Summary
Dieses Protokoll ist eine effiziente, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus lebendem, erwachsenem, menschlichem Hirngewebe. Isolierte primäre menschliche Mikroglia kann als Werkzeug für die Untersuchung zellulärer Prozesse bei Homöostase und Krankheit dienen.
Abstract
Mikroglia sind ansässige angeborene Immunzellen des Zentralnervensystems (ZNS). Mikroglia spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung, bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und bei Infektionen oder Verletzungen. Mehrere unabhängige Forschungsgruppen haben die zentrale Rolle hervorgehoben, die Mikroglia bei Autoimmunerkrankungen, autoinflammatorischen Syndromen und Krebserkrankungen spielt. Die Aktivierung von Mikroglia bei einigen neurologischen Erkrankungen kann direkt an pathogenen Prozessen beteiligt sein. Primäre Mikroglia sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Immunantworten im Gehirn, Zell-Zell-Wechselwirkungen und dysregulierte Mikroglia-Phänotypen bei Krankheiten zu verstehen. Primäre Mikroglia imitieren in vivo mikroglia-Eigenschaften besser als verewigte mikrogliarische Zelllinien. Menschliche Erwachsene Mikroglia weisen unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu menschlichen fetalen und Nagetier Mikroglia. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Methode zur Isolierung von primären Mikroglia aus erwachsenen menschlichen Gehirn. Das Studium dieser Mikroglia kann kritische Einblicke in Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Mikroglia und anderen ansässigen Zellpopulationen im ZNS liefern, einschließlich Oligodendrozyten, Neuronen und Astrozyten. Darüber hinaus können Mikroglia aus verschiedenen menschlichen Gehirnen für die Charakterisierung einzigartiger Immunantworten für personalisierte Medizin und eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen kultiviert werden.
Introduction
Das Zentralnervensystem (ZNS) besteht aus einem komplexen Netzwerk von Neuronen und Gliazellen1. Unter den Gliazellen fungieren Mikroglia als angeborene Immunzellen der ZNS2,3. Microglia sind verantwortlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase im gesunden ZNS4. Mikroglia spielen auch eine wichtige Rolle in der Neuroentwicklung, durch den Schnitt von Synapsen2. Mikroglia sind zentral für die Pathophysiologie mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf; Alzheimer-Krankheit5, Parkinson-Krankheit6, Schlaganfall7, Multiple Sklerose8, traumatische Hirnverletzung9, neuropathische Schmerzen10, Rückenmarksverletzung11 und Hirntumoren wie Gliome12.
Studien im Zusammenhang mit ZNS-Homöostase und Krankheiten nutzen Nagetier-Mikroglia aufgrund eines Mangels an kosteneffizienten und zeiteffizienten menschlichen primären Mikroglia-Isolationsprotokollen13. Nagetier-Mikroglia ähneln primären menschlichen Mikroglia in Der Expression von Genen wie Iba-1, PU.1, DAP12 und M-CSF-Rezeptor und haben wirksam beim Verständnis normaler sowie kranker Gehirn13. Interessanterweise variiert die Expression mehrerer immunbezogener Gene wie TLR4, MHC II, Siglec-11 und Siglec-3 zwischen menschlicher und Nagetier-Mikroglia13. Die Expression mehrerer Gene variiert auch in der zeitlichen Expression und bei neurodegenerativen Erkrankungen bei beiden Arten14,15. Diese signifikanten Unterschiede machen menschliche Mikroglia zu einem wesentlichen Modell, um die Mikrogliafunktion bei Homöostase und Krankheit zu untersuchen. Primäre menschliche Mikroglia kann auch ein wirksames Werkzeug für das präklinische Screening von potenziellen Wirkstoffkandidaten16sein. Die oben genannten Gründe unterstreichen den wachsenden Bedarf an kostengünstigen Protokollen zur Isolierung primärer menschlicher Mikroglia.
Wir haben ein Protokoll zur Isolierung von primären menschlichen Mikroglia aus erwachsenen menschlichen Hirngewebe als Ergebnis der chirurgischen Fenster für Tumorresektionen oder andere chirurgische Resektionen erstellt entwickelt. Die Methode unterscheidet sich hier erheblich von den bestehenden Methoden. Wir waren in der Lage, Mikroglia nach einer Transitzeit von etwa 75 Minuten von der Gewebesammelstelle bis zum Start des Isolationsprotokolls im Labor zu isolieren und zu kultiieren. Wir haben den Überstand von L929-Fibroblastenzellen verwendet, um das Wachstum isolierter Mikroglia zu fördern. Diese Methode konzentriert sich speziell auf die Kultur und Entwicklung von nur primären Mikroglia. Die resultierende Kultur vorbereitet ist etwa 80% Mikroglia. Während andere Protokolle eine angereicherte Kultur der Mikroglia durch Dichtegradientzentrifugation, Durchflusszytometrie und magnetische Perlen bieten, ist das Protokoll eine schnelle, einfache, robuste und kostengünstige Möglichkeit, primäre menschliche Mikroglia17,18,19,20zu kulturieren. Die Fähigkeit, chirurgisch entferntes lebendes erwachsenes Hirngewebe anstelle von festem Hirngewebe von Kadavern zu nutzen, erweist sich als zusätzlicher Vorteil dieser Methode im Gegensatz zu bestehenden Verfahren18,21.
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Protocol
Alle Gewebe wurden nach ethischer Freigabe von den Ethikkommissionen des Indian Institute of Technology Jodhpur und all India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur erworben.
1.Gewebeerwerb und -verarbeitung (Tag 0)
- Sammeln Sie das Gewebe in einem 50 ml Rohr mit 10 ml eiskalte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) (2 mM CaCl22 H2O, 10 mM Glukose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2-H2O, 202 mM Saccharose)20. Stellen Sie sicher, dass die Röhre auf Eis gehalten wird, wenn das Gewebe an einen anderen Ort übertragen werden muss.
HINWEIS: Bereiten Sie aCSF in autoktoriertem destilliertem Wasser vor. Filtern Sie ihn mit 0,22 m Spritzenfilter in der laminaren Haube. Diese kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden. - Wischen Sie das Sammelrohr sorgfältig mit 70% Alkohol ab und übertragen Sie es in eine aseptische laminare Luftstromkammer.
- Entsorgen Sie aCSF sorgfältig und wiegen Sie Gewebe in einem aseptischen Zustand. Gewebegewicht ist wichtig, um das Volumen von Trypsin-EDTA für nachfolgende Schritte benötigt zu berechnen.
- Halten Sie das Gewebe in frischer Wärme aCSF bei 37 °C für 5 Minuten. Dieser Schritt ist entscheidend, um den Zelltod zu vermeiden.
- ACSF entsorgen und Gewebe einmal mit 1x PBS (Phosphat gepufferte Saline) bei 37 °C waschen. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Blut mit wiederholten PBS-Waschungen (bei Bedarf) weggespült wird.
- Inkubieren Sie das Gewebe in warmem PBS, bei 37 °C, für 5 min.
- Entsorgen Sie PBS sorgfältig und übertragen Sie Gewebe in eine sterilisierte Petrischale. PBS kann mit einer Pipette entfernt werden. Dies wird jeden Verlust von Gewebe zu verhindern.
- Das Gewebe mit einem sterilen Skalpell in kleine (mindestens 1 mm3)Stücke schneiden. Fein gewürfeltes Gewebe bietet eine höhere Gewebeoberfläche für die Gewebedissoziation durch Trypsin-EDTA, um eine höhere Ausbeute zu gewährleisten.
- Übertragen Sie das gewürfelte Gewebe in ein 50 ml-Rohr mit 10 ml/g Gewebe von 0,25% Trypsin-EDTA und mischen Sie es durch Pipettieren durch eine 10 ml serologische Pipette. Fügen Sie 2 ml Trypsin/EDTA in eine Petrischale und waschen Sie den Teller gründlich mit Hilfe von Pipette. Fügen Sie dieses Trypsin wieder in das Falkenrohr. Dies minimiert den Verlust von Gewebe und Zellen beim Dicing.
- Inkubieren Sie das Rohr 30 Minuten lang bei 37 °C bei 250 U/min. Dieser Schritt erhöht die Trennung von Zellen vom Gewebe.
- Am Ende der Inkubation 10 ml neutralisierendes Medium (50% DMEM/50% F12 mit Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 10% FBS) hinzufügen, um Trypsin zu neutralisieren. Mit einer 10 ml serologischen Pipette mischen. Die Menge der hinzugefügten neutralisierenden Medien sollte der Menge an Trypsin entsprechen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr bei 2.000 x g bei 4 °C für 10 Minuten.
- Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml Kulturmedium wieder auf (50% DMEM/50% F12 mit Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 20% L929 Überstand, 10% FBS).
HINWEIS: L929-Zellen sind Kultur in DMEM (DMEM mit Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin, 10% FBS). Die empfohlene ATCC-Kulturmethode sollte für die Zellkultur befolgt werden. Überstand muss aus dem Kulturkolben gesammelt werden, der mindestens 75% konfluent ist. Es kann in loser Schüttung gesammelt und bei -80 °C gelagert werden, um eine Verschlechterung der Wachstumsfaktoren zu verhindern. Es wird empfohlen, L929 Überstand separat in Kolben hinzuzufügen, anstatt das Stoffkulturmedium hinzuzufügen. - Die Zellen in einem T-25-Kolben, geeignet für anhaftende Zellen, plattieren und 4 ml zusätzliches Kulturmedium hinzufügen. Inkubieren Sie den Kolben bei 37 °C mit 5%CO2. Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um das Gewebe homogen zu zerstreuen. Vermeiden Sie es, die Medien an den Hals des Kolbens zu bringen, während Sie schütteln, da dies die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination erhöhen kann.
2.Zellkultur (Tag 2)
- Sammeln Sie die Medien aus dem T-25 Kulturkolben, der am Tag 0 in drei 1,5 ml Zentrifugenröhren hergestellt wurde, indem Sie in jedem Rohr gleiche Medienmengen sammeln. Waschen Sie den Kolben einmal mit 1 x PBS. Schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um alle restlichen Gewebefragmente zu entfernen. Vermeiden Sie ein hartes Schütteln des Kolbens, da Restfragmente die Kultur nicht beeinträchtigen. Fügen Sie dem Kolben 5 ml frische Kulturmedien hinzu.
- Zentrifugieren Sie die gesammelten Medien bei 1.466 x g (4000 U/min) bei 4 °C für 4 Minuten.
- Entsorgen Sie den Überstand aus jedem Rohr und fügen Sie 1 ml Kulturmedium zu einem der Rohre hinzu. Mit Pipette gründlich mischen. Fügen Sie das Mischmedium mit Zellen seriell zu anderen Röhren hinzu. Mit Pipette gründlich mischen und die Zellen in einem Rohr bündeln.
- Die Zellen in einem separaten T-25-Kolben, geeignet für anhaftende Zellen, verplatten. 4 ml Kulturmedium hinzufügen und den Kolben bei 37 °C mit 5%CO2bebrüten.
3.Zellkultur (Tag 4)
- Entsorgen Sie die Medien aus beiden Kolben und fügen Sie dem Kolben frische 5 ml Kulturmedien hinzu.
- Inkubieren Sie den Kolben bei 37 °C mit 5%CO2 für 2 Tage.
4. Zellkultur (Tag 6)
- Die Zellen werden für weitere Experimente bereit sein.
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Representative Results
Durch die Verwendung des oben genannten Protokolls (Abbildung 1) konnten wir primäre menschliche Mikroglia aus lebendem chirurgisch resektiertem Hirngewebe isolieren. Kultivierte Zellen wurden mit Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) Lektin für Mikroglia (grün) und mit Glial fibrilläres saures Protein (GFAP) für Astrozyten (rot)(Abbildung 2) gefärbt, wie zuvor beschrieben22,23,24,25,26. 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) wurde verwendet, um Kerne (blau) zu färben. Am sechsten Tag nach Beginn des Experiments waren die Zellen bereit für weitere Experimente. Gefärbte Zellen wurden blind für Mikroglia und Astrozyten in der Kultur vorhanden gezählt. Etwa 80 % der Primärkultur waren Mikroglia (Abbildung 2).
Abbildung 1: Schematic der primären Mikroglia-Isolation vom erwachsenen Gehirn. Chirurgisch entferntes Gewebe wurde in eiskalten 10 ml aCSF in einem 50 ml Schlauch gesammelt und ins Labor überführt. Das Gewebe wurde mit einem CSF bzw. PBS gewaschen und fein gewürfelt, mit Hilfe von Trypsin-EDTA getrennt und in einem T-25-Kolben plattiert. Am zweiten Tag wurden die Medien gesammelt und zentrifugiert. Pellet wurde in frischen Medien gemischt und in einem T-25-Kolben vergoldet. Frische Medien wurden dem ersten Kolben hinzugefügt. Die Medien wurden in beiden Kolben an wechselnden Tagen gewechselt. Die Zellen waren am 6. Tag bereit für weitere Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Immunzytochemie isolierter primärer menschlicher Mikroglia. (A) Isolierte Zellen wurden in einem Zwei-Kammer-Dia plattiert und mit GFAP für Astrozyten (Green-first Panel) oder RCA für Mikroglia (Green-Second Panel) gefärbt. Nuclei waren blau mit DAPI gefärbt. Die Steuerung für RCA und Sekundärantikörpersteuerung für GFAP wird im Einset angezeigt. (B) Isolierte Zellen wurden in einem Zwei-Kammer-Dia plattiert und mit RCA für Mikroglia (grün) und GFAP für Astrozyten (rot) befleckt. Die zweite Zeile zeigt die Steuerung für RCA und sekundäre Antikörpersteuerung für GFAP. Nuclei waren blau mit DAPI gefärbt. (C) Zellen wurden durch geblendete Steuerung gezählt. Quantifizierung ist repräsentativ für die Zählung durch eine geblendete Steuerung. Etwa 80% der Zellen waren Mikroglia. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Mikroglia sorgen für Homöostase im normalen Gehirn und spielen eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie verschiedener neurologischer Erkrankungen4. Mikroglia sind zentral für die Neuroentwicklung und Bildung von Synapsen2. Mikroglia-Studien haben sich als entscheidend für das Verständnis der Entwicklung und des Fortschreitens verschiedener neurologischer Erkrankungen erwiesen4. Nagetier-Mikroglia sind das vorherrschende Modell der Wahl für primäre mikroglia-Studien, obwohl Nagetier-Mikroglia sich von primären menschlichen Mikroglia in Schlüsselaspekten13unterscheiden. Die Entwicklung kostengünstiger, ertragreicher Protokolle zur Isolierung primärer menschlicher Mikroglia kann dazu beitragen, diese Lücke zu schließen. Wir haben ein Protokoll zur Isolierung von primären menschlichen Mikroglia von lebendem, chirurgisch reseziertem, erwachsenem, menschlichem Hirngewebe entwickelt. Wir konnten eine mikrogliaale Reinheit von ca. 80% erreichen, wie am7. Tag überprüft.
Einer der wichtigsten Schritte des Protokolls war der Transport von erworbenem Gewebe ins Labor zur Verarbeitung. Da die Transitzeit etwa 75 Minuten betrug, war es wahrscheinlich, dass wir möglicherweise keine Zellen isolieren können. Wir haben dies mit einem 50 ml Rohr mit nur 10 ml aCSF geschafft. aCSF lieferte die benötigten Nährstoffe und der verbleibende Platz in der Röhre half, das aCSF und Gewebe zu besamern. Es besteht die Möglichkeit, dass es während der Transitzeit zu einem erheblichen Tod von Neuronen und anderen Zellen kam. Während dies bei der Isolierung von Mikroglia hilft, ist dieses Protokoll möglicherweise nicht effizient für die Isolierung anderer neurologischer Zellen. Wir waren in der Lage, mikrogliaale Zellen aus 268 mg seziertem Gewebe zu isolieren. Wir konnten auch eine signifikante Reinheit der Mikroglia erreichen, indem wir auch die Beschichtung von Kolben durch Poly-D-Lysin vermieden haben. Während dies zu einem gewissen Verlust von Mikroglia geführt haben kann, verhinderte dies auch, dass andere Gliapopulationen an der Flasche haften. Darüber hinaus verhinderte dies einen zusätzlichen Schritt des Schüttelns des Kolbens und sammeln Mikroglia. Es war möglich, dass einige der Zellen nicht in dem Kolben haften, der am Tag 0 vorbereitet wurde. Wir sammelten nicht anhaftende Zellen aus der Anfangskultur und plattierten sie an Tag 2 wieder in einem anderen Kolben, der auch Mikrogliazellen ergab. Es sollte beachtet werden, dass eine feinsintische Ausweichung des Gewebes wichtig ist, da es die Oberfläche der Oberfläche des Gewebes erhöhen wird. Dies wird Trypsin ermöglichen, auf den größten Teil des Gewebes zuzugreifen und mehr Zellen zu dissoziieren.
Um das Wachstum von Mikroglia in der Kultur zu fördern, haben wir das Kulturmedium mit dem Überstand der L929-Zellen27,28konditioniert. Dies bietet eine reiche Quelle von Granulozyt-Makrophagen Kolonie stimulierenden Faktor (GM-CSF) als Ergänzung, die Makrophagen Proliferationverbessert 27,29. Dies trug dazu bei, die Kosten für zusätzliche teure Wachstumsergänzungen zu reduzieren, die ein Standbein mehrerer mikrogliaaler Primärisolationsprotokolle sind. Die Zugabe von L929-Überstand ist entscheidend für die effiziente Isolierung und das Wachstum von Mikroglia im Protokoll. Jedoch für die Labore ohne L929 Zellkultur, Dies wird ein begrenzender Schritt unter Berücksichtigung der Gesamtkosten des Protokolls, da zusätzliche Wachstumsergänzungen benötigt werden. Wir konnten eine mikrogliaale Bevölkerung von etwa 80% in den Kulturbedingungen bekommen. Dies ist weniger als einige veröffentlichte Protokoll, aber dies kann durch eine zusätzliche Runde der Isolation durch bestimmte Protokolle wie die Verwendung von magnetischen Perlen für bestimmte mikrogliaale Marker überwunden werden. Bei etwa 80% Kulturreinheit ist das Protokoll für viele Experimente wie die Immunzytochemie effizient. Für Experimente wie Proteinreinigung, Proteinidentifikation und Western-Blotting kann jedoch eine zusätzliche Reinigung der Kultur erforderlich sein. Selbst bei hoher Reinheit der Primärkulturen besteht immer die Möglichkeit, dass andere Zellen, die in der Kultur vorhanden sind, mit längerer Kulturdauer zunehmen. Wir haben erfolgreich isolierte Mikroglia für 9 Tage kultiviert, indem wir sie einmal passieren. Während die Kulturbedingungen im Protokoll die Isolierung und das Wachstum von Mikroglia begünstigt, sollte das Vorhandensein anderer Zellen berücksichtigt werden, wenn die Kultur für längere Zeit beibehalten wird.
Dieses Protokoll zur Isolierung von primärer Mikroglia ist effektiv, robust und kosteneffizient. Solche Protokolle zur Isolierung von primären menschlichen Mikroglia aus erwachsenem Gehirngewebe ermöglichen eine zeitnahe Erforschung von Immunfunktionen, Zellphysiologie und Krankheitsreaktionen im erwachsenen Gehirn. Darüber hinaus kann patientenabgeleitete primäre Mikroglia bei der Entwicklung personalisierter, zukünftiger Therapeutika helfen.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Das Labor des SJ wurde mit institutionellen Zuschüssen des IITJ eingerichtet und wird durch Zuschüsse der Abteilung Biotechnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) und des Ministeriums für Elektronik und Informationstechnologie der indischen Regierung (Nr. 4(16)/2019-ITEA) finanziert. Die menschlichen Hirngewebeabschnitte wurden vom All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur nach der Freigabe der institutionellen Ethikkommission bezogen. Wir danken Mayank Rathor, B.Tech Student Mitglied der Design and Arts Society IIT Jodhpur, für die Videofilmunterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
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