Summary
Dieses Protokoll beschreibt die intrazelluläre In-vivo-Aufzeichnung von Rattenlenden-Motoneuronen mit gleichzeitiger transspinaler Gleichstromstimulation. Die Methode ermöglicht es uns, Membraneigenschaften zu messen und rhythmisches Abfeuern von Motoneuronen vor, während und nach der anodalen oder kathhodalen Polarisation des Rückenmarks aufzuzeichnen.
Abstract
Die intrazelluläre Aufzeichnung von Spinal-Motoneuronen in vivo bietet einen "Goldstandard" zur Bestimmung der elektrophysiologischen Eigenschaften der Zellen im intakten Wirbelsäulennetz und bietet erhebliche Vorteile gegenüber klassischen in vitro oder extrazellulären Aufzeichnungstechniken. Ein Vorteil von intrazellulären In-vivo-Aufnahmen ist, dass diese Methode an erwachsenen Tieren mit einem vollausgereiften Nervensystem durchgeführt werden kann, und daher können viele beobachtete physiologische Mechanismen in praktische Anwendungen übersetzt werden. In diesem methodischen Papier beschreiben wir dieses Verfahren in Kombination mit extern angewendeter konstanter Strömungsstimulation, die Polarisationsprozesse in spinalen neuronalen Netzwerken imitiert. Die transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS) ist eine innovative Methode, die zunehmend als neuromodulatorische Intervention in der Rehabilitation nach verschiedenen neurologischen Verletzungen sowie im Sport eingesetzt wird. Der Einfluss von tsDCS auf das Nervensystem bleibt schlecht verstanden und die physiologischen Mechanismen hinter seinen Handlungen sind weitgehend unbekannt. Die gleichzeitige Anwendung des tsDCS mit intrazellulären Aufnahmen ermöglicht es uns, Veränderungen der Motoneuronmembraneigenschaften und Eigenschaften des rhythmischen Abfeuerns als Reaktion auf die Polarisation des spinalen neuronalen Netzwerks, die für das Verständnis von tsDCS-Aktionen entscheidend ist, direkt zu beobachten. Darüber hinaus bietet das vorgestellte Protokoll, wenn es die Identifizierung des Motoneurons in Bezug auf einen innervierten Muskel und seine Funktion (Flexor versus Extensor) sowie den physiologischen Typ (schnell versus langsam) umfasst, die Möglichkeit, den Einfluss von tsDCS auf identifizierte Komponenten der Wirbelsäulenschaltung, die von der Polarisation unterschiedlich beeinflusst zu sein scheinen, selektiv zu untersuchen. Das vorgestellte Verfahren konzentriert sich auf die chirurgische Vorbereitung auf intrazelluläre Aufnahmen und Stimulation mit Einem Schwerpunkt auf den Schritten, die notwendig sind, um Präparationsstabilität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu erreichen. Die Einzelheiten der Methodik der anodalen oder kathhodalen tsDCS-Anwendung werden unter Berücksichtigung praktischer und sicherheitsgewisser informationen erörtert.
Introduction
Transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS) erhält Anerkennung als eine potente Methode zur Veränderung der Erregbarkeit des Spinalkreislaufs bei Gesundheit und Krankheit1,2,3. Bei dieser Technik wird ein konstanter Strom zwischen einer aktiven Elektrode über ausgewählten Wirbelsäulensegmenten übergeben, wobei eine Referenzelektrode entweder ventral oder rostral4befindet. Mehrere Studien haben bereits bestätigt, dass tsDCS bei der Verwaltung bestimmter pathologischer Erkrankungen wie neuropathische Schmerzen5, Spastik6, Rückenmarksverletzung7 oder zur Erleichterung der Rehabilitation8. Die Forscher vermuten, dass tsDCS Veränderungen in der Ionenverteilung zwischen dem intrazellulären und dem extrazellulären Raum über die Zellmembran hervorruft, und dies kann entweder die neuronale Aktivität je nach aktueller Ausrichtung9,10,11erleichtern oder hemmen. Bis vor kurzem fehlte jedoch eine direkte Bestätigung dieses Einflusses auf Motoneuronen.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur In-vivo-intrazellulären Aufzeichnung elektrischer Potentiale aus Lendenwirbelsäulen-Motoneuronen bei der anästhesierten Ratte bei gleichzeitiger Anwendung von tsDCS, um Veränderungen der Motoneuronmembran und feuerende Eigenschaften als Reaktion auf die anodale oder katahodale Polarisation des spinalen neuronalen Netzwerks zu beobachten. Intrazelluläre Aufnahmen öffnen mehrere Bereiche der Untersuchung von Neuroneneigenschaften, nicht verfügbar für zuvor verwendete extrazelluläre Techniken9,12. Beispielsweise ist es möglich, die Motoneuron-Membranspannung auf den durch tsDCS induzierten Gleichstromfluss präzise zu messen, die Spannungsschwelle für die Spitzenerzeugung anzugeben oder Aktionspotenzialparameter zu analysieren. Darüber hinaus ermöglicht uns diese Technik, passive Membraneigenschaften von Motoneuron zu bestimmen, wie z. B. Eingangswiderstand, und den Zusammenhang zwischen intrazellulärem Stimulationsstrom und Häufigkeit des rhythmischen Abfeuerns von Motoneuronen zu beobachten. Die antidromische Identifizierung von aufgezeichnetem Motoneuron, basierend auf der Stimulation funktionell identifizierter Nerven (d.h. Nerven, die Flexoren oder Extensoren efferents liefern) ermöglicht es uns, zusätzlich Typen von innervierten Motoreinheiten (schnell versus langsam) zu identifizieren, was die Möglichkeit gibt zu testen, ob polarisation steile debeeinflusst einzelne Elemente des reifen spinalen neuronalen Systems. Aufgrund umfangreicher Operationen vor der Aufnahme und hohen Anforderungen an die Stabilität und Zuverlässigkeit von Aufnahmen ist diese Technik sehr anspruchsvoll, ermöglicht aber eine direkte und langfristige Beurteilung der elektrophysiologischen Eigenschaften eines Motoneurons: vor, während und nach der Anwendung von tsDCS, was entscheidend ist, um sowohl seine akute Wirkung als auch die anhaltende Wirkung zu bestimmen13. Als Motoneuron aktiviert direkt extrafusale Muskelfasern14 und nimmt an der Rückkopplungssteuerung einer Muskelkontraktion und entwickelter Kraft15teil,16 jeder beobachtete Einfluss von tsDCS auf die Motoreinheit oder Muskelkontraktilen Eigenschaften kann mit Modulationen der Motoneuron Erregbarkeit oder Feuereigenschaften verbunden werden.
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Protocol
Alle mit diesem Protokoll verbundenen Verfahren wurden von den zuständigen Behörden (z. B. der lokalen Ethikkommission) akzeptiert und folgen den nationalen und internationalen Vorschriften über Tierschutz und Tierschutz.
HINWEIS: Jeder Teilnehmer, der an dem Eingriff beteiligt ist, muss in grundlegenden chirurgischen Eingriffen ordnungsgemäß geschult sein und über eine gültige Lizenz für die Durchführung von Tierversuchen verfügen.
1. Anästhesie und Prämedikation
- Anästhetisieren Sie eine Ratte mit intraperitonealen Injektionen von Natriumpentobarbital (eine Anfangsdosis von 60mg-kg -1 für 6 Monate alte männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 400-u2012550g).
HINWEIS: Dieses Protokoll ist nicht auf den angegebenen Stamm, das Geschlecht oder das Alter von Ratten beschränkt. Auch alternative Anästhesie wie Ketamin-Xylazin-Mischung, Alpha-Chloralose oder Fentanyl+Midazolam+Medetomidin kann verwendet werden, wenn besser geeignet für verschiedene Forschungsziele oder wenn von der Ethikkommission erforderlich. - Nach ca. 5 min, überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die Hinterbeine der Ratte mit stumpfer Zange kneifen. Fahren Sie nur dann mit den nächsten Schritten des Protokolls fort, wenn keine Reflexaktion beobachtet wird.
- 0,05 ml Atropin subkutan injizieren, um die Schleimproduktion nach der Intubation zu reduzieren.
- Subkutan 5 ml Phosphatpuffer mit 4% Glukoselösung, NaHCO3 (1 %) injizieren gelatine (14%). Dieser Puffer wird während eines Experiments von den Hautgefäßen absorbiert und trägt zur Aufrechterhaltung des Flüssigkeitsgleichgewichts bei.
- Während der gesamten Operation, überprüfen Sie das Tier regelmäßig auf Reflexaktionen und ergänzen Anästhesie bei Bedarf (10mg-kg -1-h -1Natriumpentobarbital).
2. Chirurgie
- Bereiten Sie das Tier für die chirurgische Behandlung vor, indem Sie Fell über den dorsalen Teil des linken Hinterbeins, vom Knöchel bis zur Hüfte, der Rückseite, vom Schwanz bis zu den hohen Brustsegmenten, die linke Seite der Brust und die ventrale Seite des Nackenbereichs über dem Brustbein
- Platzierung der intravenösen Linie
- Legen Sie die Ratte auf den Rücken auf ein geschlossenes Heizkissen (und sichern Sie sie mit Gliedmaßenfixierungen).
- Mit einer 21 Klinge, machen Sie einen Längsschnitt durch die Haut von einem Brustbein zu einem Kinn.
- Halten Sie die Haut mit Zangen und trennen Sie sie vom darunter liegenden Gewebe.
- Mit stumpfen Seziertechniken entlarven die richtige Jugularvene. Sezieren Sie die Vene vorsichtig von umgebenden Geweben.
- Suchen Sie den Teil der Vene ohne Verzweigungspunkte, rutschen Sie zwei 4-0 Ligaturen darunter.
- Machen Sie einen losen Knoten am proximalen Ende des zuvor identifizierten nicht verzweigten Segments der Vene und einen losen Knoten am distalen Ende dieses Segments der Vene. Klemmen Sie die Vene proximal an das Herz, und dann ligate den distalen Teil der Vene.
- Mit Irisschere, machen Sie einen Schnitt zwischen der Klemme und entfernten Ligatur. Halten Sie eine Venesklappe und führen Sie einen vorgefüllten Katheter so ein, dass er durch die Klemme blockiert wird.
- Wenn Sie die Vene und den Katheter zusammen mit Zangen halten, entfernen Sie die Klemme und drücken Sie den Katheter mehrere Millimeter in die Vene. Sichern Sie beide Enden des Katheters an der Vene, und fügen Sie der Haut einen zusätzlichen Fixationspunkt hinzu.
- Einführung des Trachealrohrs
- Mit stumpfer Zange trennen die beiden Unterkieferdrüsen, die die Sternohyoid-Muskeln bedecken. Trennen Sie die sternohyoiden Muskeln an der Mittellinie, um die Luftröhre freizulegen.
- Schieben Sie drei 4-0 Ligaturen unter die Luftröhre, dann machen Sie zwei Knoten unter der Trachealrohr-Einfügemarke und einen Knoten darüber.
- Suchen Sie den cricoiden Knorpel des Kehlkopfes und machen Sie einen Schnitt unterhalb des dritten Trachealknorpels.
- Legen Sie ein Luftröhrenrohr in die Luftröhre und sichern Sie das Rohr mit vorgefertigten Ligaturen an Ort und Stelle, dann fügen Sie der Haut eine zusätzliche Ligatur hinzu.
- Legen Sie ein kleines Stück Watte über die abgetrennten Muskeln und vernähen Sie die Haut über dem operierten Bereich.
- Zerlegung der Hinterbeinen Nerven
- Mit 21 Klinge, machen Sie einen Längsschnitt auf der hinteren Seite der linken Hinterglied, von der Achillessehne bis zur Hüfte.
- Schnappen Sie sich die Haut mit Dereinsleinen, und mit stumpfen Seziertechniken trennen Sie die Haut von den zugrunde liegenden Muskeln auf beiden Seiten des Schnittes.
- Finden Sie die popliteale Fossa an der Rückseite des Kniegelenks, die von den Bizeps femoris Muskel bedeckt ist, und mit einer Schere machen einen Schnitt zwischen dem vorderen und hinteren Teil dieses Muskels.
- Bewegen nach oben schneiden zwei Köpfe des Bizeps femoris bis zur Hüfte, um den Ischiasnerv zu belichten. Cauterize nach Bedarf, um Blutungen zu verhindern.
- Identifizieren Sie die suralen, tibialen und häufigen peronealen Zweige des Ischiasnervs.
- Trennen Sie mit einer Schere den seitlichen vom medialen Kopf des Magen-Darm-Muskels, um den Tibianerv und seine Zweige freizulegen.
- Mit 55 Zangen greifen sie an das distale Ende des Suralnervs, schneiden sie distally und sezieren so weit wie möglich.
- Wiederholen Sie den Vorgang mit dem gemeinsamen Peronealnerv.
- Mit einer stumpfen Glasstange trennen Sie den Tibianerv von den umgebenden Geweben, wobei darauf geachtet wird, die Blutgefäße nicht zu beschädigen, und schneiden Sie ihn distally.
- Identifizieren Sie die medialen Gastrocnemius (MG) und die seitlichen Gastrocnemius- und Soleus-Nerven (LGS).
- Mit 55 Zangen, sezieren Sie sorgfältig die MG- und LGS-Nerven, trennen sie von umgebenden Geweben, aber ihre Verbindung zu den jeweiligen Muskeln.
- Legen Sie ein mit Einer Linie getränktes Stück Watte unter die exponierten Nerven.
- Schließen Sie die Haut über dem operierten Bereich.
- Laminektomie
- Mit 21 Klinge machen einen Längsschnitt vom Kreuzbein bis zum Brustwirbel.
- Trennen Sie die Haut von den zugrunde liegenden Muskeln.
- Schneiden Sie den Longissimus-Muskel auf beiden Seiten der thorakalen und Lendenwirbelsäulenprozesse.
- Mit stumpfkantigem Skalpell ziehen Sie die Muskeln aus der Wirbelsäule zurück, um die Transversalprozesse jedes Wirbels freizulegen.
- Mit einer stumpfen Spitzenschere schneiden Sie die Sehnen der Muskeln, die mit den Querprozessen entlang der exponierten Wirbelsäule verbunden sind. Wenden Sie bei Bedarf hämostatische Mittel an.
- Identifizieren Sie den Th13-Wirbel als das niedrigste Brustsegment mit Rippeneinfügung und entfernen Sie mit feinen Rongeurs spinnöse Prozesse und Laminaen von Th13 bis L2-Wirbeln, um Lendensegmente des Rückenmarks freizulegen. Denken Sie daran, den L3-Spinnprozess, der als Fixierungspunkt für die Wirbelsäulenstabilisierung verwendet wird, nicht zu beschädigen.
- Entfernen Sie den Th12-Spinnprozess und glätten Sie die Wirbeldorsaloberfläche so weit wie möglich.
- Mit stumpfen Seziertechniken trennen Sie die Muskeln vom Th11-Wirbel, um Halter-Einfügepunkte zu erstellen.
- Legen Sie dünne, mit Wasserlinien getränkte Watte über die freiliegenden Rückenmarkssegmente.
- Bewegen Sie die Ratte auf den maßgeschneiderten Metallrahmen mit zwei parallelen Stangen und zwei verstellbaren Armen mit Klammern, um die Wirbelsäule zu stützen und zu stabilisieren.
3. Vorbereitung für die Aufnahme und Stimulation
- Wirbelsäulenfixierung und Nervenanordnung
- Legen Sie die Ratte in den maßgefertigten Rahmen auf ein Heizkissen, das mit dem geschlossenen Heizsystem verbunden ist, um die Körpertemperatur des Tieres bei 37 °C bei 1°C zu halten.
- Legen Sie EKG-Elektroden unter die Haut und schließen Sie einen Verstärker zur Herzfrequenzüberwachung an.
- Mit den Hautklappen, bilden Sie einen tiefen Pool über dem exponierten Rückenmark.
- Mit Metallklemmen, fixieren Sie die Wirbelsäule, indem Sie Klemmen unter Th12 Querprozesse und bei L3 Spinnprozess.
- Stellen Sie sicher, dass die Wirbelsäule horizontal gesichert und angeordnet ist, und wenden Sie dann dorso-ventralen Druck auf beiden Seiten der Säule an, um die Muskeln zurückzuziehen.
- Füllen Sie den Pool mit warmem (37 °C) Mineralöl und halten Sie ihn bei dieser Temperatur.
- Fädeleine eine 4-0 Ligatur durch die Achillessehne, heben und dehnen Sie die operierte linke Hinterbeine, so dass der Knöchel mit der Hüfte nivelliert wird.
- Mit den Hautklappen machen einen tiefen Pool über die exponierten Tibial, MG und LGS Nerven.
- Füllen Sie den Pool mit warmem (37 °C) Mineralöl.
- Legen Sie MG- und LGS-Nerven auf bipolare Silberdraht-stimulierende Elektroden und verbinden Sie sie mit einem quadratischen Pulsstimulator. Verwenden Sie separate Stimulationskanäle für jeden Nerv.
- Oberflächenelektrodenplatzierung
- Legen Sie eine silberne Kugelelektrode auf die linke Kaudalseite des freiliegenden Rückenmarks mit einer Referenzelektrode, die in die Rückenmuskulatur eingesetzt wird, und verbinden Sie beide Elektroden mit dem Differenz-DC-Verstärker. Die Oberflächenkugelelektrode wird verwendet, um afferent Volleys von Nerven aufzunehmen.
- Mit einem konstantstromigen Stimulator stimulieren Sie die MG- und LGS-Nerven mit quadratischen Impulsen von 0,1 ms Dauer, die bei einer Frequenz von 3 Hz wiederholt werden, und beobachten Sie affete Volleys.
- Bestimmen Sie den Schwellenwert (T) für die Nervenaktivierung, stimulieren Sie jeden Nerv bei ca. 3 T-Intensität und Rekord-Amplitude von afferent volley für jeden Nerv.
- Bewegen Sie die Oberflächenelektrode rostral und wiederholen Sie das Verfahren, um Wirbelsäulensegmente zu identifizieren, bei denen amplituden der Volleys für jeden Nerv am höchsten sind. Nach der Bestimmung der maximalen Volleyposition bewegen Sie die Oberflächenelektrode in einen sicheren Abstand vom Rückenmark.
- Muskellähmung und Bildung eines Pneumothorax zur Reduzierung von Atembewegungen
- Die Ratte intravenös mit einem neuromuskulären Blocker lähmen und das Trachealrohr mit einem externen Beatmungsgerät in Übereinstimmung mit einem Nagetier-kompatiblen Capnometer (Pancuroniumbromid, bei einer Anfangsdosis von 0,4mg-kg -1) verbinden, ergänzt alle 30 min in Dosen von 0,2mg-kg -1)
- Überwachen Sie die2 Endgezeiten-CO2-Konzentration und halten Sie sie bei etwa 3 bis 20124 %, indem Sie die Lüftungsparameter (Frequenz, Luftdruck und Durchflussvolumen) anpassen.
- Machen Sie einen Längsschnitt in der Haut zwischen der 5. und 6. Rippe auf einer Seite der Aufnahme.
- Mit einer stumpfen Spitzenschere schneiden Sie die darüber liegenden Muskeln, um den interkostalen Raum zwischen den Rippen zu visualisieren.
- Mit einer kleinen scharfen Schere, machen Sie einen kleinen Schnitt in den interkostalen Muskeln und in der Pleura, dann legen Sie eine Spitze einer stumpfen Kante Zange in die Öffnung, achten Darauf, nicht auf die Lunge drücken.
- Lassen Sie Zangen erweitern oder setzen Sie ein kleines Rohr ein, um das Pneumothorax während des Experiments offen zu halten.
- Nach dem neuromuskulären Block, überwachen Anästhesie tiefe durch die Überprüfung der EKG-Frequenz, und ergänzen Sie das Anästhetikum, wenn die Herzfrequenz überschreitet 400 bpm. Muskellähmung und Bildung eines Pneumothorax zur Verringerung der Atembewegungen, die Aufnahmestabilität verbessern
- Öffnen der Dura und Pia mater
- Mit #55 Zange, heben Sie die Dura mater vorsichtig an und schneiden Sie sie kauenal aus dem L5-Segment, rostral bis zum L4-Segment.
- Mit einem Paar ultradünner 5SF Zangen machen Sie ein kleines Pflaster in der Pia, das die Rückensäule zwischen den Blutgefäßen bedeckt, genau auf der Ebene des maximalen affetierenden Volleys aus dem MG- oder LGS-Nerven.
- Verwenden Sie kleine Stücke von salinegetränktem und getrocknetem Gelschaum, um Blutungen bei Bedarf zu blockieren.
- tsDCS-Elektrodenplatzierung
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut auf der ventralen Seite eines Rattenabdomens auf der rostro-kaudalen Ebene entsprechend der Lage der L4-L5-Spinalsegmente.
- Schnappen Sie sich die freiliegende Hautklappe mit einem Metallclip, der als Referenzelektrode dient.
- Legen Sie einen salzgetränkten Schwamm auf die Dorsalseite des Th12-Wirbels. Stellen Sie sicher, dass die Schwammgröße der einer aktiven tsDCS-Elektrode (kreisförmige Edelstahlplatte mit einem Durchmesser von 5 mm) entspricht.
- Drücken Sie mit einem feinen Manipulator den Schwamm mit einer aktiven tsDCS-Elektrode auf den Knochen und stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche der Elektrode gleichmäßig gepresst wird.
- Verbinden Sie sowohl Referenz- als auch aktive tsDCS-Elektroden mit einer Konstantstrom-Stimulatoreinheit, die einen kontinuierlichen Gleichstromfluss liefern kann.
- Herstellung von Mikropipetten
- Mit einem Mikroelektroden-Zieher eine Mikroelektrode vorbereiten.
HINWEIS: Es können sowohl Filament- als auch Nicht-Filamentelektroden verwendet werden, denken Sie jedoch daran, dass der Schaft der Elektrode lang genug sein muss, um das ventrale Horn zu erreichen, während sie dünn genug ist, um das Rückenmark beim Absteigen nicht zu komprimieren.- Stellen Sie die Puller-Einstellung so ein, dass der Inpassus, der in das Rückenmark eindringt, ca. 3 mm lang ist, während die Spitze der Elektrode nicht mehr als 1,2222 m Durchmesser hat und der Mikroelektrodenwiderstand zwischen 10 und 20 M beträgt.
- Füllen Sie die Mikroelektroden mit 2M Kalium-Citrat-Elektrolyt.
- Montieren Sie die vorbereitete Mikroelektrode am Mikromanipulator, sodass eine Schrittbewegung und stereotaxic-Kalibrierung von 1-u20122m möglich ist.
- Schließen Sie die Mikroelektrode mit der Referenzelektrode an den intrazellulären Verstärker an, die in den Rückenmuskeln platziert ist.
- Mit einem Mikroelektroden-Zieher eine Mikroelektrode vorbereiten.
- Nach dem neuromuskulären Block, überwachen Anästhesie tiefe durch die Überprüfung der EKG-Frequenz, und ergänzen Sie das Anästhetikum, so dass die Rate der Ratte nicht mehr als 400 bpm.
4. Motoneuron Verfolgung und Penetration
- Legen Sie die afferent volley Aufnahmeelektrode wieder auf die Rückenmarksoberfläche, kausal an die Position der Aufnahmestelle, auf Höhe des L6-Segments.
- Stimulieren Sie die MG- und LGS-Nerven mit elektrischen 0,1 ms Impulsen bei einer Frequenz von 3 Hz und 3T-Intensität, um alle Axone von Alpha-Motoneuronen innerhalb eines ausgewählten Nervs zu aktivieren.
- Fahren Sie die Micropipette in einen ausgewählten Patch in der Pia mit einem medio-lateralen Winkel von 15-u201220° (mit einer spitze seitlich gerichteten Spitze).
- Nach dem Abstieg unter die Oberfläche, kalibrieren Sie die Mikroelektrode und kompensieren ihre Kapazität und Spannungsversatz, und setzen Sie das Eindringen des Rückenmarks fort, wenn alle Parameter stabil sind. Ein antidromisches Feldpotential des Motoneuronbeckens wird an der Mikroelektrodenspannungsspur sichtbar sein, während man sich während der Stimulation des jeweiligen Nervs einem dedizierten Motorkern nähert.
- Führen Sie die Penetration mit der Mikroelektrode bei Schritten von 1,20122 m durch und nutzen Sie regelmäßig die Buzz-Funktion des intrazellulären Verstärkers, um die Elektrodenspitze von Rückständen zu befreien.
- Beobachten Sie die Motoneuron-Penetration, die durch eine plötzliche Hyperpolarisation der aufgezeichneten Spannungsspur und das Auftreten eines antidromischen Spitzenpotentials gekennzeichnet ist.
5. Aufnahme von Motoneuron-Membran und Brenneigenschaften
- Identifizieren Sie im Brückenmodus des intrazellulären Verstärkers das Motoneuron anhand des "Alles-oder-Nichts"-Erscheinungsbildes des antidromischen Wirkungspotentials durch Stimulierung der jeweiligen Nervenzweige. Zeichnen Sie 20 nachfolgende Spuren für die spätere Mittelung auf.
- Implementierung eines strengen Einschlusskriteriums, um qualitativ hochwertige Daten zu gewährleisten: ruhendes Membranpotenzial von mindestens -50 mV in Amplitude; Aktionspotenzial-Amplituden von mehr als 50 mV mit positiver Überschreitung; Membranpotenzial stabil für mindestens 5 min vor der Aufnahme.
- In einem diskontinuierlichen Strom-Clamp-Modus (Strom-Schaltrate-Modus 4–8 kHz) des intrazellulären Verstärkers, evozieren ein orthodromisches Aktionspotential in einem Motoneuron mit 0,5 ms intrazellulären depolarisierenden Stromimpulsen. Wiederholen Sie den Vorgang mindestens 20 Mal für die Offline-Mittelung.
- Stimulieren Sie ein Motoneuron mit 40 kurzen Impulsen (100 ms) hyperpolarisierenden Strom (1 nA), um den Zelleingangswiderstand zu berechnen.
- Stimulieren Sie ein Motoneuron mit 50 ms quadratischen Wellenimpulsen bei steigenden Amplituden, um den Rheobase-Wert als minimale Amplitude des depolarisierenden Stroms zu bestimmen, der erforderlich ist, um eine einzelne Spitze auszulösen.
- Injizieren Sie 500 ms rechteckige Impulse des depolarisierenden Stroms, bei zunehmenden Amplituden in Schritten von 0,1–2 nA, um rhythmische Entladungen von Motoneuronen zu evozieren.
6. Transspinale Gleichstromstimulation (tsDCS)
- Unter Beibehaltung einer stabilen Penetration des Motoneurons, starten Sie das Polarisationsverfahren durch transspinale Anwendung von Gleichstrom. Passen Sie die aktuelle Intensität und Anwendungszeit an das Versuchsdesign an (z. B. 0,1 mA für 15 min).
- Beobachten Sie unmittelbar nach dem Einschalten des Gleichstroms das Motoneuron-Membranpotential. Die anodale Polarisation (die aktive Elektrode als Anode) sollte zu einer Depolarisation des Membranpotentials führen, während die kathadale Polarisation (die aktive Elektrode als Kathode) einen gegenteiligen Effekt hervorrufen sollte. Beobachten Sie, ob eine Änderung des ruhenden Membranpotentials als Reaktion auf die DC-Stimulation konstant ist, wodurch sichergestellt wird, dass die elektrische Feldintensität nicht beeinträchtigt wird.
- Wiederholen Sie bei kontinuierlicher Stromanwendung die Schritte 5.3-u20125.6 in 5-min-Intervallen.
- Schalten Sie den Domänencontroller aus, und wiederholen Sie die Schritte 5.3-u20125.6 in 5-min-Intervallen, bis Aufzeichnungen instabil werden oder Aufnahmekriterien kompromittiert werden.
- Beenden Sie das Experiment und einschläfern Sie das Tier mit intravenöser Verabreichung einer tödlichen Dosis Pentobarbital-Natrium (180mg-kg -1).
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Representative Results
Parameter von Aktionspotentialen und mehrere Membraneigenschaften können auf der Grundlage intrazellulärer Aufzeichnungen berechnet werden, wenn stabile Bedingungen der Zelldurchdringung gewährleistet sind. Abbildung 1A zeigt ein typisches orthodromisches Aktionspotential, das durch intrazelluläre Stimulation evoziert wird und alle Kriterien für die Dateneinschlusse erfüllt (das Ruhende Membranpotential von mindestens -50 mV und die Spikeamplitude über 50 mV mit einer positiven Überschreitung). Es können Aktionspotentialparameter wie die Spikeamplitude, die Amplitude der Nachhyperpolarisation oder die Nachhyperpolarisations-Halbzerfallszeit (AHP-HDT) gemessen werden. Ein Wert des letztgenannten Parameters in Ratten-Motoneuronen dient als zuverlässiges Kriterium für die Unterscheidung zwischen schnellen und langsamen Motoneuronen (AHP-HDT > 20 ms für langsam, während AHP-HDT <20 ms für schnelle Motoneuronen)17. Abbildung 1B zeigt eine Zellreaktion auf einen 100 ms hyperpolarisierenden Stromimpuls von 1nA, von dem aus sowohl der Peak- als auch der Plateau-Eingangswiderstand (IR) eines Motoneurons aus der Spannungsablenkung bestimmt werden können. Abbildung 1C zeigt eine erweiterte Spannungsspur einer rheobasic-Spitze mit einer deutlich markierten Spannungsschwelle der Spitze, die den Grad der Membrandepolarisation angibt, bei dem spannungsgebundene Natriumkanäle aktiviert werden, um das Aktionspotential zu initiieren. Alle diese Aufnahmen können während und nach der tsDCS-Anwendung mehrmals wiederholt werden, was es uns ermöglicht, die entsprechenden Parameter zu vergleichen, solange das ruhende Membranpotential stabil ist und andere Kriterien der Stimulation und des Aufzeichnungsprotokolls erfüllt sind.
Mehrere Studien haben indirekt gezeigt, dass tsDCS die Motoneuronererregbarkeit und das Brennmuster9,18verändert. Abbildung 2 zeigt Beispiele für intrazelluläre Spannungsspuren von zwei Motoneuronen, die intrazellulär mit 500 ms quadratischen Impulsen des depolarisierenden Stroms vor, während und nach der tsDCS-Anwendung stimuliert wurden. Unter stabilen Bedingungen können Aufnahmen, die mehrere Minuten nacheinander wiederholt werden, durchgeführt werden, und Motoneuron-Feuermuster können zuverlässig verglichen werden. Es wurde festgestellt, dass Anodal (+) tsDCS auf eine erhöhte Motoneuronererererererererererererererererererererererererererererererererabilität und höhere Frequenzen des rhythmischen Abfeuerns wirkte (Abbildung 2A), während kathodienliche (-) tsDCS in Richtung Feuerhemmung wirkten (Abbildung 2B). Darüber hinaus überdauerten die Auswirkungen beider Arten von tsDCS die Polarisationsphase. Es ist auch erwähnenswert, dass die beobachteten Veränderungen der Erregbarkeit und des Brennmusters nicht nur auf die Depolarisation der Zellmembran oder Hyperpolarisation durch annodalen bzw. kathhoder tsDCS zurückzuführen sind, sondern auch tiefgreifende Veränderungen aufweisen, die nicht mit der Veränderung eines Membranpotentials zusammenhängen, da sie trotz der Tatsache fortbestehen, dass dieser Parameter nach dem Ende der Polarisation wieder zu einer Basislinie zurückkehrt.
Schließlich ist darauf hinzuweisen, dass Abweichungen vom vorgelegten Protokoll wahrscheinlich zu einem fehlgeschlagenen Experiment führen werden, was auf eine Verschlechterung der Vorbereitung und/oder einen tiefgreifenden Rückgang der Datenzuverlässigkeit zurückzuführen ist. Abbildung 3 zeigt Beispiele für Aufzeichnungen, bei denen Dateneinbeziehungskriterien entweder durch unvollkommene Zelldurchdringung (Abbildung 3A), Vernachlässigung zum Ausgleich von Mikroelektrodenresistenz und -kapazität (Abbildung 3B) oder durch eine Instabilität des Rückenmarks (Abbildung 3C) kompromittiert wurden. Es ist wichtig, dass Forscher solche nicht optimalen Aufzeichnungen identifizieren und angemessene Korrekturmaßnahmen durchführen oder solche Ergebnisse aus dem Datensatz ignorieren.
Abbildung 1: Parameter der Aktionspotentiale und Membraneigenschaften.
(A) Ein orthodromisches Wirkungspotential, das durch intrazelluläre Stimulation entlockt wird, mit angegebenen Grundparametern, die aus diesem Datensatz berechnet werden können. AP ampl = Aktionspotentialamplitude; AHP Ampl = Nachhyperpolarisationsamplitude; AHP-HDT = Nachhyperpolarisation Halbzerfallszeit. (B) Die Spannungsspur einer Membranantwort auf einen kurzen (100 ms) depolarisierenden Stromimpuls von 1nA Intensität, die es uns ermöglicht, den Eingangswiderstand (IR) zu berechnen. Beachten Sie den Höhepunkt einer potentiellen Durchbiegung (IR Peak), gefolgt von einer kleinen Abnahme und der folgenden Plateauphase des Membranpotentials (IR-Plateau). (C) Die erweiterte Spannungsspur einer rheobasic Spitze mit einer gepunkteten horizontalen Linie, die den Spitzenspannungsschwellenwert angibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswirkungen der Polarisation auf das Motoneuron-Feuer.
(A) Intrazelluläre Aufzeichnungen von einem Motoneuron stimuliert intrazellulär mit 7,5 nA für 500 ms, vor (links), während Anodal tsDCS (0,1 mA, Mitte) und 10 min nach dem Ende der Polarisation (rechts). Beachten Sie die allmähliche Erhöhung der Motoneuron Erregbarkeit bei der gleichen Stimulusintensität. (B) Intrazelluläre Aufzeichnungen von einem anderen Motoneuron stimuliert intrazellulär mit 6 nA für 500 ms, vor (links), während kathulart tsDCS (0,1 mA, Mitte) und 10 min nach dem Ende der Polarisation (rechts). Beachten Sie eine allmähliche Hemmung der Motoneuron-Feuerfrequenz bei der gleichen Stimulusintensität. Nachfolgend werden Spuren intrazellulärer Stimulationsstrome bereitgestellt. Die Kalibrierbalken unten rechts gelten für alle dargestellten intrazellulären Aufnahmen. Die Werte des ruhenden Membranpotentials werden links von jeder Aufnahme bereitgestellt. Die Häufigkeiten des stationären Abfeuerns, berechnet aus den Mitteln der letzten drei Zwischenintervalle, sind über den Aufzeichnungen angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiele für suboptimale Datensätze infolge von Abweichungen vom Versuchsprotokoll.
(A) Die antidromische Spitze, die von einem Motoneuron aufgezeichnet wurde, drang unzureichend ein. Das ruhende Membranpotential ist unzureichend (-45 mV), und trotz einer geeigneten Form der Spitze mit allen aufeinanderfolgenden Phasen der Depolarisation, Repolarisation und Hyperpolarisation ist ihre Amplitude zu niedrig (41 mV) und ohne Überschreitung. (B) Eine rheobasic-Spitze, die bei einer unrealistischen Spannungsschwelle erzeugt wird (Membran depolarisiert auf +68 mV). Diese Art von Fehler ist in der Regel auf eine blockierte Mikroelektrode, mit unkompensierter Beständigkeit und Kapazität. Man kann auch sehen, dass dieser Datensatz stark durch 50 Hz elektrisches Rauschen kontaminiert ist. (C) Ein Motoneuron-Rhythmusfeuer als Reaktion auf 500 ms Depolarisationsstrom, mit großen Schwankungen eines Membranpotentials, hauptsächlich verursacht durch instabile Mikroelektrodenpenetration, möglicherweise aufgrund übermäßiger Atembewegungen. Für alle dargestellten Fälle wären die berechneten Membran- oder Brenneigenschaften unzuverlässig. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Bei korrekter Durchgeführtkeit sollte der chirurgische Teil des beschriebenen Protokolls innerhalb von etwa drei Stunden abgeschlossen sein. Besonders vorsichtig ist es, während der Operation stabile physiologische Bedingungen eines Tieres, insbesondere körperintheischer Temperatur und Tiefe der Anästhesie, aufrechtzuerhalten. Abgesehen von offensichtlichen ethischen Erwägungen kann ein Mangel an richtiger Anästhesie zu übermäßigen Gliedmaßenbewegungen während der Nervensektion oder Laminektomie führen und zu einer Schädigung der Präparation oder zu einem vorzeitigen Abbruch des Experiments führen. Bei der Lähmung eines Tieres vor dem Eindringen in das Rückenmark mit einer Mikroelektrode ist es entscheidend, die Tiefe der Anästhesie und herzfrequenz zu überwachen und geeignete Beatmungsparameter auf der Grundlage des Gewichts und der Lungenkapazität des Tieres anzuwenden. Abweichungen von den gewünschten physiologischen Parametern müssen unverzüglich geändert werden, um den Prozesserfolg zu gewährleisten. Nach der Operation sollten stabile Aufnahmebedingungen für mindestens vier Stunden aufrechterhalten werden können.
Nach dem Eindringen eines Motoneurons ist die Aufnahmestabilität von hoher Bedeutung. Es ist zwingend erforderlich, dass ein Membranpotential während der Kontrollaufzeichnungen konstant bleibt, da jegliche Schwankungen den Rheobase-Strom und eine Schwelle des rhythmischen Abfeuerns erheblich beeinflussen. Die richtige Fixierung der Wirbelsäule sollte für grundlegende Stabilität sorgen, während das Ziel eines Pneumothorax es ist, die Rückenmarksbewegungen zu verringern, die durch Atmung ausgelöst werden. Darüber hinaus muss man sicher sein, dass Muskelkontraktionen vollständig abgeschafft werden, bevor die Penetration versucht wird und der neuromuskuläre Blocker in regelmäßigen Abständen verabreicht wird.
Nach erfolgreicher Penetration kann die antidromische Identifizierung des aufgezeichneten Motoneurons durch Stimulation eines jeweiligen Nervenzweigs durchgeführt werden. Dies ist ein echter Vorteil einer In-vivo-Vorbereitung, bei der Motoneuron-Axone in Kontinuität mit den innervierten Muskeln in Bezug auf intrazelluläre In-vitro-Aufnahmen an Wirbelsäulenscheiben gehalten werden, die erst vor kurzem bei erwachsenen Tieren16möglich waren, aber keine Identifizierung von aufgezeichnetem Motoneuron zulassen. Es ist jedoch wichtig, dass die Forscher ein klares Verständnis des Unterschieds zwischen antidromischer und orthodromischer Aktivierung von Motoneuron19 haben, um eine Fehlinterpretation der Daten zu vermeiden. Es ist wichtig, die periphere Nervenstimulation so gering wie möglich zu halten (weniger als 0,5 V), um die Aktivierung zusätzlicher Nerven durch die Stromausbreitung zu verhindern und auf eine konstante und kurze Latenz der antidromischen Spitze19zu achten.
Ein weiterer Vorteil der vorgestellten Technik ist, dass Motoneuronen aufgrund ihrer Wirkungspotenzialparameter, nämlich der AHP-HDT-Dauer17,zusätzlich als schnelle oder langsame Typen klassifiziert werden können. Die Unterscheidung zwischen Motoneuronen, die schnelle und langsame Muskelfasern innenaufsteigen, ist entscheidend für ihren unterschiedlichen Beitrag zur Muskelleistung während der Bewegungen. Darüber hinaus können schnelle und langsame Motoneuronen anders auf die Polarisation9reagieren.
Um zuverlässige Polarisationsergebnisse zu gewährleisten, sollte man darauf achten, die richtigen Parameter von tsDCS festzulegen. Die Stromintensität sollte einerseits eine gewünschte Felddichte im ausgewählten Bereich liefern, um Wirkungen auf neuronale Netzwerke zu evozieren, andererseits sollte sie innerhalb der Sicherheitsgrenzen für Gewebeschäden20sein. Größe der aktiven und Referenzelektroden und ihre Platzierung in Bezug auf einen Ort der Aufzeichnung sind auch wichtige Elemente zu berücksichtigen4, und die tsDCS Dauer Anwendungszeit sollte ausreichen, um die gewünschten Effekte zu evozieren16,17,22. In diesem Methodenpapier wurden die repräsentativen Ergebnisse durch Anwendung von 100 a katathare oder anodalpolarisation für 15 min erhalten. Unter Berücksichtigung der Elektrodenform und des Durchmessers betrug die jeweilige elektrische Feldintensität direkt unter der Elektrode 39,25 x2. Allerdings sollte man verstehen, dass der genaue Wert des elektrischen Feldes an der aufgezeichneten Motoneuron-Stelle unmöglich ist, als Motoneuron-Position in Bezug auf Polarisationselektrode variiert, und die E-Felddichte sinkt deutlich mit erhöhter Tiefe und verringerter Elektrodengröße4,24. Darüber hinaus ist die Ausrichtung der Motoneuronfächer im Verhältnis zum angewandten elektrischen Feld wichtig für die Erzeugung von Aktionspotentialen22,25,26, und dies kann für einzelne Zellen nicht vorhergesagt werden. Darüber hinaus ist es sehr wichtig zu verstehen, dass tsDCS-Effekte nicht auf eine Periode der Polarisierung beschränkt sind und dass anhaltende, langanhaltende Effekte gut dokumentiert sind22,27. Daher würden nach einer einzigen, kurzen Polarisationssitzung alle aufeinanderfolgenden Aufnahmen in der gleichen Präparation unter Postpolarisationsbedingungen durchgeführt, was die Anzahl möglicher akuter Polarisationsaufnahmen auf eine pro Tier begrenzt.
Zusätzliche Änderungen des vorgestellten Verfahrens können vorgenommen werden, um spezifische Forschungsfragen zu beantworten. Dieses Protokoll mit minimalen Modifikationen kann als Standard für verschiedene experimentelle Konstruktionen verwendet werden, z. B. beim Testen verschiedener Dauer und/oder Amplituden von angewendetem tsDCS oder beim Vergleich kurz- oder langfristiger Effekte von tsDCS in verschiedenen Pools Motoneuronen. Die Verwendung mehrerer genetischer Krankheitsmodelle (z. B. SOD1 G93A Rattenmodell der amyotrophen Lateralsklerose) oder verschiedener Nerven zur antidromischen Nervenaktivierung (peroneal, tibial, saphenous, etc.) ist akzeptabel. Man sollte sich jedoch auch der Verfahrensbeschränkungen bewusst sein. Zum Beispiel hemmt die Verwendung von Barbituraten zur Anästhesie die Aktivität persistenter Innenströmungen28, während die systemische Einführung spezifischer Blocker, die häufig in In-vitro-Präparaten verwendet werden (z. B. Strychnin zur Blockierung von Nikotinrezeptoren), sich als tödlich für das Tier erweisen kann. Es ist ratsam, dass Forscher diese Einschränkungen berücksichtigen, bevor sie das richtige experimentelle Protokoll auswählen.
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Disclosures
Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Stipendium des National Science Center Nr. 2017/25/B/NZ7/00373 unterstützt. Die Autoren möchten die Arbeit von Hanna Drzymaa-Celichowska und W.zimierz Mr. wczyéski würdigen, die beide zur Datenerhebung und Analyse der in diesem Beitrag vorgestellten Ergebnisse beigetragen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Durgs and solutions | - | - | - |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | - | - |
| Glucose | Merck | 346351 | - |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | - |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | - | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Pu?awy Sp. z o.o | - | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | - |
| Tetraspan | Braun | - | HES solution |
| Surgical equipment | - | - | - |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | - |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | - |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | - |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | - | - | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | - |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | - |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | - | - | - |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | - |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | - |
| Equipment | - | - | - |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | - | - | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | - | - | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | - | - | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | - | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | - | - | - |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | - | - | - |
| flexible tubing | - | - | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | - | - | For nerve electrodes |
References
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