Summary
このプロトコルは、生きている、大人、人間の脳組織から原発ミクログリアを単離する効率的で費用対効果が高く、堅牢な方法です。孤立した原発性ヒトミクログリアは、恒常性および疾患における細胞プロセスを研究するためのツールとして役立つ。
Abstract
ミクログリアは中枢神経系の自然免疫細胞(CNS)に居住している。ミクログリアは、発達中、恒常性維持、感染または傷害の間に重要な役割を果たす。いくつかの独立した研究グループは、ミクログリアが自己免疫疾患、自己炎症性症候群および癌において果たす中心的な役割を強調している。いくつかの神経疾患におけるミクログリアの活性化は、病原性プロセスに直接関与する可能性があります。原発性ミクログリアは、脳内の免疫応答、細胞と細胞の相互作用、疾患における調節不全ミクログリア型を理解するための強力なツールです。一次ミクログリアは、不死化ミクログリア細胞株よりもビボミクログリア特性を模倣する。ヒト成人ミクログリアは、ヒト胎児およびげっ歯類ミクログリアと比較して、異なる特性を示す。このプロトコルは、成人の人間の脳から原発性ミクログリアを分離するための効率的な方法を提供する。これらのミクログリアを研究することは、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびアストロサイトを含むCNSにおけるミクログリアと他の居住細胞集団との間の細胞細胞相互作用に関する重要な洞察を提供することができる。さらに、異なる人間の脳からのミクログリアは、個別化された医療のためのユニークな免疫応答の特徴付けと無数の治療用途のために培養することができる。
Introduction
中枢神経系(CNS)は、ニューロンとグリア細胞の複雑なネットワーク1で構成されている。グリア細胞の中でも、ミクログリアはCNS2,3,3の自然免疫細胞として機能する。ミクログリアは健康なCNS4で恒常性を維持する責任があります。ミクログリアはまた、シナプス2を剪定することによって、神経発達において重要な役割を果たす。ミクログリアは、含むが、制限されていないいくつかの神経疾患の病態生理学の中心です。アルツハイマー病5、パーキンソン病6、脳卒中7、多発性硬化症8、外傷性脳損傷9、神経因性疼痛10、脊髄損傷11および神経膠腫などの脳腫瘍12。
CNS恒常性および疾患に関する研究は、コスト効率が良く、時間効率の高いヒト原発性ミクログリア分離プロトコル13の枯渇に起因するげっ歯類ミクログリアを利用する。げっ歯類ミクログリアは、イバ-1、PU.1、DAP12およびM-CSF受容体などの遺伝子の発現において原発性ヒトミクログリアに類似しており、疾患を有する脳13と同様に正常な理解に有効であった。興味深いことに、TLR4、MHC II、Siglec-11およびSiglec-3などのいくつかの免疫関連遺伝子の発現は、ヒトおよびげっ歯類ミクログリア13との間で変化する。いくつかの遺伝子の発現は、両方の種14,15,15の経時的発現および神経変性疾患においても変化する。これらの有意な違いは、ヒトミクログリアを恒常性および疾患におけるミクログリア機能を研究するために不可欠なモデルにする。原発性ヒトミクログリアはまた、潜在的な薬物候補16の前臨床スクリーニングのための効果的なツールであり得る。上記の理由は、一次ヒトミクログリアの分離のための費用対効果の高いプロトコルの必要性の高まりを強調しています。
我々は、腫瘍切除または他の外科的切除のために作成された外科的窓の結果として収集された成人ヒト脳組織から原発ヒトミクログリアを単離するためのプロトコルを開発した。この方法は既存の方法とは大きく異なります。組織採取部位から約75分後にミクログリアを単離培養し、実験室で隔離プロトコルを開始することができた。我々は、単離ミクログリアの増殖を促進するためにL929線維芽細胞の上清を使用している。この方法は、特に、一次ミクログリアのみの培養と開発に焦点を当てています。得られた培養物は約80%ミクログリアである。他のプロトコルは、密度勾配遠心分離、フローサイトメトリーおよび磁気ビーズによってミクログリアの豊かな培養を提供する一方で、プロトコルは、一次ヒトミクログリア17、18、19、2018,19,を培養するための迅速でシンプルで堅牢で費用対効果の高い方法である。1720死体から固定された脳組織の代わりに外科的に除去された生きた成人の脳組織を利用する能力は、既存の手順18,21とは対照的に、21この方法の付加的な利点を証明する。
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Protocol
すべての組織は、インド工科大学ジョードプルと全インド医科学研究所(AIIMS)ジョードプルの研究所倫理委員会からの倫理的クリアランスの後に取得されました。
1.組織の獲得と処理(0日目)
- 10 mLの氷冷人工脳脊髄液(aCSF)を含む50 mLチューブに組織を収集する(2 mM CaCl2∙2H2O、10 mMグルコース、3 mM KCl、26 mM NaHCO 3、2.5 mM NaH2PO4、1mM MgCl2∙6H2O、202 mmmscesce)320組織を別の場所に移す必要がある場合は、チューブが氷の上に保たれていることを確認してください。
注:オートクレーブ蒸留水でaCSFを準備してください。ラミナーフードの0.22 μmシリンジフィルターでフィルターします。4°Cで1ヶ月間保存できます。 - 70%アルコールで回収管を丁寧に拭き取り、無菌層空気流室に移します。
- aCSFを慎重に廃棄し、無菌状態で組織を計量します。組織の重量は、その後のステップに必要なトリプシン-EDTAの体積を計算するために不可欠です。
- 37°Cで5分間、新鮮な温かいaCSFで組織を保ちます。このステップは細胞死を避けるために重要です。
- aCSFを廃棄し、37°Cで1x PBS(リン酸緩衝生理食塩基)でティッシュを1回洗浄します。 すべての血液を(必要に応じて)繰り返しPBS洗浄で洗い流してください。
- 組織を温かいPBSで、37°Cで5分間インキュベートする。
- PBSを慎重に捨て、殺菌されたペトリ皿に組織を移します。PBSはピペットで除去してもよい。これは、組織の損失を防ぐことができます。
- 滅菌メスを使用して、組織を小さな(少なくとも1mm3)片にダイスします。細かくダイシングされた組織は、トリプシン-EDTAがより高い収率を確保することによって組織解離のためのより高い組織表面積を提供する。
- 0.25%トリプシン-EDTAの10 mL/g組織を含む50 mLチューブにさいの目に切った組織を移し、10 mL血清ピペットを通してピペットで混合する。トリプシン/EDTAの2 mLをペトリ皿に加え、ピペットの助けを借りてプレートを十分に洗います。このトリプシンをハヤブサチューブに加えます。これはダイシング中の組織および細胞の損失を最小にする。
- 250rpmで37°Cで30分間、シェーカーにチューブをインキュベートします。このステップは、組織からの細胞の解離を増加させます.
- インキュベーションの終わりに、トリプシンを中和するために中和培地(グルタミンで50%DMEM/50%F12、ペニシリンストレプトマイシン1%、10%FBS)の10 mLを加えます。10 mL血清ピペットと混ぜます。中和媒体の添加量は、使用されるトリプシンの量と等しい必要があります。
- 4°Cで2,000xgでチューブを10分間遠心分離します。
- 上清を捨てて、培養培地(グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、20%L929上清、10%FBS)を用いて1mLの培養液(50%DMEM/50%F12)でペレットを再懸濁する。
注:L929細胞は、DMEM(グルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、10%FBS)の培養です。ATCC推奨培養法は、細胞培養に従うべきである。上清は、少なくとも75%コンフルエントである培養フラスコから収集されなければならない。それは一括で収集し、成長因子の分解を防ぐために-80 °Cで保存することができます。L929上清をストック培地に添加するのではなく、フラスコに別途添加することをお勧めします。 - 接着性細胞に適したT-25フラスコに細胞をプレートし、4 mLの培養培地を追加します。フラスコを37°Cで5%CO2でインキュ2ベートします。慎重にフラスコを振って組織を均一に分散させる。これは汚染の可能性を高める可能性があるため、揺れながら、フラスコの首にメディアを持ち込まないようにしてください。
2.細胞培養(2日目)
- 各チューブに等量の培地を集めることにより、0日目に製造したT-25培養フラスコを3本の1.5mL遠心管に回収します。フラスコを1回PBSで洗います。フラスコを軽く振って残った組織の断片を取り除きます。残骸は培養に悪影響を及ぼさないため、フラスコの過酷な揺れを避けてください。フラスコに5mLの新鮮な培養培地を加えます。
- 4°Cで1,466xg(4000rpm)で4分間、回収した培地を遠心分離する。
- 各チューブから上清を捨て、1mLの培養液をチューブの1つに加えます。ピペットとよく混ぜます。他のチューブに細胞と混合メディアを連続して追加します。ピペットと十分に混ぜ、1つのチューブに細胞をプールします。
- 接着細胞に適した別のT-25フラスコに細胞をプレートします。4 mLの培養培地を加え、5%CO2で37°Cでフラスコ2をインキュベートする。
3.細胞培養(4日目)
- 両方のフラスコから培地を捨て、新鮮な5mLの培養培地をフラスコに加えます。
- フラスコを37°Cで5%CO2で2日間2インキュベートします。
4. 細胞培養(6日目)
- 細胞はさらなる実験の準備ができています。
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Representative Results
上記のプロトコル(図1)を用いることで、生きた外科的に切除された脳組織から原発ヒトミクログリアを分離することができた。培養細胞は、ミクログリア(緑色)のリシヌスコミュニス凝集剤-1(RCA-1)レクチン(緑色)と、前述の22、23、24、25、26,23,24,25,26のようにアストロサイトのグリア性フィブリラリー酸性タンパク質(図2)を用いて染色した。4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)を使用して、核(青)を染色した。実験開始から6日目に、細胞はさらなる実験の準備ができていた。染色された細胞は、培養中に存在するミクログリアおよびアストロサイトについて盲検を数えた。主要培養物の約80%がミクログリアであった(図2)。
図1:成人脳からの一次ミクログリア分離の概略図 外科的に除去された組織を、50mLチューブ内のaCSFの氷冷10mLで採取し、実験室に移した。組織をそれぞれaCSFおよびPBSで洗浄し、細かくダイシングし、トリプシン-EDTAの助けを借りて解答し、T-25フラスコでめっきした。2日目にメディアが収集され、遠心分離されました。ペレットを新鮮な培地に混合し、T-25フラスコにメッキした。新鮮なメディアが最初のフラスコに加えられた。メディアは代替日に両方のフラスコで変更されました。細胞は6日目にさらなる実験の準備ができていた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単離されたヒトミクログリアの免疫細胞化学(A)を2つのウェルチャンバースライドにメッキし、アストロサイト(グリーンファーストパネル)またはミクログリア用RCA(グリーン秒パネル)にGFAPで染色した。核はDAPIで青色に染色した。GFAPのRCAおよび二次抗体制御の制御は、インセットで示されている。(B)分離した細胞を2つのウェルチャンバースライドにメッキし、ミクログリア(緑色)用RCAとアストロサイト用GFAP(赤色)で染色した。2行目は、GFAPのRCAおよび二次抗体制御の制御を示しています。核はDAPIで青色に染色した。(C)細胞は、ブラインドコントロールによってカウントされた。定量化は、1つの盲目のコントロールによるカウントの代表です。細胞の約80%がミクログリアであった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ミクログリアは、正常な脳における恒常性を確保し、様々な神経疾患の病態生理学において中心的な役割を果たす4.ミクログリアは、シナプス2の神経発達と形成の中心である。ミクログリア研究は、多様な神経疾患の発症と進行を理解する上で極めて重要であることが証明されている 4.げっ歯類ミクログリアは、一次ミクログリア研究のための選択の一般的なモデルですが、しかし、げっ歯類ミクログリアは重要な側面で一次ヒトミクログリアとは異なります13.一次ヒトミクログリアを分離するための費用対効果の高い、高収量のプロトコルの開発は、このギャップを埋めるのに役立つ可能性があります。我々は、生きている、外科的に切除された、成人、人間の脳組織から原発性ヒトミクログリアを単離するためのプロトコルを開発した。7日目 に確認した約80%のミクログリア純度を達成することができました。
プロトコルの最も重要なステップの1つは、処理のために、後天した組織を実験室に輸送することであった。通過時間は約75分であったため、細胞を単離できない可能性が高かった。これを管理するために、aCSF の 10 mL のみの 50 mL チューブを使用しました。aCSFは必要な栄養素を提供し、チューブ内の残りのスペースはaCSFおよび組織をaerateするのに役立った。輸送期間中にニューロンおよび他の細胞のかなりの死があった可能性があります。.これはミクログリアの単離に役立ちますが、このプロトコルは他の神経細胞の単離には効率的ではないかもしれません。268mgの解剖組織からミクログリア細胞を単離することができた。また、ポリ-D-リジンによるフラスコのコーティングを避けることで、ミクログリアのかなりの純度を達成することができました。これはミクログリアのいくらかの損失をもたらしたかもしれないが、これはまた、フラスコに付着することから他のグリア集団を避けた。さらに、フラスコを振ってミクログリアを収集するという余分なステップを避けました。一部の細胞は、0日目に調製されたフラスコに接着していない可能性があります。最初の培養から非接着性細胞を採取し、2日目に別のフラスコに再びメッキし、ミクログリア細胞も得た。なお、組織の表面を増加させるため、組織を細かくダイシングすることが重要である。これは、トリプシンが組織の大部分にアクセスし、より多くの細胞を解化することができます.
培養中のミクログリアの増殖を促進するために、L929細胞27,28,28の上清を用いて培地をコンディショネートした。これは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)をサプリメントとして豊富な供給源を提供し、マクロファージ増殖を増強する27、29。,29これは、いくつかのミクログリア一次分離プロトコルの主力である追加の高価な成長サプリメントのコストを削減するのに役立ちました.L929上澄を追加することは、プロトコルにおけるミクログリアの効率的な分離と成長にとって非常に重要です。しかし、L929細胞培養のないラボの, これは追加の成長サプリメントが必要とされるプロトコルの全体的なコストを考慮すると制限ステップになります。.私たちは、培養条件で約80%のミクログリア人口を得ることができました。これは一部の公開プロトコルよりも小さいですが、これは特定の微小的なマーカーに磁気ビーズを使用するような特定のプロトコルを介して分離の追加ラウンドを持つことによって克服することができます。約80%の培養純度で、このプロトコルは免疫細胞化学のような多くの実験に対して有効である。しかし、タンパク質精製、タンパク質同定、ウェスタンブロッティングなどの実験では、培養物の精製が追加的に必要となる場合があります。一次培養物の純度が高くても、培養期間が長くなると、培養中に存在する他の細胞が増える可能性が常にあります。私たちは、1回通過させることによって9日間、単離ミクログリアを培養することに成功しました。プロトコルの培養条件はミクログリアの分離と成長を優先するが、培養期間を長く維持する際には他の細胞の存在を考慮すべきである。
一次ミクログリアを分離するためのこのプロトコルは、効果的で堅牢でコスト効率が良い。成人の脳組織から原発性ヒトミクログリアを単離するためのこのようなプロトコルは、成人の脳における免疫機能、細胞生理学および疾患応答に関するタイムリーな研究を可能にする。さらに、患者由来の原発ミクログリアは、パーソナライズされた将来の治療薬の開発に役立つ可能性があります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
SJの研究所は、IITJの機関補助金を受けて設立され、バイオテクノロジー省(BT/PR12831/MED/30/10/1089/2015)とインド電子情報技術省(No.4(16)/2019-ITEA)からの助成金を受けています。ヒトの脳組織切片は、全インド医科学研究所(AIIMS)ジョードプルから制度倫理委員会のクリアランスの後に得られた。デザイン・アンド・アーツ・ソサエティIIT JodhpurのB.Tech学生メンバーであるMayank Rathorに、ビデオ撮影のサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
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