Summary
Dit protocol is een efficiënte, kosteneffectieve en robuuste methode voor het isoleren van primaire microglia van levend, volwassen, menselijk hersenweefsel. Geïsoleerde primaire menselijke microglia kan dienen als een instrument voor het bestuderen van cellulaire processen in homeostase en ziekte.
Abstract
Microglia zijn ingezeten ingeboren immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CNS). Microglia spelen een cruciale rol tijdens de ontwikkeling, bij het handhaven van homeostase, en tijdens infectie of letsel. Verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen hebben gewezen op de centrale rol die microglia spelen in auto-immuunziekten, auto-inflammatoire syndromen en kanker. De activering van microglia bij sommige neurologische ziekten kan direct deelnemen aan pathogene processen. Primaire microglia zijn een krachtig hulpmiddel om de immuunreacties in de hersenen, celcelinteracties en geantreguleerde microglia fenotypes bij ziekte te begrijpen. Primaire microglia bootsen in vivo microgliale eigenschappen beter na dan vereeuwigde microgliale cellijnen. Menselijke volwassen microglia vertonen verschillende eigenschappen in vergelijking met menselijke foetale en knaagdier microglia. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor isolatie van primaire microglia van volwassen menselijke hersenen. Het bestuderen van deze microglia kan kritische inzichten bieden in celcelinteracties tussen microglia en andere ingezeten cellulaire populaties in het CNS, waaronder oligodendrocyten, neuronen en astrocyten. Bovendien, microglia uit verschillende menselijke hersenen kan worden gekweekt voor karakterisering van unieke immuunreacties voor gepersonaliseerde geneeskunde en een groot aantal therapeutische toepassingen.
Introduction
Het centrale zenuwstelsel (CNS) is opgebouwd uit een complex netwerk van neuronen en gliacellen1. Onder de gliacellen functioneert microglia als de aangeboren immuuncellen van het CNS2,3. Microglia is verantwoordelijk voor het behoud van homeostase in het gezonde CNS4. Microglia spelen ook een belangrijke rol in de neuroontwikkeling, door het snoeien van synapsen2. Microglia staan centraal in de pathofysiologie van verschillende neurologische aandoeningen, waaronder maar niet beperkt tot; De ziekte van Alzheimer5, De ziekte van Parkinson6, beroerte7,multiple sclerose8, traumatisch hersenletsel9, neuropathische pijn10, dwarslaesie11 en hersentumoren zoals gliomen12.
Studies met betrekking tot CNS homeostase en ziekten maken gebruik van knaagdier microglia als gevolg van een gebrek aan kostenefficiënte en tijdefficiënte menselijke primaire microglia isolatie protocollen13. Knaagdier microglia lijken op primaire menselijke microglia in expressie van genen zoals Iba-1, PU.1, DAP12 en M-CSF receptor en zijn effectief geweest in het begrijpen van normale en zieke hersenen13. Interessant is dat de expressie van verschillende immuungerelateerde genen zoals TLR4, MHC II, Siglec-11 en Siglec-3 varieert tussen menselijke en knaagdiermicroglia13. De expressie van verschillende genen varieert ook in temporele expressie en in neurodegeneratieve ziekten bij beide soorten14,15. Deze significante verschillen maken menselijke microglia een essentieel model om microgliafunctie in homeostase en ziekte te bestuderen. Primaire menselijke microglia kan ook een effectief instrument voor preklinische screening van potentiële kandidaat-geneesmiddelen16. De bovengenoemde redenen onderstrepen de groeiende behoefte aan kosteneffectieve protocollen voor isolatie van primaire menselijke microglia.
We hebben een protocol ontwikkeld voor isolatie van primaire menselijke microglia van volwassen menselijk hersenweefsel verzameld als gevolg van chirurgisch venster gemaakt voor tumorresecties of andere chirurgische resecties. De methode hier is aanzienlijk anders dan bestaande methoden. We waren in staat om te isoleren en cultuur microglia na een transittijd van ongeveer 75 minuten van de weefsel collectie site te starten van de isolatie protocol in het laboratorium. We hebben de supernatant van L929 fibroblastcellen gebruikt om de groei van geïsoleerde microglia te bevorderen. Deze methode richt zich specifiek op de cultuur en ontwikkeling van alleen primaire microglia. De resulterende cultuur voorbereid is ongeveer 80% microglia. Terwijl andere protocollen zorgen voor een verrijkte cultuur van microglia door dichtheidgradiëntcentrifugatie, stroomcytometrie en magnetische kralen, is het protocol een snelle, eenvoudige, robuuste en kosteneffectieve manier om primaire menselijke microglia17,18,,19,20te verkreeden ., De mogelijkheid om chirurgisch verwijderd levend volwassen hersenweefsel te gebruiken in plaats van vaste hersenweefsels van kadavers bewijst een extra voordeel van deze methode in tegenstelling tot de bestaande procedures18,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle weefsels werden verworven na ethische goedkeuring van het instituut ethische commissies van het Indian Institute of Technology Jodhpur en All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Weefselverwerving en -verwerking (dag 0)
- Verzamel het weefsel in een buis van 50 mL met 10 mL ijskoude kunstmatige hersenvocht (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM sucrose)20. Zorg ervoor dat de buis op ijs wordt gehouden als het weefsel naar een andere locatie moet worden overgebracht.
LET OP: Bereid aCSF voor in automatisch gedestilleerd water. Filter het met 0,22 μm spuitfilter in de laminaire kap. Deze kan 1 maand worden bewaard bij 4 °C. - Veeg de opvangbuis zorgvuldig af met 70% alcohol en breng over naar een aseptische laminaire luchtstroomkamer.
- Gooi aCSF voorzichtig weg en weeg weefsel in een aseptische conditie. Weefselgewicht is essentieel om het volume van trypsin-EDTA te berekenen dat nodig is voor volgende stappen.
- Houd het weefsel in vers warme aCSF gedurende 5 minuten op 37 °C. Deze stap is van cruciaal belang om celdood te voorkomen.
- Gooi aCSF weg en was weefsel eenmaal met 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) bij 37 °C. Zorg ervoor dat al het bloed wordt weggespoeld met herhaalde PBS wasbeurten (indien nodig).
- Incubeer het weefsel in warme PBS, bij 37 °C, gedurende 5 min.
- Gooi PBS voorzichtig weg en breng weefsel over naar een gesteriliseerde petrischaal. PBS kan worden verwijderd met een pipet. Dit voorkomt verlies van weefsel.
- Snijd het weefsel in kleine (ten minste 1 mm3)stukken met behulp van een steriele scalpel. Fijn in blokjes gesneden weefsel zorgt voor een hoger weefseloppervlak voor weefseldissociatie door trypsine-EDTA zorgen voor een hogere opbrengst.
- Breng het in blokjes gesneden weefsel over in een buis van 50 mL met 10 mL/g weefsel van 0,25% trypsin-EDTA en meng door een 10 mL serologische pipet te pipetten. Voeg 2 mL trypsin/EDTA toe aan een petrischaaltje en was de plaat grondig met behulp van pipet. Voeg deze trypsine terug aan de valkbuis. Dit minimaliseert het verlies van weefsel en cellen tijdens het dicing.
- Broed de buis 30 minuten op een shaker bij 37 °C bij 250 tpm. Deze stap verhoogt de dissociatie van cellen uit weefsel.
- Voeg aan het einde van de incubatie 10 mL neutraliserend medium (50% DMEM/50% F12 met glutamine, 1% penicilline-streptomycine, 10% FBS) toe om trypsine te neutraliseren. Meng met een serologische pipet van 10 mL. De hoeveelheid toegevoegde neutraliserende media moet gelijk zijn aan de hoeveelheid trypsine die wordt gebruikt.
- Centrifugeren de buis op 2.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
- Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 1 mL kweekmedium (50% DMEM/50% F12 met glutamine, 1% penicilline-streptomycine, 20% L929 supernatant, 10% FBS).
OPMERKING: L929 cellen zijn cultuur in DMEM (DMEM met glutamine, 1% penicilline-streptomycine, 10% FBS). ATCC aanbevolen cultuur methode moet worden gevolgd voor celcultuur. Supernatant moet worden verzameld uit de cultuurkolf die ten minste 75% confluent is. Het kan in bulk worden verzameld en opgeslagen bij -80 °C om afbraak van groeifactoren te voorkomen. Het wordt aanbevolen om L929 supernatant afzonderlijk toe te voegen in kolven in plaats van toe te voegen aan het stamcultuurmedium. - Plaats de cellen in een T-25 kolf, geschikt voor aanhangende cellen, en voeg 4 mL extra kweekmedium toe. Incubeer de kolf bij 37 °C met 5% CO2. Schud de kolf voorzichtig om het weefsel homogeen te verspreiden. Vermijd het brengen van de media naar de nek van de kolf, tijdens het schudden, omdat dit de kans op besmetting kan verhogen.
2.Celcultuur (dag 2)
- Verzamel de media uit de T-25 cultuurfles bereid op dag 0 in drie 1,5 mL centrifugebuizen door het verzamelen van gelijke hoeveelheid media in elke buis. Was de kolf één keer met 1 x PBS. Schud de kolf voorzichtig om restjes te verwijderen weefselfragmenten links. Vermijd harde schudden van de kolf als eventuele restfragmenten zal geen negatieve invloed op de cultuur. Voeg 5 mL verse cultuurmedia toe aan de kolf.
- Centrifugeren de verzamelde media op 1.466 x g (4000 rpm) bij 4 °C gedurende 4 minuten.
- Gooi de supernatant van elke buis en voeg 1 mL cultuurmedium toe aan een van de buizen. Meng grondig met pipet. Voeg in serie de gemengde media met cellen toe aan andere buizen. Meng grondig met pipet en pool de cellen in een buis.
- Plaats de cellen in een aparte T-25 kolf, geschikt voor aanhangende cellen. Voeg 4 mL kweekmedium toe en broed de kolf bij 37 °C met 5% CO2.
3.Celcultuur (dag 4)
- Gooi de media uit beide kolven en voeg verse 5 mL cultuur media aan de kolf.
- Incubeer de kolf bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2 dagen.
4. Celcultuur (dag 6)
- Cellen zullen klaar zijn voor verdere experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door het bovengenoemde protocol te gebruiken (Figuur 1), konden we primaire menselijke microglia isoleren van levende chirurgisch gereseceerde hersenweefsels. Gekweekte cellen werden gekleurd met Ricinus communis agglutinine-1 (RCA-1) lectine voor microglia (groen) en met glia-fibrillair zuur eiwit (GFAP) voor astrocyten (rood) (figuur 2) zoals eerder beschreven22,23,24,25,26. 4′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) werd gebruikt om kernen (blauw) vlek. Op de zesde dag van het begin van het experiment waren de cellen klaar voor verdere experimenten. Gekleurde cellen werden blind geteld voor microglia en astrocyten aanwezig in de cultuur. Ongeveer 80% van de primaire cultuur waren microglia(figuur 2).
Figuur 1: Schematisch van primaire microglia isolatie van volwassen hersenen. Chirurgisch verwijderd weefsel werd verzameld in ijskoud 10 mL van aCSF in een 50 mL buis en overgebracht naar het laboratorium. Het weefsel werd gewassen met respectievelijk aCSF en PBS en fijn in blokjes gesneden, gescheiden met behulp van trypsin-EDTA en verguld in een T-25 kolf. Op de tweede dag werd de media verzameld en gecentrifugeerd. Pellet werd gemengd in verse media en verguld in een T-25 kolf. Verse media werd toegevoegd aan de eerste kolf. Media werd veranderd in beide flessen op alternatieve dagen. De cellen waren klaar voor verdere experimenten op dag 6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Immunocytochemie van geïsoleerde primaire menselijke microglia. (A) Geïsoleerde cellen werden verguld in een twee putkamerdia en werden bevlekt met GFAP voor astrocyten (Green-first panel) of RCA voor microglia (Green-second panel). Kernen waren blauw gekleurd met DAPI. De controle voor RCA en secundaire antilichaamcontrole voor GFAP wordt in inzet weergegeven. (B) Geïsoleerde cellen werden verguld in een twee put kamer dia en werden gekleurd met RCA voor microglia (groen) en GFAP voor astrocyten (rood). De tweede rij toont de controle voor RCA en secundaire antilichaamcontrole voor GFAP. Kernen waren blauw gekleurd met DAPI. (C) Cellen werden geteld door verblinde controle. Kwantificering is representatief voor het tellen door een geblindeerde controle. Ongeveer 80% van de cellen waren microglia. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microglia zorgen voor homeostase in de normale hersenen en spelen een centrale rol in de pathofysiologie van verschillende neurologische ziekten4. Microglia staan centraal in de neuroontwikkeling en vorming van synapsen2. Microgliale studies hebben bewezen cruciaal te zijn in het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van diverse neurologische ziekten4. Knaagdier microglia zijn de heersende model van keuze voor primaire microglia studies, hoewel, knaagdier microglia zijn verschillend van primaire menselijke microglia in de belangrijkste aspecten13. Ontwikkeling van kosteneffectieve, hoogrenderende, protocollen voor isolatie van primaire menselijke microglia kan helpen deze kloof te overbruggen. We hebben een protocol ontwikkeld voor isolatie van primaire menselijke microglia uit levende, chirurgisch gereseceerde, volwassen, menselijk hersenweefsel. We waren in staat om microgliale zuiverheid van ongeveer 80% te bereiken zoals gecontroleerd op de7e dag.
Een van de meest kritieke stappen van het protocol was het transport van verworven weefsel naar het laboratorium voor verwerking. Aangezien de transittijd ongeveer 75 minuten was, was het waarschijnlijk dat we geen cellen konden isoleren. Dit lukte met behulp van een 50 mL buis met slechts 10 mL aCSF. aCSF op voorwaarde dat de benodigde voedingsstoffen en de resterende ruimte in de buis geholpen bescheerde het aCSF en weefsel. Er is de mogelijkheid dat er aanzienlijke dood van neuronen en andere cellen tijdens de transitperiode. Hoewel dit helpt bij de isolatie van microglia, kan dit protocol niet efficiënt zijn voor isolatie van andere neurologische cellen. We waren in staat om microgliale cellen te isoleren van 268 mg ontleed weefsel. We waren ook in staat om een aanzienlijke zuiverheid van microglia te bereiken door ook het vermijden van de coating van kolf door poly-D-lysine. Hoewel dit kan hebben geresulteerd in een verlies van microglia, dit ook vermeden andere glia bevolking van het vasthouden aan de fles. Bovendien, dit vermeden een extra stap van het schudden van de kolf en het verzamelen van microglia. Het was mogelijk dat sommige cellen zich niet in de kolf hebben vastgemaakt die op dag 0 werd bereid. We verzamelden niet-aanhangende cellen uit de oorspronkelijke cultuur en vergulden het opnieuw in een andere fles op dag 2, die ook microgliacellen opleverde. Opgemerkt moet worden dat fijn dicing het weefsel belangrijk is omdat het het oppervlak van het weefsel zal verhogen. Dit zal trypsine in staat stellen om toegang te krijgen tot het grootste deel van het weefsel en meer cellen te scheiden.
Om de groei van microglia in de cultuur te bevorderen, hebben we het kweekmedium geconditioneerd met het supernatant van L929 cellen27,28. Dit biedt een rijke bron van Granulocyte-macrofaag kolonie stimuleren factor (GM-CSF) als een aanvulling, die macrofaag proliferatie27,29verbetert . Dit hielp verminderen de kosten voor extra dure groei supplementen die een steunpilaar van verschillende microgliale primaire isolatie protocollen zijn. Het toevoegen van L929 supernatant is cruciaal voor de efficiënte isolatie en groei van microglia in het protocol. Maar voor de laboratoria zonder L929 celcultuur, dit wordt een beperkende stap gezien de totale kosten van het protocol als extra groei supplementen nodig zal zijn. We waren in staat om een microgliale bevolking van ongeveer 80% in de cultuuromstandigheden te krijgen. Dit is minder dan sommige gepubliceerde protocol, maar dit kan worden overwonnen door het hebben van een extra ronde van isolatie door middel van specifieke protocollen zoals het gebruik van magnetische kralen voor specifieke microgliale markers. Bij ongeveer 80% cultuurzuiverheid is het protocol efficiënt voor vele experimenten zoals immunocytochemie. Echter, voor experimenten zoals eiwitzuivering, eiwitidentificatie en westerse blotting, kan extra zuivering van de cultuur nodig zijn. Zelfs met hoge zuiverheid van de primaire culturen, is er altijd een mogelijkheid dat andere cellen aanwezig in de cultuur zou kunnen toenemen met een langere cultuurduur. We hebben met succes gekweekt geïsoleerde microglia voor 9 dagen door ze een keer te passeren. Terwijl de cultuurvoorwaarden in het protocol de isolatie en de groei van microglia goedkeurt, zou de aanwezigheid van andere cellen moeten worden overwogen wanneer het handhaven van de cultuur voor langere duur.
Dit protocol voor het isoleren van primaire microglia is effectief, robuust en kostenefficiënt. Dergelijke protocollen voor isolatie van primaire menselijke microglia uit volwassen hersenweefsel zal tijdig onderzoek naar immuunfuncties, celfysiologie en ziektereacties in de volwassen hersenen mogelijk maken. Bovendien, patiënt afgeleide primaire microglia kan helpen bij het ontwikkelen van gepersonaliseerde, toekomstige therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het laboratorium van SJ is opgericht met institutionele subsidies van IITJ en wordt gefinancierd door subsidies van het Department of Biotechnology (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) en de regering van het Ministerie van Elektronica en Informatietechnologie van India (nr.4(16)/2019-ITEA). De menselijke hersenen weefsel secties werden verkregen van het All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur na institutionele ethiek commissie goedkeuring. Wij danken Mayank Rathor, B.Tech Student lid van Design and Arts Society IIT Jodhpur, voor videografie ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
