Summary
Este protocolo es un método eficiente, rentable y robusto para aislar la microglia primaria del tejido cerebral humano vivo, adulto. La microglia humana primaria aislada puede servir como una herramienta para estudiar los procesos celulares en la homeostasis y la enfermedad.
Abstract
Las microglia son células inmunitarias innatas residentes del sistema nervioso central (SNC). La microglia desempeña un papel fundamental durante el desarrollo, en el mantenimiento de la homeostasis y durante la infección o lesión. Varios grupos de investigación independientes han puesto de relieve el papel central que desempeñan las microglia en las enfermedades autoinmunes, los síndromes autoinflamatorios y los cánceres. La activación de la microglia en algunas enfermedades neurológicas puede participar directamente en procesos patógenos. La microglia primaria es una herramienta poderosa para entender las respuestas inmunitarias en el cerebro, las interacciones celulares y celulares y los fenotipos de microglia desregulados en la enfermedad. La microglia primaria imita las propiedades microgliaales in vivo mejor que las líneas celulares microgliaales inmortalizadas. La microglia adulta humana exhibe propiedades distintas en comparación con la microglia fetal y de roedores humanos. Este protocolo proporciona un método eficiente para el aislamiento de la microglia primaria del cerebro humano adulto. El estudio de estas microglias puede proporcionar información crítica sobre las interacciones entre células celulares entre la microglia y otras poblaciones celulares residentes en el SNC, incluidos los oligodendrocitos, las neuronas y los astrocitos. Además, la microglia de diferentes cerebros humanos puede ser cultivada para la caracterización de respuestas inmunitarias únicas para la medicina personalizada y una miríada de aplicaciones terapéuticas.
Introduction
El sistema nervioso central (SNC) está construido de una compleja red de neuronas y células gliales1. Entre las células gliales, la microglia funciona como las células inmunitarias innatas del SNC2,3. Microglia es responsable de mantener la homeostasis en el SNC sano4. Microglia también juega un papel importante en el neurodesarrollo, mediante la poda de sinapsis2. Las microglia son fundamentales para la fisiopatología de varias enfermedades neurológicas, incluyendo pero no limitado a; Enfermedad de Alzheimer5, Enfermedad de Parkinson6, accidente cerebrovascular7, esclerosis múltiple8, lesión cerebral traumática9, dolor neuropático10, lesión de la médula espinal11 y tumores cerebrales como gliomas12.
Los estudios relacionados con la homeostasis y las enfermedades del SNC utilizan microglia de roedores debido a una escasez de protocolos de aislamiento de microglia primaria humana rentables y eficientes en el tiempo13. La microglia de roedores se asemeja a la microglia humana primaria en la expresión de genes como iba-1, PU.1, DAP12 y receptor M-CSF y han sido eficaces en la comprensión de cerebros normales y enfermos13. Curiosamente, la expresión de varios genes inmunes relacionados como TLR4, MHC II, Siglec-11 y Siglec-3 varía entre la microglia humana y la microglia de roedores13. La expresión de varios genes también varía en la expresión temporal y en las enfermedades neurodegenerativas en ambas especies14,,15. Estas diferencias significativas hacen de la microglia humana un modelo esencial para estudiar la función de la microglia en la homeostasis y la enfermedad. La microglia humana primaria también puede ser una herramienta eficaz para el cribado preclínico de posibles candidatos a medicamentos16. Las razones antes mencionadas subrayan la creciente necesidad de protocolos rentables para el aislamiento de la microglia humana primaria.
Hemos desarrollado un protocolo para el aislamiento de la microglia humana primaria a partir del tejido cerebral humano adulto recogido como resultado de la ventana quirúrgica creada para resección de tumores u otras resecciones quirúrgicas. El método aquí es considerablemente diferente de los métodos existentes. Pudimos aislar y cultivar microglia después de un tiempo de tránsito de unos 75 minutos desde el sitio de recolección de tejidos hasta iniciar el protocolo de aislamiento en el laboratorio. Hemos utilizado el sobrenadante de células de fibroblastos L929 para promover el crecimiento de microglia aislada. Este método se centra específicamente en la cultura y el desarrollo de sólo la microglia primaria. El cultivo resultante preparado es de aproximadamente 80% microglia. Mientras que otros protocolos proporcionan un cultivo enriquecido de microglia por centrifugación de gradiente de densidad, citometría de flujo y cuentas magnéticas, el protocolo es una forma rápida, simple, robusta y rentable de cultivar microglia humana primaria17,18,19,20. La capacidad de utilizar el tejido cerebral adulto vivo extirpado quirúrgicamente en lugar de los tejidos cerebrales fijos de los cadáveres demuestra una ventaja adicional de este método en contraste con los procedimientos existentes18,,21.
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Protocol
Todos los tejidos fueron adquiridos después de la autorización ética de los comités de ética del Instituto Indio de Tecnología Jodhpur y el Instituto de Ciencias Médicas de all India (AIIMS) Jodhpur.
1.Adquisición y procesamiento de tejidos (Día 0)
- Recoger el tejido en un tubo de 50 ml que contenga 10 ml de líquido cefalorraquídeo artificial helado (aCSF) (2 mM CaCl2a 2H2O, 10 mM de glucosa, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2a6H 2O, 202 mM sacarosa)20. Asegúrese de que el tubo se mantiene en hielo si el tejido necesita ser transferido a un lugar diferente.
NOTA: Prepare el aCSF en agua destilada autoclavada. Filtrar con un filtro de jeringa de 0,22 m en la campana laminar. Esto se puede almacenar durante 1 mes a 4 oC. - Limpie el tubo de recogida cuidadosamente con 70% de alcohol y transfiera a una cámara de flujo de aire laminar aséptica.
- Deseche el aCSF cuidadosamente y pese el tejido en una condición aséptica. El peso del tejido es esencial para calcular el volumen de tripsina-EDTA necesario para los pasos posteriores.
- Mantener el tejido en aCSF fresco y caliente a 37 oC durante 5 minutos. Este paso es fundamental para evitar la muerte celular.
- Deseche el aCSF y lave el tejido una vez con 1 PBS (solución salina tamponada de fosfato) a 37 oC. Asegúrese de que toda la sangre se lave con lavados repetidos de PBS (según sea necesario).
- Incubar el tejido en PBS caliente, a 37oC, durante 5 min.
- Deseche PBS cuidadosamente y transfiera el tejido a una placa Petri esterilizada. PBS se puede quitar con una pipeta. Esto evitará cualquier pérdida de tejido.
- En dados el tejido en trozos pequeños (al menos 1 mm3)utilizando un bisturí estéril. El tejido finamente cortado en cubos proporciona una mayor superficie tisular para la disociación de tejidos por trippsina-EDTA asegurando un mayor rendimiento.
- Transfiera el tejido cortado en cubos a un tubo de 50 ml que contenga 10 ml/g de tejido de 0,25% de trippsina-EDTA y mezcle pipeteando a través de una pipeta serológica de 10 ml. Agregue 2 ml de tripps/EDTA a un plato de Petri y lave bien la placa con la ayuda de la pipeta. Añade esta tripina al tubo de halcón. Esto minimiza la pérdida de tejido y células mientras se dicing.
- Incubar el tubo en una coctelera durante 30 minutos a 37 oC a 250 rpm. Este paso aumenta la disociación de las células del tejido.
- Al final de la incubación, añadir 10 mL de medio neutralizador (50% DMEM/50% F12 con glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS) para neutralizar la tripina. Mezclar con una pipeta serológica de 10 ml. La cantidad de medios neutralizantes añadidos debe ser igual a la cantidad de tripsina utilizada.
- Centrifugar el tubo a 2.000 x g a 4 oC durante 10 minutos.
- Desechar el sobrenadante y re-suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo (50% DMEM/50% F12 con glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 20% sobrenadante L929, 10% FBS).
NOTA: Las células L929 se cultivan en DMEM (DMEM con glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS). Se debe seguir el método de cultivo recomendado por ATCC para el cultivo celular. El sobrenadante debe recogerse del matraz de cultivo que sea al menos del 75% confluente. Se puede recoger a granel y almacenar a -80 oC para evitar la degradación de los factores de crecimiento. Se recomienda añadir L929 sobrenadante por separado en matraces en lugar de añadir al medio de cultivo de stock. - Placar las células en un matraz T-25, adecuado para las células adherentes, y añadir 4 ml de medio de cultivo adicional. Incubar el matraz a 37oC con 5% de CO2. Agitar cuidadosamente el matraz para dispersar homogéneamente el tejido. Evite llevar el soporte al cuello del matraz, mientras agita, ya que esto puede aumentar las posibilidades de contaminación.
2.Cultivo celular (Día 2)
- Recoger los medios del matraz de cultivo T-25 preparado el día 0 en tres tubos centrífugos de 1,5 ml mediante la recogida del mismo volumen de medios en cada tubo. Lave el matraz una vez con 1 x PBS. Agitar el matraz suavemente para eliminar los fragmentos de tejido remanente que queden. Evite el temblor brusca del matraz, ya que los fragmentos remanentes no afectarán negativamente al cultivo. Añadir 5 ml de medios de cultivo frescos al matraz.
- Centrifugar los medios recogidos a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 oC durante 4 minutos.
- Deseche el sobrenadante de cada tubo y agregue 1 ml de medio de cultivo a uno de los tubos. Mezclar bien con la pipeta. Agregue en serie los medios mixtos con las células a otros tubos. Mezclar bien con la pipeta y agrupar las células en un tubo.
- Placar las células en un matraz T-25 separado, adecuado para las células adherentes. Añadir 4 ml de medio de cultivo e incubar el matraz a 37oC con un 5% de CO2.
3.Cultivo celular (Día 4)
- Deseche el soporte de ambos matraces y añada 5 ml de medios de cultivo al matraz.
- Incubar el matraz a 37oC con 5% deCO2 durante 2 días.
4. Cultivo celular (Día 6)
- Las células estarán listas para más experimentos.
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Representative Results
Mediante el uso del protocolo antes mencionado (Figura 1), pudimos aislar la microglia humana primaria de los tejidos cerebrales resecados quirúrgicamente en vivo. Las células cultivadas se tiñeron con Ricinus communis agglutinina-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) y con proteína ácida fibrillaria Glial (GFAP) para astrocitos (rojo) (Figura 2) como se describió anteriormente22,23,24,25,26. Se utilizó 4o,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para manchar los núcleos (azul). En el sexto día desde el inicio del experimento, las células estaban listas para nuevos experimentos. Las células manchadas se contaron ciegas para la microglia y los astrocitos presentes en el cultivo. Alrededor del 80% del cultivo primario eran microglia(Figura 2).
Figura 1: Esquema del aislamiento primario de la microglia del cerebro adulto. El tejido extirpado quirúrgicamente se recogió en hielo frío 10 ml de aCSF en un tubo de 50 ml y se transfirió al laboratorio. El tejido fue lavado con aCSF y PBS respectivamente y finamente cortado en cubos, disociado con la ayuda de la trippsina-EDTA y chapado en un matraz T-25. El segundo día los medios de comunicación fueron recogidos y centrifugados. Pellet se mezclaba en medios frescos y se enmadaba en un matraz T-25. Se añadieron medios frescos al primer matraz. Los medios se cambiaron en ambos frascos en días alternos. Las células estaban listas para nuevos experimentos en el día 6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:Inmunocitoquímica de microglia humana primaria aislada. (A) Las células aisladas se placaron en un tobogán de cámara de dos pozos y se teñiron con GFAP para astrocitos (panel verde-primer) o RCA para microglia (panel verde-segundo). Los núcleos se tiñeron de azul con DAPI. El control de RCA y el control secundario de anticuerpos para GFAP se muestra inset. (B) Las células aisladas estaban chapadas en un tobogán de cámara de dos pozos y se teñiron con RCA para microglia (verde) y GFAP para astrocitos (rojo). La segunda fila muestra el control de RCA y el control de anticuerpos secundarios para GFAP. Los núcleos se tiñeron de azul con DAPI. (C) Las celdas se contaron mediante control cegado. La cuantificación es representativa del escrutinio por un control cegado. Alrededor del 80% de las células eran microglia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Microglia asegurar la homeostasis en el cerebro normal y desempeñar un papel central en la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas4. Las microglia son fundamentales para el neurodesarrollo y la formación de sinapsis2. Los estudios microgliales han demostrado ser fundamentales para comprender el desarrollo y la progresión de diversas enfermedades neurológicas4. La microglia de roedores es el modelo predominante de elección para los estudios microgliales primarios, a pesar de que, la microglia de los roedores es diferente de la microglia humana primaria en aspectos clave13. El desarrollo de protocolos rentables y de alto rendimiento para el aislamiento de la microglia humana primaria puede ayudar a cerrar esta brecha. Hemos desarrollado un protocolo para el aislamiento de la microglia humana primaria del tejido cerebral humano vivo, resecado quirúrgicamente, adulto. Pudimos alcanzar una pureza microglial de alrededor del 80% como se comprueba el día7.
Uno de los pasos más críticos del protocolo fue el transporte de tejido adquirido al laboratorio para su procesamiento. Como el tiempo de tránsito era de unos 75 minutos, era probable que no pudiéramos aislar ninguna célula. Lo gestionamos utilizando un tubo de 50 ml con solo 10 ml de aCSF. aCSF proporcionó los nutrientes requeridos y el espacio restante en el tubo ayudó a airear el aCSF y el tejido. Existe la posibilidad de que hubo una muerte considerable de neuronas y otras células durante el período de tránsito. Si bien esto ayuda con el aislamiento de la microglia, este protocolo puede no ser eficiente para el aislamiento de otras células neurológicas. Pudimos aislar células microgliales de 268 mg de tejido diseccionado. También pudimos lograr una pureza significativa de la microglia evitando también el recubrimiento del matraz por poli-D-lisina. Si bien esto puede haber dado lugar a cierta pérdida de microglia, esto también evitó que otra población glial se adhirieron al matraz. Además, esto evitó un paso adicional de agitar el matraz y recoger la microglia. Era posible que algunas de las células no se hubieran adherido en el matraz preparado el día 0. Recogimos células no adherentes del cultivo inicial y la encamanciamos de nuevo en otro matraz el día 2, que también produjo células de microglia. Cabe señalar que la osa finamente el tejido es importante, ya que aumentará la superficie de la superficie del tejido. Esto permitirá a la trippsina acceder a la mayor parte del tejido y disociar más células.
Para promover el crecimiento de la microglia en el cultivo, hemos condicionado el medio de cultivo con el sobrenadante de L929 células27,,28. Esto proporciona una rica fuente de factor estimulante de colonia de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) como un suplemento, que mejora la proliferación de macrófagos27,,29. Esto ayudó a reducir el costo de suplementos de crecimiento caros adicionales que son un pilar de varios protocolos de aislamiento primario microglial. La adición de sobrenadantes L929 es crucial para el aislamiento eficiente y el crecimiento de la microglia en el protocolo. Sin embargo para los laboratorios sin cultivo celular L929, Esto se convierte en un paso limitante teniendo en cuenta el costo general del protocolo como suplementos de crecimiento adicionales serán necesarios. Pudimos obtener una población microglial de alrededor del 80% en las condiciones de cultivo. Esto es menor que algún protocolo publicado, pero esto se puede superar al tener una ronda adicional de aislamiento a través de protocolos específicos como el uso de cuentas magnéticas para marcadores microgliales específicos. Con alrededor del 80% de pureza del cultivo, el protocolo es eficiente para muchos experimentos como la inmunocitoquímica. Sin embargo, para experimentos como la purificación de proteínas, la identificación de proteínas y la hinchazón occidental, puede ser necesaria una purificación adicional del cultivo. Incluso con alta pureza de los cultivos primarios, siempre existe la posibilidad de que otras células presentes en el cultivo puedan aumentar con una mayor duración del cultivo. Hemos cultivado con éxito microglia aislada durante 9 días pasándolos una vez. Mientras que las condiciones de cultivo en el protocolo favorecen el aislamiento y crecimiento de la microglia, la presencia de otras células debe tenerse en cuenta al mantener el cultivo durante más tiempo.
Este protocolo para aislar la microglia primaria es eficaz, robusto y rentable. Tales protocolos para el aislamiento de la microglia humana primaria del tejido cerebral adulto permitirán la investigación oportuna sobre las funciones inmunitarias, la fisiología celular y las respuestas a enfermedades en el cerebro adulto. Además, la microglia primaria derivada del paciente puede ayudar en el desarrollo de terapias personalizadas y futuras.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El laboratorio de SJ se estableció con subvenciones institucionales del IITJ y está financiado por subvenciones del Departamento de Biotecnología (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) y del Ministerio de Electrónica y Tecnología de la Información del Gobierno de la India (No 4(16)/2019-ITEA). Las secciones de tejido cerebral humano se obtuvieron del Instituto de Ciencias Médicas de All India (AIIMS) Jodhpur después de la autorización del comité de ética institucional. Agradecemos a Mayank Rathor, estudiante de B.Tech Student miembro de la Sociedad de Diseño y Artes IIT Jodhpur, por el apoyo a la videografía.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
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