Summary
La biomimética se ha utilizado anteriormente como una herramienta para estudiar las interacciones hoja-microorganismo. Sin embargo, no existe tal herramienta para las raíces. Aquí, desarrollamos un protocolo para formar superficies sintéticas imitando la microestructura de la superficie de la raíz para el estudio de las interacciones entre la raíz y el entorno.
Abstract
La biomimética es el uso de la química y las ciencias materiales para imitar los sistemas biológicos, específicamente las estructuras biológicas, para mejorar la humanidad. Recientemente, las superficies biomiméticas imitando la microestructura de la superficie de la hoja, se utilizaron para estudiar los efectos de la microestructura de las hojas en las interacciones hoja-entorno. Sin embargo, no existe tal herramienta para las raíces. Desarrollamos una herramienta que permite el mimetismo sintético de la microestructura de la superficie de la raíz en una superficie artificial. Nos basamos en el método de litografía suave, conocido por la replicación de microestructuras de superficie de hoja, utilizando un proceso de dos pasos. El primer paso es el más desafiante, ya que involucra el tejido biológico. Aquí, utilizamos un polímero diferente y estrategia de curado, confiando en el poliuretano fuerte, rígido, curado por UV para el moldeo de raíz. Esto nos permitió lograr una imagen negativa confiable de la microestructura de la superficie de la raíz, incluyendo las características delicadas y desafiantes como los vellos de raíz. Luego usamos esta imagen negativa como plantilla para lograr la replicación de la microestructura de la superficie raíz utilizando tanto el bien establecido polidimetil siloxano (PDMS) como un derivado de celulosa, celulosa etílica, que representa una imitación más cercana de la raíz y que también puede ser degradado por enzimas de celulasa secretadas por microorganismos. Esta plataforma recién formada se puede utilizar para estudiar los efectos microestructurales de la superficie en las interacciones de raíz-microorganismo de una manera similar a lo que se ha demostrado previamente en las hojas. Además, el sistema nos permite rastrear las ubicaciones del microorganismo, en relación con las características de la superficie, y en el futuro su actividad, en forma de secreción de celulasa.
Introduction
La replicación de la microestructura superficial de la hoja es un método conocido en el campo de investigación biomimético1,2,3,4. Las primeras replicaciones de la microestructura de la superficie de la hoja se realizaron utilizando esmalte de uñas y materiales de caucho aplicados en la superficie de la hoja para una mejor visualización de la microestructura, específicamente estomas5,6,7,8,9,10. El método se mejoró entonces, y se utilizaron polímeros avanzados para imitar la microestructura de la superficie de la hoja utilizando una litografía suave, especialmente en el contexto de la biomimética de superficies súper hidrófobas2,,3,,4,,11,,12. En los últimos años, este método fue probado como una herramienta útil en el estudio de la interacción entre la superficie de la hoja y los microorganismos que residen en la superficie si son patógenos13,,14 o beneficiosos, como parte de la filosfera de hoja natural15. La simplificación del sistema natural se demostró extremadamente útil en el estudio de las interacciones superficie-microorganismo incluso cuando se utilizaron sistemas puramente sintéticos como superficies15,,16,,17,,18.
Si bien se demostró que la replicación de la microestructura superficial de la hoja era una herramienta útil para estudiar la interacción que se produce en la superficie de la hoja con diferentes microorganismos, no existe tal herramienta para las raíces de las plantas. Las raíces de las plantas son más difíciles de estudiar ya que residen bajo el suelo y todas las interacciones ocurren dentro del suelo. Al igual que las hojas, es probable que la microestructura de la superficie radicular desempeñe un papel en las interacciones entre la raíz y el microorganismo. Sin embargo, actualmente no existe ningún método para aislar el papel específico de la microestructura de la superficie de la raíz en las complejas interacciones entre la raíz y el microorganismo. La característica microestructural de la superficie radicular más estudiada son los vellos radiculares19,,20,,21. Los vellos de raíz tienen un papel importante en el aumento de la superficie y al permitir una ingesta más eficiente de nutrientes y agua22,sin embargo su participación como característica estructural en las interacciones entre la raíz y los microorganismos nunca ha sido probada.
El polímero más utilizado para la litografía suave en las hojas es el polidimetil siloxano (PDMS). Las propiedades de PDMS se asemejan a las de la cutícula de hoja15,23. Sin embargo, en raíces vegetales, el material más abundante es la celulosa24,,25 que tiene propiedades diferentes a las de PDMS26,,27,,28. El uso de PDMS para crear una plataforma sintética para estudiar los efectos de la microestructura superficial en las interacciones entre la raíz y el entorno es, por lo tanto, menos que ideal.
El protocolo presentado aquí permite la formación de réplicas de microestructura de superficie de raíz sintética a partir de diversos materiales. Al igual que el método para la replicación de microestructura de superficie de hoja, este es un proceso de dos pasos. El primer paso utiliza el tejido biológico (raíz) como fuente para el moldeo en un molde de poliuretano (una réplica negativa). El molde de poliuretano, que representa la imagen negativa de la microestructura de superficie de raíz, se puede utilizar como base para generar la replicación positiva de la microestructura de la superficie raíz a partir de una variedad de materiales, incluidos PDMS y derivados de la celulosa. Esta replicación de superficie raíz se puede utilizar más adelante como plataforma para comprender el rol de estructura de superficie en las interacciones entre raíz y microorganismo.
Protocol
1. Cultivo de las plantas y preparación de raíces
- Opción 1: Preparar raíces adventicias a partir del tallo.
- Tome una bandeja de enraizamiento para el cultivo de plantas.
- Llene la bandeja con tierra.
- Agregue una semilla de cultivar de tomate M82 a cada célula de la bandeja.
- Cubra las semillas con un poco de tierra.
- Regar la bandeja desde el fondo con un cuentagotas a medida que el agua llena el fondo de la bandeja y el suelo absorbe el agua.
- Añadir 2 ml de fertilizante por 1 L de agua al fondo de la bandeja una vez a la semana.
- Crecer en una cámara de crecimiento a 25oC.
- Utilice condiciones de iluminación de 9 h de luz (7:00-16:00) alternadas con 15 h de oscuridad.
- Después de 3 semanas retirar la planta del suelo.
- Cortar el sistema radicular de la planta en el punto de interacción con el tallo.
- Ponga la planta sin raíces en un vaso lleno de agua.
- Después de unos días, corta las raíces adventicias que emergen del tallo y ústalas para la replicación.
- Opción 2: Preparar raíces germinantes de semillas.
- Humedezca un papel de filtro del tamaño de un plato Petri con agua.
- Ponga varias semillas M82 (no más de 10) en el papel, dentro de un plato de Petri.
- Incubar la placa a 25oC.
- Hidrata el papel todos los días.
- Después de que las raíces germinadas son lo suficientemente largas (aproximadamente 5 días), retire las semillas y use las raíces para la replicación.
2. Preparación de la réplica negativa de raíz a partir de poliuretano
- Para generar una solución de réplica negativa, añada 9,49 g de dimetillato de diuretano a un vial de 20 ml.
- Añadir 1,45 ml de metacrilato etílico al vial.
- Revuelva a temperatura ambiente (RT) hasta que la solución se vea clara y se vuelva homogénea.
NOTA: Aproximadamente 2 h es suficiente para alcanzar una solución homogénea. - Agregue 3 ml del plastificante, el ftalato de dietil y revuelva durante 1 h en RT.
NOTA: El ftalato de dietilo es miscible en monómero de acrilato. - Añadir 300 l del iniciador de la foto, 2-hidroxi-2-metilpropiofenona, y remover durante la noche en RT. Continúe revolviendo hasta que se retiren todas las burbujas.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. La solución se puede mantener en RT.
- Para generar la réplica negativa de la raíz, tome un portaobjetos de vidrio limpio y vierta 1 ml de la solución de réplica negativa en él.
- Coloque raíces de 2 a 20123 sobre la solución. No permita que las raíces estén completamente cubiertas por la solución.
- Mantenga la corredera por debajo de la lámpara ultra violeta (UV) de 8 W durante 8o u201210 min. No mantenga la solución bajo luz UV durante demasiado tiempo.
NOTA: Es importante no mantener la solución bajo la luz UV durante demasiado tiempo, ya que hace que el poliuretano sea demasiado duro, lo que hace imposible quitar la raíz. - Apague la lámpara UV, retire la réplica del portaobjetos de vidrio y colóquela en un plato de Petri lleno de etanol, para eliminar el monómero no reaccionado.
- Para obtener la réplica negativa, quite la raíz de la réplica muy lentamente mediante fórceps.
3. Prepare la réplica positiva raíz de PDMS.
- Para generar la mezcla para la réplica positiva, coloque 10 g de dimetil siloxano en una taza de papel.
- Añadir 1 g de agente de curado y mezclar bien.
- Conservar la mezcla en un desecador al vacío durante 2 horas para eliminar las burbujas de aire.
- Para generar la réplica positiva, coloque la réplica negativa de poliuretano en un plato de Petri.
- Vierta la mezcla PDMS encima de la réplica negativa.
- Aplicar vacío durante 2 h para asegurar la cobertura de la microestructura.
- Mantenga el plato de Petri durante la noche en RT.
- Separe la réplica positiva curada de la réplica negativa a mano.
4. Prepare la réplica positiva de raíz a partir de celulosa etílica.
- Para generar la solución de celulosa etílica, poner 1,32 ml de ptalato de dietil como plastificante en una taza de 100 ml.
- Añadir 20 ml de etanol y remover a RT durante 2 horas.
- Añadir 3,3 g de celulosa etílica y remover durante la noche.
- Para generar la réplica positiva, coloque la réplica negativa de poliuretano en un plato de Petri.
- Vierta la solución de celulosa etílica encima de la réplica negativa.
- Mantenga el plato de Petri durante la noche en RT bajo el capó.
- Quite la réplica positiva de la réplica negativa muy lentamente por fórceps.
Representative Results
Para formar la replicación de la microestructura de la superficie raíz, se debe elegir una raíz para el moldeo. Cultivamos plantas de tomate en el suelo, haciendo que el uso de la raíz natural del sistema radicular sea extremadamente difícil. La eliminación del suelo del sistema radicular puede ser difícil y, además, las raíces del sistema radicular son frágiles y pueden romperse al intentar moldear. Por lo tanto, sugerimos utilizar primero raíces más rígidas, para establecer el protocolo en el laboratorio. La formación de tales raíces se describe en la Figura 1A. El sistema radicular se elimina después de que la planta fue cultivada durante 3 semanas y la planta sin raíces se coloca en agua durante aproximadamente una semana hasta que las raíces adventiciias emergen del tallo. Esas raíces se pueden utilizar para la replicación durante el establecimiento del protocolo. Una vez que el protocolo ha sido bien establecido, se desea una estructura de superficie de raíz más realista. Aquí sugerimos evitar las raíces cultivadas en el suelo como la eliminación completa del suelo en extremadamente desafiante. En su lugar sugerimos el uso de raíces germinantes, proporcionando información valiosa sobre la microestructura de la superficie de la raíz de una planta genéticamente específica. El crecimiento de estas raíces se describe en la Figura 1B. Las semillas se colocan sobre un papel de filtro húmedo y se incuban a 25 oC. Después de aproximadamente 5 días, durante los cuales el papel de filtro se mantiene húmedo, las raíces germinadas son lo suficientemente largas para la replicación. Esas raíces son más frágiles que las raíces sugeridas anteriormente y requieren un cuidado más delicado.
La producción de la réplica de microestructura de superficie raíz es un proceso de dos pasos. En el primer paso, la raíz natural se moldea en un molde a base de poliuretano (la réplica negativa). La ventaja de este paso es que se están preparando todos los materiales para el molde de poliuretano y la raíz se coloca en la parte superior de la solución preparada al final para una exposición de 10 minutos a los rayos UV. Como resultado, el tejido biológico no está expuesto a condiciones adversas durante demasiado tiempo y se puede manejar suavemente al final del proceso. Si se siguen todos los pasos del protocolo, se genera una buena réplica negativa. Esta réplica mostrará la estructura celular de la superficie de la raíz, así como los agujeros que representan la ubicación de los pelos de la raíz (Figura 2A). Si no se siguen algunos pasos críticos del protocolo, se producirá un error en el procedimiento. Uno de estos pasos es la colocación de la raíz en la solución de poliuretano antes del curado. La raíz debe colocarse muy suavemente para evitar la inmersión de la misma en la solución de poliuretano. Tal inmersión, de cualquier parte de la raíz, causará el atrapamiento de la raíz en el polímero duro sin capacidad de eliminarlo. Si se produce un evento de este tipo, la raíz permanecerá dentro de la réplica negativa después de que se cure (Figura 2B). Otro paso crucial es con respecto al tiempo de curado por luz UV. El tiempo de curado recomendado es de 8o 201210 min. Pasar de 10 min resultará en un molde de poliuretano extremadamente duro, lo que hace imposible eliminar la raíz sin romperla dentro del molde de poliuretano. La rotura de la raíz a veces puede ser visible a simple vista, por ejemplo, cuando se rompe una pieza grande(Figura 2C,parte superior, marcada con flechas púrpuras). Sin embargo, a veces se dejan pequeñas piezas de raíz en el material que son difíciles de detectar a simple vista y se tiene que utilizar un microscopio(Figura 2C, inferior, marcado con flechas púrpuras). Recomendamos examinar cuidadosamente la réplica negativa de poliuretano con un microscopio antes de la continuación del protocolo para asegurarse de que no hay ninguna raíz residual presente.
Una vez preparada la réplica negativa de poliuretano; muchos materiales se pueden utilizar para la preparación de la réplica positiva. La preparación de la réplica positiva, utilizando la réplica negativa de poliuretano como molde, es directa y depende completamente de la calidad de la réplica negativa de poliuretano. Para generar la réplica positiva hemos utilizado tanto PDMS — como es bien conocido en el campo de la litografía suave (Figura 3A)— y celulosa etílica como un material que imita mejor las propiedades de la superficie raíz que se compone principalmente de celulosa (Figura 3B). La imagen SEM de la réplica de PDMS muestra los vellos de raíz muy claramente. Los pelos están en la zona de alargamiento, donde comienzan a emerger. Por lo tanto, la longitud de los vellos radiculares varía a lo largo de la superficie de la raíz a medida que se hacen más largos, al igual que en la raíz natural (Figura 3A). La celulosa etílica genera una película más dura y menos flexible que PDMS. Por lo tanto, la eliminación de la misma del moho negativo requiere más cuidado. Sin embargo, algunos pelos y la microestructura superficial son visibles bajo el microscopio de luz (Figura 3B). Usamos esos dos materiales para generar la réplica positiva, sin embargo, cualquier material que pueda formar una película será un buen candidato para la réplica positiva, utilizando la réplica negativa de poliuretano.
Figura 1: Raíces de plantas de tomate para replicación. (A) Una planta de tomate (M82) se cultiva a 25oC con 9 h de luz y 15 h de oscuridad. Después de 3 semanas, la planta se retira del suelo y el sistema radicular se corta. La planta sin raíces se pone en agua hasta que las raíces adventicies emergen del tallo después de aproximadamente una semana. Estas raíces no muestran la estructura exacta como las raíces del sistema radicular, pero representan un buen modelo. Esas raíces son menos frágiles que las raíces del sistema radicular y por lo tanto se prefiere trabajar con al establecer la técnica en el laboratorio. (B) Las semillas de tomate (M82) se colocan en un papel de filtro húmedo en un plato de Petri y se incuban a 25 oC. El papel se hidrata todos los días y las semillas están germinando. Las raíces están creciendo y después de aproximadamente 5 días son lo suficientemente largos como para ser utilizados para la replicación. Estas raíces son más suaves y deben utilizarse una vez que el método está bien establecido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de microscopía de réplica negativa de poliuretano. (A) Imagen SEM de réplica negativa de poliuretano realizada según un protocolo siguiendo todos los pasos. La estructura celular es claramente visible. Las flechas amarillas apuntan a agujeros formados por los pelos de la raíz. (B) Imágenes ligeras de microscopía de poliuretano réplica negativa con una raíz en su interior, ya que estaba completamente cubierta con la solución y la eliminación de la misma era imposible. El negativo de poliuretano se curó con la raíz en el interior. La raíz es visible a simple vista y utilizando microscopía de luz. Es imposible quitar esta raíz de la réplica curada. (C) Imágenes ligeras de microscopía de réplica negativa de poliuretano que se mantuvo bajo luz UV durante demasiado tiempo. Como resultado, la raíz no se podía eliminar completamente del polímero con partículas grandes visibles a simple vista (imagen superior, marcadas con flechas púrpuras) o pequeñas fracciones visibles sólo por microscopio (imagen inferior, marcada con flechas púrpuras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes del microscopio de réplica positiva. (A) Micrografía SEM de una réplica positiva hecha de PDMS. El agrandamiento muestra los vellos de las raíces. (B) Imágenes ligeras de microscopía de una réplica positiva hecha de celulosa etílica. Los pelos se muestran en las imágenes de la derecha, mientras que la textura de la superficie es visible en la imagen de la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Presentamos un método novedoso para la replicación de la microestructura de la superficie radicular. Este método se basa en los métodos existentes de replicación de microestructura de superficie de hoja4. Para desarrollar este método, tuvimos que ajustar el método existente para las hojas. Nos dimos cuenta de que el paso problemático en la copia del método de replicación de hojas en raíces implica el primer paso del moldeo de raíz. Esta es la parte más sensible del método, ya que involucra el tejido biológico. Como resultado, queríamos elegir un polímero que exigiría condiciones relativamente suaves para el curado y por lo tanto causar un daño mínimo al tejido biológico. Elegimos el poliuretano porque se puede polimerizar rápidamente (dentro de 10 min) bajo la luz UV29. Además, es muy difícil una vez polimerizado30 y esperábamos que esta propiedad permitiría la eliminación relativamente fácil de la raíz del molde de poliuretano.
El método presentado es un enfoque de dos pasos en el que la imagen negativa (réplica negativa) se forma en el primer paso y la replicación se forma en el segundo paso, en función de la réplica negativa. Esto amplía la gama de materiales con los que podemos trabajar. La replicación de la microestructura de superficie de hoja se realizó principalmente en MATERIALES PDMS o epoxi11,,31. Se realizó un poco de trabajo con otros materiales, específicamente materiales que apoyan el crecimiento de microorganismos13,,32. Esto se debe a que en los últimos años este método se ha utilizado para estudiar las interacciones microorganismo-superficie en el contexto de la estructura de la superficie de la hoja. Sin embargo, no se han utilizado materiales similares a la celulosa en este método en el contexto de las hojas. Sugerimos el uso de una réplica negativa de poliuretano como un molde y una variedad de materiales para la réplica positiva. En otras palabras, hacer la réplica positiva, de una variedad de materiales, es relativamente fácil una vez que se hace una buena réplica negativa. Actualmente utilizamos derivados de celulosa, pero estamos explorando las posibilidades de utilizar materiales más relevantes para la superficie de la raíz como pectina y lignina33,,34 en combinación con derivados de celulosa.
El método también se expande sobre el método existente de replicación de microestructura de superficie de hoja, ya que la hoja es una superficie 2D mientras que la superficie de la raíz es curva y, por lo tanto, es una superficie 3D. Nuestro método no permite la replicación de toda la superficie ya que la incrustación de toda la raíz en la solución de poliuretano no permite su liberación. Por lo tanto, se debe elegir un lado de la raíz al replicar la microestructura de la superficie raíz. La superficie sintética generada es curva y representa aproximadamente la mitad de la superficie, pero no toda ella. Nuestra suposición es que las características estructurales de la superficie de la raíz son en su mayoría simétricas sobre el eje a lo largo de la longitud de la raíz. Sin embargo, en estudios en los que no se asume dicha simetría, se debe tener cuidado de elegir la raíz lateral adecuada para replicar.
Presentamos dos opciones para que las raíces se utilicen como moldes. La primera es la opción de raíces adventicias cultivadas a partir del tallo y la segunda es la opción de raíces germinadas en papel. La primera opción está destinada principalmente a ayudar a los investigadores en la práctica del método, ya que estas raíces son más robustas y más fáciles de trabajar. La segunda opción representa las diferencias genéticas que se pueden encontrar entre las raíces de diferentes cultivares, independientemente de las condiciones ambientales. Estas superficies se pueden utilizar como herramientas de investigación importantes, sin embargo, hay que ser conscientes de que el medio ambiente puede tener una fuerte influencia en la estructura de la superficie de la raíz, específicamente el suelo en el que se cultivan las raíces35,,36. Debido al estrés mecánico infligido por el suelo, algunos cambios morfológicos están destinados a ocurrir, además de heridas que se acumulan en la superficie a medida que la raíz penetra en el suelo37. La eliminación de las raíces del suelo, así como la limpieza de ellas, sin dañar su estructura es una tarea muy difícil. Por lo tanto, no somos optimistas en cuanto a la capacidad de utilizar este método para imitar de forma fiable la microestructura superficial de la raíz de las raíces cultivadas en el suelo. Sin embargo, para la investigación que se centra en las diferencias genéticas o diferencias ambientales donde el cambio en la microestructura es notablemente claro, este método se puede utilizar como una herramienta para estudiar la influencia de la microestructura de la superficie de la raíz.
Nuestro método produce una superficie inerte imitando sólo las propiedades microestructurales de la superficie de la raíz. Si bien este método está diseñado para separar los efectos estructurales en las interacciones root-ambiental de todos los demás efectos, no podemos ignorar los compuestos químicos en esas interacciones. Algunos microorganismos pueden no sobrevivir o funcionar en la superficie sin la adición de compuestos, específicamente nutrientes. El siguiente paso en el desarrollo de esta plataforma será la adición controlada de compuestos químicos para estudiar sus efectos en las diferentes interacciones cuando se combina con la estructura.
Este método fue desarrollado como un primer paso en el desarrollo de una plataforma sintética para estudiar las interacciones entre la raíz y el microorganismo. Aquí imitamos la microestructura de la superficie de la raíz y esta plataforma inicial se puede utilizar para estudiar la influencia de la microestructura superficial en el comportamiento del microorganismo. Sin embargo, esta plataforma es limitada ya que carece de muchos otros elementos del sistema natural. Esta plataforma debe desarrollarse aún más con el uso de los materiales adecuados para generar la superficie y con la adición de otros productos químicos críticos en el sistema. En una plataforma más avanzada, también podemos imaginar la distribución espacial de los productos químicos. Sin embargo, dado que actualmente no existe ningún otro método para aislar los efectos estructurales en las interacciones entre la raíz y el microorganismo, esperamos que los investigadores puedan utilizar esta plataforma inicial para hacer preguntas específicas de la estructura en esas interacciones.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La investigación fue apoyada por fondos semilla de la Organización de Investigación Agrícola a MK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-hydroxy-2-methylpropiophenone | Sigma | 405655 | |
| Diethyl phthalate | Across | 114520010 | |
| Diurethane dimetharylate | Sigma | 436909 | |
| Ethyl cellulose | Across | 232705000 | |
| Ethyl methacrylate | Sigma | 234893 | |
| Shaphir Solution | GAT fertilizer | 6-2-4 | |
| Sylgard 184 kit | Polymer-G | 510018400500 |
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