Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הערכת הביטוי של קומפלקס היסטו-תאימות גדול מחלקה I על נוירונים היפוקמפוס מורין ראשי על ידי Cytometry זרימה

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61436
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לתיבוי נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ממוחו של העכבר העוברי. הביטוי של המעמד המורכב histocompatibility גדול אני על פני השטח החוץ תאיים של נוירונים מתורבתים מוערך לאחר מכן על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה.

Abstract

הגדלת הראיות תומכת בהשערה כי אינטראקציות נוירו-חיסוניות משפיעות על תפקוד מערכת העצבים הן במצבים הומיאוסטטיים והן במצבים פתולוגיים. פונקציה נחקרת היטב של המעמד המורכב העיקרי histocompatibility I (MHCI) היא הצגת פפטידים שמקורם בתא למערכת החיסון האדפטיבית, במיוחד בתגובה לזיהום. לאחרונה הוכח כי הביטוי של מולקולות MHCI על נוירונים יכול לווסת שינויים תלויי פעילות בקישוריות הסינפטית במהלך התפתחות נורמלית והפרעות נוירולוגיות. החשיבות של פונקציות אלה לבריאות המוח תומכת בצורך במהלך בדיקה רגישה המזהה בקלות ביטוי MHCI על נוירונים. כאן אנו מתארים שיטה לתרבות העיקרית של נוירונים בהיפוקמפוס מורין ולאחר מכן הערכה של ביטוי MHCI על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה. ההיפוקמפוס המורי הוא microdissected מגורי עכבר טרום לידתי ביום העוברי 18. רקמה מנותקת לתוך השעיית תא יחיד באמצעות טכניקות אנזימטיות ומכאניות, ולאחר מכן מתורבת במדיה ללא סרום המגבילה את הצמיחה של תאים לא עצביים. לאחר 7 ימים במבחנה, ביטוי MHCI מגורה על ידי טיפול בתאים מתורבתים פרמקולוגית עם אינטרפרון בטא. מולקולות MHCI מסומנות במקום עם נוגדן מתויג פלואורסצנטי, ואז התאים מנותקים באופן לא אנזימטי להשעיית תא אחד. כדי לאשר את הזהות העצבית, התאים קבועים עם paraformaldehyde, מחלחל, ומסומן עם נוגדן מתויג פלואורסצנטי המזהה אנטיגן גרעיני עצבי NeuN. ביטוי MHCI מכומת לאחר מכן על נוירונים על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה. תרבויות עצביות יכול בקלות להיות מניפולציה על ידי שינויים גנטיים או התערבויות תרופתיות כדי לבדוק השערות ספציפיות. עם שינויים קלים, שיטות אלה יכולות לשמש לתרבות אוכלוסיות עצביות אחרות או כדי להעריך ביטוי של חלבונים אחרים של עניין.

Introduction

מערכת העצבים המרכזית (CNS) נחשבה פעם נטולת מעקב חיסוני, המכונה "חיסון מיוחס1." עכשיו ברור כי זכות זו אינה משתווה להיעדר מוחלט של מרכיבים חיסוניים, אלא, תקנה מיוחדת הפועלת כדי להגביל את הנזק הקשורים אימונופתולוגיה1. למעשה, תקשורת בין מערכת העצבים המרכזית לבין המערכת החיסונית היא שיחה מתמשכת הדרושה להתפתחות מוחית בריאה ותגובה לזיהומים2,3.

מולקולות מורכבות היסטו-תאימות עיקריות מסוג I (MHCI) הן חלבוני טרנסממברן פוליגניים ופולימורפיים הידועים בעיקר בשל תפקידם בהצגת פפטידים אנטיגניים לתאי CD8+ T במהלך זיהום4. קומפלקסים קלאסיים של MHCI מורכבים משרשרת α טרנסממבראן ושרשרת אור חוץ-תאית, הנקראת β2-מיקרוגלובולין. שרשרת α מכילה חריץ פולימורפי שקושר פפטיד אנטיגני למצגת5. ביטוי נכון של MHCI על קרום חוץ תאי דורש פעולה מתואמת של מלווים מולקולריים ברשתית אנדופלזמית כדי להבטיח קיפול נאות של שרשרת α ו β2-microglobulin יחד עם טעינה של ליגנד פפטיד זיקה גבוהה5. רק לאחר קומפלקסים MHCI מורכבים, הם מיוצאים מן reticulum אנדופלזמה לקרום הפלזמה6. עם מעורבות של קולטן תא T קוגנייט עם קומפלקס MHCI טעון פפטיד, CD8+ תאי T לתווך הרג תאים על ידי שחרור גרגירים lytic המכילים פרפורין ו granzymes או על ידי גרימת אפופטוזיס באמצעות קשירת קולטן פאס על קרום תא היעד7. בנוסף, תאי CD8+ T מייצרים ציטוקינים, כגון אינטרפרון גמא (IFNγ) וגורם נמק הגידול אלפא (TNFα), אשר יכול להפעיל מנגנונים אנטי ויראליים בתאים נגועים ללא השפעות ציטופתיות8,9. עבור וירוסים נוירוטרופיים רבים, CD8+ תאי T נחוצים כדי לנקות את הזיהום מן מערכת העצבים המרכזית10,11,12.

בעבר חשבו כי נוירונים מבטאים MHCI רק בתנאים של נזק, זיהום ויראלי, או עם גירוי ציטוקינים במבחנה. לאחרונה, מחקר זיהה תפקיד לביטוי עצבי של MHCI בשיפוץ סינפטי פלקסיות13,14. למרות המנגנונים המדויקים שבבסיס ויסות הסינפסה אינם מובנים היטב, הנתונים מצביעים על כך שרמת הביטוי MHCI מוסדרת על ידי פעילות סינפטית15,16. השערה אחת מניחה כי נוירונים מבטאים קולטן B דמוי אימונוגלובולין מזווג (PirB) presynaptically, אשר קושר MHCI transynaptically13,17. אינטראקציה זו יוזמת מפל איתות על ידי PirB המתנגד למסלולים המעורבים בשיפוץ סינפטי, ובכך מחזק ומייצב את החיבור הסינפטי17,18,19. בהיעדר פעילות עצבית, ביטוי MHCI הוא ירד14, ואובדן MHCI תוצאות חיסול סינפסה פגומה ומעגלים סינפטיים מאורגנים20,21.

ההסמכה המתוארת כאן, אשר הותאמה שבלייה ואח'9, משתמש ניתוח ציטומטרי זרימה כדי להעריך כמותית ביטוי חלבון חוץ תאי של MHCI על תרבויות ראשוניות של נוירונים היפוקמפוס מורין. פרוטוקול זה ממחיש את הטכניקות הראשוניות למיקרו-הבחנה של רקמת ההיפוקמפוס מגורי עכבר עובריים. לאחר מכן הוא מפרט תהליכים לניתוק אנזימטי ומכאני של רקמה לתוך השעיית תא יחיד ושיטות לשמירה על התרבויות במבחנה. מכיוון שהם אינם מתחלקים, ברגע שהם בתרבות, נוירונים חייבים להיות מצופים בצלחת וצפיפות המתאימה לנקודת הקצה הניסיונית שלהם. לאחר מכן, הוא מתאר שלבים לגרימת ביטוי MHCI עם אינטרפרון בטא (IFNβ), אימונולה עבור MHCI וסמן גרעיני עצבי NeuN, וניתוח תאים על ידי cytometry זרימה. לבסוף, הוא מתאר נהלים להערכת נתוני cytometry זרימה כדי לזהות נוירונים חיוביים MHCI וכימות רמת הביטוי MHCI. כמו כן צוין בפרוטוקול זה התאמות קטנות שניתן לבצע על מנת תרבות נוירונים קליפת המוח בנוסף או במקום נוירונים בהיפוקמפוס. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי לבדוק השערות ספציפיות באמצעות וריאציות גנטיות או טיפולים תרופתיים.

Protocol

כל ההליכים בוצעו בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות ובהתאם לעקרונות המנחים הבינלאומיים למחקר ביו-רפואי הכוללים בעלי חיים. הפרוטוקול אושר על ידי אוניברסיטת צפון קרוליינה בוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בשארלוט (פרוטוקול #19-020).

1. הכנה לתרבות

הערה: נהלים אלה צריכים להיעשות בתנאים סטריליים בארון biosafety ייעודי לתרבות הרקמות. ראה טבלה 1 לקבלת מדיה ופתרונות.

  1. לעקר את כל כלי הניתוח על ידי autoclaving בשקיות עיקור עצמי.
  2. הכינו מלאי עובד של פולי-די-לידין לטיפול במנות תרבות של 12 בארות.
    1. להמיס פולי-D-ליצין ב 1x בוראט חוצץ לריכוז של 100 מיקרוגרם / מ"ל (מרוכז 10x). לאחסן כ 1 מ"ל aliquots ב -20 מעלות צלזיוס עד הצורך.
    2. לדלל 10x מרוכז פולי-D-ליסין ב dPBS ל 10 מיקרוגרם / מ"ל (1x) ומסנן לעקר.
    3. לטפל צלחות תרבות 12-well עם 0.5 מ"ל לכל באר של 1x פולי-D-לידין בטמפרטורת החדר לפחות 1 שעה או לילה לשימוש למחרת. ודא שנפח הפולי-די-לידין מספיק כדי לכסות באופן מלא את החלק התחתון של אזור התרבות.
    4. רגע לפני השימוש, יש להסיר פולי-די-ליסין מלוח התרבות, לשטוף פי 3 במים סטריליים ולשמור במים סטריליים עד שהם מוכנים לצלחת. הסר את כל העקבות של נוזל על ידי שאיפה יסודית לפני ציפוי תאים.
  3. הכן מדיה צמיחה נוירון ומאגר FACS. מסננים מעוקרים ומאחסנים ב-4°C עד לשימוש. נוירון צמיחה מדיה ניתן לשמור על כ 2 wks; ניתן לשמור מאגר FACS למשך כ- 4 wks.

2. ניתוח היפוקמפוס עוברי

הערה: הליך זה יכול להתבצע על הספסל כפי שהוא דורש שימוש במיקרוסקופ סטריאו להסרת קרום ומיקרו-דיסקציה של ההיפוקמפוס. לדבוק בטכניקה אספטית קפדנית כדי למזער את הזיהום הפוטנציאלי.

  1. המתת חסד עכבר נקבה C57BL/6J מתוזמן בהריון ביום העוברי 18 בתא CO2.
  2. לרסס את עור הבטן ואת הפרווה עם 70% EtOH, ואז לצבוט את העור עם מלקחיים רקמה ולעשות חתך קטן עם מספריים כירורגיים. להסית את הצפק כדי לחשוף את הקרביים והרחם.
  3. לתפוס את הרחם עם מלקחיים דפוס סטנדרטי, להרים מתוך החלל, לחתוך את החיבור mesometrium עם מספריים בסדר. מעבירים את הרחם עם עוברים לתרבית פלסטיק סטרילית 100 מ"מ המונחת על קרח.
  4. בעזרת מספריים עדינות ומלקחיים עדינים, חותכים בזהירות את הרחם ומסירים את השק העוברי כדי לשחרר עוברים. מעבירים עוברים לתבשיל חדש של תרבית פלסטיק סטרילית 100 מ"מ המכיל dPBS המונח על קרח.
  5. ערפו את ראשם של גורים עובריים באמצעות מספריים דקים, והעבירו ראשים לתבנית חדשה של 100 מ"מ בתרבית פלסטיק סטרילית המכילה מדיום Hibernate-E המונח על קרח.
  6. כדי להסיר את המוח, להחזיק את הראש עם זוג מלקחיים בסדר ביד אחת. באמצעות מלקחיים #7 מעוקלים של Dumont ביד השנייה, הכנס את קצה המלקחיים בבסיס הגולגולת וצבוט את העצם ואת העור overlying נע במהירות לאורך קו האמצע מבלי לנקב את המוח.
  7. שימוש במלקחיים מעוגלים מפרק את העור והגולגולת כדי לחשוף את המוח. לטאטא את המלקחיים המעוקלים מתחת למוח מנורת הריח החשופה למוח הקטן כדי להרים את המוח מהגולגולת. מעבירים את המוח לתבשיל חדש של 100 מ"מ בתרבית פלסטיק סטרילית המכילה מדיום Hibernate-E המונח על קרח. חזור על הפעולה עבור כל מוח.
    הערה: ניתן לאסוף את כל המוחות בצלחת תרבות אחת, אלא אם כן יש צורך להפריד למטרות ספציפיות לניסוי.
  8. תחת מיקרוסקופ ניתוח סטריאו, עובד עם מוח אחד בכל פעם ושני זוגות של מלקחיים #5 דומונט סטריליים, לצבוט את נורות הריח ולהרחיק קרום המוח. הסרה יסודית של קרום המוח יש צורך למנוע זיהום תרבות על ידי תאים אחרים כדי לאפשר ניתוח נוסף.
  9. לאחר קרום המוח מוסרים כראוי, הצד העליון של קליפת המוח נפתח לרוחב, אשר יחשוף את ההיפוקמפוס. באמצעות מלקחיים #5 Dumont, לצבוט את ההיפוקמפוס הרחק קליפת המוח המצורפת, ולהעביר בזהירות היפוקמפוס מבודד לצינור חרוט סטרילי 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיום Hibernate-E על קרח.
  10. חזור על הניתוח עבור שתי ההמיספרות במוח עבור כל גור עכבר עוברי ולשלב את כל ההיפוקמפי לתוך צינור חרוט אחד 15 מ"ל, אלא אם כן יש צורך בנפרד למטרות ספציפיות לניסוי.
    1. לנוירונים קליפתיים תרבותיים, קליפת המוח עשויה להיות מופרדת מתת-קליפת המוח ומעובדת באופן זהה לנוירונים בהיפוקמפוס.
      הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול. אחסן מוחות או היפוקמפי מנותח במדיום Hibernate-E בתוספת B27 (2%) ב 4 °C (69 °F) עד חודש אחד, אם כי עיכוב ממושך עלול לסכן את מספר התאים קיימא.

3. ניתוק ופולחן נוירונים בהיפוקמפוס

הערה: כל ההליכים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים בארון biosafety ייעודי לתרבות רקמות.

  1. הכן 0.5 מ"ל של פתרון דיסוציאציה פפאין לכל עובר לניתוק ההיפוקמפוס. נפח פתרון הדיסוציאציה הדרוש ישתנה בהתאם למספר המוחות העובריים המנותחים.
    הערה: לתרבות הנוירונים בקליפת המוח, הכינו 1.0 מ"ל של תמיסת פפאין לעובר.
    1. להמיס 20 μL של השעיית פפאין לכל 1 מ"ל של מדיום E תרדמה על ידי מערבולת במשך כ 3 דקות.
    2. לאחר פפאין מומס, להוסיף 1 μL של DNase אני לכל 1 מ"ל של הפתרון. אל מערבולת הפתרון לאחר DNase אני נוסף כמו זה יכול להשבית את האנזים.
  2. צינור חרוט צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל רקמת היפוקמפוס (שלב 2.10) ב 1, 000 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant ולהוסיף פתרון פפאין. Resuspend את הרקמה על ידי היפוך מספר פעמים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, היפוך כדי resuspend הרקמה כל 10 דקות.
    1. אם אתם מטפחים נוירונים קליפתיים, העבירו את כל קליפות המוח לתבשיל תרבות סטרילי חדש של 100 מ"מ, שאפתו בזהירות מדיה מהצלחת, וטחנו רקמת בשר טחון עם מספריים עדינות או סכין גילוח. הוסף פתרון פפאין לצלחת התרבות ולהעביר רקמת קליפת המוח עם פתרון פפאין לצינור חרוט 15 מ"ל באמצעות פיפטה העברה סטרילית. דגירה רקמה ותמיסת אנזים ב 37 °C (60 °F) במשך 30 דקות, נסער כל 10 דקות.
  3. במהלך 30 דקות דגירה, להכין 3 פיפטות פסטר זכוכית מלוטשת אש: 1 פתוח לחלוטין, 1 חצי פתוח, ו 1 רבע פתוח.
  4. לאחר הדגירה של 30 דקות, צנטריפוגה צינור חרוט 15 מ"ל המכיל רקמות מוח מתעכל ב 125 x g במשך 10 דקות. הסר את פתרון האנזים והחלף בנפח שווה של מדיום Hibernate E טרי.
  5. באמצעות פיפטה פסטר פתוחה לחלוטין, triturate הרקמה 10x. תן לרקמה להסתפק 2 דקות, ולאחר מכן להעביר את השעיית התא supernatant לצינור חרוט סטרילי 50 מ"ל. הוסף נפח שווה של מדיום Hibernate E בחזרה לרקמה.
  6. שימוש חצי פתוח פסטר פיפטה, רקמת triturate 10x. תן לרקמה להסתפק 2 דקות, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה תא supernatant לאותו צינור חרוט 50 מ"ל כמו בשלב הקודם. הוסף נפח שווה של מדיום Hibernate E בחזרה לרקמה.
  7. באמצעות רבע פתוח פסטר פיפטה, רקמת triturate 10x. תן לרקמה להסתפק 2 דקות, ואז להעביר את השעיית התא supernatant שוב לאותו חרוט 50 מ"ל כמו בשלבים קודמים. השלך את כל הרקמות שנותרו שלא ניתזו.
  8. צנטריפוגה הצינור חרוט 50 מ"ל המכיל את supernatant מן התא השעיה ב 125 x g במשך 5 דקות. אם עדיין לא נעשה, לשטוף צלחות מצופות פולי-D-ליצין עם מים סטריליים ולהסיר את כל עקבות של נוזל על ידי שאיפה יסודית במהלך צנטריפוגה.
  9. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 5 מ"ל של נוירון צמיחה מדיה. לספור תאים חיים באמצעות כחול trypan ו hemocytometer.
    1. אם culturing נוירונים קליפת המוח, להוסיף לפחות 10 מ"ל של נוירון צמיחה מדיה עבור תאים צפופים פחות ספירה מדויקת יותר.
  10. לדלל תאים עם נוירון צמיחה מדיה עבור צפיפות ציפוי סופית של 5 x 105 תאים קיימא לכל מיליליטר ולהוסיף 1 מ"ל של השעיית תא מדולל לכל באר של צלחת 12 היטב. לשמור על נוירונים ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2.
    הערה: בדרך כלל, ההיפוקמפי ממוח עכבר עוברי אחד, כלומר, 2 היפוקמפי, מניב כ 1 x 106 תאים קיימא. מספר זה מסופק למטרות תכנון ניסויים בלבד ואין לראות בו תחליף לספירת תאים עבור כל תרבות.
  11. לשנות את מדיה הצמיחה יום אחרי תרבות על ידי הסרת מחצית נפח המדיה מכל באר, כלומר, 0.5 מ"ל, ולהוסיף נפח שווה של מדיה טרייה לצד של הבאר, כדי למנוע שיבוש התאים התרבותיים. חצי מדיה שלמה משתנה פעמיים בשבוע לתוחלת החיים של התרבות.

4. הערכת ביטוי MHCI על ידי ציטומטריית זרימה

  1. הכן טיפול על ידי דילול אינטרפרון בטא (IFNβ) או נפח שווה של diluent במדיה צמיחה נוירון. מאז שינוי מדיה יהיה שינוי חצי נפח, להכין את מדיית הטיפול עם 2x מרוכז IFNβ. כלומר, כדי לטפל 3 בארות של צלחת 12 גם עם 100 U / mL של IFNβ, להכין 1.5 מ"ל עם 200 U / mL IFNβ או נפח שווה של IFNβ diluent עבור פקדים שטופלו במדיה.
  2. הסר 0.5 מ"ל מכל באר של נוירונים ולהוסיף 0.5 מ"ל של נוירון צמיחה מדיה עם או בלי IFNβ לכל באר. דגירה בתנאי צמיחה רגילים (37 °C (37 °C, 5% CO2) עבור 6-72 שעות, בהתאם לתנאים ניסיוניים ואופטימיזציה אות.
  3. לאחר זמן הטיפול, להסיר את כל המדיה התרבותית בעדינות לשטוף פעם אחת במדיה נוירובאסלית קרה חסר תוספי מזון (B27, L-גלוטמין, עט-סטרפטוקוקוס).
  4. הוסף 0.5 מ"ל של מדיה נוירובסלית קרה ללא תוספת המכילה 1 מיקרוגרם / מ"ל של בלוק Fc ו 1 מיקרוגרם / מ"ל של נוגדן פלואורסצנטי מצומד נגד MHCI לכל באר. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור במשך 45 דקות.
  5. הסר מדיה המכילה נוגדנים ולשטוף בזהירות פעם אחת dPBS קר. הוסיפו 0.5 מ"ל של מאגר ניתוק תאים ללא אנזימים בטמפרטורת חדר לכל באר והתסיסו כדי לעקור תאים. היזהר דיסוציאציה באמצעות מיקרוסקופ תרבית רקמות הפוכה.
  6. לאחר התאים מנותקים צלחת תרבות, להוסיף 0.5 מ"ל של מאגר FACS לכל באר, תאים triturate לפזר גושים, ולהעביר את הנפח הכולל של כל באר בודדים 1.7 mL microcentrifuge צינורות.
  7. צנטריפוגה ב 1, 000 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant, resuspend גלולת התא ב 100 μL של מאגר FACS, ולהעביר את הנפח הכולל של כל צינור בארות בודדות של צלחת 96 גם U-bottom.
  8. הוסף 100 μL של מגיב מתקנת לכל באר. Triturate מספר פעמים כדי למנוע תאים גושים דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.
  9. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו לשימוש חוזר ב 200 μl של מאגר FACS.
  10. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend ב 100 μL של ריאגנט permeabilization המכיל נוגדן פלואורסצנטי מצומד נגד NeuN (1:100 דילול) לכל באר. מערבבים היטב, ואז דגירה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור עם נדנדה במשך 20 דקות.
  11. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו לשימוש חוזר ב 100 μL של מאגר FACS. חזור על 2x.
  12. לאחר הכביסה הסופית, resuspend תאים ב 100 μL של 2% paraformaldehyde מדולל במאגר FACS. מערבבים היטב כדי למנוע תאים מגושם. יש לאחסן ב-4°C מוגן מפני אור עד שהוא מוכן לקריאה על ציטומטר זרימה. קרא דגימות בהקדם האפשרי, בתוך שבוע.

5. כימות והערכת נתונים

  1. למדוד את פקדי הפיצוי עבור כל צבע פלואורסצנטי ולתקן כל חפיפה ספקטרלית. בקרות פיצוי אידיאליות כוללות נוירונים תרבותיים שאינם מוכתמים, מוכתמים באנטי-MHCI בלבד ומוכתמים באנטי-נויN בלבד.
  2. במידת האפשר, רשום 100,000 אירועים עבור כל מדגם (לפחות 10,000) ושמור כקבצי FCS.
  3. כדי לנתח נתונים, באמצעות תוכנת ניתוח מתאימה, הגדר שערים רציפים, כמתואר באיור 1A-C לבחירה עבור נוירונים חיוביים של NeuN.
    1. התווה SSC-A (יומן) לעומת FSC-A (ליניארי). צייר שער על האוכלוסייה הסלולרית (P1) כדי לחסל פסולת הסלולר מהניתוח.
    2. בתוך אוכלוסיית הסלולר P1, התווה FSC-H (ליניארי) לעומת FSC-A (ליניארי). צייר שער על אוכלוסיית תא יחיד.
    3. בתוך אוכלוסיית התאים הבודדים, התווה SSC-A (יומן) לעומת NeuN (יומן רישום). צייר שער על אוכלוסייה חיובית של NeuN באמצעות תאים מוכתמים או מוכתמים ב- MHCI בלבד כמדריך.
    4. התווה היסטוגרמה של פלואורסצנטיות MHCI עם אירועים סלולריים מנורמלים למצב על ציר y. באמצעות נוירונים מוכתמים או מוכתמים ב- NeuN בלבד כמדריך, צייר שער אופקי כדי לכמת את אחוז הנוירונים החיוביים עבור MHCI.
    5. יצא את תאי האחוזים החיוביים עבור MHCI, כמו גם את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) עבור MHCI באוכלוסייה החיובית של NeuN להערכה סטטיסטית ולציור גרפי.

Representative Results

באמצעות ההליך שהוצג כאן, רקמת ההיפוקמפוס נותחה מגורי עכבר טרום לידתיים ביום העוברי 18. הרקמה נותקה להשעיית תא בודד בשיטות אנזימטיות ומכאניות, ואז תרביתה ב-12 לוחות באר שטופלו מראש בפולי-די-ליצין. לאחר 7 ימים במבחנה, התאים טופלו עם 100 U / mL של IFNβ או מדיה רק עבור 72 שעות, אשר עורר את הביטוי של MHCI. נוירונים הוכתמו במקום עבור MHCI לפני שהם נותקו באופן לא אנזימטי להשעיה של תא אחד. נוירונים תוקנו וחלחלו, ואז הוכתמו תאית עבור סמן גרעינים עצביים NeuN. דגימות הוערכו על ידי cytometry זרימה ונתונים נותחו באמצעות התוכנה המשויכת. נוירונים זוהו באמצעות גיטינג רציף של סך האירועים כדי לא לכלול פסולת סלולרית וכפולים(איור 1A,B). נוירונים זוהו באופן סופי על ידי חיוביות NeuN (איור 1C). תאים של NeuN+ נותחו עוד יותר עבור חיוביות MHCI על-ידי התוויית תאים בהיסטוגרמה כאשר מספר התאים מנורמל למצב בציר y ופלואורסצנטיות MHCI בציר ה- x. שער MHCI+ נמשך בנקודה שבה פסגות חיוביות ושליליות התפצלו (איור 1D). מתוך זה, אחוז הנוירונים החיוביים לכתמי MHCI (איור 1E) ועוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI; איור 1F) חושבו. התוצאות מראות כי טיפול IFNβ באופן משמעותי upregulated אחוז הנוירונים חיובי עבור כתמים חוץ תאיים של MHCI, כמו גם את רמת הביטוי, כפי שצוין על ידי MFI. ניתוח סטטיסטי וייצוג גרפי נעשו באמצעות תוכנה סטטיסטית זמינה מסחרית.

Figure 1
איור 1: אסטרטגיית גיטינג ייצוגית וכימות MHCI.
נוירונים היפוקמפוס ראשוני טופלו עם 100 U / mL של IFNβ או מדיה בלבד. לאחר 72 שעות, נוירונים הוכתמו באופן חוץ-תאי עם MHCI עם מצומד כחול האוקיינוס השקט (1 מיקרוגרם / מ"ל H2-Kb), ולאחר מכן מתויגים תאית עם NEUN מצומד PE (1:100 דילול). פלואורסצנטיות תאית הוערכה על ידי ציטומטריית זרימה, ונתונים נותחו. (A) סה"כ אירועים הותוו כ- SSC-A (יומן) לעומת FSC-A (ליניארי), ותאים (P1) היו מגודרים כדי לא לכלול פסולת. (B) בתוך אוכלוסיית P1, תאים הותוו כ- FSC-H (ליניארי) לעומת FSC-A (ליניארי) כדי לשער את אוכלוסיית התאים הבודדים. (C) בתוך אוכלוסיית התאים הבודדים, תאים הותוו SSC-A (יומן) לעומת NeuN-PE (יומן רישום). תאי NeuN+ היו מגודרים לזיהוי נוירונים. (D) בתוך אוכלוסיית הנוירונים, תאים הותוו על היסטוגרמה עם MHCI-PacBlu על ציר x ומספרי תאים מנורמלים למצב על ציר y. שער אופקי צויר כדי לכמת את אחוז הנוירונים החיוביים עבור כתמי MHCI. (ה)כימות של אחוז MHCI+ של NeuN+ תאים במדיה בלבד ותאי עצב שטופלו IFNβ. (F) כימות של עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) של MHCI על NeuN+ תאים בתאי מדיה (שחורים) ו- IFNβ שטופלו (אדום). מובהקות סטטיסטית חושבה על ידי מבחן t לא משועבד. **, פי < 0.01. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

נוירון צמיחה מדיה (50 מ"ל)
מגיב ריכוז סופי ריכוז מלאי עבור 50 מ"ל
תוספת B27 2% 100% 1.0 מ"ל
ל-גלוטמין 2 מ"מ 200 מ"מ 0.5 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיצין 100 יו/מ"ל 10,000 יו/מ"ל 0.5 מ"ל
מדיה נוירובסלית 48.0 מ"ל
מאגר FACS (500 מ"ל)
מגיב ריכוז סופי ריכוז מלאי עבור 500 מ"ל
סרום שור עוברי 2% 100% 10 מ"ל
אדטה (EDTA) 1 מ"מ 500 מ"מ 1 מ"ל
dPBS 489 מ"ל
פתרון ניתוק פפאין
מגיב ריכוז סופי ריכוז מלאי עבור 1 מ"ל
השעיית פפאין 20 יו/מ"ל 1000 יו/מ"ל 0.020 מ"ל
DNase I 2.5 יו/מ"ל 2500 יו/מ"ל 0.001 מ"ל
שנת חורף-E 1.0 מ"ל
הערה: הנפח של פתרון ניתוק Papain הדרוש ישתנה בהתאם למספר המוחות העובריים להיות מנותח. הכינו 0.5 מ"ל למוח לנוירונים בהיפוקמפוס או 1.0 מ"ל למוח לנוירונים קליפתיים.
הערה: הכן פתרון דיסוציאציה על ידי השעיית פפאין מערבולת בתרדמת חורף-E במשך כ 3 דקות. לאחר פפאין הוא מומס ביסודיות, להוסיף DNase אני. אל מערבולת DNase אני.

טבלה 1: מדיה ופתרונות.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח והתרבות של נוירונים היפוקמפוס ראשוניים מגורים עכבר טרום לידתי ביום העוברי 18. השימוש בנוירונים ראשוניים בתרבית מכרסמים הוא אחת המתודולוגיות הבסיסיות ביותר שפותחו בנוירוביולוגיה המודרנית22. למרות קווי תאים מונצחים יכולים מודל היבטים מסוימים של נוירונים, הטבע שלהם כמו תאים שמקורם בגידול, כישלון לפתח אקסונים מוגדרים, וחלוקת תאים מתמשכת מעלה ספקות אם הם בנאמנות recapitulate מאפיינים של נוירונים פוסט מיטוטיים vivo23. חלופה נוספת לנוירונים ראשוניים היא השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (HiPSCs). הטכנולוגיה לשימוש HiPSCs, במיוחד אלה שמקורם בחולה, התקדם במהירות בשנים האחרונות24. עם זאת, ישנן עדיין מגבלות לעבודה עם HiPSCs כולל שונות בין קווי תאים, חוסר בגרות תפקודית, והבדלים בפרופילים אפיגנטיים25. אמנם יש גם מגבלות לעבודה עם המודל הרדוקציוניסטי של נוירונים מכרסמים ראשוניים, נוירונים תרבותיים לשמור על הטבע הפוסט מיטוטי של נוירונים vivo. כמו כן, כלי הביולוגיה המולקולרית הנרחבים ושינויים גנטיים הזמינים לעכברים מעדיפים את השימוש בנוירונים ראשוניים על פני HiPSCs עבור יישומים רבים, ומחקרי עכברים יכולים להיות מתורגמים בקלות לאורגניזם המורכב יותר ב- vivo מבלי לאבד את המערכת הגנטית הניסיונית. מסיבות אלה, חוקרים רבים משתמשים נוירונים מכרסמים ראשוניים כדי לאמת היבטים מרכזיים, אם לא את עיקר, של המחקר שלהם.

עבור מבחנים מסוימים, נוירונים עשויים להיות מנותחים ישירות לאחר בידוד מן המוח ex vivo. זה רצוי במיוחד עבור ניסויים מעורבים עכברים בוגרים שיכולים להיות כפופים לתנאים ניסיוניים ספציפיים או שעשויים להיות תלויים באינטראקציות של סוגי תאים מרובים; עם זאת, ישנן מספר בעיות המגבילות את סוג הניתוחים שניתן לבצע. זה מאתגר מבחינה טכנית להכין השעיית תא יחיד של נוירונים ממוחם של עכברים בוגרים כי נוירונים מחוברים באופן ייחודי מעוגנת על ידי מיאלין26. שיטות לא אנזימטיות של טריטורציה של רקמות אינן יעילות בניתוק הרקמה ולגרום למוות של תאים, ואילו תכשירים אנזימטיים לעתים קרובות cleave תא אנטיגנים27. יתר על כן, בעוד המיאלין נעדר במידה רבה מעכברים עובריים, הוא מהווה כ -20% מהמוח הבוגר, ויכול לפגוע בבידוד תאים בר קיימא ולעכב ניתוח ציטומטריה זרימה28. רבות מהטכניקות שפותחו בסופו של דבר מפשיטות נוירונים של הציטוסול שלהם ומשאירות גופי תאים קטנים מעוגלים המורכבים בעיקר מגרעינים29. למרות שזה מקובל על כמה ניתוחים, זה לא מתאים לכימות ביטוי חלבון ציטופלזמי או חוץ תאי. יתר על כן, מערכת תרבות התאים ההקציוניסטית מאפשרת לבחון שאלות מקניסטיות ספציפיות בקנה מידה קצר יותר ממה שניתן לעתים קרובות עם מערכת in vivo.

בפרוטוקול זה מתוארות גם שיטות לגירוי ביטוי MHCI תרופתי עם IFNβ, וכימות של ביטוי MHCI חוץ-תאי על ידי ציטומטריית זרימה. גירוי על ידי IFNβ הוא שליטה חיובית שימושית לבדיקת תנאים ניסיוניים אחרים, אבל ניתן לציין כי IFNγ וחומצה kainic יכול גם לעורר ביטוי MHCI בנוירונים9,30, בעוד טטרודוטוקסין מקטין ביטוי MHCI14. שיטות קודמות לגילוי ביטוי MHCI הסתמכו על הכלאה situ וניתוח אימונוהיסטוכימי14,15,20,31. בעוד מבחנים מבוססי mRNA, כגון באתרו הכלאה ו qRT-PCR, יכול לקבוע את לוקליזציה spatiotemporal, ספציפיות סוג התא, ורמות של שעתוק גנים, מבחנים אלה אינם יכולים להעריך תרגום חלבון או להעביר לקרום הפלזמה. ניתוח כתמים אימונוהיסטוכימיים ומערביים יכול לקבוע הבדלים בביטוי החלבון ופוטנציאל לוקליזציה הסלולר אבל יכול להיות קשה לכמת במדויק. יתר על כן, נוגדני MHCI רבים מזהים את המבנה השלישוני של המתחם, והם רגישים מאוד לשינויים קונפורמיים. לכן תנאי חדירה או דנטיזציה לגרום לאובדן של חיסוניות MHCI32. השיטה המוצגת כאן משתמשת ב- situ immunostaining עבור MHCI, המאפשרת הכרה בחלבון על ידי הנוגדן בקונפורמציה הטבעית שלו, ואחריו קיבעון ושיטות חדירה.

עם שינויים קלים, השיטות המתוארות כאן יכולות לשמש לתרבות אוכלוסיות עצביות אחרות או כדי להעריך ביטוי של חלבונים חוץ תאיים אחרים בעלי עניין. ציין בפרוטוקול זה הם שינויים קלים שניתן לבצע על מנת תרבות נוירונים קליפת המוח, אבל השיטות המתוארות כאן עשוי לשמש גם לתרבות אוכלוסיות עצביות אחרות, כגון נוירונים סטריאטליים33. יתר על כן, למרות פרוטוקול זה מציין immunostaining של MHCI ו- NeuN, סמנים סלולריים אחרים ניתן לזהות באופן דומה. באופן כללי, סמנים חוץ תאיים ניתן להתייחס כמו MHCI סמנים תאיים ניתן להתייחס כמו NeuN. עם זאת, יש לציין כי במהלך שלב הניתוק התאי, תחזיות אקסונליות מנותקות מהסומה. מכיוון שאסטרטגיית הגיהוק המוגדרת כאן מסננת פסולת תאית ומתמקדת בסמן גרעיני עצבי NeuN, חלבונים המתבטאים אך ורק בתחזיות אקסונליות לא יזוהו.

עד לאחרונה, נוירונים נחשבו להביע MHCI רק בתגובה נזק, זיהום, או גירוי ציטוקינים במבחנה על מנת לעסוק CD8 ציטוטוקסי+ תאי T9. מחקר חדש הבהיר פונקציה אחרת של MHCI בוויסות קשרים סינפטיים במהלך הפיתוח13. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש ב- IFNβ כדי לעורר ביטוי MHCI בנוירונים תרבותיים מסוג בר, אך ניתן להשתמש בשיטות דומות עם מגוון גירויים תאיים או שינויים גנטיים כדי לבדוק השערות ספציפיות. שיטה זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את ביטוי MHCI, אשר ישפרו את ההבנה של התפקיד הדיכוטומי של MHCI בשתי פונקציות תאיות נפרדות אלה.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIA R00 AG053412 (KEF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Laboratory Supplies
100 mm sterile culture dish Fisher FB012924 Tissue Culture Supplies
15 ml Centrifuge Tubes Genesee 21-103 Laboratory Supplies
50 ml centrifuge tube Genesee 21-108 Laboratory Supplies
500 mM EDTA Invitrogen AM9260G FACS Buffer Reagent
70% Ethanol Fisher BP82031Gal Tissue Culture Supplies
96 well U-bottom plate Genesee 25-221 Flow Cytometry Supplies
B27 Gibco 17504044 Neuron Culture Reagent
Borate Buffer Thermo Scientific 28341 Tissue Culture Supplies
Borosilicate Glass Pasteur Pipette Fisher 13 678 20C Laboratory Supplies
Cell Dissociation Buffer Gibco 13 151 014 Flow Cytometry Supplies
DNase I Thermo 90083 Dissociation Solution Reagent
dPBS Gibco 14190-235 Tissue Culture Supplies
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20 Dissection Tool
Dumont #7 Forceps Fine Science Tools 91197-00 Dissection Tool
Fetal Bovine Serum Gibco 26140079 Tissue Culture Supplies
Fine Forceps Fine Science Tools 91113-10 Dissection Tool
Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11 Dissection Tool
Fix and Perm Cell Permeabilization Kit Invitrogen GAS003 Flow Cytometry Supplies
Glutamax Gibco 35050061 Neuron Culture Reagent
Hibernate-E Medium Gibco A1247601 Neuron Culture Reagent
Instant Sealing Sterilization Pouches Fisher 181254 Tissue Culture Supplies
Interferon Beta PBL Assay Science 12405-1 Flow Cytometry Supplies
Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60 MilliporeSigma FCMAB317PE Flow Cytometry Antibody
Neurobasal Media Gibco 21103049 Neuron Culture Reagent
Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody BioLegend 116513 Flow Cytometry Antibody
Papain Solution Worthington LS003126 Dissociation Solution Reagent
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714 Fixative
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Neuron Culture Reagent
Poly-D-Lysine Sigma P7280 Neuron Culture Reagent
Standard Pattern Forceps Fine Science Tools 91100-12 Dissection Tool
Stereo dissection microscope Swift M29TZ-SM99CL-BTW1 Dissection Tool
Surgical Scissors Fine Science Tools 91401-10 Dissection Tool
Transfer Pipets Corning 357575 Laboratory Supplies
TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody BioLegend 101319 Flow Cytometry Antibody
Trypan Blue Sigma T8154-100ML Tissue Culture Supplies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. What is immune privilege (not). Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).
  2. Morimoto, K., Nakajima, K. Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System. Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).
  3. Klein, R. S., et al. Neuroinflammation During RNA Viral Infections. Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).
  4. Janeway, C. A. The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation. Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).
  5. Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).
  6. Donaldson, J. G., Williams, D. B. Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules. Traffic. 10 (12), Copenhagen, Denmark. 1745-1752 (2009).
  7. Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. T cell-mediated cytotoxicity. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).
  8. Guidotti, L. G., Chisari, F. V. Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response. Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).
  9. Chevalier, G., et al. Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection. PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).
  10. Shrestha, B., Diamond, M. S. Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection. Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).
  11. Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells. Virology. 449, 235-243 (2014).
  12. Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection. Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).
  13. Shatz, C. J. MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity. Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).
  14. Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity. Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).
  15. Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).
  16. Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).
  17. Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex. Science. 313 (5794), New York, N.Y. 1795-1800 (2006).
  18. Atwal, J. K., et al. PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration. Science. 322 (5903), New York, N.Y. 967-970 (2008).
  19. Takai, T. Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition. Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).
  20. Lee, H., et al. Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db. Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).
  21. Ribic, A., et al. Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey. Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).
  22. Sahu, M. P., Nikkilä, O., Lågas, S., Kolehmainen, S., Castrén, E. Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex. Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).
  23. Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 1-8 (2013).
  24. Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).
  25. Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease. Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).
  26. Ho, H., et al. A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).
  27. Panchision, D. M., et al. Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  28. Snaidero, N., Simons, M. Myelination at a glance. Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).
  29. Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).
  30. Lv, D., et al. Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling. PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).
  31. Barco, A., et al. Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture. Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).
  32. Glynn, M. W., et al. MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections. Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).
  33. Facci, L., Skaper, S. D. Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons. Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 159 מצגת אנטיגן ציטומטריית זרימה היפוקמפוס סוג מורכב היסטו-תאימות גדול I מיקרו-דיסקציה נוירואימונית נוירונים ראשוניים
הערכת הביטוי של קומפלקס היסטו-תאימות גדול מחלקה I על נוירונים היפוקמפוס מורין ראשי על ידי Cytometry זרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Funk, K. E., Lotz, S. K. Assessing… More

Funk, K. E., Lotz, S. K. Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (159), e61436, doi:10.3791/61436 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter