利用软光刻改变根面微结构的仿生复制

Summary

仿生学以前被用作研究叶-微生物相互作用的工具。但是，根不存在此类工具。在这里，我们开发一个协议，形成合成表面模仿根表面微观结构的研究根环境相互作用。

Abstract

仿生学是利用化学和材料科学来模仿生物系统，特别是生物结构，以更好的人类。最近，仿效叶面的微观结构，用于研究叶微观结构对叶环境相互作用的影响。但是，根不存在此类工具。我们开发了一种工具，允许将根面微观结构合成为人造表面。我们依靠软光刻方法，以叶面微结构复制为名，采用两步法。第一步是更具挑战性的，因为它涉及生物组织。在这里，我们采用不同的聚合物和固化策略，依靠强、刚性、聚氨酯，用UV固化为根部成型。这使我们能够实现根面微观结构的可靠负面图像，包括细腻的，具有挑战性的功能，如根毛。然后，我们使用这个负图像作为模板，使用成熟的聚二甲基硅氧烷（PDMS）以及纤维素衍生物乙基纤维素实现根面显微结构复制，该衍生物表示对根的更密切的模仿，也可以被微生物分泌的纤维素酶降解。这个新形成的平台可以用来研究表面在根-微生物相互作用中的微观结构效应，其方式与之前在叶子中显示的相似。此外，该系统使我们能够跟踪微生物的位置，相对于表面特征，并在将来其活动，以纤维素酶分泌的形式。

Introduction

复制叶面微观结构是仿生学研究领域^{1、2、3、4,2,的一种已知方法}。叶表面微观结构的最早复制是使用涂在叶表面的指甲油和橡胶材料进行，以便更好地可视化微结构，特别是^波托马塔5，6，7，8，9，10。^,6,7,8,9,10该方法随后得到改进，采用软光刻模拟叶片表面微观结构，特别是在超疏^,水表面^{,2、3、4、11、12,3,4}的仿生^学背景下。¹¹近年来，这种方法被证明是研究叶表面与生活在表面的微生物之间的相互作用的有用工具，无论它们是^{致病性的13、14,14}还是有益，作为天然叶层¹⁵的一部分。自然系统的简化在研究表面微生物相互作用方面证明极为有用，即使纯合成系统被用作表面15、16、17、18。^15,16,17,18

虽然叶表面微观结构的复制证明是研究叶子表面与不同微生物相互作用的有用工具，但植物根部不存在这种工具。植物根部更难研究，因为它们位于地下，所有相互作用都发生在土壤中。与叶子类似，根面微观结构很可能在根-微生物相互作用中发挥作用。然而，目前还没有一种方法可以分离根面微结构在复杂根-微生物相互作用中的具体作用。研究最多的根面微结构特征是根毛^{19，20，21。,2119,}根毛在增加表面积和允许更有效地摄入营养物质和水²²方面起着重要作用，然而它们作为根-微生物相互作用的结构特征的介入从未经过过测试。

叶中软光刻使用最广泛的聚合物是聚二甲基硅氧烷（PDMS）。PDMS的特性类似于叶角质层^{15，23。15,}然而，在植物根部，最丰富的材料是^{纤维素24，25，,25}其性质不同于^{PDMS26，27，28。,27,28}因此，利用PDMS构建一个合成平台，研究根-环境相互作用中的表面微观结构效应。因此，这不太理想。

此处介绍的协议能够形成各种材料的合成根面微观结构复制品。与叶面微观结构复制的方法一样，这是一个两步过程。第一步使用生物组织（根）作为成型成聚氨酯模具（负复制品）的来源。聚氨酯模具代表根面微观结构的负图像，然后可以用作基材，从各种材料（包括PDMS和纤维素衍生物）生成根面微观结构的正复制。这种根面复制以后可以用作平台，以了解表面结构在根-微生物相互作用中的作用。

Protocol

1. 种植植物和根部

1. 选项1：从茎准备冒险的根。
   1. 为生长的植物拿一个生根托盘。
   2. 用泥土填充托盘。
   3. 在托盘的每个细胞中加入一个M82番茄品种的种子。
   4. 用一点土壤盖住种子。
   5. 当水充满托盘底部，土壤吸收水分时，用滴管从底部为托盘浇水。
   6. 每1升水向托盘底部添加2 mL肥料，每周一次。
   7. 在25°C下生长的室内生长。
   8. 使用 9 小时照明条件（7：00-16：00）与 15 小时黑暗交替。
   9. 3周后，将植物从土壤中去除。
   10. 与茎相互作用时，从植物中切开根系。
   11. 将无根植物放入装满水的烧杯中。
   12. 几天后，切断从茎中浮现的冒险根，并使用它们进行复制。
2. 选项2：准备种子发芽根。
   1. 用水将培养皿大小的滤纸淋湿。
   2. 将几个M82种子（不超过10个）放在纸上，放在培养皿里。
   3. 在25°C下孵育板。
   4. 每天使纸张水合。
   5. 发芽的根足够长（大约 5 天）后，取出种子并使用根进行复制。

2. 制备聚氨酯的根负复制品

1. 要生成负复制溶液，请将 9.49 g 利尿烷二甲基丙烯酸酯添加到 20 mL 小瓶中。
   1. 在小瓶中加入1.45 mL的乙基甲基丙烯酸酯。
   2. 在室温 （RT） 下搅拌，直到溶液看起来清晰且均匀。
      注：大约 2 小时足以到达均匀溶液。
   3. 加入3 mL的增塑剂，二乙基邻苯二甲酸酯，在RT搅拌1小时。
      注：二乙基邻苯二甲酸酯在丙烯酸酯单体中是可混错的。
   4. 加入300μL的光启动器，2-羟基-2-甲基丙酮，并在RT. 继续搅拌过夜，直到去除所有气泡。
      注意：可以在这里暂停协议。解决方案可以保留在 RT。
2. 要生成根的负副本，请采取干净的玻璃幻灯片，将 1 mL 的负副本溶液倒到其上。
   1. 将 2\u20123 根放在解决方案上。不要让解决方案完全覆盖根。
   2. 将幻灯片保持在 8 W 紫外 （UV） 灯下 8\u201210 分钟。请勿将溶液在紫外线下保持太久。
      注：重要的是不要将溶液留在紫外光下太久，因为它使聚氨酯太硬，使得无法去除根部。
   3. 关闭紫外线灯，从玻璃滑梯上取下复制品，放入装满乙醇的培养皿中，取出未反应的单体。
   4. 要获取负副本，请使用钳子非常缓慢地从副本中删除根。

3. 从 PDMS 准备根阳性副本。

1. 要生成正复制品的混合物，请将 10 克二甲基硅氧烷放入纸杯中。
   1. 加入1克固化剂，彻底混合。
   2. 将混合物在真空下干燥器中保持 2 小时，以清除气泡。
2. 要生成正复制品，请将聚氨酯负复制品放在培养皿中。
   1. 将 PDMS 混合物倒在负副本上。
   2. 应用真空2小时，确保微结构覆盖。
   3. 在 Rt 保持宠物菜过夜。
   4. 用手将固化的正副本与负副本分开。

4. 准备乙基纤维素的根阳性复制品。

1. 要生成乙基纤维素溶液，请将 1.32 ml 二乙基酸酯作为增塑剂放入 100 ml 杯中。
   1. 加入20 mL乙醇，在RT搅拌2小时。
   2. 加入3.3克乙基纤维素，搅拌过夜。
2. 要生成正复制品，请将聚氨酯负复制品放在培养皿中。
   1. 将乙基纤维素溶液倒在负副本上。
   2. 将培养皿在 Rt 的引擎盖下过夜。
   3. 通过钳子非常缓慢地从负副本中删除正副本。

Representative Results

要形成根面微观结构复制，必须选择根进行成型。我们在土壤中种植番茄植物，使得利用根系的天然根部极具挑战性。从根系中去除土壤可能很困难，此外，根系根系的根部是脆弱的，在成型尝试时可能会断裂。因此，我们建议首先使用更严格的根，在实验室中建立协议。图1A描述了这种根的形成。植物根系在植物生长3周后被移除，无根植物在水中放置约一周，直到从茎中产生出的生根。这些根可用于在协议建立期间的复制。一旦协议建立良好，需要一个更逼真的根面结构。在这里，我们建议避免根生长在土壤中，因为完全去除土壤在极具挑战性。相反，我们建议使用发芽根，提供基因特异性植物的根面微观结构的宝贵信息。图1B中描述了这种根的生长。种子放在湿滤纸上，在25°C下孵育。大约 5 天后，过滤纸保持湿润，发芽的根足够长，可以复制。这些根比先前建议的根更脆弱，需要更微妙的照顾。

根面微观结构副本的生产是一个两步过程。在第一步中，自然根被模塑成聚氨酯基模具（负仿）。此步骤的优点是，聚氨酯模具的所有材料都在准备中，根部在最接近尾声时放在准备好的溶液上，10分钟暴露在紫外线下。因此，生物组织不会暴露在恶劣条件下太久，可以在过程结束时轻轻处理。如果遵循所有协议步骤，则生成一个良好的负副本。此副本将显示根面的细胞结构以及表示根毛位置的孔（图 2A）。如果未遵循协议中某些关键步骤，则该过程将失败。其中一个步骤是将根放在聚氨酯溶液上，然后固化。根必须非常轻轻地放置，以避免其淹没在聚氨酯溶液中。这种淹没，任何部分的根，将导致根在硬聚合物的陷阱，没有能力去除它。如果发生此类事件，根根在固化后将保留在负副本中（图 2B）。另一个关键步骤是紫外线的固化时间。推荐的固化时间是8\u201210分钟。超过10分钟将导致极硬的聚氨酯模具，使得在不破坏聚氨酯模具中去除根部是不可能的。根的破损有时可以肉眼可见，例如，当一大块破损时（图2C，顶部，标有紫色箭头）。然而，有时小根片留在材料中，这是很难发现肉眼和显微镜必须使用（图2C，底部，标有紫色箭头）。我们建议在协议延续之前，用显微镜仔细检查聚氨酯负复制体，以确保不存在残留根。

一旦聚氨酯负复制品被准备好;许多材料可用于制备正副本。正复制品的制备，使用聚氨酯负复制品作为模具，是直截了当的，完全取决于聚氨酯负复制品的质量。为了生成正副本，我们同时使用了PDMS（在软光刻领域（图3A）和乙基纤维素（12.18中）作为更好地模仿主要由纤维素构成的根面特性的材料（图3B）。PDMS 副本的 SEM 图像非常清楚地显示根毛。头发在伸长区，在那里他们开始出现。因此，根毛的长度沿根面变化，因为它们变长，很像在自然根（图3A）。乙基纤维素产生的薄膜比PDMS更硬、更不灵活。因此，从负模中去除它需要更多的注意。然而，一些毛发和表面微观结构在光显微镜下可见（图3B）。我们使用这两种材料生成正副本，但是，任何可以形成薄膜的材料都将是正复制品的候选材料，使用聚氨酯负复制品。

图1：番茄植物根进行复制。（A） 番茄 （M82） 植物在 25 °C 下生长，光线为 9 小时，黑暗度为 15 小时。3周后，植物从土壤中去除，根系被切断。无根植物被放入水中，直到大约一周后从茎中产生冒险的根。这些根没有将确切的结构作为根系的根，但它们代表一个很好的模型。这些根比根系根不易碎，因此在实验室中建立技术时，首选使用。（B） 番茄 （M82） 种子放在培养皿中的湿滤纸上，在 25°C 下孵育。纸每天水合，种子发芽。根正在生长，大约 5 天后足够长的时间用于复制。这些根是温和的，应该使用一旦方法建立良好。请单击此处查看此图的较大版本。

图2：聚氨酯负复制品的显微镜图像。（A） 聚氨酯负复制品的SEM图像，按照所有步骤的协议制作。细胞结构清晰可见。黄色箭头指向根部中的头发形成的孔。（B） 聚氨酯负复制品的光显微镜图像，其内部有根，因为它完全覆盖了溶液，并删除是不可能的。聚氨酯负性用根部内根固化。根是可见的眼睛和使用光显微镜。无法从已固化副本中删除此根。（C） 在紫外线下保存太久的聚氨酯负复制品的光显微镜图像。因此，无法完全去除聚合物的根，因为大颗粒可以通过眼睛可见（顶部图像，标有紫色箭头），或者只有显微镜才能看到小部分（下图，用紫色箭头标记）。请单击此处查看此图的较大版本。

图3：正副本的显微镜图像。（A） 由PDMS制作的正副本的SEM显微图。放大显示根毛。（B） 由乙基纤维素制作的正复制品的光显微镜图像。头发显示在右侧的图像中，而表面纹理在左侧的图像中可见。请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

提出了一种复制根面微观结构的新方法。该方法依赖于现有的叶面微观结构复制方法^4。为了开发这种方法，我们不得不调整现有的叶子方法。我们意识到将叶复制方法复制到根中时有问题的步骤涉及根成型的第一步。这是方法最敏感的部分，因为它涉及生物组织。因此，我们希望选择一种聚合物，这种聚合物需要相对温和的固化条件，从而对生物组织造成最小的损伤。我们之所以选择聚氨酯，是因为它可以在^{紫外线29下快速聚合（10分钟内）。}此外，它是非常困难的一次聚合^30，我们希望，该属性将允许相对容易地从聚氨酯模具根部去除。

提出的方法是一种两步方法，其中负映像（负副本）在第一步中形成，复制在第二步中基于负副本形成。这扩展了我们可以使用的材料的范围。叶面微结构复制主要在PDMS或环氧材料^{11、31,上进行}。一些工作是用其他材料，特别是支持微生物生长^{的材料13，32。,32}这是因为近年来，这种方法已被用于研究叶表面结构背景下的微生物-表面相互作用。然而，在叶子的上下文中，这种方法没有使用任何纤维素状材料。我们建议使用聚氨酯负复制品作为模具和各种材料的正复制品。换句话说，一旦制作了好的负副本，从各种材料制作正副本就相对容易了。我们目前使用纤维素衍生物，但正在探索使用更相关的材料根面的可能性，如果胶和木质素^33，34结合纤维素衍生物。^33,

该方法还扩展了现有的叶面微观结构复制方法，因为叶是 2D 曲面，而根面是弯曲的，因此是 3D 曲面。由于将整个根嵌入聚氨酯溶液中不允许其释放，因此我们的方法无法复制整个表面。因此，在复制根面微观结构时，必须选择根的一侧。生成的合成曲面是弯曲的，大约占表面的一半，但并不是所有的曲面。我们的假设是，根面的结构特征大多与沿根长的轴对称。但是，在未假定这种对称性的研究中，应小心选择适当的侧根进行复制。

我们提出了两个选项，用于根作为模具。第一种选择是从茎中生长的冒险根，第二种选择是纸上发芽根。第一种选择主要是帮助研究人员练习这种方法，因为这些根更健壮，更容易使用。第二个选项表示不同品种的根之间可以发现的遗传差异，无论环境条件如何。这些表面可以作为重要的研究工具，但是，人们应该知道，环境可以对根面结构产生强烈的影响，特别是土壤中根生长^{35，36。35,}由于土壤造成的机械应力，一些形态变化势必会发生，除了根部渗入土壤37时表面的^{伤口外，还会发生。}从土壤中去除根，以及清洁它们，而不损害其结构是一个非常困难的任务。因此，我们对使用这种方法可靠地模拟土壤中根根的根面微观结构的能力并不乐观。然而，对于关注遗传差异或环境差异的研究，在微观结构的变化是明显明显的，此方法可以用作研究根面微观结构的影响的工具。

我们的方法只产生一个惰性表面，只模拟根面的微观结构特性。虽然这种方法旨在将根-环境相互作用的结构效应与所有其他效应分开，但我们不能忽视这些相互作用中的化合物。如果不添加化合物，特别是营养物质，某些微生物可能无法在表面生存或发挥作用。该平台的下一步将是控制添加化合物，以研究它们与结构结合时对不同相互作用的影响。

该方法是开发研究根-微生物相互作用的合成平台的第一步。在这里，我们模拟根面的微观结构，这个初始平台可用于研究表面微观结构对微生物行为的影响。然而，这个平台是有限的，因为它缺乏许多其他元素从自然系统。应利用正确的材料生成表面，并在系统中添加其他关键化学品，进一步开发这一平台。在一个更先进的平台中，我们也可以想象化学品的空间分布。然而，由于目前没有其他方法来分离根-微生物相互作用的结构效应，我们希望研究人员能够利用这个初始平台在这些相互作用中提出结构特定的问题。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-hydroxy-2-methylpropiophenone	Sigma	405655
Diethyl phthalate	Across	114520010
Diurethane dimetharylate	Sigma	436909
Ethyl cellulose	Across	232705000
Ethyl methacrylate	Sigma	234893
Shaphir Solution	GAT fertilizer	6-2-4
Sylgard 184 kit	Polymer-G	510018400500