Summary
Ce protocole est une méthode efficace, rentable et robuste d’isoler les microglies primaires des tissus cérébraux vivants, adultes et humains. Les microglies humains primaires isolés peuvent servir d’outil pour étudier les processus cellulaires dans l’homéostasie et la maladie.
Abstract
Les microglies résident les cellules immunitaires innées du système nerveux central (SNC). Les microglies jouent un rôle essentiel pendant le développement, dans le maintien de l’homéostasie, et pendant l’infection ou les blessures. Plusieurs groupes de recherche indépendants ont mis en évidence le rôle central que jouent les microglies dans les maladies auto-immunes, les syndromes autoinflammatoires et les cancers. L’activation de la microglie dans certaines maladies neurologiques peut participer directement aux processus pathogènes. Les microglies primaires sont un outil puissant pour comprendre les réponses immunitaires dans le cerveau, les interactions cellule-cellule et les phénotypes dysrégulés de microglie dans la maladie. Les microglies primaires imitent mieux les propriétés microgliales in vivo que les lignées cellulaires microgliales immortalisées. Les microglies adultes humains présentent des propriétés distinctes par rapport aux microglies foetales et rongeurs humaines. Ce protocole fournit une méthode efficace pour l’isolement des microglies primaires du cerveau humain adulte. L’étude de ces microglies peut fournir des informations critiques sur les interactions cellule-cellule entre les microglies et d’autres populations cellulaires résidentes dans le SNC, y compris les oligodendrocytes, les neurones et les astrocytes. En outre, les microglies de différents cerveaux humains peuvent être cultivées pour la caractérisation des réponses immunitaires uniques pour la médecine personnalisée et une myriade d’applications thérapeutiques.
Introduction
Le système nerveux central (SNC) est construit à partir d’un réseau complexe de neurones et de cellules gliales1. Parmi les cellules gliales, les microglies fonctionnent comme les cellules immunitaires innées du SNC2,3. Les microglies sont responsables du maintien de l’homéostasie dans le SNC4en bonne santé . Les microglies jouent également un rôle important dans le neurodéveloppement, en élaguant les synapses2. Les microglies sont au cœur de la pathophysiologie de plusieurs maladies neurologiques, y compris, mais pas limitée à; Maladie d’Alzheimer5, maladie de Parkinson6, ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL7, Sclérose en plaques8, lésion cérébrale traumatique9, douleur neuropathique10, lésions de la moelle épinière11 et tumeurs cérébrales telles que les gliomes12.
Les études liées à l’homéostasie et aux maladies du SNC utilisent des microglies de rongeurs en raison d’une pénurie de protocoles d’isolement des microglies primaires humaines efficaces et rentables13. Les microglies de rongeurs ressemblent à des microglies humaines primaires dans l’expression de gènes tels que Iba-1, PU.1, DAP12 et M-CSF récepteur et ont été efficaces dans la compréhension normale ainsi que le cerveau malade13. Fait intéressant, l’expression de plusieurs gènes immunitaires connexes tels que TLR4, MHC II, Siglec-11 et Siglec-3 varie entre les microglies humaines et les rongeurs13. L’expression de plusieurs gènes varie également dans l’expression temporelle et dans les maladies neurodégénératives chez les deux espèces14,15. Ces différences significatives font de la microglie humaine un modèle essentiel pour étudier la fonction de microglie dans l’homéostasie et la maladie. La microglie humaine primaire peut également être un outil efficace pour le dépistage préclinique des candidats potentiels16. Les raisons mentionnées ci-dessus soulignent le besoin croissant de protocoles rentables pour l’isolement des microglies humaines primaires.
Nous avons développé un protocole pour l’isolement de la microglie humaine primaire du tissu humain adulte de cerveau recueilli à la suite de la fenêtre chirurgicale créée pour les résections de tumeur ou d’autres résections chirurgicales. La méthode ici est considérablement différente des méthodes existantes. Nous avons pu isoler et culturer des microglies après un temps de transit d’environ 75 minutes entre le site de collecte des tissus et le début du protocole d’isolement en laboratoire. Nous avons utilisé le supernatant des cellules fibroblastiques L929 pour favoriser la croissance de microglies isolées. Cette méthode se concentre spécifiquement sur la culture et le développement de microglies primaires seulement. La culture qui en résulte est d’environ 80% de microglies. Alors que d’autres protocoles fournissent une culture enrichie de microglies par centrifugation gradient de densité, cytométrie de flux et perles magnétiques, le protocole est un moyen rapide, simple, robuste et rentable à la culture primaire microglie humaine17,18,19,20. La capacité d’utiliser le tissu cérébral adulte vivant enlevé chirurgicalement au lieu des tissus fixes du cerveau des cadavres prouve un avantage supplémentaire de cette méthode contrairement aux procédures existantes18,21.
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Protocol
Tous les tissus ont été acquis après l’autorisation éthique des comités d’éthique de l’Institut indien de technologie Jodhpur et de l’Institut indien des sciences médicales (AIIMS) Jodhpur.
1.Acquisition et traitement de tissus (Jour 0)
- Recueillir le tissu dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) (2 mM CaCl2•2H2O, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2•6H2O, 202 mM saccharose)20. Assurez-vous que le tube est conservé sur la glace si le tissu doit être transféré à un autre endroit.
REMARQUE : Préparer l’ACSF dans de l’eau distillée autoclavée. Filtrez-le avec un filtre à seringues de 0,22 μm dans le capot laminaire. Ceci peut être stocké pendant 1 mois à 4 °C. - Essuyez soigneusement le tube de collecte avec 70 % d’alcool et transférez-le dans une chambre à écoulement d’air laminaire aseptique.
- Jetez soigneusement l’aCSF et pesez les tissus dans un état aseptique. Le poids des tissus est essentiel pour calculer le volume de trypsin-EDTA nécessaire pour les étapes suivantes.
- Gardez le tissu dans l’aCSF frais chaud à 37 °C pendant 5 minutes. Cette étape est essentielle pour éviter la mort cellulaire.
- Jeter l’aCSF et laver les tissus une fois avec 1x PBS (saline tamponnée de phosphate) à 37 °C. Assurez-vous que tout le sang est lavé avec des lavages répétés PBS (au besoin).
- Incuber le tissu dans un PBS chaud, à 37 °C, pendant 5 min.
- Jeter pbs soigneusement et transférer le tissu dans une boîte de Pétri stérilisée. PBS peut être enlevé avec une pipette. Cela permettra d’éviter toute perte de tissu.
- Couper le tissu en petits morceaux (au moins 1 mm3)à l’aide d’un scalpel stérile. Les tissus finement coupés en dés fournissent une surface supérieure des tissus pour la dissociation des tissus par la trypsin-EDTA assurant un rendement plus élevé.
- Transférer le tissu en dés dans un tube de 50 ml contenant 10 ml/g de tissu de 0,25 % de trypsin-EDTA et mélanger en pipeting à travers une pipette sérologique de 10 mL. Ajouter 2 mL de trypsin/EDTA dans une boîte de Pétri et laver soigneusement la plaque à l’aide de la pipette. Ajoutez cette trypsin au tube de faucon. Cela minimise la perte de tissus et de cellules pendant le dés.
- Incuber le tube sur un shaker pendant 30 minutes à 37 °C à 250 tr/min. Cette étape augmente la dissociation des cellules des tissus.
- À la fin de l’incubation, ajouter 10 mL de milieu neutralisant (50% DMEM/50% F12 avec de la glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine, 10% FBS) pour neutraliser la trypsine. Mélanger avec une pipette sérologique de 10 mL. La quantité de supports neutralisants ajoutées doit être égale à la quantité de trypsine utilisée.
- Centrifuger le tube à 2 000 x g à 4 °C pendant 10 minutes.
- Jeter le supernatant et re-suspendre le granulé dans 1 mL de milieu de culture (50% DMEM/50% F12 avec de la glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine, 20% L929 supernatant, 10% FBS).
NOTE : Les cellules L929 sont de culture dans DMEM (DMEM avec glutamine, 1% pénicilline-streptomycine, 10% FBS). La méthode de culture recommandée par l’ATCC doit être suivie pour la culture cellulaire. Le superflu doit être prélevé dans la fiole de culture qui est d’au moins 75% confluent. Il peut être collecté en vrac et stocké à -80 °C pour prévenir la dégradation des facteurs de croissance. Il est recommandé d’ajouter le supernatant L929 séparément dans des flacons au lieu d’ajouter au milieu de culture de stock. - Plaquez les cellules dans une fiole T-25, adaptée aux cellules adhérentes, et ajoutez 4 ml de milieu de culture supplémentaire. Incuber la fiole à 37 °C avec 5% de CO2. Secouez soigneusement la fiole pour disperser homogènement le tissu. Évitez d’amener le milieu au cou de la fiole, tout en secouant, car cela peut augmenter les risques de contamination.
2.Culture cellulaire (Jour 2)
- Recueillir les supports de la fiole de culture T-25 préparée le jour 0 dans trois tubes de centrifugeuse de 1,5 mL en recueillant un volume égal de supports dans chaque tube. Laver la fiole une fois avec 1 x PBS. Agiter doucement la fiole pour enlever les fragments de tissu restants laissés. Évitez les secousses sévères de la fiole car les fragments de reste n’affecteront pas négativement la culture. Ajoutez 5 mL de supports de culture fraîche à la fiole.
- Centrifuger le support collecté à 1 466 x g (4000 tr/min) à 4 °C pendant 4 minutes.
- Jeter le supernatant de chaque tube et ajouter 1 ml de milieu de culture à l’un des tubes. Bien mélanger avec la pipette. Ajoutez en série les supports mixtes avec des cellules à d’autres tubes. Mélanger soigneusement avec la pipette et mettre les cellules en commun dans un tube.
- Plaquez les cellules dans une fiole T-25 séparée, adaptée aux cellules adhérentes. Ajouter 4 ml de milieu de culture et incuber la fiole à 37 °C avec 5% de CO2.
3.Culture cellulaire (Jour 4)
- Jetez les supports des deux flacons et ajoutez 5 ml de supports culturels frais à la fiole.
- Incuber la fiole à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 2 jours.
4. Culture cellulaire (Jour 6)
- Les cellules seront prêtes pour d’autres expériences.
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Representative Results
En utilisant le protocole mentionné ci-dessus (Figure 1), nous avons été en mesure d’isoler les microglies humaines primaires des tissus cérébraux vivants réséqués chirurgicalement. Les cellules cultivées ont été tachées de ricinus communis agglutinine-1 (RCA-1) lectine pour microglie (vert) et avec des protéines acides fibrillaires gliales (GFAP) pour les astrocytes (rouge) (Figure 2) comme décrit précédemment22,23,24,25,26. 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été utilisé pour tacher les noyaux (bleu). Le sixième jour du début de l’expérience, les cellules étaient prêtes pour d’autres expériences. Les cellules tachées ont été comptées aveugles pour les microglies et les astrocytes présents dans la culture. Environ 80 % de la culture primaire étaient des microglies (figure 2).
Figure 1: Schématique de l’isolement primaire des microglies du cerveau adulte. Le tissu enlevé chirurgicalement a été recueilli dans le froid de glace 10 ml de l’aCSF dans un tube de 50 ml et transféré au laboratoire. Le tissu a été lavé avec l’aCSF et PBS respectivement et finement coupé en dés, dissocié à l’aide de trypsin-EDTA et plaqué dans une fiole T-25. Le deuxième jour, les médias ont été recueillis et centrifuges. Le granulé était mélangé dans des supports frais et plaqué dans une fiole T-25. Des nouveaux médias ont été ajoutés à la première fiole. Les médias ont été changés dans les deux flacons les jours alternatifs. Les cellules étaient prêtes pour d’autres expériences le jour 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Immunocytochimie des microglies humaines primaires isolées. (A) Les cellules isolées ont été plaquées dans une lame de deux puits et ont été tachées de GFAP pour les astrocytes (panneau vert-premier) ou RCA pour microglie (panneau de seconde verte). Les noyaux étaient tachés de bleu avec DAPI. Le contrôle de RCA et de contrôle secondaire des anticorps pour le GFAP est indiqué dans l’encart. (B) Les cellules isolées ont été plaquées dans une lame de chambre de deux puits et ont été tachées avec RCA pour la microglie (vert) et GFAP pour les astrocytes (rouge). La deuxième ligne montre le contrôle de rca et le contrôle des anticorps secondaires pour GFAP. Les noyaux étaient tachés de bleu avec DAPI. (C) Les cellules ont été comptées par un contrôle aveuglé. La quantification est représentative du comptage par un contrôle aveuglé. Environ 80% des cellules étaient des microglies. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Microglie assurer l’homéostasie dans le cerveau normal et jouer un rôle central dans la pathophysiologie de diverses maladies neurologiques4. Les microglies sont au cœur du neurodéveloppement et de la formation des synapses2. Les études microgliale se sont avérées essentielles dans la compréhension du développement et de la progression de diverses maladies neurologiques4. Les microglies de rongeurs sont le modèle de choix prédominant pour les études microgliales primaires, même si, les microglies de rongeurs sont différentes des microglies humaines primaires dans les aspects clés13. L’élaboration de protocoles rentables et à haut rendement pour l’isolement des microglies humaines primaires peut aider à combler cet écart. Nous avons développé un protocole pour l’isolement des microglies humaines primaires à partir de tissus cérébraux vivants, chirurgicalement réséqués, adultes et humains. Nous avons été en mesure d’atteindre la pureté microgliale d’environ 80% comme vérifié le7ème jour.
L’une des étapes les plus critiques du protocole a été le transport des tissus acquis au laboratoire pour traitement. Comme le temps de transit était d’environ 75 minutes, il était probable que nous ne puissions pas isoler les cellules. Nous avons réussi à le faire en utilisant un tube de 50 ml avec seulement 10 ml d’aCSF. aCSF a fourni les nutriments nécessaires et l’espace restant dans le tube a aidé à aérer l’aCSF et les tissus. Il est possible qu’il y ait eu une mort considérable des neurones et d’autres cellules pendant la période de transit. Bien que cela aide à l’isolement des microglies, ce protocole peut ne pas être efficace pour l’isolement d’autres cellules neurologiques. Nous avons pu isoler les cellules microgliales de 268 mg de tissu disséqué. Nous avons également pu atteindre une pureté significative de microglie en évitant également le revêtement de la fiole par poly-D-lysine. Bien que cela ait pu entraîner une certaine perte de microglie, cela a également évité d’autres populations gliales d’adhérer à la fiole. En outre, cela a évité une étape supplémentaire de secouer la fiole et la collecte de microglies. Il était possible que certaines des cellules n’aient pas adhéré dans la fiole préparée le jour 0. Nous avons recueilli des cellules non adhérentes de la culture initiale et l’avons plaquée à nouveau dans un autre flacon le jour 2, qui a également donné des cellules de microglie. Il convient de noter que le dés finement le tissu est important car il augmentera la surface de la zone du tissu. Cela permettra à la trypsie d’accéder à la plupart des tissus et de dissocier plus de cellules.
Pour promouvoir la croissance des microglies dans la culture, nous avons conditionné le milieu de culture avec le supernatant de cellules L92927,28. Ceci fournit une source riche de facteur stimulant de colonie de granulocyte-macrophage (GM-CSF) comme supplément, qui améliore la prolifération de macrophage27,29. Cela a aidé à réduire le coût pour les suppléments de croissance coûteux supplémentaires qui sont un pilier de plusieurs protocoles d’isolement primaire microglial. L’ajout du supernatant L929 est crucial pour l’isolement et la croissance efficaces des microglies dans le protocole. Toutefois, pour les laboratoires sans culture cellulaire L929, cela devient une étape limitante compte tenu du coût global du protocole que des suppléments de croissance supplémentaires seront nécessaires. Nous avons pu obtenir une population microgliale d’environ 80% dans les conditions culturelles. C’est moins que certains protocoles publiés, mais cela peut être surmonté en ayant un cycle supplémentaire d’isolement par des protocoles spécifiques comme l’utilisation de perles magnétiques pour des marqueurs microgliaux spécifiques. À environ 80% de pureté de culture, le protocole est efficace pour de nombreuses expériences comme l’immunocytochimie. Cependant, pour des expériences comme la purification des protéines, l’identification des protéines et le blotting occidental, une purification supplémentaire de la culture peut être nécessaire. Même avec une grande pureté des cultures primaires, il ya toujours une possibilité que d’autres cellules présentes dans la culture pourrait augmenter avec une plus longue durée de la culture. Nous avons réussi à cultivé des microglies isolées pendant 9 jours en les passant une fois. Alors que les conditions de culture dans le protocole favorise l’isolement et la croissance des microglies, la présence d’autres cellules devrait être considérée lors du maintien de la culture pour une plus longue durée.
Ce protocole d’isolement des microglies primaires est efficace, robuste et rentable. De tels protocoles pour l’isolement des microglies humaines primaires des tissus cérébraux adultes permettront une recherche opportune sur les fonctions immunitaires, la physiologie cellulaire et les réponses aux maladies dans le cerveau adulte. En outre, le patient dérivé microglie primaire peut aider à développer personnalisé, thérapeutiques futures.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le laboratoire de SJ a été créé grâce à des subventions institutionnelles de l’IITJ et est financé par des subventions du Département de la biotechnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) et du Ministère de l’électronique et des technologies de l’information du Gouvernement de l’Inde (no 4(16)/2019-ITEA). Les sections de tissu cérébral humain ont été obtenues du All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur après l’autorisation du comité d’éthique institutionnel. Nous remercions Mayank Rathor, B.Tech Student membre de design and Arts Society IIT Jodhpur, pour son soutien en vidéographie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
