Summary
Questo protocollo è un metodo efficiente, conveniente e robusto per isolare la microglia primaria dal tessuto cerebrale umano vivo, adulto. Microglia umana primaria isolata può servire come strumento per studiare i processi cellulari in omeostasi e malattia.
Abstract
Le microglia sono cellule immunitarie innate residenti del sistema nervoso centrale (SNC). Microglia svolgono un ruolo fondamentale durante lo sviluppo, nel mantenimento dell'omeostasi e durante l'infezione o lesioni. Diversi gruppi di ricerca indipendenti hanno evidenziato il ruolo centrale che la microglia svolgono nelle malattie autoimmuni, nelle sindromi autoinfiammatori e nei tumori. L'attivazione della microglia in alcune malattie neurologiche può partecipare direttamente a processi patogeni. La microglia primaria è un potente strumento per comprendere le risposte immunitarie nel cervello, le interazioni tra cellule cellulari e i fenotipi di microglia disregolati nella malattia. Le microglia primarie imitano le proprietà microgliali in vivo meglio delle linee cellulari microgliali immortalate. La microglia adulta umana presenta proprietà distinte rispetto alla microglia fetale e roditore umana. Questo protocollo fornisce un metodo efficiente per l'isolamento della microglia primaria dal cervello umano adulto. Lo studio di questi microglia può fornire informazioni critiche sulle interazioni tra microglia e altre popolazioni cellulari residenti nel SNC, tra cui oligodendrociti, neuroni e astrociti. Inoltre, microglia da diversi cervelli umani possono essere colturati per caratterizzazione di risposte immunitarie uniche per la medicina personalizzata e una miriade di applicazioni terapeutiche.
Introduction
Il sistema nervoso centrale (SNC) è costruito da una complessa rete di neuroni e cellule gliali1. Tra le cellule gliali, la microglia funziona come le cellule immunitarie innate del CNS2,3. Microglia sono responsabili del mantenimento dell'omeostasi nel sano CNS4. Microglia svolgono anche un ruolo importante nel neurosviluppo, potando le sinapsi2. Le microglia sono centrali nella fisiofisiologia di diverse malattie neurologiche, tra cui, ma non limitate; Morbo di Alzheimer5, Morbo di Parkinson6,ictus 7, sclerosi multipla8, lesione cerebrale traumatica9, dolore neuropatico10, lesione del midollo spinale11 e tumori cerebrali come gliomas12.
Gli studi relativi all'omeostasi e alle malattie del SNC utilizzano la microglia dei roditori a causa di una carenza di protocolli di isolamento primario di microglia umano13 efficientiin termini di costi ed efficienti in termini di tempo. I microglia roditori assomigliano alla microglia umana primaria nell'espressione di geni come Iba-1, PU.1, DAP12 e M-CSF recettori e sono stati efficaci nella comprensione del cervello normale emalore 13. È interessante notare che l'espressione di diversi geni immuni correlati come TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia tra microglia umana e roditore13. L'espressione di diversi geni varia anche nell'espressione temporale e nelle malattie neurodegenerative in entrambe lespecie 14,15. Queste differenze significative rendono la microglia umana un modello essenziale per studiare la funzione della microglia nell'omeostasi e nella malattia. La microglia umana primaria può anche essere uno strumento efficace per lo screening preclinico dei potenziali candidati ai farmaci16. Le ragioni di cui sopra sottolineano la crescente necessità di protocolli convenienti per l'isolamento della microglia umana primaria.
Abbiamo sviluppato un protocollo per l'isolamento della microglia umana primaria dal tessuto cerebrale umano adulto raccolto a seguito di una finestra chirurgica creata per le resezioni tumorali o altre resezioni chirurgiche. Il metodo in questo caso è notevolmente diverso dai metodi esistenti. Siamo stati in grado di isolare e coltura microglia dopo un tempo di transito di circa 75 minuti dal sito di raccolta dei tessuti per avviare il protocollo di isolamento in laboratorio. Abbiamo usato il supernatant di cellule fibroblasti L929 per promuovere la crescita di microglia isolata. Questo metodo si concentra specificamente sulla cultura e lo sviluppo di solo microglia primaria. La coltura risultante è di circa l'80% di microglia. Mentre altri protocolli forniscono una coltura arricchita di microglia per centrifugazione gradiente di densità, citometria di flusso e perline magnetiche, il protocollo è un modo rapido, semplice, robusto ed economico per coltura primaria microgliaumana 17,18,19,20. La capacità di utilizzare il tessuto cerebrale adulto vivo rimosso chirurgicamente invece di tessuti cerebrali fissi dai cadaveri dimostra un ulteriore vantaggio di questo metodo in contrasto con le procedureesistenti 18,21.
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Protocol
Tutti i tessuti sono stati acquisiti dopo l'autorizzazione etica dai comitati etici dell'Indian Institute of Technology Jodhpur e dell'All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Acquisizione ed elaborazione dei tessuti (giorno 0)
- Raccogliere il tessuto in un tubo da 50 mL contenente 10 mL di liquido cerebrospinale artificiale freddo di ghiaccio (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glucosio, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM saccarosio)20. Assicurarsi che il tubo sia conservato sul ghiaccio se il tessuto deve essere trasferito in una posizione diversa.
NOTA: Preparare l'ACSF in acqua distillata autoclave. Filtrare con il filtro della siringa da 0,22 m nella cappa laminare. Questo può essere conservato per 1 mese a 4 gradi centigradi. - Pulire attentamente il tubo di raccolta con il 70% di alcol e trasferirlo in una camera a flusso d'aria laminare attico.
- Scartare aCSF con attenzione e pesare il tessuto in una condizione asetica. Il peso del tessuto è essenziale per calcolare il volume di trypsin-EDTA necessario per i passaggi successivi.
- Mantenere il tessuto in aCSF fresco caldo a 37 gradi centigradi per 5 minuti. Questo passaggio è fondamentale per evitare la morte delle cellule.
- Scartare l'aCSF e lavare il tessuto una volta con 1x PBS (salina tamponata di fosfato) a 37 gradi centigradi. Assicurarsi che tutto il sangue sia lavato via con ripetuti lavaggi PBS (se necessario).
- Incubare il tessuto in PBS caldo, a 37 gradi centigradi, per 5 min.
- Scartare pbS con attenzione e trasferire il tessuto in un piatto Petri sterilizzato. PBS può essere rimosso con una pipetta. Questo impedirà qualsiasi perdita di tessuto.
- Tagliare a dadini il tessuto in piccoli (almeno 1 mm3) pezzi utilizzando un bisturi sterile. Il tessuto tagliato finemente fornisce una superficie tissunte più elevata per la dissociazione dei tessuti mediante la trypsina-EDTA garantendo una resa più elevata.
- Trasferire il tessuto tagliato a dadini in un tubo da 50 mL contenente un tessuto a 10 mL/g di 0,25% di trypsin-EDTA e mescolare mediante pipetta da 10 mL. Aggiungere 2 mL di trypsin/EDTA a un piatto Petri e lavare accuratamente il piatto con l'aiuto di pipetta. Aggiungere questa trypsin di nuovo al tubo di falco. Questo riduce al minimo la perdita di tessuto e cellule durante la morte.
- Incubare il tubo su uno shaker per 30 minuti a 37 gradi centigradi a 250 giri/min. Questo passaggio aumenta la dissociazione delle cellule dal tessuto.
- Alla fine dell'incubazione, aggiungere 10 mL di mezzo neutralizzante (50% DMEM/50% F12 con glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 10% FBS) per neutralizzare la metapsina. Mescolare con una pipetta sierologica da 10 mL. La quantità di supporti di neutralizzazione aggiunti deve essere uguale alla quantità di trypsin utilizzata.
- Centrifugare il tubo a 2.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 minuti.
- Scartare il supernatante e ri-sospendere il pellet in 1 mL di media coltura (50% DMEM/50% F12 con glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 20% L929 supernante, 10% FBS).
NOTA: le cellule L929 sono coltura in DMEM (DMEM con glutammina, 1% penicillina-streptomicina, 10% FBS). Il metodo di coltura consigliato da ATCC deve essere seguito per le impostazioni cultura delle celle. Supernatant deve essere raccolto dal fiaschetta di coltura che è almeno 75% confluente. Può essere raccolto alla rinfusa e conservato a -80 gradi centigradi per prevenire il degrado dei fattori di crescita. Si consiglia di aggiungere L929 supernatant separatamente in flaconi invece di aggiungere al supporto di coltura stock. - Placcare le cellule in un pallone T-25, adatto per le cellule aderenti, e aggiungere 4 mL di mezzo di coltura aggiuntivo. Incubare il pallone a 37 gradi centigradi con 5% CO2. Agitare con cura il flacone per disperdere omogeneamente il tessuto. Evitare di portare il supporto al collo del flacone, mentre agitare, in quanto questo può aumentare le probabilità di contaminazione.
2.Coltura cellulare (Giorno 2)
- Raccogliere i supporti dal flacone di coltura T-25 preparato il giorno 0 in tre tubi centrifuga da 1,5 mL raccogliendo lo stesso volume di supporti in ogni tubo. Lavare il pallone una volta con 1 x PBS. Agitare delicatamente il pallone per rimuovere eventuali frammenti di tessuto residuo rimasti. Evitare di agitare duramente il pallone in quanto eventuali frammenti residui non influenzeranno negativamente la coltura. Aggiungere supporti di 5 mL di coltura fresca al pallone.
- Centrifugare i supporti raccolti a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 gradi centigradi per 4 minuti.
- Scartare il supernatant da ogni tubo e aggiungere 1 mL di mezzo di coltura a uno dei tubi. Mescolare accuratamente con pipetta. Aggiungere in serie il supporto misto con le cellule ad altri tubi. Mescolare accuratamente con pipetta e mettere in comune le celle in un tubo.
- Piastrare le cellule in un pallone T-25 separato, adatto per le cellule aderenti. Aggiungere 4 mL di mezzo di coltura e incubare il pallone a 37 gradi centigradi con 5% CO2.
3.Coltura cellulare (Giorno 4)
- Scartare il supporto da entrambi i flaconi e aggiungere nuovi 5 mL di supporti di coltura al flacone.
- Incubare il pallone a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per 2 giorni.
4. Cultura cellulare (Giorno 6)
- Le cellule saranno pronte per ulteriori esperimenti.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo di cui sopra (Figura 1), siamo stati in grado di isolare microglia umana primaria da tessuti cerebrali in tempo reale chirurgicamente resected. Le cellule colturate sono state macchiate con Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina per microglia (verde) e con proteina acida fibrillante gliale (GFAP) per gli astrociti(rosso) (Figura 2) come descritto inprecedenza 22,23,24,25,26. 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) è stato utilizzato per macchiare i nuclei (blu). Il sesto giorno dall'inizio dell'esperimento le cellule erano pronte per ulteriori esperimenti. Le cellule macchiate sono state conteggiate cieche per microglia e astrociti presenti nella coltura. Circa l'80% della coltura primaria era microglia (Figura 2).
Figura 1: Schema dell'isolamento primario della microglia dal cervello adulto. Il tessuto rimosso chirurgicamente è stato raccolto in ghiaccio freddo 10 mL di aCSF in un tubo da 50 mL e trasferito in laboratorio. Il tessuto è stato lavato rispettivamente con aCSF e PBS e tagliato a dadini finemente, dissociato con l'aiuto di trypsin-EDTA e placcato in una fiaschetta T-25. Il secondo giorno i media sono stati raccolti e centrifugati. Pellet è stato mescolato in supporti freschi e placcato in un pallone T-25. Il supporto fresco è stato aggiunto al primo flacone. I supporti sono stati cambiati in entrambi i flaconi in giorni alternati. Le cellule erano pronte per ulteriori esperimenti il giorno 6. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immunocitochimica della microglia umana primaria isolata. (A) Le cellule isolate sono state placcate in uno scivolo a due camere ben macchiate e sono state macchiate con GFAP per astrociti (pannello verde-primo) o RCA per microglia (pannello verde-secondo). Nuclei erano macchiati di blu con DAPI. Il controllo per la RCA e il controllo degli anticorpi secondari per GFAP è mostrato in inset. (B) Le cellule isolate sono state placcate in uno scivolo a due camere ben e sono state macchiate con RCA per microglia (verde) e GFAP per astrociti (rosso). La seconda riga mostra il controllo per la RCA e il controllo degli anticorpi secondari per GFAP. Nuclei erano macchiati di blu con DAPI. (C) Le celle sono state conteggiate dal controllo cieco. La quantificazione è rappresentativa del conteggio da parte di un controllo cieco. Circa l'80% delle cellule erano microglia. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Microglia garantire l'omeostasi nel cervello normale e svolgere ruoli centrali nella fisiopatologia di varie malattie neurologiche4. I microglia sono centrali per il neurosviluppo e la formazione di sinapsi2. Gli studi microgliali si sono dimostrati fondamentali nella comprensione dello sviluppo e della progressione di diverse malattieneurologiche 4. La microglia roditore è il modello prevalente di scelta per gli studi primari sui microgliali, anche se la microglia di roditore è diversa dalla microglia umana primaria negli aspettichiave 13. Lo sviluppo di protocolli efficaci in termini di costi e ad alto rendimento per l'isolamento della microglia umana primaria può contribuire a colmare questa lacuna. Abbiamo sviluppato un protocollo per l'isolamento della microglia umana primaria dal tessuto cerebrale umano vivo, chirurgicamente risettato, adulto. Siamo stati in grado di raggiungere la purezza microgliale di circa l'80% come controllato il7 esimo giorno.
Uno dei passaggi più critici del protocollo è stato il trasporto del tessuto acquisito al laboratorio per l'elaborazione. Poiché il tempo di transito era di circa 75 minuti, era probabile che non fosse in grado di isolare alcuna cella. Abbiamo gestito questo utilizzando un tubo da 50 mL con solo 10 mL di aCSF. aCSF ha fornito i nutrienti necessari e lo spazio rimanente nel tubo ha contribuito ad aerare l'aCSF e il tessuto. C'è la possibilità che ci sia stata una notevole morte di neuroni e altre cellule durante il periodo di transito. Mentre questo aiuta con l'isolamento della microglia, questo protocollo potrebbe non essere efficiente per l'isolamento di altre cellule neurologiche. Siamo stati in grado di isolare le cellule microgliali da 268 mg di tessuto sezionato. Siamo stati anche in grado di raggiungere una significativa purezza di microglia evitando anche il rivestimento del pallone da poli-D-lisina. Anche se questo potrebbe aver provocato una certa perdita di microglia, questo ha evitato anche altre popolazioni di gliali di aderire alla fiaschetta. Inoltre, questo ha evitato un passo in più di scuotere il pallone e raccogliere microglia. Era possibile che alcune delle cellule non aderenzavano nel flacone preparato il giorno 0. Abbiamo raccolto cellule non aderenti dalla coltura iniziale e l'abbiamo placcato di nuovo in un altro pallone il giorno 2, che ha anche prodotto cellule di microglia. Va notato che finemente attare il tessuto è importante in quanto aumenterà la superficie della superficie del tessuto. Questo permetterà la trypsin per accedere alla maggior parte del tessuto e dissociare più cellule.
Per promuovere la crescita della microglia nella coltura, abbiamo condizionato il mezzo di coltura con il supernatant di L929 cellule27,28. Questo fornisce una ricca fonte di Granulocyte-macrofagio colonia fattore stimolante (GM-CSF) come integratore, che migliora la proliferazione macrofaage27,29. Questo ha contribuito a ridurre il costo per ulteriori integratori di crescita costosi che sono un pilastro di diversi protocolli di isolamento primario microgliale. L'aggiunta di L929 supernatant è fondamentale per l'isolamento efficiente e la crescita della microglia nel protocollo. Tuttavia per i laboratori senza coltura cellulare L929, Questo diventa un passo limitante considerando il costo complessivo del protocollo come ulteriori supplementi di crescita saranno necessari. Siamo stati in grado di ottenere una popolazione microgliale di circa l'80% nelle condizioni di coltura. Questo è meno di qualche protocollo pubblicato, ma questo può essere superato avendo un ulteriore ciclo di isolamento attraverso protocolli specifici come l'utilizzo di perline magnetiche per marcatori microgliali specifici. Con circa l'80% di purezza della coltura, il protocollo è efficiente per molti esperimenti come l'immunocitochimica. Tuttavia, per esperimenti come la purificazione delle proteine, l'identificazione delle proteine e il gonfiore occidentale, potrebbe essere necessaria un'ulteriore purificazione della coltura. Anche con l'alta purezza delle culture primarie, c'è sempre la possibilità che altre cellule presenti nella coltura possano aumentare con una durata di coltura più lunga. Abbiamo colturato con successo microglia isolata per 9 giorni passandoli una volta. Mentre le condizioni di coltura nel protocollo favoriscono l'isolamento e la crescita della microglia, la presenza di altre cellule dovrebbe essere considerata quando si mantiene la coltura per più tempo.
Questo protocollo per isolare la microglia primaria è efficace, robusto ed efficiente in termini di costi. Tali protocolli per l'isolamento della microglia umana primaria dal tessuto cerebrale adulto consentiranno una ricerca tempestiva sulle funzioni immunitarie, la fisiologia cellulare e le risposte alle malattie nel cervello adulto. Inoltre, la microglia primaria derivata dal paziente può aiutare a sviluppare terapie future e personalizzate.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il laboratorio di SJ è stato istituito con sovvenzioni istituzionali dell'IITJ ed è finanziato da sovvenzioni del Dipartimento di Biotecnologie (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) e del Ministero dell'Elettronica e della Tecnologia dell'Informazione dell'India (n. 4(16)/2019-ITEA). Le sezioni del tessuto cerebrale umano sono state ottenute dall'All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur dopo l'autorizzazione del comitato etico istituzionale. Ringraziamo Mayank Rathor, membro B.Tech Student della Design and Arts Society IIT Jodhpur, per il supporto alla videografia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
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