Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שכפול של מבנה משטח שורש באמצעות שינוי של ליתוגרפיה רכה

Published: August 5, 2020 doi: 10.3791/61437
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Institute of Plant Sciences, Agricultural Research Organization (Volcani Center), 2Agro-NanoTechnology and Advanced Materials Center, Agricultural Research Organization (Volcani Center)

Summary

ביואימטיקה שימש בעבר ככלי לחקר אינטראקציות העלה-מיקרואורגניזם. עם זאת, לא קיים כלי כזה עבור שורשים. כאן, אנו מפתחים פרוטוקול כדי ליצור משטחים סינתטיים מחקה מיקרומבנה שורש פני השטח לחקר אינטראקציות סביבה שורש.

Abstract

ביומיוטיקה הוא השימוש בכימיה ובמדעי החומרים לחיקוי מערכות ביולוגיות, במיוחד למבנים ביולוגיים, לאנושות טובה יותר. לאחרונה, משטחי ביואידיי מחקות את המיקרומבנה של משטח העלה, שימשו כדי ללמוד את ההשפעות של המיקרו מבנה העלה על אינטראקציות העלה-סביבה. עם זאת, לא קיים כלי כזה עבור שורשים. פיתחנו כלי המאפשר את החיקוי הסינתטי של המיקרו מבנה השורש לתוך משטח מלאכותי. הסתמנו על שיטת הליטוגרפיה הרך, הידועה בשכפול מבני משטח עלה, בתהליך של שני שלבים. הצעד הראשון הוא אחד מאתגר יותר כפי שהוא כרוך הרקמה הביולוגית. כאן, השתמשנו פולימר שונים וריפוי אסטרטגיה, הסתמכות על חזק, נוקשה, פוליאוריטן, נרפא על ידי UV עבור דפוס השורש. הדבר איפשר לנו להשיג תמונה שלילית אמינה של מבנה שורש פני השטח כולל תכונות עדינות, מאתגרת כגון שערות שורש. לאחר מכן השתמשנו בתמונה זו שלילית כתבנית כדי להשיג את שכפול מבנה המשטח השורש באמצעות היטב מבוסס polydimethyl תיל siloxane (PDMS), כמו גם נגזרת תאית, אתיל תאית, אשר מייצגת חיקוי קרוב יותר של השורש, אשר יכול גם להיות מושפל על ידי אנזימים צלוליטיס מופרש על ידי מיקרואורגניזמים. פלטפורמה זו הוקמה לאחרונה ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעות המיקרוקונסטרוקטיבית של פני השטח באינטראקציות שורש מיקרואורגניזם באופן דומה למה שהוצג בעבר עלים. בנוסף, המערכת מאפשרת לנו לעקוב אחר מיקומי המיקרואורגניזם, ביחס לתכונות המשטח, ובעתיד פעילותה, בצורה של הפרשה תאית.

Introduction

שכפול של משטח עלה המבנה הוא שיטה ידועה בתחום המחקר ביומטיקה1,2,3,4. שכפולים המוקדמים ביותר של מבנה המשטח של העלה בוצעו באמצעות מסמר וחומרים גומי מוחל על משטח העלה להדמיה טובה יותר של microstructure בנה, במיוחד סטואטה5,6,7,8,9,10. השיטה השתפרה לאחר מכן, ופולימרים מתקדמים שימשו לחיקוי מבנה המשטח של העלה באמצעות ליתוגרפיה רכה, במיוחד בהקשר של ביומטיקה של משטחי סופר הידרופובי2,3,4,11,12. בשנים האחרונות, שיטה זו הוכחה ככלי שימושי בחקר האינטראקציה בין משטח העלה לבין מיקרואורגניזמים המתגוררים על פני השטח בין אם הם בעלי כפתוגניים13,14 או מועיל, כחלק מהצומח הטבעי של העלה15. פישוט של המערכת הטבעית הוכח שימושי מאוד בחקר אינטראקציות מיקרואורגניזם בפני השטח גם כאשר מערכות סינתטי גרידא שימשו משטחים15,16,17,18.

בעוד שכפול של משטח עלה מבנה הוכח היה כלי שימושי עבור לימוד האינטראקציה המתרחשת על פני השטח של העלה עם מיקרואורגניזמים שונים, לא קיים כלי כזה עבור שורשי הצמח. שורשי הצומח קשים יותר ללמידה מאחר שהם נמצאים מתחת לקרקע וכל האינטראקציות מתרחשות בתוך האדמה. דומה עלים, מבנה משטח השורש עשוי לשחק תפקיד ב שורש מיקרואורגניזם אינטראקציות. עם זאת, כרגע אין שיטה לבודד את התפקיד הספציפי של מבנה מיקרופני השטח השורש באינטראקציות השורש המורכבות של מיקרואורגניזם. התכונה מיקרוקונסטרוקטיבית שורש השטח הנלמד ביותר הוא שערות השורש19,20,21. שערות השורש יש תפקיד חשוב בהגדלת שטח פני השטח ועל ידי המאפשר צריכת יעיל יותר של חומרים מזינים ומים22, אולם מעורבות שלהם כתכונה מבנית באינטראקציות שורש מיקרואורגניזם מעולם לא נבדקו.

פולימר הנפוץ ביותר עבור ליתוגרפיה רכה בעלים הוא פולידימתיל siloxane (PDMS). מאפייני pdms דומים לאלה של הקוטיקולה העלה15,23. עם זאת, ב שורשי הצמח, החומר הנפוץ ביותר הוא תאית24,25 אשר יש מאפיינים שונים מאלה של pdms26,27,28. שימוש ב-PDMS לבניית פלטפורמה סינתטית לחקר ההשפעות של מבנה הפני שטח באינטראקציות בסביבה השורש הוא, ולכן, פחות אידיאלי.

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר היווצרות של העתק השורש סינתטי מבנה המשטח מחומרים שונים. כמו השיטה לשכפול מבנה המשטח עלה זהו תהליך בן שני שלבים. הצעד הראשון משתמש ברקמה הביולוגית (השורש) כמקור ליציקה לתבנית פוליאוריטן (עותק שלילי). עובש פוליאוריטן, אשר מייצג את התמונה השלילית של המיקרו מבנה השורש, לאחר מכן ניתן להשתמש כבסיס כדי ליצור את השכפול החיובי של מבנה פני השטח השורש מתוך מגוון של חומרים, כולל PDMS, ונגזרות תאית. ניתן להשתמש בשכפול משטח שורש זה כפלטפורמה כדי להבין את תפקיד מבנה פני השטח באינטראקציות של מיקרואורגניזם בשורש.

Protocol

1. גידול הצמחים והכנת השורש

  1. אופציה 1: הכינו שורשים אדוורקית מגבעול.
    1. לקחת מגש השתרשות עבור צמחים צומחים.
    2. ממלאים את המגש באדמה.
    3. הוסיפו זרע אחד מזנים M82 עגבניות לכל תא במגש.
    4. כסו את הזרעים באדמה קטנה.
    5. המים מגש מלמטה עם טפטפת כמו המים ממלא את החלק התחתון של המגש ואת הקרקע סופג מים.
    6. הוסף 2 מ ל של דשן לכל 1 ליטר של מים עד לתחתית המגש פעם בשבוע.
    7. גדלים בחדר הגדל ב -25 ° c.
    8. השתמש בתנאי תאורה של 9 h אור (7:00-16:00) לסירוגין עם 15 שעות של חושך.
    9. לאחר 3 שבועות להסיר את הצמח מן הקרקע.
    10. חותכים את מערכת השורש מהמפעל בנקודת האינטראקציה עם הגבעול.
    11. שים את הצמח חסר שורשים. בגביע מלא במים
    12. לאחר מספר ימים, חותכים את השורשים האדוורקית היוצאים מן הגבעול ומשתמשים בהם לשכפול.
  2. אופציה 2: הכנת שורשי זרעים מונסת.
    1. מסנן בגודל של צלחת פטרי עם מים.
    2. שים כמה זרעים M82 (לא יותר מ 10) על הנייר, בתוך צלחת פטרי.
    3. מודקת את הצלחת ב -25 ° c.
    4. . מימה את העיתון כל יום
    5. לאחר שורשים מונבטים ארוכים מספיק (כ 5 ימים), להסיר את הזרעים ולהשתמש בשורשים עבור השכפול.

2. הכנת העותק המשוכפל השלילי השורש מפוליאורטן

  1. כדי ליצור פתרון עותק משוכפל שלילי, הוסף 9.49 גרם של משתנות dimethacrylate ל 20 מ ל בקבוקון.
    1. תוסיף 1.45 מ ל. של אתיל-מתיאקריל לבקבוקון
    2. לערבב בטמפרטורת החדר (RT) עד הפתרון נראה ברור והופך הומוגנית.
      הערה: כ-2 כ ח מספיק כדי להגיע לפתרון הומוגנית.
    3. הוסיפו 3 מ ל של הפלסטיות, דיאתיל פלות'אט, ומערבבים 1 h ב RT.
      הערה: דיאתיל פתלאט מmiscible במונומר אקרילי.
    4. להוסיף 300 μL של יוזם התמונה, 2-הידרוxy-2-methylpropiophenone, ומערבבים לילה ב RT. המשך לערבב עד כל בועות יוסרו.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. הפתרון ניתן לשמור ב-RT.
  2. כדי ליצור העתק שלילי של השורש, לקחת שקופית זכוכית נקייה ויוצקים 1 מ ל של הפתרון המשוכפל השלילי על זה.
    1. מקום 2 \ u20123 שורשים על הפתרון. אל תאפשר לשורשים להיות מכוסים באופן מלא על ידי הפתרון.
    2. שמור את השקופית תחת 8 W אולטרה סגול (UV) מנורה עבור 8 \ u201210 min. אין לשמור על הפתרון תחת אור UV במשך זמן רב מדי.
      הערה: חשוב לא לשמור על הפתרון תחת אור UV במשך זמן רב מדי, מאחר שהוא הופך את הפוליאורטן לקשה מדי, כך שאין אפשרות להסיר את השורש.
    3. כבה את מנורת UV, להסיר את ההעתק מן השקופית זכוכית ולשים אותו בצלחת פטרי מלא אתנול, כדי להסיר מונומר הגיב.
    4. כדי להשיג את העותק המשוכפל השלילי, להסיר את השורש משוכפל לאט מאוד באמצעות מלקחיים.

3. הכן את ההעתק החיובי הבסיסי מ-PDMS.

  1. כדי ליצור את התערובת עבור העותק המשוכפל החיובי, במקום 10 גרם של דימתיל siloxane בספל נייר.
    1. הוסף 1 g של ריפוי סוכן ומערבבים ביסודיות.
    2. לשמור את התערובת desiccator תחת ואקום עבור 2 h כדי להסיר בועות אוויר.
  2. כדי ליצור את העותק המשוכפל החיובי, הציבו את העותק המשוכפל השלילי בצלחת פטרי.
    1. יוצקים את התערובת PDMS על גבי העותק המשוכפל השלילי.
    2. החלת ואקום עבור 2 h כדי להבטיח כיסוי של המיקרו מבנה.
    3. שמור את צלחת הפטרי ללילה בשעה RT.
    4. הפרד את העותק המשוכפל החיובי הנרפא מההעתק השלילי ביד.

4. להכין את העתק חיובי השורש מן אתיל תאית.

  1. כדי ליצור את הפתרון אתיל תאית, לשים 1.32 ml של דיאתיל pthalate כמו פלסטלינה בגביע 100 ml.
    1. הוסף 20 מ ל אתנול ומערבבים ב RT עבור 2 h.
    2. הוסף 3.3 g של אתיל תאית ומערבבים בן לילה.
  2. כדי ליצור את העותק המשוכפל החיובי, הציבו את העותק המשוכפל השלילי בצלחת פטרי.
    1. יוצקים את הפתרון אתיל תאית על גבי העותק המשוכפל השלילי.
    2. שמור את צלחת הפטרי בלילה. בשעה מתחת למכסה המנוע
    3. הסר את העותק המשוכפל החיובי משוכפל שלילי לאט מאוד על ידי מלקחיים.

Representative Results

כדי ליצור את שכפול מבנה המיקרו של משטח השורש, יש לבחור בסיס לדפוס. אנחנו מגדלים צמחי עגבניות באדמה, מה שהופך את השימוש בשורש הטבעי ממערכת השורש מאתגר מאוד. הסרת אדמה ממערכת השורש יכול להיות קשה ובנוסף, שורשי מערכת השורש הם שבירים והוא יכול לשבור את הניסיונות מבעד לדפוס. לפיכך, אנו ממליצים להשתמש תחילה בשורשים נוקשים יותר, כדי לבסס את הפרוטוקול במעבדה. היווצרות שורשים כאלה מתואר באיור 1A. מערכת השורש של הצמח מוסרת לאחר שהמפעל גדל במשך 3 שבועות, הצמח חסר שורשים ממוקם במים במשך כשבוע עד שורשים האדוקית להגיח מן הגבעול. ניתן להשתמש בשורשים אלה לשכפול במהלך מוסד הפרוטוקולים. לאחר הפרוטוקול הוקמה היטב, מבנה פני שטח שורש מציאותי יותר רצוי. כאן אנו מציעים הימנעות שורשים גדל באדמה כהסרה מלאה של הקרקע מאתגרת מאוד. במקום זאת אנו מציעים את השימוש של שורשי מונגטינג, אספקת מידע יקר על המבנה השורש של המשטח של צמח ספציפי גנטית. התפתחותם של שורשים כאלה מתוארת באיור 1B. הזרעים מונחים על נייר מסנן רטוב ומודחים ב -25 ° c. לאחר כ 5 ימים, שבמהלכו נייר הסינון נשמר לח, השורשים מונבטים מספיק זמן לשכפול. השורשים האלה שבירים יותר מאשר השורשים שהוצעו בעבר ודורשים טיפול עדין יותר.

הייצור של העותק המשוכפל של מבנה שורש פני השטח הוא תהליך של שני שלבים. בשלב הראשון השורש הטבעי הוא להיות יצוק עובש פוליאוריטן מבוסס (העותק השלילי). היתרון של שלב זה הוא כי כל החומרים של עובש פוליאוריטן הם להיות מוכנים השורש ממוקם על גבי הפתרון המוכן בסוף מאוד לחשיפה של 10 דקות UV. כתוצאה מכך, הרקמה הביולוגית אינה נחשפת לתנאים קשים במשך זמן רב מדי וניתן לטפל בעדינות בסוף התהליך. אם מעקב אחר כל שלבי הפרוטוקול, נוצרת העתק שלילי טוב. עותק משוכפל זה יציג את מבנה התא של משטח השורש, כמו גם חורים המייצגים את המיקום של שערות השורש (איור 2A). אם לא עוקבים אחר חלק מהשלבים הקריטיים בפרוטוקול, השגרה תיכשל. צעד אחד כזה הוא המיקום של השורש על הפתרון פוליאוריטן לפני הריפוי. השורש חייב להיות ממוקם בעדינות מאוד כדי למנוע את התחתית של אותו בתמיסה פוליאוריטן. שבירה כזאת, של כל חלק של השורש, יגרום מלכודת של השורש של פולימר קשה ללא יכולת להסיר אותו. אם מתרחש אירוע כזה, השורש יישאר בתוך העותק המשוכפל השלילי לאחר שהוא נרפא (איור 2B). צעד מכריע נוסף הוא לגבי זמן הריפוי של אור UV. זמן הריפוי המומלץ הוא 8 \ u201210 min. הולך בעבר 10 דקות תגרום עובש פוליאוריטן קשה מאוד, מה שהופך את זה בלתי אפשרי להסיר את השורש מבלי לשבור אותו בתוך עובש פוליאוריטן. השבר של השורש יכול לפעמים להיות גלוי לעין בלתי, לדוגמה, כאשר חתיכה גדולה מקולקלת (איור 2C, למעלה, מסומן בחצים סגולים). עם זאת, לפעמים פיסות השורש הקטנות נותרו בחומר שקשה לזהות בעין בלתי ומיקרוסקופ יש להשתמש (איור 2C, למטה, מסומן עם חצים סגולים). אנו ממליצים לבחון בקפידה את ההעתק השלילי של הפוליאורטן עם מיקרוסקופ לפני המשכו של הפרוטוקול כדי לוודא שלא קיים שורש שרידי.

ברגע שעותק משוכפל שלילי פוליאוריטן מוכן; ניתן להשתמש בחומרים רבים להכנת העותק המשוכפל החיובי. הכנת העותק המשוכפל החיובי, באמצעות העתק שלילי פוליאוריטן כתבנית, הוא ישר קדימה תלוי לחלוטין על איכות העותק המשוכפל שלילי פוליאוריטן. כדי ליצור את העותק המשוכפל החיובי השתמשנו בשני PDMS-כפי שהוא ידוע היטב בתחום של ליתוגרפיה רכה (איור 3A)-ו אתיל תאית כחומר מחקה טוב יותר את המאפיינים של משטח השורש אשר מורכב בעיקר של תאית (איור 3a). תמונת ה-SEM של עותק משוכפל PDMS מציגה את שערות השורש באופן ברור מאוד. , השערות נמצאות באזור התארכות. שם הן מתחילות לצוץ מכאן, אורך השערות השורש משתנה לאורך משטח השורש כפי שהם הופכים ארוכים יותר, כמו בשורש הטבעי (איור 3A). אתיל תאית מייצרת סרט קשה וגמיש פחות PDMS. מכאן, הסרת אותו מן העובש השלילי דורש טיפול נוסף. עם זאת, כמה שערות ומבנה המיקרו משטח גלויים מתחת למיקרוסקופ האור (איור 3B). השתמשנו שני חומרים אלה כדי ליצור את העותק המשוכפל החיובי, עם זאת, כל חומר שיכול ליצור סרט יהיה מועמד טוב עבור העתק חיובי, באמצעות העתק שלילי פוליאוריטן.

Figure 1
איור 1: שורשי צמחי העגבניה לשכפול. (A) צמח עגבנייה (M82) גדל ב -25 ° c עם 9 מעלות של אור ו 15 h החושך. לאחר 3 שבועות, המפעל מוסר מהקרקע ומערכת השורש נחתך. המפעל מושם במים עד ששורשים האדויים מגיחים מגבעול אחרי כשבוע. שורשים אלה אינם מראים את המבנה המדויק כשורשים ממערכת השורש, אך הם מייצגים מודל טוב. שורשים אלה הם פחות שבירים מאשר שורשי מערכת השורש ולכן הם העדיפו לעבוד עם בעת הקמת הטכניקה במעבדה. (ב) הזרעים (ב) עגבניות (M82) מכניסים נייר מסנן רטוב בצלחת פטרי ומודגרת ב -25 ° c. הנייר רטוב מדי יום והזרעים מונהים. השורשים גדלים ואחרי כ 5 ימים הם מספיק זמן כדי לשמש לשכפול. שורשים אלה הם עדין ויש להשתמש בהם לאחר השיטה היא מבוססת היטב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תמונות מיקרוסקופית של העתק שלילי פוליאוריטן. (A) SEM תמונה של העתק שלילי פוליאוריטן שנעשו על פי פרוטוקול לאחר כל השלבים. . מבנה התא נראה בבירור חיצים צהובים להצביע על חורים שנוצרו על ידי השערות בשורש. (ב) מיקרוסקופ אור תמונות של העתק שלילי פוליאוריטן עם שורש בתוכו כפי שהיה מכוסה לחלוטין עם הפתרון והסרת אותו היה בלתי אפשרי. הפוליאורטן השלילי נרפא. עם השורש שבפנים השורש גלוי על ידי עין ושימוש במיקרוסקופ אור. זה בלתי אפשרי להסיר את השורש מן העותק המשוכפל נרפא. (ג) תמונות מיקרוסקופית אור של העתק שלילי פוליאוריטן שנשמר תחת אור UV במשך זמן רב מדי. כתוצאה מכך, השורש לא יכול להיות מוסר במלואו מן הפולימר עם חלקיקים גדולים לעין (התמונה העליונה, מסומן עם חיצים סגולים) או שברים קטנים גלוי רק על ידי מיקרוסקופ (התמונה התחתונה, מסומן עם חיצים סגולים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: תמונות מיקרוסקופ של העתק חיובי. (A) SEM יקרוגפיה של עותק משוכפל חיובי עשוי pdms. ההרחבה מראה שערות שורש. (ב) מיקרוסקופ אור תמונות של עותק משוכפל חיובי עשוי אתיל תאית. שערות מוצגות בתמונות בצד ימין בזמן שמרקם המשטח גלוי בתמונה שמשמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

אנו מציגים שיטה הרומן עבור השכפול של מבנה המיקרוקציה של משטח השורש. שיטה זו נשענת על שיטות קיימות של שכפול מבנה המשטח של העלה4. על מנת לפתח שיטה זו, היינו צריכים לכוונן את השיטה הקיימת לעלים. הבנו שהצעד הבעייתי בהעתקת שיטת שכפול העלים לשורשים כרוך בשלב הראשון של עיצוב השורש. זהו החלק הרגיש ביותר של השיטה כפי שהיא מערבת את הרקמה הביולוגית. כתוצאה מכך, רצינו לבחור פולימר כי ידרוש תנאים עדינים יחסית לריפוי ומכאן גרימת נזק מינימלי לרקמות הביולוגי. בחרנו בפוליאורטן משום שהוא יכול להיות מהיר במהירות (בתוך 10 דקות) תחת אור UV29. בנוסף, זה קשה מאוד פעם אחת הפילמור30 וקיווינו כי מאפיין זה יאפשר הסרה קלה יחסית של השורש מן העובש פוליאוריטן.

השיטה המוצגת היא גישה דו-step שבה התמונה השלילית (עותק משוכפל שלילי) נוצרת בשלב הראשון והשכפול נוצר בשלב השני, בהתבסס על העותק המשוכפל השלילי. זה מרחיב את מגוון החומרים שאנחנו יכולים לעבוד איתם. שכפול מבנה המשטח של העלה בוצע בעיקר ב-pdms או בחומרי אפוקסי11,31. עבודה מסוימת נעשתה עם חומרים אחרים, במיוחד חומרים התומכים גידול מיקרואורגניזם13,32. הסיבה לכך היא בשנים האחרונות שיטה זו שימש לחקר אינטראקציות מיקרואורגניזם במשטח בהקשר של מבנה פני השטח עלה. עם זאת, אין חומרים תאית כמו שימשו בשיטה זו בהקשר של עלים. אנו מציעים את השימוש בעותק משוכפל שלילי פוליאוריטן כתבנית ומגוון של חומרים עבור עותק משוכפל חיובי. במילים אחרות, ביצוע העתק חיובי, מתוך מגוון של חומרים, הוא קל יחסית פעם העתק שלילי טוב הוא עשה. אנו כרגע משתמשים נגזרות תאית, אבל הם בוחנים את האפשרויות של שימוש בחומרים רלוונטיים יותר למשטח השורש כגון פקטין ו ליגנין33,34 בשילוב עם נגזרות תאית.

השיטה גם מתרחבת על השיטה הקיימת של שכפול מבנה משטח העלה מאז העלה הוא משטח דו-ממדי בעוד משטח השורש הוא מעוקל ולכן הוא משטח 3D. השיטה שלנו אינה מאפשרת את השכפול של המשטח כולו מאז הטבעה של שורש שלם בתמיסה הפוליאורתן אינה מאפשרת את שחרורו. לכן יש לבחור צד אחד של השורש בעת שכפול מבנה המיקרו של משטח השורש. המשטח הסינתטי שנוצר מעוקל ומייצג בערך חצי מהמשטח, אך לא את כולו. ההנחה שלנו היא כי התכונות המבבניות של משטח השורש הם סימטריים בעיקר על הציר לאורך השורש. עם זאת, במחקרים שבהם סימטריה כזאת אינה מניחה, יש להקפיד לבחור את השורש הצדדי המתאים לשכפול.

אנו מציגים שתי אפשרויות שורשים לשמש כתבניות. הראשונה היא האפשרות של שורשים האדוניות גדל מן הגבעול והשני הוא אופציה של שורשים מונבטים על נייר. האפשרות הראשונה נועדה בעיקר לסייע לחוקרים לתרגל את השיטה כמו שורשים אלה הם חזקים יותר וקל יותר לעבוד עם. האפשרות השנייה מייצגת את ההבדלים הגנטיים שניתן למצוא בין שורשי זנים שונים, ללא קשר לתנאי הסביבה. משטחים אלה יכולים לשמש ככלי מחקר חשוב, עם זאת, יש לדעת כי הסביבה יכולה להיות השפעה חזקה על מבנה פני השטח השורש, במיוחד את הקרקע שבה השורשים גדלים35,36. בשל הלחץ המכני שנגרם על ידי הקרקע, כמה שינויים מורפולוגיים מחויבים לקרות, בנוסף לפצעים המצטברת על פני השטח כשורש חודר לקרקע37. הסרת שורשים מקרקע, כמו גם ניקוי אותם, מבלי לפגוע במבנה שלהם היא משימה קשה מאוד. מכאן, אנחנו לא אופטימי כמו היכולת להשתמש בשיטה זו כדי לחקות באופן אמין את מבנה השורש של פני השטח של שורשים גדל באדמה. עם זאת, עבור מחקר המתמקד הבדלים גנטיים או הבדלים סביבתיים שבו השינוי במבנה מיקרו הוא ברור באופן ניכר, שיטה זו יכולה לשמש ככלי כדי ללמוד את ההשפעה של מיקרומבנה המשטח השורש.

השיטה שלנו מייצרת מחקה משטח אדיש של המאפיינים המיקרוקונסטרוקטיבי של משטח השורש בלבד. למרות ששיטה זו מיועדת להפריד בין ההשפעות המבבניות באינטראקציות של סביבת השורש מכל ההשפעות האחרות, אין באפשרותך להתעלם מהתרכובות הכימיות באינטראקציות אלה. מיקרואורגניזמים מסוימים עשויים לא לשרוד או לתפקד על פני השטח ללא תוספת של תרכובות, במיוחד חומרים מזינים. השלב הבא בפיתוח פלטפורמה זו יהיה התוספת הנשלטת של תרכובות כימיות כדי ללמוד את ההשפעות שלהם על האינטראקציות השונות בשילוב עם המבנה.

שיטה זו פותחה כצעד ראשון בפיתוח של פלטפורמה סינתטית כדי ללמוד אינטראקציות שורש מיקרואורגניזם. כאן אנו לחקות את המיקרומבנה של משטח השורש ואת הפלטפורמה הראשונית הזאת ניתן להשתמש כדי ללמוד את ההשפעה של מיקרו מבנה פני השטח על התנהגות מיקרואורגניזם. עם זאת, פלטפורמה זו מוגבלת, שכן הוא חסר אלמנטים רבים אחרים מהמערכת הטבעית. פלטפורמה זו צריכה להיות מפותחת יותר עם שימוש בחומרים הנכונים כדי ליצור את פני השטח עם תוספת של אחרים, קריטי, כימיקלים למערכת. בפלטפורמה מתקדמת יותר, אנו יכולים גם לדמיין התפלגות מרחבית של הכימיקלים. עם זאת, מכיוון שכרגע אין שיטה אחרת לבידוד השפעות מבניות באינטראקציות השורש, אנו מקווים שחוקרים יוכלו להשתמש בפלטפורמה ראשונית זו כדי לשאול שאלות ספציפיות למבנה באינטראקציות אלה.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי קרנות זרע מארגון המחקר החקלאי ל-MK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-hydroxy-2-methylpropiophenone Sigma 405655
Diethyl phthalate Across 114520010
Diurethane dimetharylate Sigma 436909
Ethyl cellulose Across 232705000
Ethyl methacrylate Sigma 234893
Shaphir Solution GAT fertilizer 6-2-4
Sylgard 184 kit Polymer-G 510018400500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhushan, B., Jung, Y. C., Niemietz, A., Koch, K. Lotus-Like Biomimetic Hierarchical Structures Developed by the Self-Assembly of Tubular Plant Waxes. Langmuir. 25, 1659-1666 (2009).
  2. Koch, K., Barthlott, W. Superhydrophobic and superhydrophilic plant surfaces: an inspiration for biomimetic materials. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 367, 1487-1509 (2009).
  3. Schulte, A. J., Koch, K., Spaeth, M., Barthlott, W. Biomimetic replicas: Transfer of complex architectures with different optical properties from plant surfaces onto technical materials. Acta Biomaterialia. 5, 1848-1854 (2009).
  4. Koch, K., Schulte, A., Fischer, A., Gorb, S., Barthlott, W. A fast, precise and low-cost replication technique for nano- and high-aspect-ratio structures of biological and artificial surfacese. Bioinspiration & Biomimetics. 3, 046002 (2008).
  5. Weyers, J. D. B., Johansen, L. G. Accurate Estimation of Stomatal Aperture From Silicone Rubber Impressions. New Phytology. 101, 109-115 (1985).
  6. Hilu, K. W., Randall, J. L. Convenient Method for Studying Grass Leaf Epidermis. Taxon. 33, 413-415 (1984).
  7. Sampson, J. A. Method of replicating Dry or Moist Surfaces for Examination by Light. Nature. 191, 932-933 (1961).
  8. Weyers, J. B. D., Travis, A. J. Selection and Preparation of Leaf Epidermis for Experiments on Stomatal Physiology. Journal of experimental botany. 32, 837-850 (1981).
  9. Groot, J. The Use of Silicone Rubber Plastic for Replicating Leaf Surfaces. Acta Botanica. Neerlandica. 18, 703-708 (1969).
  10. Wu, S., Zhao, B. Using Clear Nail Polish to Make Arabidopsis Epidermal Impressions for Measuring the Change of Stomatal Aperture Size in Immune Response. Plant Pattern Recognition Receptors. , 243-248 (2017).
  11. Wu, W., Guijt, R., Silina, Y., Koch, M., Manz, A. Plant leaves as templates for soft lithography. RSC Advances. 6, 22469-22475 (2016).
  12. Barthlott, W., Mail, M., Bhushan, B., Koch, K. Plant Surfaces: Structures and Functions for Biomimetic Innovations. Nano-Micro Letters. 9, 23 (2017).
  13. Zhang, B., et al. Fabrication of biomimetically patterned surfaces and their application to probing plant-bacteria interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 6, 12467-12478 (2014).
  14. Szyndler, M. W., Haynes, K. F., Potter, M. F., Corn, R. M., Loudon, C. Entrapment of bed bugs by leaf trichomes inspires microfabrication of biomimetic surfaces. Journal of the Royal Society Interface. 10, 20130174 (2013).
  15. Doan, H. K., Leveau, J. H. J. Artificial Surfaces in Phyllosphere Microbiology. Phytopathology. 105, 1036-1042 (2015).
  16. Chung, K. K., et al. Impact of engineered surface microtopography on biofilm formation of Staphylococcus aureus. Biointerphases. 2, 89-94 (2007).
  17. Sirinutsomboon, B., Delwiche, M. J., Young, G. M. Attachment of Escherichia coli on plant surface structures built by microfabrication. Biosystems Engineering. 108, 244-252 (2011).
  18. Bhattacharjee, A., Khan, M., Kleiman, M., Hochbaum, A. I. Effects of Growth Surface Topography on Bacterial Signaling in Coculture Biofilms. ACS Applied Materials and Interfaces. 9, 18531-18539 (2017).
  19. Measuring roots: an updated approach. Mancuso, S. , Springer Science & Business Media. (2011).
  20. Schneider, K., Wells, B., Dolan, L., Roberts, K. Structural and genetic analysis of epidermal cell differentiation in Arabidopsis primary roots. Development. 1798, 1789-1798 (1997).
  21. Dolan, L., et al. Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis. Development. 2474, 2465-2474 (1994).
  22. Leitner, D., et al. A dynamic model of nutrient uptake by root hairs. New Phytology. 185, 792-802 (2010).
  23. Soffe, R., Bernach, M., Remus-emsermann, M. N. P., Nock, V. Replicating Arabidopsis Model Leaf Surfaces for Phyllosphere Microbiology. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  24. Sorieul, M., Dickson, A., Hill, S. J., Pearson, H. Plant fibre: Molecular structure and biomechanical properties, of a complex living material, influencing its deconstruction towards a biobased composite. Materials. 9, 618 (2016).
  25. Gibson, L. J. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9, 2749-2766 (2012).
  26. Poletto, M., Pistor, V., Zattera, A. J. Structural characteristics and thermal properties of native cellulose. Cellulose-fundamental aspects. , 45-68 (2013).
  27. Moon, R. J., Martini, A., Nairn, J. A., Simonsen, J., Youngblood, J. Cellulose Nanomaterials Review: Structure, Properties. Chemical Society Reviews. 40, 3941-3994 (2011).
  28. Johnston, I., McCluskey, D., Tan, C., Tracey, M. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, 035017 (2014).
  29. Yan-yan, W., Ying-wu, L., Bao-fang, L., Bo-geng, L. Water-soluble UV curable urethane methyl acrylate coating: preparation and properties. Journal of Zhejiang University-SCIENCE A. 5, 906-911 (2004).
  30. Bao, L., Huang, Y. Synthesis and Properties of UV Curable Waterborne Polyurethane Acrylate Based on Modified Castor Oil. The pharmaceutical and chemical journal. 4, 34-40 (2017).
  31. Sharma, V., Orejon, D., Takata, Y., Krishnan, V., Harish, S. Gladiolus dalenii Based Bioinspired Structured Surface via Soft Lithography and Its Application in Water Vapor Condensation and Fog Harvesting. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 6, 6981-6993 (2018).
  32. Soffe, R., Altenhuber, N., Bernach, M., Remus-Emsermann, M. N. P., Nock, V. Comparison of replica leaf surface materials for phyllosphere microbiology. PloS one. 14, 1-19 (2019).
  33. Whitehead, D. C., Buchan, H., Hartlay, R. D. Composition and decomposition of roots of ryegrass and red clover. Soil Biology and Biochemistry. 11, 619-628 (1979).
  34. Ververis, C., Georghiou, K., Christodoulakis, N., Santas, P., Santas, R. Fiber dimensions, lignin and cellulose content of various plant material and their suitability for paper production. Industrial crops and products. 19, 245-254 (2004).
  35. Croser, C., Bengough, A. G., Pritchard, J. The effect of mechanical impedance on root growth in pea (Pisum sativum). II. Cell expansion and wall rheology during recovery. Physiologia Plantarum. 109, 150-159 (2000).
  36. Lipiec, J., Horn, R., Pietrusiewicz, J., Siczek, A. Effects of soil compaction on root elongation and anatomy of different cereal plant species. Soil and Tillage Research. 121, 74-81 (2012).
  37. Potocka, I., Szymanowska-Pulka, J. Morphological responses of plant roots to mechanical stress. Annals of botany. 122, 711-723 (2018).

Tags

ביו-הנדסה סוגיה 162 שורש משטח מיקרומבנה סינתטי ביואיטיקה אינטראקציה
שכפול של מבנה משטח שורש באמצעות שינוי של ליתוגרפיה רכה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kumari, P., Sayas, T., Kleiman, M.… More

Kumari, P., Sayas, T., Kleiman, M. Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography. J. Vis. Exp. (162), e61437, doi:10.3791/61437 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter