Summary
Detta protokoll är en effektiv, kostnadseffektiv och robust metod för att isolera primär mikroglia från levande, vuxen, mänsklig hjärnvävnad. Isolerade primära mänskliga mikroglia kan fungera som ett verktyg för att studera cellulära processer i homeostas och sjukdom.
Abstract
Microglia är bosatta medfödda immunceller i centrala nervsystemet (CNS). Microglia spela en avgörande roll under utveckling, för att upprätthålla homeostas, och under infektion eller skada. Flera oberoende forskargrupper har belyst den centrala roll som mikroglia spelar i autoimmuna sjukdomar, autoinflammatory syndrom och cancer. Aktiveringen av mikroglia i vissa neurologiska sjukdomar kan direkt delta i patogena processer. Primär mikroglia är ett kraftfullt verktyg för att förstå immunsvaren i hjärnan, cell-cell interaktioner och dysregulated microglia fenotyper i sjukdom. Primär microglia härma in vivo mikroglial egenskaper bättre än förevigade mikroglial cellinjer. Mänskliga vuxna microglia uppvisar distinkta egenskaper jämfört med mänskliga fetala och gnagare microglia. Detta protokoll ger en effektiv metod för isolering av primär mikroglia från vuxna mänskliga hjärnan. Studera dessa microglia kan ge kritiska insikter i cell-cell interaktioner mellan microglia och andra bosatta cellulära populationer i CNS inklusive, oligodenadrocytes, nervceller och astrocyter. Dessutom kan mikroglia från olika mänskliga hjärnor odlas för karakterisering av unika immunsvar för personlig medicin och en myriad av terapeutiska tillämpningar.
Introduction
Det centrala nervsystemet (CNS) är konstruerad av ett komplext nätverk av nervceller och gliaceller1. Bland de gliaceller, microglia funktion som de medfödda immuncellerna i CNS2,3. Microglia ansvarar för att upprätthålla homeostas i den friska CNS4. Microglia spelar också en viktig roll i neuroutveckling, genom beskärning synapser2. Microglia är centrala för patofysiologi av flera neurologiska sjukdomar inklusive men inte begränsat till; Alzheimers sjukdom5, Parkinsons sjukdom6, stroke7, multipel skleros8, traumatisk hjärnskada9, neuropatisk smärta10, ryggmärgsskada11 och hjärntumörer som gliomas12.
Studier relaterade till CNS homeostas och sjukdomar utnyttja gnagare microglia på grund av en brist på kostnadseffektiva och tidseffektiva mänskliga primära microglia isolering protokoll13. Gnagare mikroglia likna primära mänskliga mikroglia i uttryck av gener som Iba-1, PU.1, DAP12 och M-CSF receptorn och har varit effektiva i att förstå normala samt sjuka hjärnan13. Intressant nog varierar uttrycket av flera immun relaterade gener såsom TLR4, MHC II, Siglec-11 och Siglec-3 mellan människa och gnagare microglia13. Uttrycket av flera gener varierar också i temporala uttryck och i neurodegenerativa sjukdomar hos bådaarterna 14,15. Dessa betydande skillnader gör mänskliga microglia en viktig modell för att studera microglia funktion i homeostas och sjukdom. Primär människa microglia kan också vara ett effektivt verktyg för preklinisk screening av potentiella läkemedelskandidater16. De ovan nämnda orsakerna understryker det växande behovet av kostnadseffektiva protokoll för isolering av primära mänskliga mikroglia.
Vi har utvecklat ett protokoll för isolering av primära mänskliga microglia från vuxna mänskliga hjärnvävnad som samlats in som ett resultat av kirurgiska fönster skapas för tumör samband eller andra kirurgiska samband. Metoden här skiljer sig avsevärt från befintliga metoder. Vi kunde isolera och odla mikroglia efter en transittid på ca 75 minuter från vävnadsinsamlingsplatsen för att starta isoleringsprotokollet i laboratoriet. Vi har använt supernatanten av L929 fibroblastceller för att främja tillväxten av isolerad mikroglia. Denna metod fokuserar specifikt på kulturen och utvecklingen av endast primära microglia. Den resulterande kulturen beredd är ca 80% mikroglia. Medan andra protokoll ger en berikad kultur av mikroglia genom densitet gradient centrifugering, flödescytometri och magnetiska pärlor, är protokollet en snabb, enkel, robust och kostnadseffektivt sätt att kultur primära mänskliga mikroglia17,18,19,20. Förmågan att utnyttja kirurgiskt bort levande vuxna hjärnvävnad i stället för fasta hjärnvävnader från kadaver visar en extra fördel av denna metod i motsats till befintliga förfaranden18,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla vävnader förvärvades efter etiska godkännande från institutet etik kommittéer indiska Institute of Technology Jodhpur och Alla Indien Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Tissue förvärv och bearbetning (Dag 0)
- Samla upp vävnaden i ett 50 mL-rör innehållande 10 mL iskall konstgjord cerebrospinalvätska (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glukos, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM sackaros)20. Se till att röret hålls på is om vävnaden behöver överföras till en annan plats.
OBS: Förbered aCSF i autoklaverat destillerat vatten. Filtrera den med 0,22 μmsprutedfilter i laminarhuven. Denna kan förvaras i 1 månad vid 4 °C. - Torka uppsamlingsröret försiktigt med 70% alkohol och överför till en aseptisk laminär luftflödeskammare.
- Kassera aCSF försiktigt och väg vävnad i ett aseptiskt tillstånd. Vävnad vikt är väsentlig till beräkna den volym av trypsin- EDTA behövde för följande stammen.
- Håll vävnaden i färskt varmt aCSF vid 37 °C i 5 minuter. Detta steg är avgörande för att undvika celldöd.
- Kassera aCSF och tvätta vävnad en gång med 1x PBS (fosfatbuffrad koksaltlösning) vid 37 °C. Se till att allt blod tvättas bort med upprepade PBS tvättar (efter behov).
- Inkubera vävnaden i varm PBS, vid 37 °C, i 5 min.
- Kassera PBS försiktigt och överför vävnad till en steriliserad Petriskål. PBS kan tas bort med en pipett. Detta kommer att förhindra all förlust av vävnad.
- Tärna vävnaden till små (minst 1 mm3) bitar med hjälp av en steril skalpell. Fint tärnad vävnad ger högre vävnad yta för vävnad dissociation genom trypsin-EDTA säkerställa högre avkastning.
- Överför den tärnade vävnaden till ett 50 mL-rör som innehåller 10 mL/g vävnad på 0,25 % trypsin-EDTA och blanda genom pipettering genom en 10 mL serologisk pipett. Tillsätt 2 mL trypsin/EDTA till en Petri-skål och tvätta plattan noggrant med hjälp av pipett. Lägg till denna trypsin tillbaka till falken röret. Detta minimerar förlust av vävnad och celler medan tärning.
- Inkubera röret på en skakmaskin i 30 minuter vid 37 °C vid 250 rpm. Detta steg ökar dissociation av celler från vävnad.
- I slutet av inkubationen, tillsätt 10 mL neutraliserande medium (50% DMEM/50% F12 med glutamin, 1% penicillin-streptomycin, 10% FBS) för att neutralisera trypsin. Blanda med en 10 mL serologisk pipett. Mängden neutraliserande media som läggs till ska vara lika med mängden trypsin som används.
- Centrifugera röret vid 2 000 x g vid 4 °C i 10 minuter.
- Kassera supernatanten och åter upphäva pelleten i 1 mL av odlingsmedium (50% DMEM/50% F12 med glutamin, 1% penicillin-streptomycin, 20% L929 supernatant, 10% FBS).
OBS: L929 celler är kultur i DMEM (DMEM med glutamin, 1% penicillin-streptomycin, 10% FBS). ATCC rekommenderade odlingsmetoden bör följas för cellodling. Supernatant måste samlas in från odlingskolven som är minst 75 procent konfluent. Den kan samlas i bulk och lagras vid -80 °C för att förhindra nedbrytning av tillväxtfaktorer. Det rekommenderas att lägga till L929 supernatant separat i kolvar i stället för att lägga till beståndet odlingsmedium. - Platta cellerna i en T-25 kolv, lämpad för vidhäftande celler, och tillsätt 4 mL ytterligare odlingsmedium. Inkubera kolven vid 37 °C med 5% CO2. Skaka försiktigt kolven för att homogent skingra vävnaden. Undvik att föra media till kolvens hals, medan du skakar, eftersom detta kan öka risken för kontaminering.
2.Cell kultur (Dag 2)
- Samla in media från T-25-odlingskolven som är beredd dag 0 i tre 1,5 mL centrifugeringsrör genom att samla lika stora medievolymer i varje rör. Tvätta kolven en gång med 1 x PBS. Skaka kolven försiktigt för att avlägsna eventuella kvarleva vävnadsfragment som lämnas kvar. Undvik hårda skakningar av kolven eftersom eventuella restfragment inte kommer att påverka kulturen negativt. Tillsätt 5 mL färskt odlingsmedier till kolven.
- Centrifugera det insamlade mediet vid 1 466 x g (4000 rpm) vid 4 °C i 4 minuter.
- Kassera supernatanten från varje rör och tillsätt 1 mL odlingsmedium till ett av rören. Blanda noggrant med pipett. Tillsätt det blandade mediet med celler i andra rör i följetong. Blanda noggrant med pipett och pool cellerna i ett rör.
- Platta cellerna i en separat T-25 kolv, lämpad för vidhäftande celler. Tillsätt 4 mL odlingsmedium och inkubera kolven vid 37 °C med 5 % CO2.
3.Cell kultur (Dag 4)
- Kassera media från båda kolvarna och tillsätt färsk 5 ml odlingsmedier i kolven.
- Inkubera kolven vid 37 °C med 5%CO 2 i 2 dagar.
4. Cell kultur (Dag 6)
- Celler kommer att vara redo för ytterligare experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att använda ovan nämnda protokollet (Figur 1), kunde vi isolera primära mänskliga microglia från levande kirurgiskt resected hjärnvävnader. Odlade celler var färgas med Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectin för microglia (grön) och med Glial fibrillary acidic protein (GFAP) för astrocyter (röd) (Figur 2) som tidigarebeskrivits 22,23,24,25,26. 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) användes för att fläcka kärnor (blå). På den sjätte dagen från starten av experimentet var cellerna ordnar till för mer ytterligare experiment. Stained celler räknades blinda för microglia och astrocyter som finns i kulturen. Omkring 80% av primärkulturen var mikroglia (Figur 2).
Bild 1: Schematisk för primär mikrogliaisolering från vuxen hjärna. Kirurgiskt bort vävnad samlades i iskall 10 mL av aCSF i en 50 mL rör och överförs till laboratoriet. Vävnaden tvättades med aCSF respektive PBS och fint tärnad, dissocieras med hjälp av trypsin-EDTA och pläterade i en T-25 kolv. På den andra dagen media samlades in och centrifuged. Pellet blandades i färska medier och pläterades i en T-25 kolv. Färska medier lades till den första kolven. Media ändrades i båda kolven varannan dag. Celler var redo för ytterligare experiment på dag 6. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Immuncytokemi av isolerade primära mänskliga microglia. (A) Isolerade celler var pläterade i en två väl kammare glida och var färgas med GFAP för astrocyter (Green-första panelen) eller RCA för microglia (Green-andra panel). Kärnor var färgas blå med DAPI. Kontrollen för RCA och sekundär antikroppskontroll för GFAP visas i inset. (B) Isolerade celler var pläterade i en två väl kammare glida och var färgas med RCA för microglia (grön) och GFAP för astrocyter (röd). Den andra raden visar kontrollen för RCA och sekundär antikroppskontroll för GFAP. Kärnor var färgas blå med DAPI. (C) Celler räknades av blindad kontroll. Kvantifiering är representativt för att räkna med en förblindad kontroll. Omkring 80% av cellerna var mikroglia. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microglia säkerställa homeostas i den normala hjärnan och spela centrala roller i patofysiologi av olika neurologiska sjukdomar4. Microglia är centrala för neuroutveckling och bildande av synapser2. Mikroglialstudier har visat sig vara avgörande för att förstå utvecklingen och utvecklingen av olika neurologiska sjukdomar4. Gnagare microglia är den förhärskande modellen av val för primära mikroglialstudier, även om, gnagare microglia skiljer sig från primära mänskliga mikroglia i viktiga aspekter13. Utveckling av kostnadseffektiva, högavkastande, protokoll för isolering av primära mänskliga mikroglia kan bidra till att överbrygga denna klyfta. Vi har utvecklat ett protokoll för isolering av primära mänskliga microglia från levande, kirurgiskt resected, vuxna, mänskliga hjärnvävnad. Vi kunde uppnå mikroglial renhet på ca 80% som kontrolleras den 7dagen.
En av de mest kritiska stegen i protokollet var transport av förvärvad vävnad till laboratoriet för bearbetning. Eftersom transittiden var ca 75 minuter, var det troligt att vi kanske inte kan isolera några celler. Vi lyckades detta genom att använda en 50 mL rör med endast 10 mL aCSF. aCSF som de nödvändiga näringsämnen och det återstående utrymmet i röret hjälpte till att aerera aCSF och vävnad. Det finns möjlighet att det fanns betydande död av nervceller och andra celler under transitperioden. Medan detta hjälper till med isolering av mikroglia, kan detta protokoll inte vara effektivt för isolering av andra neurologiska celler. Vi kunde isolera mikroglial celler från 268 mg dissekerat vävnad. Vi kunde också uppnå betydande renhet av microglia genom att också undvika beläggning av kolv genom poly-D-lysin. Även om detta kan ha resulterat i en viss förlust av mikroglia, detta också undvek andra gliapopulation från att följa kolven. Dessutom undvek detta ett extra steg att skaka kolven och samla mikroglia. Det var möjligt att vissa av cellerna kanske inte hade hållit sig kvar i den kolv som var beredd dag 0. Vi samlade in icke-anhängare celler från den ursprungliga kulturen och pläterade den igen i en annan kolv dag 2, vilket också gav mikrogliaceller. Det bör noteras att fint tärning av vävnaden är viktigt eftersom det kommer att öka ytan av vävnaden. Detta gör det möjligt trypsin att få tillgång till de flesta av vävnaden och dissociate fler celler.
För att främja tillväxten av mikroglia i kulturen har vi betingat odlingsmediet med supernatanten av L929 celler27,28. Detta ger en rik källa till Granulocyt-makrofag koloni stimulerande faktor (GM-CSF) som ett komplement, som förbättrar makrofag spridning27,29. Detta bidrog till att minska kostnaderna för ytterligare dyra tillväxt kosttillskott som är en stöttepelare i flera mikroglial primära isolering protokoll. Lägga till L929 supernatant är avgörande för en effektiv isolering och tillväxt av mikroglia i protokollet. Men för labben utan L929 cellkultur, Detta blir ett begränsande steg med tanke på den totala kostnaden för protokollet som ytterligare tillväxt kosttillskott kommer att behövas. Vi kunde få en mikroglial befolkning på cirka 80% i kulturförhållandena. Detta är mindre än vissa publicerade protokoll men detta kan övervinnas genom att ha en ytterligare omgång isolering genom specifika protokoll som att använda magnetiska pärlor för specifika mikroglialmarkörer. Vid cirka 80% kultur renhet, är protokollet effektivt för många experiment som immuncytokemi. Men för experiment som proteinrening, protein identifiering och västra blotting, ytterligare rening av kulturen kan behövas. Även med hög renhet av de primära kulturerna, finns det alltid en möjlighet att andra celler som finns i kulturen kan öka med längre kultur varaktighet. Vi har framgångsrikt odlade isolerade microglia i 9 dagar genom passaging dem en gång. Medan odlingsförhållandena i protokollet gynnar isolering och tillväxt av mikroglia, bör närvaron av andra celler övervägas när man underhåller kulturen under längre tid.
Detta protokoll för att isolera primär mikroglia är effektivt, robust och kostnadseffektivt. Sådana protokoll för isolering av primär mänsklig mikroglia från vuxna hjärnvävnad kommer att möjliggöra snabb forskning om immunfunktioner, cellfysiologi och sjukdomssvar i den vuxna hjärnan. Dessutom kan patienten härledda primära microglia stöd i utvecklingen av personliga, framtida therapeutics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
SJs laboratorium inrättades med institutionella bidrag från IITJ och finansieras genom bidrag från Institutionen för bioteknik (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) och Ministry of Electronics and Information Technology Government of India (No.4(16)/2019-ITEA). Den mänskliga hjärnvävnad avsnitten erhölls från All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur efter institutionella etik kommitté godkännande. Vi tackar Mayank Rathor, B.Tech Student medlem av Design och Konst Samhälle IIT Jodhpur, för videography stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
