Summary
यह प्रोटोकॉल जीवित, वयस्क, मानव मस्तिष्क ऊतक से प्राथमिक माइक्रोग्लिया को अलग करने का एक कुशल, लागत प्रभावी और मजबूत तरीका है। अलग प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया होरोस्टेसिस और रोग में सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं।
Abstract
माइक्रोग्लिया केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं। माइक्रोग्लिया विकास के दौरान, होरोस्टेसिस को बनाए रखने में, और संक्रमण या चोट के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। कई स्वतंत्र अनुसंधान समूहों ने केंद्रीय भूमिका पर प्रकाश डाला है जो माइक्रोग्लिया ऑटोइम्यून रोगों, ऑटोइंफ्लेमेटरी सिंड्रोम और कैंसर में खेलते हैं । कुछ न्यूरोलॉजिकल रोगों में माइक्रोग्लिया की सक्रियता सीधे रोगजनक प्रक्रियाओं में भाग ले सकती है। प्राथमिक माइक्रोग्लिया मस्तिष्क में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, कोशिका-कोशिका इंटरैक्शन और रोग में डाइसिगुएल माइक्रोग्लिया फेनोटाइप को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। वीवो माइक्रोग्लियल गुणों में प्राथमिक माइक्रोग्लिया की नकल अमर माइक्रोग्लियल सेल लाइनों से बेहतर है। मानव वयस्क माइक्रोग्लिया मानव भ्रूण और कृंतक माइक्रोग्लिया की तुलना में अलग गुण प्रदर्शित करते हैं। यह प्रोटोकॉल वयस्क मानव मस्तिष्क से प्राथमिक माइक्रोग्लिया के अलगाव के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है। इन माइक्रोग्लिया का अध्ययन करने से सीएनएस में माइक्रोग्लिया और अन्य निवासी सेलुलर आबादी के बीच सेल-सेल इंटरैक्शन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है, जिसमें ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स, न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, विभिन्न मानव दिमाग से माइक्रोग्लिया व्यक्तिगत चिकित्सा और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के असंख्य के लिए अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है।
Introduction
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं1के एक जटिल नेटवर्क का निर्माण किया गया है। ग्लियल कोशिकाओं में, माइक्रोग्लिया सीएनएस2,,3की जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में कार्य करता है। माइक्रोग्लिया स्वस्थ सीएनएस4में होयोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार हैं। माइक्रोग्लिया भी सिनैप्स2की छंटाई करके न्यूरोडेवलपमेंट में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। माइक्रोग्लिया कई न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगविज्ञान के लिए केंद्रीय हैं, जिनमें शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं; अल्जाइमर रोग5,पार्किंसंस रोग6,स्ट्रोक7,मल्टीपल स्क्लेरोसिस8,दर्दनाक मस्तिष्क चोट9,न्यूरोपैथिक दर्द10, रीढ़की हड्डी में चोट11 और ब्रेन ट्यूमर जैसे ग्लियोमास12।
सीएनएस होरोस्टेसिस और रोगों से संबंधित अध्ययन लागत कुशल और समय कुशल मानव प्राथमिक माइक्रोग्लिया आइसोलेशन प्रोटोकॉलकीकमी के कारण कृंतक माइक्रोग्लिया का उपयोग करते हैं । कृंतक माइक्रोग्लिया जीन की अभिव्यक्ति में प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया जैसा कि आईबीए-1, पीयू.1, डीएपी12 और एम-सीएसएफ रिसेप्टर जैसा दिखता है और सामान्य और रोगग्रस्त मस्तिष्क13को समझने में प्रभावी रहा है। दिलचस्प बात यह है कि टीएलआर 4, एमएचसी II, सिग्लेक-11 और सिग्लेक-3 जैसे कई प्रतिरक्षा संबंधित जीनों की अभिव्यक्ति मानव और कृंतक माइक्रोग्लिया13के बीच भिन्न होती है। 14,15दोनों प्रजातियों में लौकिक अभिव्यक्ति और14न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में भी कई जीनों की अभिव्यक्ति भिन्न होती है . ये महत्वपूर्ण अंतर मानव माइक्रोग्लिया को होमोसटासिस और रोग में माइक्रोग्लिया फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए एक आवश्यक मॉडल बनाते हैं। 16संभावित दवा उम्मीदवारों की प्रीक्लिनिकल स्क्रीनिंग के लिए प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया भी एक प्रभावी उपकरण हो सकता है । उपर्युक्त कारण प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया के अलगाव के लिए लागत प्रभावी प्रोटोकॉल की बढ़ती आवश्यकता को रेखांकित करते हैं।
हमने ट्यूमर रिसेक्शन या अन्य सर्जिकल रिसेक्शन के लिए बनाई गई सर्जिकल विंडो के परिणामस्वरूप एकत्र वयस्क मानव मस्तिष्क ऊतक से प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। यहां की विधि मौजूदा तरीकों से काफी अलग है । हम प्रयोगशाला में अलगाव प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए ऊतक संग्रह साइट से लगभग 75 मिनट के पारगमन समय के बाद अलग और संस्कृति माइक्रोग्लिया करने में सक्षम थे। हमने अलग-थलग माइक्रोग्लिया के विकास को बढ़ावा देने के लिए L929 फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के सुपरनैंट का उपयोग किया है। यह विधि विशेष रूप से केवल प्राथमिक माइक्रोग्लिया की संस्कृति और विकास पर केंद्रित है। परिणामस्वरूप तैयार संस्कृति के बारे में 80% माइक्रोग्लिया है। जबकि अन्य प्रोटोकॉल घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र, प्रवाह साइटोमेट्री और चुंबकीय मोतियों द्वारा माइक्रोग्लिया की समृद्ध संस्कृति प्रदान करते हैं, प्रोटोकॉल प्राथमिक,मानव माइक्रोग्लिया17, 18, 19,20संस्कृति के लिए एक तेजीसे, सरल,18,19मजबूत और लागत प्रभावी तरीका है। शवों से स्थिर मस्तिष्क ऊतकों के बजाय शल्य चिकित्सा से हटाए गए जीवित वयस्क मस्तिष्क के ऊतकों का उपयोग करने की क्षमता मौजूदा प्रक्रियाओं के विपरीत इस विधि का एक अतिरिक्त लाभ साबित करती है18,21।
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Protocol
भारतीय प्रौद्योगिकी संस्थान जोधपुर और अखिल भारतीय आयुर्विज्ञान संस्थान (एम्स) जोधपुर की इंस्टीट्यूट एथिक्स कमेटियों से नैतिक मंजूरी के बाद सभी ऊतकों का अधिग्रहण किया गया।
1. ऊतक अधिग्रहण और प्रसंस्करण (दिन 0)
- एक 50 मिलीएल ट्यूब में ऊतक को इकट्ठा करें जिसमें 10 एमएल बर्फ ठंड कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (एसीएसएफ) (2 एमएमएम सीएसीएल2 ∙2H2O, 10 एमएमएम ग्लूकोज, 3 एमएमएम केसीएल, 26 एमएम एनएएचसीओ3,2.5 एमएमएनएएच 2पीओ4,1 एमएम एमजीसीएल2∙6एच2ओ, 202 एमएम सुक्रोज)20। सुनिश्चित करें कि ट्यूब बर्फ पर रखा जाता है अगर ऊतक को एक अलग स्थान पर स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है।
नोट: ऑटोक्लेव्ड आसुत पानी में aCSF तैयार करें। लेमिनार हुड में 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के साथ इसे फ़िल्टर करें। इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने के लिए स्टोर किया जा सकता है। - संग्रह ट्यूब को ध्यान से 70% शराब के साथ पोंछें और एक एसेप्टिक लैमिनार एयर फ्लो चैंबर में स्थानांतरित करें।
- एसीएसएफ को सावधानी से त्यागें और ऊतक को एक एसेप्टिक स्थिति में तौलें। ऊतक वजन बाद के चरणों के लिए आवश्यक ट्रिप्पसिन-EDTA की मात्रा की गणना करने के लिए आवश्यक है।
- टिश्यू को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ताजा गर्म एसीएसएफ में रखें। सेल डेथ से बचने के लिए यह कदम अहम है।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस (फॉस्फेट बफर नमकीन) के साथ एक बार एसीएसएफ और वॉश टिश्यू को डिस्क् स डिस्क् स करें। सुनिश्चित करें कि सभी रक्त दोहराया PBS धोता (जरूरत के रूप में) के साथ बह गया है ।
- गर्म पीबीएस में ऊतक को 37 डिग्री सेल्सियस पर, 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस को ध्यान से त्यागें और ऊतक को एक निष्फल पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। पीबीएस को पिपेट के साथ हटाया जा सकता है। इससे टिश्यू के किसी भी नुकसान से बचा जा सकेगा।
- एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग कर छोटे (कम से कम1 मिमी 3)टुकड़ों में ऊतक पासा। पतले डिकेड ऊतक अधिक उपज सुनिश्चित करने वाले ट्राइप्सिन-ईडीटीए द्वारा ऊतक वियोजन के लिए उच्च ऊतक सतह क्षेत्र प्रदान करता है।
- डिकेड टिश्यू को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 0.25% ट्राइपसिन-ईडीटीए के 10 एमएल/जी ऊतक होते हैं और 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के माध्यम से पाइपिंग करके मिलाएं। एक पेट्री डिश में ट्राइपसिन/ईडीटीए के 2 एमएल डालें और पिपेट की मदद से प्लेट को अच्छी तरह धो लें । इस ट्रिपसिन को वापस फाल्कन ट्यूब में जोड़ें। यह डीडिंग करते समय ऊतक और कोशिकाओं के नुकसान को कम करता है।
- 250 आरपीएम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक शेकर पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। इस कदम से ऊतक से कोशिकाओं का वियोजन बढ़ जाता है।
- इनक्यूबेशन के अंत में, ट्राइपसिन को बेअसर करने के लिए ग्लूटामिन, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% एफबीएस के साथ 10 मिलियन मिलियन बेअसर माध्यम (50% डीएमईएम/50% एफ12) जोड़ें। 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ मिलाएं। बेअसर मीडिया की मात्रा का उपयोग किए जाने वाले ट्राइपसिन की मात्रा के बराबर होना चाहिए।
- 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें।
- सुपरनैक्टेंट को त्यागें और संस्कृति माध्यम के 1 एमसीएल में गोली को फिर से निलंबित करें (ग्लूटामिन के साथ 50% डीएमईएम/50% एफ12, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 20% एल929 सुपरनैक्टेंट, 10% एफबीएस)।
नोट: L929 कोशिकाएं डीएमईएम में संस्कृति हैं (ग्लूटामीन के साथ डीएमईएम, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% एफबीएस)। सेल संस्कृति के लिए एटीसीसी अनुशंसित संस्कृति विधि का पालन किया जाना चाहिए। सुपरनेट को कल्चर फ्लास्क से एकत्र किया जाना चाहिए जो कम से कम 75% कॉन्फ्लूंट है। इसे थोक में एकत्र किया जा सकता है और विकास कारकों के क्षरण को रोकने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। स्टॉक कल्चर मीडियम में जोड़ने के बजाय फ्लास्क में अलग से L929 सुपरनेटेंट जोड़ने की सिफारिश की जाती है। - एक टी-25 फ्लास्क में कोशिकाओं को प्लेट करें, जो अनुयायी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है, और अतिरिक्त संस्कृति माध्यम के 4 एमएल जोड़ें। 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें। कुप्पी को ऊतक को समरूपता से फैलाने के लिए सावधानी से हिलाएं। हिलते समय मीडिया को फ्लास्क की गर्दन में लाने से बचें, क्योंकि इससे प्रदूषण की संभावना बढ़ सकती है।
2. सेल संस्कृति (2 दिन)
- प्रत्येक ट्यूब में मीडिया की बराबर मात्रा एकत्र करके तीन १.५ एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में दिन 0 पर तैयार टी-25 कल्चर फ्लास्क से मीडिया को इकट्ठा करें । 1 एक्स पीबीएस के साथ एक बार फ्लास्क धोएं। किसी भी अवशेष ऊतक के टुकड़े को हटाने के लिए फ्लास्क को धीरे से हिलाएं। फ्लास्क के कठोर झटकों से बचें क्योंकि किसी भी अवशेष टुकड़े संस्कृति पर प्रतिकूल प्रभाव नहीं डालेंगे। फ्लास्क में 5 एमएल फ्रेश कल्चर मीडिया जोड़ें।
- 4 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,466 x g (4000 आरपीएम) पर एकत्र मीडिया सेंट्रलाइज।
- प्रत्येक ट्यूब से सुपरनैंट को त्यागें और ट्यूबों में से एक में संस्कृति माध्यम का 1 एमएल जोड़ें। पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं। सीरियलली मिश्रित मीडिया को कोशिकाओं के साथ अन्य ट्यूबों में जोड़ें। पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिलाएं और कोशिकाओं को एक ट्यूब में पूल करें।
- कोशिकाओं को एक अलग टी-25 फ्लास्क में प्लेट करें, जो अनुयायी कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है। संस्कृति माध्यम के 4 मिलीएल जोड़ें और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क इनक्यूबेट ।
3. सेल संस्कृति (दिन 4)
- दोनों फ्लास्क से मीडिया को त्यागें और फ्लास्क में संस्कृति मीडिया के ताजा 5 एमएल जोड़ें।
- 2 दिनों के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें।
4. सेल संस्कृति (6 दिन)
- आगे के प्रयोगों के लिए सेल तैयार होंगे।
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Representative Results
उपर्युक्त प्रोटोकॉल(चित्रा 1)का उपयोग करके, हम प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया को लाइव शल्य चिकित्सा से पुनः प्राप्त मस्तिष्क ऊतकों से अलग करने में सक्षम थे। सुसंस्कृत कोशिकाओं को रिसिनस साम्यवाद अग्लुटिनिन-1 (आरसीए-1) माइक्रोग्लिया (हरा) के लिए लेक्टिन और एस्ट्रोसाइट्स (लाल)(चित्रा 2)के लिए ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) के साथ दाग दिया गया था, जैसा,कि पहले22,23,,24, 25,,26वर्णित था।,26 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) का उपयोग नाभिक (नीला) को दागने के लिए किया जाता था। प्रयोग शुरू होने से छठे दिन कोशिकाएं आगे के प्रयोगों के लिए तैयार थीं । दाग कोशिकाओं को संस्कृति में मौजूद माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट्स के लिए अंधा गिना जाता था। प्राथमिक संस्कृति का लगभग 80% माइक्रोग्लिया(चित्र 2)था।
चित्रा 1:वयस्क मस्तिष्क से प्राथमिक माइक्रोग्लिया अलगाव की योजनाबद्ध। शल्य चिकित्सा से हटा ऊतक बर्फ ठंड में एकत्र किया गया था 10 मिलीएल aCSF के एक ५० एमएल ट्यूब में और प्रयोगशाला में स्थानांतरित कर दिया । ऊतक क्रमशः aCSF और PBS के साथ धोया गया था और पतले diced, ट्रिप्पसिन-EDTA की मदद से अलग और एक टी-25 फ्लास्क में चढ़ाया । दूसरे दिन मीडिया एकत्रित होकर सेंट्रलाइज्ड हुआ। पैलेट को फ्रेश मीडिया में मिलाया गया और टी-25 फ्लास्क में चढ़ाया गया । पहले फ्लास्क में ताजा मीडिया को जोड़ा गया । वैकल्पिक दिनों पर दोनों फ्लैक्स में मीडिया को बदल दिया गया । कोशिकाओं को 6 दिन पर आगे प्रयोगों के लिए तैयार थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:अलग प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया के इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री । (ए)पृथक कोशिकाओं को दो अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में चढ़ाया गया था और एस्ट्रोसाइट्स (ग्रीन-फर्स्ट पैनल) या माइक्रोग्लिया (ग्रीन-सेकंड पैनल) के लिए आरसीए के लिए GFAP के साथ दाग दिया गया था । नाभिक DAPI के साथ नीले रंग के थे । इनसेट में जीएफएपी के लिए आरसीए और सेकेंडरी एंटीबॉडी कंट्रोल के लिए कंट्रोल दिखाया गया है। (ख)अलग कोशिकाओं को दो अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में चढ़ाया गया था और माइक्रोग्लिया (ग्रीन) और एस्ट्रोसाइट्स (लाल) के लिए GFAP के लिए आरसीए के साथ दाग थे । दूसरी पंक्ति जीएफएपी के लिए आरसीए और माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण के लिए नियंत्रण दिखाती है। नाभिक DAPI के साथ नीले रंग के थे । (ग)कोशिकाओं को अंधा नियंत्रण द्वारा गिना जाता था । परिमाणीकरण एक अंधे नियंत्रण द्वारा गिनती का प्रतिनिधि है। लगभग 80% कोशिकाएं माइक्रोग्लिया थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
माइक्रोग्लिया सामान्य मस्तिष्क में होमोसेस्टेसिस सुनिश्चित करते हैं और विभिन्न न्यूरोलॉजिकल रोगों के रोगविज्ञान में केंद्रीय भूमिकाएं निभाते हैं4. माइक्रोग्लिया न्यूरोडेवलपमेंट और सिनेप्स 2 केगठनके लिए केंद्रीय हैं। माइक्रोग्लियल अध्ययन विविध न्यूरोलॉजिकल रोगों के विकास और प्रगति को समझने में निर्णायक साबितहुएहैं । कृंतक माइक्रोग्लिया प्राथमिक माइक्रोग्लियल अध्ययनों के लिए पसंद का प्रचलित मॉडल है, भले ही, कृंतक माइक्रोग्लिया प्रमुख पहलुओं में प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया से अलग हैं13। लागत प्रभावी, उच्च उपज, प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल के विकास से इस अंतर को पाटने में मदद मिल सकती है । हमने प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया को लाइव, शल्य चिकित्सा से पुनः प्राप्त, वयस्क, मानव मस्तिष्क ऊतक से अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। हम 7वें दिन चेक के रूप में लगभग 80% की माइक्रोग्लियाल शुद्धता प्राप्त करने में सक्षम थे।
प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में अधिग्रहीत ऊतक का परिवहन था। चूंकि पारगमन का समय लगभग 75 मिनट था, इसलिए यह संभव था कि हम किसी भी कोशिकाओं को अलग-थलग करने में सक्षम न हों। हमने एसीएसएफ के केवल 10 एमएल के साथ 50 एमएल ट्यूब का उपयोग करके इसे प्रबंधित किया। ACSF आवश्यक पोषक तत्व प्रदान की है और ट्यूब में शेष जगह aCSF और ऊतक वात में मदद की । संभावना है कि पारगमन अवधि के दौरान न्यूरॉन्स और अन्य कोशिकाओं की काफी मौत हुई थी। हालांकि यह माइक्रोग्लिया के अलगाव के साथ मदद करता है, यह प्रोटोकॉल अन्य न्यूरोलॉजिकल कोशिकाओं के अलगाव के लिए कुशल नहीं हो सकता है। हम 268 मिलीग्राम विच्छेदित ऊतकों से माइक्रोग्लियल कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम थे। हम पॉली-डी-लैसिन द्वारा फ्लास्क की कोटिंग से भी बचकर माइक्रोग्लिया की महत्वपूर्ण शुद्धता प्राप्त करने में सक्षम थे। हालांकि इससे माइक्रोग्लिया का कुछ नुकसान हो सकता है, इससे अन्य ग्लियल आबादी को भी फ्लास्क का पालन करने से बचा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह फ्लास्क मिलाते हुए और माइक्रोग्लिया इकट्ठा करने के एक अतिरिक्त कदम से बचा। यह संभव था कि 0 दिन में तैयार फ्लास्क में कुछ कोशिकाओं का पालन नहीं किया गया हो। हमने प्रारंभिक संस्कृति से गैर-अनुयायी कोशिकाओं को एकत्र किया और इसे 2 दिन पर एक और फ्लास्क में फिर से चढ़ाया, जिससे माइक्रोग्लिया कोशिकाएं भी मिलीं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ऊतक को बारीक रूप से टुकड़े करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सतह को ऊतक के क्षेत्र में वृद्धि करेगा। यह ट्राइप्सिन को अधिकांश ऊतकों तक पहुंचने और अधिक कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देगा।
संस्कृति में माइक्रोग्लिया के विकास को बढ़ावा देने के लिए, हमने एल929 कोशिकाओं27, 28,के सुपरनैंट के साथ संस्कृति माध्यम कोवातानुकूलितकिया है। यह ग्रेनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) का एक पूरक स्रोत प्रदान करता है, जो मैक्रोफेज प्रसार27,,29को बढ़ाता है। इससे अतिरिक्त महंगी विकास की खुराक के लिए लागत को कम करने में मदद मिली जो कई माइक्रोग्लियल प्राथमिक अलगाव प्रोटोकॉल का मुख्य आधार है। प्रोटोकॉल में माइक्रोग्लिया के कुशल अलगाव और विकास के लिए L929 सुपरनाटेंट जोड़ना महत्वपूर्ण है। हालांकि L929 सेल संस्कृति के बिना प्रयोगशालाओं के लिए, यह एक सीमित अतिरिक्त विकास की खुराक के रूप में प्रोटोकॉल की समग्र लागत पर विचार कदम बन जाता है की जरूरत होगी । हम संस्कृति की स्थितियों में लगभग 80% की माइक्रोग्लियल आबादी प्राप्त करने में सक्षम थे। यह कुछ प्रकाशित प्रोटोकॉल से कम है, लेकिन विशिष्ट माइक्रोग्लियल मार्कर के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करने जैसे विशिष्ट प्रोटोकॉल के माध्यम से अलगाव का एक अतिरिक्त दौर होने से इसे दूर किया जा सकता है। लगभग 80% संस्कृति शुद्धता पर, प्रोटोकॉल इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री जैसे कई प्रयोगों के लिए कुशल है। हालांकि, प्रोटीन शुद्धिकरण, प्रोटीन पहचान और पश्चिमी धब्बा जैसे प्रयोगों के लिए, संस्कृति के अतिरिक्त शुद्धिकरण की आवश्यकता हो सकती है। यहां तक कि प्राथमिक संस्कृतियों की उच्च शुद्धता के साथ, हमेशा एक संभावना होती है कि संस्कृति में मौजूद अन्य कोशिकाएं लंबी संस्कृति अवधि के साथ बढ़ सकती हैं। हमने उन्हें एक बार पास करके 9 दिनों के लिए अलग-थलग माइक्रोग्लिया को सफलतापूर्वक सुसंस्कृत किया है। जबकि प्रोटोकॉल में संस्कृति की स्थिति माइक्रोग्लिया के अलगाव और विकास के पक्ष में है, लंबी अवधि के लिए संस्कृति को बनाए रखते समय अन्य कोशिकाओं की उपस्थिति पर विचार किया जाना चाहिए।
प्राथमिक माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए यह प्रोटोकॉल प्रभावी, मजबूत और लागत कुशल है। वयस्क मस्तिष्क ऊतक से प्राथमिक मानव माइक्रोग्लिया के अलगाव के लिए इस तरह के प्रोटोकॉल वयस्क मस्तिष्क में प्रतिरक्षा कार्यों, कोशिका शरीर विज्ञान और रोग प्रतिक्रियाओं पर समय पर शोध करने में सक्षम होंगे। इसके अतिरिक्त, रोगी व्युत्पन्न प्राथमिक माइक्रोग्लिया व्यक्तिगत, भविष्य के चिकित्सीय विकास में सहायता कर सकते हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
एसजे की प्रयोगशाला आईआईटीजे से संस्थागत अनुदान के साथ स्थापित की गई थी और इसे जैव प्रौद्योगिकी विभाग (बीटी/PR12831/MED/30/1489/2015) और भारत के इलेक्ट्रॉनिक्स और सूचना प्रौद्योगिकी सरकार (संख्या 4 (16) /2019-आईटीईए) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है । इंस्टीट्यूशनल एथिक्स कमेटी की मंजूरी के बाद अखिल भारतीय आयुर्विज्ञान संस्थान (एम्स) जोधपुर से मानव मस्तिष्क के टिश्यू सेक्शन प्राप्त किए गए। हम वीडियोग्राफी समर्थन के लिए डिजाइन और आर्ट्स सोसायटी आईआईटी जोधपुर के बीटेक छात्र सदस्य मयंक राठौड़ को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
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