvändigt för hälsosam hjärnutveckling och svar på infektioner2,3.
Stora histokompatibilitet komplexa klass I (MHCI) molekyler är polygena och polymorfa transmembran proteiner mest kända för sin funktion i att presentera antigena peptider till CD8+ T celler under infektion4. Klassiska MHCI-komplex består av en transmembran α-kedja och en extracellulär ljuskedja, kallad β2-mikroglobulin. Den α innehåller ett polymorfa spår som binder en antigen peptid för presentation5. Korrekt uttryck av MHCI på det extracellulära membranet kräver samordnad verkan av molekylära förkläde vid det endoplasmatiska retikulumet för att säkerställa korrekt vikning av α-kedjan och β2-mikroglobulin tillsammans med belastningen av en hög affinitetpeptid ligand5. Endast när MHCI-komplex har monterats exporteras de från det endoplasmatiska retikulumet till plasmamembranet6. Vid in engagement av cognate T-cellreceptorn med det peptidbelastade MHCI-komplexet förmedlar CD8+ T-celler celldödande genom att släppa ut lytiska granulat som innehåller perforin och granzymer eller genom att inducera apoptos genom bindning Fas-receptorn på målcellmembranet7. Dessutom producerar CD8+ T-celler cytokiner, såsom gammainterferon (IFNγ) och tumörnekrosfaktor alfa (TNFα), som kan aktivera antivirala mekanismer i infekterade celler utan cytopatiska effekter8,9. För många neurotropa virus är CD8+ T-celler nödvändiga för att rensa infektionen från CNS10,11,12.
Man trodde tidigare att nervceller uttrycker MHCI endast under förhållanden av skador, viral infektion, eller med in vitro cytokin stimulering. Nyligen har forskning identifierat en roll för neuronalt uttryck av MHCI i synaptisk ombyggnad och plasticitet13,14. Även om de exakta mekanismerna bakom synapsregleringen inte är väl förstådda, indikerar data att MHCI-uttrycksnivå regleras av synaptiskaktivitet 15,16. En hypotes hävdar att nervceller uttrycker parat immunglobulinliknande receptor B (PirB) presynaptiskt, vilket binder MHCI transynaptically13,17. Denna interaktion initierar en signalkaskad av PirB som motsätter sig vägar som är involverade i synaptisk ombyggnad, vilket förstärker och stabiliserar den synaptiskaanslutningen 17,18,19. I avsaknad av neuronal aktivitet minskar MHCI-uttrycket14, och förlusten av MHCI resulterar i defekt synapseliminering och felorganiserade synaptiskakretsar 20,21.
Analysen beskrivs här, som anpassades från Chevalier et al.9, använder flöde cytometrisk analys för att kvantitativt bedöma extracellulära protein uttryck av MHCI på primära kulturer av murin hippocampal nervceller. Detta protokoll illustrerar de första teknikerna för microdissekerande hippocampal vävnad från embryonala mus valpar. Den beskriver sedan processer för enzymatisk och mekanisk dissociation av vävnad till en enda cell suspension och metoder för att upprätthålla kulturerna in vitro. Eftersom de inte delar sig, när de är i kultur, måste nervceller pläteras i en maträtt och densitet som är lämplig för deras experimentella slutpunkt. Därefter beskriver den steg för att inducera MHCI-uttryck med betainterferon (IFNβ), immunolabeling för MHCI och neuronal nuklei markör NeuN, och analysera celler genom flöde cytometri. Slutligen beskriver den förfaranden för att bedöma flöde cytometri data för att identifiera MHCI-positiva nervceller och kvantifiera nivån på MHCI uttrycket. Också noterat i detta protokoll är små justeringar som kan göras för att odla när nervceller utöver eller istället för hippocampal nervceller. Detta protokoll kan enkelt ändras för att testa specifika hypoteser med hjälp av genetiska variationer eller farmakologiska behandlingar.
Protocol
Alla försök utfördes i enlighet med rekommendationerna i vägledningen för vård och användning av laboratoriedjur vid De nationella hälsoinstituten och i enlighet med de internationella vägledande principerna för biomedicinsk forskning som inbegriper djur. Protokollet godkändes av University of North Carolina vid Charlotte Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll #19-020).
1. Förberedelser för kultur
OBS: Dessa procedurer bör göras under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp med vävnadskultur. Se tabell 1 för media och lösningar.
- Sterilisera alla dissektionsverktyg genom att autoklavera i självförslutande steriliseringspåsar.
- Förbered arbetslager av poly-D-lysin för behandling av 12-brunns kulturrätter.
- Lös upp poly-D-lysin i 1x boratbuffert till en koncentration av 100 μg/ml (10x koncentrerad). Förvara ca 1 ml alikvoter vid -20 °C tills det behövs.
- Späd 10x koncentrerat poly-D-lysin i dPBS till 10 μg/ml (1x) och filtrera sterilisera.
- Behandla 12-brunns odlingsplattor med 0,5 ml per brunn av 1x poly-D-lysin vid rumstemperatur i minst 1 timme eller över natten för användning nästa dag. Se till att volymen poly-D-lysin är tillräcklig för att helt täcka botten av kulturområdet.
- Strax före användning, ta bort poly-D-lysin från odlingsplattan, skölj 3x i sterilt vatten och förvara i sterilt vatten tills det är klart att plätera celler. Ta bort alla spår av vätska genom en grundlig aspiration före plätering av celler.
- Förbered Neuron Growth Media och FACS buffert. Filtrera sterilisera och förvara vid 4 °C tills det används. Neuron Growth Media kan hållas i cirka 2 wks; FACS-buffert kan hållas i cirka 4 wks.
2. Dissekera embryonal hippocampus
OBS: Denna procedur kan utföras på bänkskivan eftersom det kräver användning av ett stereomikroskop för avlägsnande av hjärnhinnor och mikrodissekering av hippocampus. Följ strikt aseptisk teknik för att minimera potentiell kontaminering.
- Avliva en tidsbesläktad C57BL/6J kvinnlig mus på embryonal dag 18 i en CO2-kammare.
- Spraya bukhuden och pälsen med 70% EtOH, nyp sedan huden med vävnadstång och gör små snitt med kirurgisk sax. Inhysa peritoneum för att exponera inälvorna och livmodern.
- Ta tag i livmodern med standardmönster tång, lyft ut ur håligheten och skär anslutningen till mesometrium med fin sax. Överför livmodern med embryon till 100 mm steril plastkulturrätt placerad på is.
- Använd fin sax och fina tångar, skär försiktigt livmodern och ta bort embryonala säckar för att frigöra embryon. Överför embryon till en ny 100 mm steril plastkulturrätt som innehåller dPBS som placeras på is.
- Halshugg embryonala valpar med fin sax och överför huvuden till ny 100 mm steril plastkulturrätt som innehåller Hibernate-E medium placerad på is.
- För att ta bort hjärnan, håll huvudet med ett par fina tång i en hand. Använd böjda Dumont #7 tång i andra handen, sätt in spetsen på tången vid basen av skallen och nypa benet och överliggande hud som rör sig främre längs mittlinjen utan att genomborra hjärnan.
- Genom att använda böjda tång drar man isär hud och skalle för att exponera hjärnan. Sopa de böjda tångarna under hjärnan från den exponerade luktlampan till lillhjärnan för att lyfta hjärnan ur skallen. Överför hjärnan till en ny 100 mm steril plastkulturrätt som innehåller Hibernate-E medium placerad på is. Upprepa för varje hjärna.
OBS: Alla hjärnor kan samlas i en enda odlingsrätt om det inte behövs separat för experimentspecifika ändamål. - Under ett stereo dissekeringsmikroskop, arbetar med en hjärna i taget och två par sterila Dumont #5 tång, nyper av luktlampor och drar bort meninges. Grundligt avlägsnande av hjärnhinnorna är nödvändigt för att undvika kulturförorening av andra celler och för att möjliggöra ytterligare dissekering.
- När hjärnhinnorna har tagits bort ordentligt öppnas den överlägsna sidan av cortex i sidled, vilket kommer att exponera hippocampus. Använd Dumont #5 tång, nyp hippocampus bort från den bifogade cortex och försiktigt överföra isolerade hippocampus till ett sterilt 15 ml koniskt rör som innehåller 5 ml Hibernate-E medium på is.
- Upprepa dissekeringen för båda hjärnhalvorna för varje embryonal musvalp och kombinera alla hippocampi till ett enda koniskt rör på 15 ml, om det inte behövs separat för experimentspecifika ändamål.
- För att odla när nervceller, hjärnbarken kan separeras från subcortex och behandlas identiskt med hippocampal nervceller.
Obs: I det här läget kan protokollet pausas. Lagra hjärnor eller dissekerade hippocampi i Hibernate-E medium kompletterat med B27 (2%) vid 4 °C i upp till 1 månad, även om förlängd fördröjning kan äventyra antalet livskraftiga celler.
- För att odla när nervceller, hjärnbarken kan separeras från subcortex och behandlas identiskt med hippocampal nervceller.
3. Dissociating och odling hippocampal nervceller
OBS: Alla procedurer bör utföras under sterila förhållanden i ett vävnadskulturerat biosäkerhetsskåp.
- Bered 0,5 ml papain dissociation lösning per embryo för hippocampal dissociation. Volymen av dissociation lösning behövs kommer att variera beroende på antalet embryonala hjärnor som dissekeras.
OBS: För när neuron kultur, förbereda 1,0 ml papainlösning per embryo.- Lös upp 20 μL papainupphängning per 1 ml av Hibernate E-mediet genom att virvla i cirka 3 minuter.
- När papain har lösts upp, tillsätt 1 μL DNase I per 1 ml av lösningen. Virvel inte lösningen efter DNase jag har lagts till eftersom detta kan inaktivera enzymet.
- Centrifugera 15 ml koniskt rör som innehåller hippocampal vävnad (steg 2.10) vid 1 000 x g i 5 minuter. Ta bort supernaten och tillsätt papainlösning. Återanvänd vävnaden genom att invertera flera gånger. Inkubera vid 37 °C i 30 min, vänd för att återanvända vävnaden var 10: e minut.
- Om du odlar närneuroner, överför alla cortices till en ny 100 mm steril odlingsform, aspirera försiktigt media från tallrik och köttfärsvävnad med fin sax eller rakblad. Tillsätt papainlösning till odlingsskålen och överför närvävnad med papainlösning till 15 ml koniskt rör med en steril överföringspipett. Inkubera vävnad och enzymlösning vid 37 °C i 30 min, agitera var 10:e minut.
- Under 30 min inkubation, förbered 3 brandpolerade glas Pasteur pipetter: 1 helt öppen, 1 halv öppen och 1 fjärdedel öppen.
- Efter inkubationen på 30 min, centrifugera det koniska röret på 15 ml som innehåller smälta hjärnvävnader vid 125 x g i 10 min. Ta bort enzymlösningen och ersätt med en lika stor volym färskt Hibernate E-medium.
- Använd helt öppen Pasteur pipett, triturera vävnaden 10x. Låt vävnaden nöja sig med 2 min och överför sedan den övernaturliga cellupphängningen till ett sterilt 50 ml koniskt rör. Tillsätt en lika stor volym Hibernate E medium tillbaka till vävnaden.
- Använd halvöppen Pasteurpipett, trituratvävnad 10x. Låt vävnaden nöja sig i 2 min och överför sedan den övernaturliga cellupphängningen till samma 50 ml koniska rör som i föregående steg. Tillsätt en lika stor volym Hibernate E medium tillbaka till vävnaden.
- Med kvartsöppen Pasteur pipett, trituratvävnad 10x. Låt vävnaden sätta sig i 2 min och överför sedan supernatantcellsupphängningen igen till samma 50 ml koniska som i tidigare steg. Kassera eventuell återstående vävnad som inte har dissocierat.
- Centrifugera det koniska röret på 50 ml som innehåller supernaten från cellupphängningen vid 125 x g i 5 min. Om det inte redan är gjort, tvätta poly-D-lysinbelagda plattor med sterilt vatten och ta bort alla spår av vätska genom noggrann aspiration under centrifugation.
- Efter centrifugation, kassera supernatant och återanvänd cellpelleten i 5 ml Neuron Growth Media. Räkna levande celler med trypanblått och hemocytometer.
- Om odling av när neuroner, tillsätt minst 10 ml Neuron Growth Media för mindre täta celler och mer exakt räkning.
- Späd celler med Neuron Growth Media för en slutlig pläteringstäthet på 5 x 105 livskraftiga celler per ml och tillsätt 1 ml utspädd cellfjädring till varje brunn på en 12 brunnsplatta. Håll nervceller vid 37 °C med 5% CO2.
OBS: Vanligtvis ger hippocampi från 1 embryonal mushjärna, dvs. 2 hippocampi, cirka 1 x 106 livskraftiga celler. Detta nummer tillhandahålls endast för experimentplaneringsändamål och bör inte betraktas som en ersättning för att räkna celler för varje kultur. - Ändra tillväxtmedierna dagen efter kulturen genom att ta bort hälften av medievolymen från varje brunn, dvs. 0,5 ml, och lägg till en lika stor mängd färska medier till sidan av brunnen för att undvika att störa de odlade cellerna. Slutför hälften av mediebytena två gånger i veckan under kulturens livstid.
4. Bedömning av MHCI-uttryck genom flödescytometri
- Bered behandling genom att späda ut Interferon beta (IFNβ) eller en lika stor volym spädning i Neuron Growth Media. Eftersom medieförändringen kommer att bli en halvvolymsförändring, förbered behandlingsmedier med 2x koncentrerad IFNβ. Dvs. för att behandla 3 brunnar av en 12 brunnsplatta med 100 U/ml IFNβ, bered 1,5 ml med 200 U/ml IFNβ eller lika stor volym IFNβ-spädning för mediebehandlade kontroller.
- Ta bort 0,5 ml från varje brunn av nervceller och tillsätt 0,5 ml Neuron Growth Media med eller utan IFNβ till varje brunn. Inkubera under normala tillväxtförhållanden (37 °C, 5 % CO2) i 6–72 timmar, beroende på experimentella förhållanden och signaloptimering.
- Efter behandlingstid, ta bort alla kulturmedier och tvätta försiktigt en gång i kalla Neurobasal media saknar kosttillskott (B27, L-glutamin, Pen-Strep).
- Tillsätt 0,5 ml icke-kompletterade kalla neurobasala medier som innehåller 1 μg/ml Fc-block och 1 μg/ml fluorescerande konjugerad anti-MHCI-antikropp till varje brunn. Inkubera vid 4 °C skyddad mot ljus i 45 min.
- Ta bort antikroppsinnehållande media och tvätta försiktigt en gång i kall dPBS. Tillsätt 0,5 ml enzymfri cellavsorienteringsbuffert i rumstemperatur till varje brunn och omrör för att lossa celler. Se upp för dissociation med inverterat vävnadskulturmikroskop.
- När celler har lossnat från odlingsskålen, tillsätt 0,5 ml FACS-buffert till varje brunn, triturera celler för att sprida klumpar och överför den totala volymen av varje brunn till enskilda 1,7 mL mikrocentrifugrör.
- Centrifugera vid 1 000 x g i 5 min. Ta bort supernatanten, återanvänd cellpelleten i 100 μL FACS-buffert och överför den totala volymen av varje rör till enskilda brunnar på en 96 brunn U-bottenplatta.
- Tillsätt 100 μL fixativt reagens till varje brunn. Triturera flera gånger för att undvika att celler klumpar ihop sig och inkuberar i 15 minuter vid rumstemperatur skyddad mot ljus.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återanvänd i 200 μl FACS-buffert.
- Centrifugera vid 500 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återanvänd i 100 μL permeabiliseringsreagens som innehåller fluorescerande konjugerad anti-NeuN-antikropp (1:100 utspädning) till varje brunn. Blanda väl och inkubera sedan vid rumstemperatur skyddad från ljus med gungning i 20 min.
- Efter inkubation, centrifugera vid 500 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återanvänd i 100 μL FACS-buffert. Upprepa 2x.
- Efter den slutliga tvätten, återanvända celler i 100 μL av 2% paraformaldehyd utspädd i FACS buffert. Blanda väl för att förhindra att celler klumpar ihop sig. Förvara vid 4 °C skyddad från ljus tills den är klar att läsas på en flödescytometer. Läs prover så snart som möjligt, inom 1 vecka.
5. Kvantifiering och utvärdering av uppgifter
- Mät kompensationskontrollerna för varje fluorescerande färgämne och korrigera eventuella spektralöverlappningar. Idealiska kompensationskontroller inkluderar odlade nervceller som är osedda, färgade med endast anti-MHCI och färgade med anti-NeuN endast.
- Om möjligt registrerar du 100 000 händelser för varje exempel (minst 10 000) och sparar som FCS-filer.
- Om du vill analysera data, med hjälp av lämplig analysprogramvara, ställer du in sekventiella grindar, som avbildas i figur 1A-C för att välja för NeuN-positiva nervceller.
- Rita SSC-A (log) vs FSC-A (linjär). Rita en grind på cellpopulationen (P1) för att eliminera cellulärt skräp från analysen.
- Inom P1 cellulär population, plot FSC-H (linjär) vs FSC-A (linjär). Rita en grind på encellspopulationen.
- Inom encellspopulationen ritar du SSC-A (log) vs NeuN (log). Rita en grind på NeuN-positiv population med osedda eller MHCI-färgade celler som guide.
- Rita ett histogram av MHCI fluorescens med cellulära händelser normaliserade till läge på y-axeln. Använd osedda eller NeuN-färgade nervceller som guide, rita en horisontell grind för att kvantifiera de procent neuroner som är positiva för MHCI.
- Exportera de procentceller som är positiva för MHCI, samt medianfluorescensintensiteten (MFI) för MHCI på den NeuN-positiva populationen för statistisk utvärdering och grafisk ritning.
Representative Results
Med hjälp av förfarandet som presenteras här dissekerades hippocampal vävnad från prenatala musvalpar vid embryonala dag 18. Vävnaden var dissociated i en enda cell suspension med enzymatiska och mekaniska metoder, sedan odlas i 12 väl plattor som var förbehandlade med poly-D-lysin. Efter 7 dagar in vitro behandlades cellerna med 100 U/ml IFNβ eller media endast i 72 timmar, vilket stimulerade uttrycket av MHCI. Nervceller var färgas in situ för MHCI innan de är icke-enzymatically dissociated i en enda cell suspension. Nervceller var fasta och permeabilized, sedan färgas intracellularly för neuronal atomkärnor markör NeuN. Prover bedömdes av flöde cytometri och data analyserades med tillhörande programvara. Nervceller identifierades genom sekventiell gating av de totala händelserna för att utesluta cellulära skräp och dubblerar (Figur 1A, B). Nervceller identifierades slutgiltigt av NeuN-positivitet (Figur 1C). NeuN+ celler analyserades ytterligare för MHCI-positivitet genom att plotta celler på ett histogram med antalet celler normaliserade till läget på y-axeln och MHCI fluorescens på x-axeln. En MHCI+ grind drogs vid den punkt där positiva och negativa toppar avvek (Figur 1D). Från detta, procent neuroner positiva för MHCI färgning (Figur 1E) och median fluorescens intensitet (MFI; Figur 1F) beräknades. Resultaten visar att IFNβ behandling avsevärt uppreglerade andelen nervceller positiva för extracellulär färgning av MHCI, liksom nivån av uttryck, som anges av MFI. Statistisk analys och grafisk representation gjordes med hjälp av kommersiellt tillgänglig statistisk programvara.
Figur 1: Representativ gatingstrategi och MHCI-kvantifiering.
Primära hippocampal nervceller behandlades med 100 U/ml IFNβ eller endast media. Efter 72 h, nervceller färgades extracellulärt med Pacific Blue-konjugerade MHCI (1 μg/mL H2-Kb),sedan intracellulärt märkt med PE-konjugerade NeuN (1:100 utspädning). Cellulär fluorescens bedömdes av flöde cytometri, och data analyserades. (A) Totalt antal händelser ritades upp när SSC-A (log) vs FSC-A (linjär) och celler (P1) var gated för att utesluta skräp. B)Inom P1-populationen ritades celler som FSC-H (linjär) vs FSC-A (linjär) för att gate den enskilda cellpopulationen. (C) Inom encellspopulationen ritades celler SSC-A (log) vs NeuN-PE (log). NeuN+ celler var gated för att identifiera nervceller. (D) Inom neuronpopulationen ritades cellerna på ett histogram med MHCI-PacBlu på x-axeln och cellnummer normaliserade till läge på y-axeln. En horisontell grind drogs för att kvantifiera procent av nervceller positiva för MHCI färgning. (E) Kvantifiering av procent MHCI+ av NeuN+ celler endast i media och IFNβ-behandlade nervceller. (F) Kvantifiering av mhci-intensitet (medianfluorescens) på NeuN+ celler i media (svarta) och IFNβ-behandlade (röda) nervceller. Statistisk signifikans beräknades genom oparat t-test. P < 0,01. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Neuron tillväxt media (50 ml) | |||
| reagens | Slutlig koncentration | Koncentration av lager | För 50 ml |
| B27 tillägg | 2% | 100% | 1,0 ml |
| L-glutamin | 2 mM | 200 mM | 0,5 ml |
| Penicillin-Streptomycin | 100 U/ml | 10 000 U/ml | 0,5 ml |
| Neurobasala medier | 48,0 ml | ||
| FACS-buffert (500 ml) | |||
| reagens | Slutlig koncentration | Koncentration av lager | För 500 ml |
| Fetala nötkreatur serum | 2% | 100% | 10 ml |
| Edta | 1 mM | 500 mM | 1 ml |
| dPBS (på 2000) | 489 ml | ||
| Papain dissociation lösning | |||
| reagens | Slutlig koncentration | Koncentration av lager | För 1 ml |
| Papain Suspension | 20 U/ml | 1000 U/ml | 0,020 ml |
| DNase I | 2,5 U/ml | 2500 U/ml | 0,001 ml |
| Viloläge-E | 1,0 ml | ||
| Obs: Volymen av Papain Dissociation Solution som behövs kommer att variera beroende på antalet embryonala hjärnor som dissekeras. Förbered 0,5 ml per hjärna för hippocampal nervceller eller 1,0 ml per hjärna för när nervceller. | |||
| Obs: Förbered dissociationslösningen genom att virka papainupphängning i Hibernate-E i ca 3 min. När papain är ordentligt upplöst, lägg till DNase I. Virvel inte DNase I. | |||
Tabell 1: Media och lösningar.
Discussion
Detta protokoll beskriver dissekering och kultur av primära hippocampal nervceller från prenatala mus valpar på embryonala dag 18. Användningen av primära nervceller odlade från gnagare är en av de mest grundläggande metoderna som utvecklats i modern neurobiologi22. Även om odödliga cellinjer kan modellera vissa aspekter av nervceller, deras natur som tumör-härledda celler, underlåtenhet att utveckla definierade axoner och fortsatt celldelning väcker tvivel om de troget rekapitulerar egenskaper hos post-mitotiska nervceller in vivo23. Ett annat alternativ till primära nervceller är användningen av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (HiPSCs). Tekniken för att använda HiPSCs, särskilt de som är patientbaserade, har utvecklats snabbt under de senaste åren24. Det finns dock fortfarande begränsningar för att arbeta med HiPSCs inklusive variation mellan cellinjer, brist på funktionell mognad och skillnader i epigenetiska profiler25. Även om det också finns begränsningar för att arbeta med reduktionistiska modellen av primära gnagare nervceller, odlade nervceller behåller den post-mitotiska karaktären av nervceller in vivo. De expansiva molekylärbiologiska verktygen och genetiska modifieringar som finns tillgängliga för möss gynnar också användningen av primära nervceller över HiPSCs för många applikationer, och musstudier kan enkelt översättas till den mer komplexa in vivo-organismen utan att förlora det experimentella genetiska systemet. Av dessa skäl använder många forskare primära gnagare nervceller för att verifiera viktiga aspekter, om inte huvuddelen, av deras forskning.
För vissa analyser kan nervceller analyseras direkt efter isolering från hjärnan ex vivo. Detta är särskilt önskvärt för experiment som involverar vuxna möss som kan utsättas för specifika experimentella tillstånd eller som kan bero på interaktioner av flera celltyper. Det finns dock flera frågor som begränsar vilken typ av analyser som kan göras. Det är tekniskt utmanande att förbereda en enda cell suspension av nervceller från hjärnan hos vuxna möss eftersom nervceller är unikt sammankopplade och ensheathed av myelin26. Icke-enzymatiska metoder för vävnadstrituration är ineffektiva vid dissociering av vävnaden och orsakar celldöd, medan enzymatiska preparat ofta klyver cellytans antigener27. Dessutom, medan myelin till stor del är frånvarande från embryonala möss, består den av cirka 20% av den vuxna hjärnan och kan försämra livskraftig cellisolering och hindra flödescytometrianalys28. Många av de tekniker som har utvecklats i slutändan strippa nervceller av deras cytosol och lämna små, rundade cellkroppar som främst består avatomkärnor 29. Även om detta är acceptabelt för vissa analyser, är detta inte lämpligt för kvantifiering cytoplasmic eller extracellulära protein uttryck. Dessutom tillåter reduktionistcellkultursystemet testning av specifika mekanistiska frågor på kortare tidsskala än vad som ofta är möjligt med ett in vivo-system.
Beskrivs också i detta protokoll är metoder för att stimulera MHCI uttryck farmakologiskt med IFNβ, och kvantifiering av extracellulära MHCI uttryck genom flöde cytometri. Stimulering av IFNβ är en användbar positiv kontroll för att testa andra experimentella tillstånd, men det kan noteras att IFNγ och kainsyra också kan stimulera MHCI-uttryck i nervceller9,30, medan tetrodotoxin minskar MHCI-uttryck14. Tidigare metoder för att upptäcka MHCI-uttryck som förlitats på in situ hybridisering och immunohistochemical analys14,15,20,31. Medan mRNA-baserade analyser, såsom in situ hybridisering och qRT-PCR, kan bestämma spatiotemporal lokalisering, celltyp specificitet och nivåer av gen transkription, dessa analyser kan inte bedöma protein översättning eller transport till plasma membranet. Immunohistochemical och western blot analys kan bestämma skillnader i protein uttryck och potentiellt cellulära lokalisering men kan vara svårt att exakt kvantifiera. Dessutom känner många MHCI-antikroppar igen komplexens tertiära struktur och är mycket känsliga för konformationsförändringar. Således permeabilization eller denaturering villkorar resulterar i förlust av MHCI immunoreactivity32. Metoden som presenteras här använder in situ immunostaining för MHCI, vilket möjliggör erkännande av proteinet av antikroppen i sin inhemska konformation, följt av fixering och permeabiliseringsmetoder.
Med små modifieringar kan de metoder som beskrivs här användas för att odla andra neuronala populationer eller för att bedöma uttryck för andra extracellulära proteiner av intresse. Noterat i detta protokoll är enkla ändringar som kan göras för att odla när nervceller, men de metoder som beskrivs här kan också användas för att odla andra neuronala populationer, såsom striatala nervceller33. Även om detta protokoll specificerar immunostaining av MHCI och NeuN, kan andra cellulära markörer identifieras på ett liknande sätt. I allmänhet kan extracellulära markörer behandlas som MHCI och intracellulära markörer kan behandlas som NeuN. Det bör dock noteras att under cellulära dissociation steg, axonal projektioner avskurna från soma. Eftersom gating strategi definieras här skärmar ut cellulära skräp och fokuserar på neuronal atomkärnor markör NeuN, proteiner som uttrycks uteslutande i axonal projektioner får inte detekteras.
Fram till nyligen, neuroner troddes uttrycka MHCI endast som svar på skador, infektion, eller in vitro cytokin stimulering för att engagera cytotoxiska CD8+ T celler9. Ny forskning har belyst en annan funktion av MHCI för att reglera synaptiska anslutningar under utveckling13. Det protokoll som beskrivs här använder IFNβ för att stimulera MHCI-uttryck i vilda typer odlade nervceller, men liknande metoder kan användas med en mängd olika cellulära stimuli eller genetiska modifieringar för att testa specifika hypoteser. Denna metod kommer att göra det möjligt för forskare att undersöka de molekylära mekanismer som reglerar MHCI-uttryck, vilket kommer att förbättra förståelsen för MHCI: s dichotomösa roll på dessa två distinkta cellulära funktioner.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIA R00 AG053412 (KEF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Laboratory Supplies |
| 100 mm sterile culture dish | Fisher | FB012924 | Tissue Culture Supplies |
| 15 ml Centrifuge Tubes | Genesee | 21-103 | Laboratory Supplies |
| 50 ml centrifuge tube | Genesee | 21-108 | Laboratory Supplies |
| 500 mM EDTA | Invitrogen | AM9260G | FACS Buffer Reagent |
| 70% Ethanol | Fisher | BP82031Gal | Tissue Culture Supplies |
| 96 well U-bottom plate | Genesee | 25-221 | Flow Cytometry Supplies |
| B27 | Gibco | 17504044 | Neuron Culture Reagent |
| Borate Buffer | Thermo Scientific | 28341 | Tissue Culture Supplies |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipette | Fisher | 13 678 20C | Laboratory Supplies |
| Cell Dissociation Buffer | Gibco | 13 151 014 | Flow Cytometry Supplies |
| DNase I | Thermo | 90083 | Dissociation Solution Reagent |
| dPBS | Gibco | 14190-235 | Tissue Culture Supplies |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Dissection Tool |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | Dissection Tool |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Tissue Culture Supplies |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | Dissection Tool |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | Dissection Tool |
| Fix and Perm Cell Permeabilization Kit | Invitrogen | GAS003 | Flow Cytometry Supplies |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | Neuron Culture Reagent |
| Hibernate-E Medium | Gibco | A1247601 | Neuron Culture Reagent |
| Instant Sealing Sterilization Pouches | Fisher | 181254 | Tissue Culture Supplies |
| Interferon Beta | PBL Assay Science | 12405-1 | Flow Cytometry Supplies |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 | MilliporeSigma | FCMAB317PE | Flow Cytometry Antibody |
| Neurobasal Media | Gibco | 21103049 | Neuron Culture Reagent |
| Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody | BioLegend | 116513 | Flow Cytometry Antibody |
| Papain Solution | Worthington | LS003126 | Dissociation Solution Reagent |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Fixative |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Neuron Culture Reagent |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | Neuron Culture Reagent |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 91100-12 | Dissection Tool |
| Stereo dissection microscope | Swift | M29TZ-SM99CL-BTW1 | Dissection Tool |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91401-10 | Dissection Tool |
| Transfer Pipets | Corning | 357575 | Laboratory Supplies |
| TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody | BioLegend | 101319 | Flow Cytometry Antibody |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-100ML | Tissue Culture Supplies |
References
- Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. What is immune privilege (not). Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).
- Morimoto, K., Nakajima, K. Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System. Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).
- Klein, R. S., et al. Neuroinflammation During RNA Viral Infections. Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).
- Janeway, C. A. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).
- Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).
- Donaldson, J. G., Williams, D. B. Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules. Traffic. 10 (12), Copenhagen, Denmark. 1745-1752 (2009).
- Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. T cell-mediated cytotoxicity. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).
- Guidotti, L. G., Chisari, F. V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).
- Chevalier, G., et al. Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection. PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).
- Shrestha, B., Diamond, M. S. Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection. Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).
- Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells. Virology. 449, 235-243 (2014).
- Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection. Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).
- Shatz, C. J. MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity. Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).
- Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity. Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).
- Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).
- Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).
- Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex. Science. 313 (5794), New York, N.Y. 1795-1800 (2006).
- Atwal, J. K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science. 322 (5903), New York, N.Y. 967-970 (2008).
- Takai, T. Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition. Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).
- Lee, H., et al. Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db. Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).
- Ribic, A., et al. Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey. Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).
- Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S., Castrén, E. Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex. Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
- Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).
- Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease. Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).
- Ho, H., et al. A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).
- Panchision, D. M., et al. Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
- Snaidero, N., Simons, M. Myelination at a glance. Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).
- Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).
- Lv, D., et al. Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling. PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).
- Barco, A., et al. Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture. Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).
- Glynn, M. W., et al. MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections. Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons. Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).
