Summary
Denne protokollen er en effektiv, kostnadseffektiv og robust metode for å isolere primærmikroglia fra levende, voksent, menneskelig hjernevev. Isolert primær human mikroglia kan tjene som et verktøy for å studere cellulære prosesser i homeostase og sykdom.
Abstract
Microglia er bosatt medfødte immunceller i sentralnervesystemet (CNS). Microglia spiller en kritisk rolle under utviklingen, i å opprettholde homeostase, og under infeksjon eller skade. Flere uavhengige forskningsgrupper har fremhevet den sentrale rollen som microglia spiller i autoimmune sykdommer, autoinflammatoriske syndromer og kreft. Aktiveringen av microglia i noen nevrologiske sykdommer kan direkte delta i patogene prosesser. Primær mikroglia er et kraftig verktøy for å forstå immunresponsene i hjernen, cellecelleinteraksjoner og dysregulerte mikrogliafenotyper i sykdom. Primær microglia etterligne in vivo mikrogliale egenskaper bedre enn udødeliggjort mikroglial cellelinjer. Human voksen microglia viser forskjellige egenskaper sammenlignet med humant foster og gnagermikroglia. Denne protokollen gir en effektiv metode for isolering av primær mikroglia fra voksen menneskelig hjerne. Å studere disse mikroglia kan gi kritisk innsikt i cellecelleinteraksjoner mellom microglia og andre fastboende cellulære populasjoner i CNS, inkludert oligodendrocytter, nevroner og astrocytter. I tillegg kan microglia fra forskjellige menneskelige hjerner dyrkes for karakterisering av unike immunresponser for personlig medisin og et mylder av terapeutiske applikasjoner.
Introduction
Sentralnervesystemet (CNS) er konstruert av et komplekst nettverk av nevroner og glialceller1. Blant glialcellene fungerer microglia som de medfødte immuncellene i CNS2,3. Microglia er ansvarlig for å opprettholde homeostase i den sunne CNS4. Microglia spiller også en viktig rolle i nevroutvikling, ved beskjæring synapser2. Microglia er sentrale i patofysiologien til flere nevrologiske sykdommer, inkludert, men ikke begrenset til; Alzheimers sykdom5, Parkinsons sykdom6, hjerneslag7, multippel sklerose8, traumatisk hjerneskade9, nevropatisk smerte10, ryggmargsskade11 og hjernesvulster som gliomer12.
Studier relatert til CNS homeostase og sykdommer benytter gnagermikroglia på grunn av en mangel på kostnadseffektive og tidseffektive menneskelige primære mikrogliaiisolasjonsprotokoller13. Rodent microglia ligner primær human mikroglia i uttrykk for gener som Iba-1, PU.1, DAP12 og M-CSF reseptor og har vært effektive i å forstå normal samt syk hjerne13. Interessant, uttrykket av flere immunrelaterte gener som TLR4, MHC II, Siglec-11 og Siglec-3 varierer mellom menneskelig og gnager microglia13. Uttrykket av flere gener varierer også i timelig uttrykk og i nevrodegenerative sykdommer i beggeartene 14,15. Disse signifikante forskjellene gjør menneskelig mikroglia til en viktig modell for å studere mikrogliafunksjon i homeostase og sykdom. Primær menneskelig microglia kan også være et effektivt verktøy for preklinisk screening av potensielle legemiddelkandidater16. De ovennevnte årsakene understreker det økende behovet for kostnadseffektive protokoller for isolering av primær menneskelig mikroglia.
Vi har utviklet en protokoll for isolering av primær menneskelig mikroglia fra voksent menneskelig hjernevev samlet som følge av kirurgisk vindu opprettet for tumorreseksjoner eller andre kirurgiske reseksjoner. Metoden her er betydelig forskjellig fra eksisterende metoder. Vi var i stand til å isolere og kultur microglia etter en transitttid på ca 75 minutter fra vevsamlingsstedet for å starte isolasjonsprotokollen i laboratoriet. Vi har brukt supernatant av L929 fibroblast celler for å fremme veksten av isolertmikroglia. Denne metoden fokuserer spesielt på kultur og utvikling av bare primære microglia. Den resulterende kulturen utarbeidet er ca 80% microglia. Mens andre protokoller gir en beriket kultur av mikroglia ved tetthet gradient sentrifugering, strømningscytometri og magnetiske perler, er protokollen en rask, enkel, robust og kostnadseffektiv måte å kultur primære menneskelige microglia17,18,19,20. Evnen til å utnytte kirurgisk fjernet levende voksen hjernevev i stedet for fast hjernevev fra beviser en ekstra fordel med denne metoden i motsetning til eksisterende prosedyrer18,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle vev ble kjøpt etter etisk klarering fra instituttets etiske komiteer ved Indian Institute of Technology Jodhpur og All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Tissue oppkjøp og behandling (Dag 0)
- Samle vevet i et 50 ml rør som inneholder 10 ml iskald kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glukose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3,2,5 mM NaH2PO4,1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM sukrose)20. Sørg for at røret holdes på is hvis vevet må overføres til et annet sted.
MERK: Forbered aCSF i autoklavet destillert vann. Filtrer det med 0,22 μm sprøytefilter i laminærhetten. Dette kan oppbevares i 1 måned ved 4 °C. - Tørk oppsamlingsrøret forsiktig med 70% alkohol og overfør til et aseptisk laminær luftstrømkammer.
- Kast aCSF nøye og veie vev i aseptisk tilstand. Vevsvekt er viktig for å beregne volumet av trypsin-EDTA som trengs for påfølgende trinn.
- Oppbevar vevet i frisk varm aCSF ved 37 °C i 5 minutter. Dette trinnet er avgjørende for å unngå celledød.
- Kast aCSF og vask vev én gang med 1x PBS (fosfatbufret saltvann) ved 37 °C. Sørg for at alt blod vaskes bort med gjentatte PBS-vasker (etter behov).
- Inkuber vevet i varm PBS, ved 37 °C, i 5 min.
- Kast PBS nøye og overfør vev til en sterilisert petriskål. PBS kan fjernes med en pipette. Dette vil forhindre tap av vev.
- Terninger vevet i små (minst 1 mm3) stykker ved hjelp av en steril skalpell. Fint terninger vev gir høyere vev overflateareal for vev dissosiasjon av trypsin-EDTA sikre høyere utbytte.
- Overfør terninger vev til en 50 ml rør som inneholder 10 ml / g vev på 0,25% trypsin-EDTA og bland ved pipettering gjennom en 10 ml serologisk pipette. Tilsett 2 ml trypsin/EDTA i en petriskål og vask platen grundig ved hjelp av pipette. Legg denne trypsin tilbake til falkerøret. Dette minimerer tap av vev og celler mens terninger.
- Inkuber røret på en shaker i 30 minutter ved 37 °C ved 250 omdr./min. Dette trinnet øker dissosiasjonen av celler fra vev.
- På slutten av inkubasjonen, tilsett 10 ml nøytraliserende medium (50% DMEM / 50% F12 med glutamin, 1% penicillin-streptomycin, 10% FBS) for å nøytralisere trypsin. Bland med en 10 ml serologisk pipette. Mengden nøytraliserende medier som legges til, skal være lik mengden trypsin som brukes.
- Sentrifuger røret ved 2000 x g ved 4 °C i 10 minutter.
- Kast den supernatante og re-suspendere pellet i 1 ml kultur medium (50% DMEM/ 50% F12 med glutamin, 1% penicillin-streptomycin, 20% L929 supernatant, 10% FBS).
MERK: L929 celler er kultur i DMEM (DMEM med glutamin, 1% penicillin-streptomycin, 10% FBS). ATCC anbefalt kultur metode bør følges for cellekultur. Supernatant må samles fra kulturkolben som er minst 75% samløpet. Det kan samles i bulk og lagres ved -80 °C for å hindre nedbrytning av vekstfaktorer. Det anbefales å legge til L929 supernatant separat i flasker i stedet for å legge til lagerkulturmediet. - Plate cellene i en T-25 kolbe, egnet for tilhengerceller, og tilsett 4 ml ekstra kultur medium. Inkuber kolben ved 37 °C med 5 % CO2. Rist forsiktig kolben for å homogent spre vevet. Unngå å bringe media til halsen på kolben, mens du rister, da dette kan øke sjansene for forurensning.
2.Cell kultur (Dag 2)
- Samle media fra T-25 kultur kolbe utarbeidet på dag 0 i tre 1,5 ml sentrifuge rør ved å samle like volum av media i hvert rør. Vask kolben én gang med 1 x PBS. Rist kolben forsiktig for å fjerne eventuelle restvevfragmenter igjen. Unngå hard risting av kolben som noen restfragmenter vil ikke påvirke kulturen negativt. Legg til 5 ml friske kulturmedier i kolben.
- Sentrifuger det innsamlede mediet ved 1466 x g (4000 o/min) ved 4 °C i 4 minutter.
- Kast det overnaturlige fra hvert rør og tilsett 1 ml kulturmedium til et av rørene. Bland godt med pipette. Legg serielt til blandede medier med celler i andre rør. Bland godt med pipette og pool cellene i ett rør.
- Plate cellene i en egen T-25 kolbe, egnet for tilhengerceller. Tilsett 4 ml kulturmedium og inkuber kolben ved 37 °C med 5 % CO2.
3.Cell kultur (Dag 4)
- Kast mediene fra begge kolben og tilsett friske 5 ml kulturmedier i kolben.
- Inkuber kolben ved 37 °C med 5 % CO2 i 2 dager.
4. Cellekultur (Dag 6)
- Celler vil være klare for ytterligere eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å bruke ovennevnte protokoll (figur 1) var vi i stand til å isolere primære menneskelige mikroglia fra levende kirurgisk resected hjernevev. Kultiverte celler ble farget med Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectin for microglia (grønn) og med Glial fibrillær surt protein (GFAP) for astrocytter (rød) (Figur 2) som tidligere beskrevet22,23,24,25,26. 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ble brukt til å flekke kjerner (blå). På den sjette dagen fra starten av eksperimentet var cellene klare for videre eksperimenter. Fargede celler ble regnet blinde for microglia og astrocytter tilstede i kulturen. Omtrent 80% av den primære kulturen var microglia (Figur 2).
Figur 1: Skjematisk av primær mikroglia isolasjon fra voksen hjerne. Kirurgisk fjernet vev ble samlet inn i iskaldt 10 ml aCSF i et 50 ml rør og overført til laboratoriet. Vevet ble vasket med henholdsvis aCSF og PBS og fint terninger, dissosiert ved hjelp av trypsin-EDTA og belagt i en T-25 kolbe. Den andre dagen media ble samlet inn og sentrifugert. Pellet ble blandet i friske medier og belagt i en T-25 kolbe. Ferske medier ble lagt til den første kolben. Media ble endret i begge kolben på alternative dager. Cellene var klare for ytterligere eksperimenter på dag 6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Immunocytochemistry av isolerte primære humane microglia. (A) Isolerte celler ble belagt i en to brønnkammer lysbilde og ble farget med GFAP for astrocytter (Green-first panel) eller RCA for microglia (Green-second panel). Kjerner var farget blå med DAPI. Kontrollen for RCA og sekundær antistoffkontroll for GFAP er vist i innløp. (B)Isolerte celler ble belagt i en to brønnkammer lysbilde og ble farget med RCA for microglia (grønn) og GFAP for astrocytter (rød). Den andre raden viser kontrollen for RCA og sekundær antistoffkontroll for GFAP. Kjerner var farget blå med DAPI. (C) Celler ble regnet med blindet kontroll. Kvantifisering er representativ for å telle med en blindet kontroll. Omtrent 80% av cellene var microglia. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microglia sikre homeostase i normal hjerne og spille sentrale roller i patofysiologien til ulike nevrologiske sykdommer4. Microglia er sentrale for nevroutvikling og dannelse av synapser2. Mikrogliale studier har vist seg avgjørende for å forstå utviklingen og utviklingen av ulike nevrologiske sykdommer4. Rodent microglia er den utbredte modellen for primære mikrogliale studier, selv om gnagermikroglia er forskjellig fra primær menneskelig mikroglia i viktige aspekter13. Utvikling av kostnadseffektive, høygivende protokoller for isolering av primær menneskelig mikroglia kan bidra til å bygge bro over dette gapet. Vi har utviklet en protokoll for isolering av primær human mikroglia fra levende, kirurgisk resected, voksen, menneskelig hjernevev. Vi var i stand til å oppnå mikroglial renhet på ca 80% som sjekket påden 7.
Et av de mest kritiske trinnene i protokollen var transport av ervervet vev til laboratoriet for behandling. Siden transittiden var omtrent 75 minutter, var det sannsynlig at vi kanskje ikke kunne isolere noen celler. Vi klarte dette ved å bruke et 50 ml rør med bare 10 ml aCSF. aCSF ga de nødvendige næringsstoffene og gjenværende plass i røret hjalp til med å aerate aCSF og vev. Det er mulighet for at det var betydelig død av nevroner og andre celler i transittperioden. Selv om dette hjelper med isolering av microglia, kan denne protokollen ikke være effektiv for isolering av andre nevrologiske celler. Vi var i stand til å isolere mikrogliale celler fra 268 mg dissekert vev. Vi var også i stand til å oppnå betydelig renhet av microglia ved også å unngå belegg av kolbe av poly-D-lysin. Selv om dette kan ha resultert i noe tap av microglia, unngikk dette også andre glialpopulasjoner fra å følge kolben. I tillegg unngikk dette et ekstra trinn for å riste kolben og samle microglia. Det var mulig at noen av cellene kanskje ikke hadde festet seg i kolben tilberedt på dag 0. Vi samlet ikke-tilhengerceller fra den opprinnelige kulturen og belagt den igjen i en annen kolbe på dag 2, som også ga mikrogliaceller. Det bør bemerkes at fint å skille vevet er viktig da det vil øke overflaten av vevet. Dette vil tillate trypsin å få tilgang til det meste av vevet og dissosiere flere celler.
For å fremme veksten av microglia i kulturen, har vi betinget kulturmediet med det overnaturlige av L929-cellene27,28. Dette gir en rik kilde til Granulocytt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF) som et supplement, noe som forbedrer makrofag spredning27,29. Dette bidro til å redusere kostnadene for ekstra dyre veksttilskudd som er en bærebjelke i flere mikrogliale primære isolasjonsprotokoller. Å legge til L929-supernatant er avgjørende for effektiv isolasjon og vekst av microglia i protokollen. Men for laboratorier uten L929 celle kultur, Dette blir et begrensende skritt vurderer den totale kostnaden for protokollen som ytterligere vekst kosttilskudd vil være nødvendig. Vi var i stand til å få en mikroglial befolkning på ca 80% i kulturforholdene. Dette er mindre enn noen publisert protokoll, men dette kan overvinnes ved å ha en ekstra runde med isolasjon gjennom spesifikke protokoller som å bruke magnetiske perler for bestemte mikrogliale markører. Med ca 80% kultur renhet, protokollen er effektiv for mange eksperimenter som immunocytochemistry. Men for eksperimenter som proteinrensing, proteinidentifikasjon og vestlig blotting, kan det være behov for ytterligere rensing av kulturen. Selv med høy renhet av de primære kulturer, er det alltid en mulighet for at andre celler tilstede i kulturen kan øke med lengre kulturvarighet. Vi har med hell dyrket isolert mikroglia i 9 dager ved å passere dem en gang. Mens kulturforholdene i protokollen favoriserer isolasjon og vekst av microglia, bør tilstedeværelsen av andre celler vurderes når du opprettholder kulturen for lengre varighet.
Denne protokollen for å isolere primærmikroglia er effektiv, robust og kostnadseffektiv. Slike protokoller for isolering av primær menneskelig mikroglia fra voksen hjernevev vil muliggjøre be gangsforsket forskning på immunfunksjoner, cellefysiologi og sykdomsresponser i den voksne hjernen. I tillegg kan pasientens avledede primære mikroglia hjelpe til med å utvikle personlige, fremtidige terapeutiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
SJs laboratorium ble etablert med institusjonelle tilskudd fra IITJ og er finansiert av tilskudd fra Institutt for bioteknologi (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) og Ministry of Electronics and Information Technology Government of India (Nr. 4(16)/2019-ITEA). De menneskelige hjernevevsseksjonene ble hentet fra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur etter institusjonell etikkkomitéklarering. Vi takker Mayank Rathor, B.Tech Student medlem av Design and Arts Society IIT Jodhpur, for videografi støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
