Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Визуализация взаимодействия белков ДНК по иммунофлюоресценции

doi: 10.3791/61447 Published: June 26, 2020

Summary

После повреждения ДНК, человеческие клетки активируют необходимые пути восстановления для восстановления целостности их генома. Здесь мы описываем метод косвенного иммунофторесценции как средство обнаружения белков восстановления ДНК, анализа их пространственного и временного набора, а также помогаем допросить взаимодействие белково-белкового белка в местах повреждения ДНК.

Abstract

Клетки млекопитающих постоянно подвергаются воздействию химических веществ, излучению и естественным метаболическим побочным продуктам, которые создают специфические типы оскорблений ДНК. Генотоксические агенты могут повредить позвоночник ДНК, сломать его или изменить химический характер отдельных оснований. После оскорбления ДНК активируются пути реакции повреждения ДНК (DDR) и набираются белки, участвующие в ремонте. Множество факторов участвуют в зондировании типа повреждения и активации соответствующего ответа на ремонт. Неспособность правильно активировать и набирать факторы DDR может привести к геномной нестабильности, которая лежит в основе многих человеческих патологий, включая рак. Исследования белков DDR могут дать представление о генотоксической реакции препарата и клеточных механизмах лекарственной устойчивости.

Есть два основных способа визуализации белков in vivo:прямое наблюдение, пометки белка интереса с флуоресцентным белком и после него живой визуализации, или косвенные иммунофторесценции на фиксированных образцах. В то время как визуализация флуоресцентно помеченных белков позволяет точно контролировать с течением времени, прямые пометки в N- или C-термине могут помешать локализации или функции белка. Предпочтительнее наблюдение за белками в их немодифицированном эндогенном варианте. Когда белки восстановления ДНК набираются на оскорбление ДНК, их концентрация увеличивается локально, и они образуют группы, или "фоки", которые могут быть визуализированы косвенным иммунофторесценцией с использованием конкретных антител.

Хотя обнаружение белковых очагов не является окончательным доказательством прямого взаимодействия, ко-локализация белков в клетках указывает на то, что они перегруппируются к месту повреждения и могут информировать о последовательности событий, необходимых для сложного образования. Тщательный анализ очагов пространственного перекрытия в клетках, выражаюющих дикий тип или мутантные версии белка, может дать драгоценные подсказки о функциональных областях, важных для функции восстановления ДНК. Наконец, ко-локализация белков указывает на возможные прямые взаимодействия, которые могут быть проверены путем ко-иммунопреципиентации в клетках, или прямого выдвижного использования очищенных белков.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Клетки человека постоянно подвергаются воздействию различных ДНК-повреждающих веществ различного происхождения. Экзогенные источники в основном состоят из воздействия радиации, химических веществ (включая химиотерапевтические агенты и некоторые антибиотики) и вирусов, в то время как основные эндогенные источники включают ошибки в репликации ДНК и окислительного стресса. Прямые последствия генотоксического воздействия могут варьироваться от модифицированной базы до потенциально смертельного разрыва двойной нити ДНК (DSB), в зависимости от стресса и дозы воздействия. В конечном счете, невосстановимые или неправильно отремонтированные повреждения ДНК могут привести к накоплению мутаций, геномных перестановок, нестабильности генома и в конечном итоге привести кканцерогенеза 1. Клетки млекопитающих развились сложные пути для распознавания конкретных типовповреждения ДНК 2,3 и ремонта их своевременно, синхронизированы с прогрессированием клеточного цикла.

Ионизирующее излучение (ИК) повреждает двойную спираль ДНК и создает двойные разрывы (DSB), одну из самых вредных форм повреждения ДНК. Комплекс MRN (MRE11, RAD50, NBS1) функционирует как датчик конца ДНК и активирует белок киназы атаксия телангиектазия мутировавшая(ATM) 4,5. После первоначальной активации банкомата по ДНК заканчивается, банкомат запускает каскад событий DDR в месте разрыва, инициируя с ключевым событием, фосфорилирование гистона вариант H2AX6. Фосфорилирование H2AX на остатке S139 активирует его в QH2AX, охватывающих регионы до мегабазы вокругпоражения ДНК 6,,7,,8,,9. Это событие повышает доступность ДНК, что приводит к набору и накоплению других белков восстановленияДНК 7. Из-за того, что ЗГ2АКС обильно и специально индуцирован окружающими DSB, его можно легко визуализировать с помощью специфических антител, и он обычно используется в качестве суррогатного маркера для DSBs в области восстановления ДНК. Как только разрыв сигнализируется, клетки активируют пути восстановления ДНК и обработать повреждение ДНК. Белок MDC1 (посредник белка контрольно-пропускного пункта повреждения ДНК 1) напрямую связывает qH2AX10,взаимодействуетс банкоматом 11, а также с NBS112,,13. Это способствует увеличению концентрации комплекса MRN в DSB и инициированию положительного цикла обратной связи банкоматов. После ремонта разрыв быстро удаляется, что позволяет контролировать клиренс DSB. Вслед за микроскопией, снижение йH2AX с течением времени обеспечивает косвенное измерение остаточных разрывов и эффективности восстановления ДНК.

Эукариотические клетки могут ремонтировать DSBs несколькими путями, два основных из которых являются неомологическими конца присоединения (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR) (Рисунок 1). NHEJ по существу лигаты ДНК двойной пряди заканчивается без использования расширенной гомологии и работает на протяжении всегоклеточного цикла 14,15. HR становится преобладающим во время фаз S и G2, и в противном случае подавляется, так как он требует сестра хроматид в качестве гомологовогошаблона для ремонта 14,16. Выбор пути между NHEJ и HR зависит не только от физической близости сестры хроматид, но и от расширения ДНК конца ресекции17, который подавляет NHEJ.

Гомологиологически-зависимый ремонт DSB инициирует нуклеолитической деградацией 5' нитей от концов разрыва для генерации 3' однотяговых ДНК (ssDNA) хвостов, процесс, называемый 5'-3' resection. Комплекс MRN инициирует ресекцию конца ДНК и дальнейшая ресекция обрабатывается в сочетании с BLM/EXO1 (белок синдрома Блума/экзонуклеаза 1) или BLM/DNA2 (репликация ДНК АТФ-зависимого геликайса/нуклеазы)18,19,20,21,22. Ресекция конца ДНК усиливается CtIP (CtBP-взаимодействующий белок) через его прямое взаимодействие с MRNкомплекс 23 и набор BRCA1 (белок восприимчивости рака молочной железы типа1) 24,25. Репликационный белок A (RPA) быстро связывается с ssDNA подвергается, а затем вытесняется рекомбиназы белка RAD51 сформировать нуклеопротеин нить, которая катализа гомологичный поиск и вторжениепряди 26,27,28.

Инициирование ресекции является важным шагом для выбора пути ремонта. После того, как ресекция началась, концы ДНК становятся бедными субстратами для связывания гетенодимером Ku70/Ku80 (компонент пути NHEJ), а клетки привержены HR17,,29,30. Ku70/Ku80 гетенодимер связывается с концами DSB, вербовка ДНК-PKcs и p53 Связывающий белок 1 (53BP1)29,30. 53BP1 выступает в качестве барьера для resection в G1, тем самым блокируя HR при продвижении NHEJ31,32, но он удаляется в BRCA1-зависимой манере в фазе S, следовательно, позволяя resectionпроизойти 33,34. Таким образом, 53BP1 и BRCA1 играют противоположную роль в ремонте DSB, с 53BP1 является посредником NHEJ в то время как BRCA1 действует позволяет перерывы для ремонта через HR.

В лаборатории образование DSB может быть вызвано ионизирующим излучением (ИК). Хотя этот пример использует высокую дозу 4 Gy, 1 Gy и 2 Gy также создать значительное количество DSBs, подходит для анализа образования очагов обильными белками. Важно отметить, что тип и доза используемого излучения может привести к различным поражениям в ДНК и в клетке: в то время как ИК индуцирует DSBs, он также может вызвать одиночные разрывы нити или изменения базы(см. 35,36 для справки об облучении линейной передачи энергии (LET) и тип повреждения ДНК). Для определения кинетики ионизирующего радиационно-индуцированного образования очагов (IRIF) и их расчистки, которые указывают на ремонт повреждений и разворот активированного DDR8,,9,,37,,38,образование очагов можно контролировать в разные моменты времени после ионизирующего излучения. Сроки активации и очистки всех основных белков поврежденияДНК известно 39, и многие из них расследуются как суррогатные маркеры ключевых событий. Например, pRPA, который обладает высокой сродством к ssDNA используется в качестве суррогата ресекции разрыва, белки MRN (MRE11, RAD50, NBS1) и экзонуклеазы могут быть использованы для оценки эффективности ресекции тоже. В то время как RAD51, BRCA1, BRCA2 (белок восприимчивости к раку молочной железы 2 типа) и PALB2 (партнер и локализатор BRCA2) могут быть проверены для оценки эффективности HR, наличие белков Ku или 53BP1, используются в качестве маркеров NHEJ (Рисунок 1).

По мере того как протеины машин ремонта ДНАА вербуют один другого к пролому и собирают в супер-комплексах, взаимодействия дна-белка и протеина-протеина можно сделать вывод путем следовать за их индивидуальной локализацией над временем и анализировать co-локализацию протеинов, как визуализировано перекрывая сигналамив клетке 40,41,42. В клеточных линиях введение точечных мутаций или удаление в конкретных генах восстановления ДНК либо путем редактирования генома, либо путем переэкспрессии плазмидных мутантов, позволяет изутовить специфические остатки и их возможную роль в признании повреждения ДНК (например, совместной локализации с помощью QH2AX) или сложной сборки (совместной локализации с другим, или несколькими белками), а также их влияния на ДНК. Здесь мы используем косвенное иммунофторесценцию как среднее для исследования образования и разрешения DSBs, следуя фоклюсу NO2AX с течением времени. Мы также представляем один пример анализа формирования очагов и совместной локализации крупным игроком в ремонте DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Как упоминалось ранее, 53BP1 считается центральным для выбора пути восстановления ДНК. После накопления 53BP1 и его совместной локализации с хХ2АКС предоставляет ценную информацию о фазе клеточного цикла, накоплении повреждений ДНК и пути, используемом для ремонта DSB. Целью косвенной иммунолокализации является оценка эффективности восстановления повреждений ДНК в клеточных линиях, после ИК, как в данном исследовании, или после воздействия различных напряжений в клетке, от перекрестного пересечения ДНК до блокировки вилки репликации (список повреждающих ДНК агентов приведен в таблице 1).

Figure 1
Рисунок 1: ДНК двойные нити перерывов (DSB) ремонт путей.
Ремонт DSB включает в себя два основных пути: гомологичная рекомбинация (HR, слева) и не гомологичный end-Joining (NHEJ, справа). После перерыва, белки активируются, чтобы отметить разрыв (NOH2AX), участвовать в конце ресекции (MRN), пальто resected ssDNA (pRPA), способствовать рекомбинации (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) или ограничить ресекцию и содействовать NHEJ (53BP1). Другие белки участвуют в ремонте повреждений, но перечисленные белки обычно следуют косвенные иммунофлуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Повреждающее ДНК агент Механизм действия Рекомендуемая доза
К-лучи/рентгеновские лучи Излучения
Формирование двухместных разрывов с некоторыми неконтролируемыми клеточными эффектами
1-4 Gy
36 Лет Ар ионы Излучения
Формирование двухместных перерывов
270 кВ/мкм
К-частицы Излучения
Формирование двухместных перерывов
116 кВ/мкм
Блеомицин Ингибитор синтеза ДНК 0,4-2 мкг/мл
Камптотецин Ингибитор топоизомеразы I 10-200 нм
Цисплатин Алкилайт агент
(индуцирующие внутристрандовые перекрестные ссылки)
0,25-2 МКМ
Доксорубицин Интеркалирующий агент
Ингибитор топоизомеразы II
10-200 нм
Этопозид Ингибитор топоизомеразы II 10 МКМ
Гидроксиуреа Ингибитор синтеза ДНК
(по рибонуклеотидной редуказе)
10-200 МКМ
Метил метансульфонат Алкилайт агент 0,25-2 мММ
Митомицин C Алкилайт агент 0,25-2 МКМ
Ультрафиолетовый (УФ) свет Формирование димеров тимидин
(генерация искажения цепочки ДНК)
50-100 мДж/см2

Таблица 1: Генотоксические агенты. Примеры повреждающих ДНК агентов, их механизм действия и ущерб, индуцированный на основе предложенной рабочей концентрации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Культура клеток HeLa

  1. Предварительно обработать круглые стеклянные крышки с 1 M HCl при 50 градусов по Цельсию в течение 16-18 часов. Промыть ddH2O и хранить в 100% EtOH.
  2. Подготовка среды клеточной культуры: добавьте 10% (v/v) FBS к среде DMEM.
  3. Выращивайте 4,0 х10 4 клетки/ну в стерильной пластине 12-колодец с 18-мм круглым стеклянным крышкой при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 во влажном инкубаторе. Выращиваемые клетки до 80% стечения (примерно 24 часа).

2. Клеточная обработка с радиацией (IR)

  1. Чтобы вызвать образование двухтяговых разрывов, подвергайте клетки 4 Ги-облучению (контроль: Отсутствие облучения, t'0). В Гамма-клетке -40, это соответствует 4,54 мин, на 0,815 Gy за минуту.
  2. Инкубационные клетки при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 во влажном инкубаторе для соответствующего времени (точки времени, выбранные здесь t'1, 2, 4, 16 h).

3. Ядерная добыча и фиксация клеток

  1. Подготовка фондовых растворов: 0.2 M PIPES (рН 6.8), 5 M NaCl, 2 M сахароза, 1 M MgCl2, 0.1 M EGTA (рН 8.0).
  2. Подготовка буфера ядерной добычи (NEB): растворить 10 мМ PIPES (рН 6,8), 100 мм НаКл, 300 мм сахарозы, 3 мм MgCl2, 1 мМ ЕГТА (рН 8,0) и 0,5% (v/v) Тритон X-100 в ddH2O. Mix до полного растворения.
  3. Подготовка 4% (v/v) параформалдегид (PFA): растворить 10 мл 16% PFA aqueous решение в 30 мл PBS. Смешайте до полного растворения.
  4. В нужное время (t'0, 1, 2, 4, 16 h), мыть клетки дважды с 1 мл PBS. Удалите PBS полностью.
  5. Добавьте 200 МКЛ НЭБ к каждой колодец для извлечения ядер клеток (цитоплазма деградирует, остается только ядро)(рисунок 2). Инкубировать в течение 2 минут при комнатной температуре и удалить полностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышать 2 минут.

Figure 2
Рисунок 2: Ядерная добыча.
Репрезентативные изображения ячеек до (слева) и после (справа) ядерной добычи. Цитоплазма должна быть переварена, но ядерная структура должна оставаться нетронутой после экстракции (справа). (A) увеличение в 20 раз; шкала бар 20 мкм и (B) 40x увеличение; шкала бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

  1. Вымойте клетки с 1 мл PBS. Удалите PBS полностью. Добавить PBS тщательно, клетки очень хрупкие на этом этапе.
  2. Добавьте 200 МКЛ 4% (v/v) PFA к каждому колодец для фиксации клеток. Инкубировать в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Удалите PFA полностью.
  3. Добавьте 1 мл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться в PBS при 4 градусах Цельсия.

4. Иммунофлуоресценция окрашивания

  1. Подготовь блокирующий раствор: растворите 5% BSA (w/v) в PBS и добавьте 0,3% (v/v) Triton X-100. Смешайте до полного растворения.
  2. Подготовь буфер разбавления: растворите 1% BSA (w/v) в PBS и добавьте 0,3% (v/v) Triton X-100. Смешайте до полного растворения.
  3. Для блокировки добавьте 200 МКЛ блокирующего решения к каждой из них. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре или 16-18 часов при температуре 4 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если коза антитела будут использоваться, добавить 5% козьей сыворотки для блокирования раствора.
  4. Разбавить первичные антитела в буфере разбавления (1:500; см. таблицу 2 для списка антител) и вихрь до тех пор, пока хорошо смешанные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если коза антитела используется, добавить 1% козьей сыворотки для разбавления буфера.
  5. В коробке влажности/инкубации прилипаем к куску парафильма. Добавьте 10 МКЛ первичного антитела (в одну каплю). Выровняйте один край крышки с падением и медленно опустите на парафильм, чтобы жидкость распространилась по всему (избегайте пузырьков, если это возможно). Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
  6. Мытье coverslips три раза в PBS в течение 1 минуты.
  7. Разбавить вторичные антитела в буфере разбавления (окончательная концентрация: 2 мкг/мл) и вихрь до тех пор, пока хорошо смешанные.
  8. Нанесите 10 МКЛ вторичных антител, как описано для первичных антител. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите от света.
Антитела Компании Ссылки Источник
53BP1 Сигнализация ячеей 4937 Кролик
Анти-мышь IgG Н И Л (Алекса Флюор 647) Абкам ab150103 Осла
Антифосфо-гистон H2A. X (Ser139), клон JBW301 Миллипор 05-636 Мыши
Анти-Rabbit IgG H и L (Алекса Флюор 488) Абкам ab150081 Коза

Таблица 2: Антитела, используемые. Список антител, используемых в этом исследовании.

  1. Мытье coverslips три раза в PBS в течение 1 минуты.
  2. Вымойте крышки с H2O в течение 1 минуты.
  3. Антистейн ДНК с DAPI: применить 10 йл 300 нМ DAPI (как описано для антител), инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем установить на стеклянную горку с глицеролом на основе монтажа средств массовой информации. Кроме того, добавьте одну каплю (10 МКЛ) коммерческих антифадных монтажных средств, содержащих DAPI, на слайд и нанесите крышку. Аккуратно нажмите на крышку и удалите излишки жидкости вокруг нее бумажным полотенцем.
  4. Печать охватывает с прозрачным лаком для ногтей и дайте им высохнуть в течение 20 минут.
  5. Храните слайды при 4 градусах Цельсия.

5. Приобретение изображений

  1. Поместите каплю масла погружения на объектив 60x объектив. Используйте DAPI, чтобы найти ядра через кусок глаза.
    1. Для приобретения изображений XY, открытого программного обеспечения для приобретения и выбора параметров: Тип сканера: Galvano; Режим сканера: Раундтрип; Размер изображения: 512-512; Режим PMT: VBF; Среднее значение ПМТ: кадр (4 раза); Последовательное сканирование PMT: линия.
    2. Выберите краситель и детекторы:
      Канал (CH1), краситель (DAPI), детектор (SD1)
      Канал (CH2), краситель (Alexa Fluor 488), детектор (HSD3)
      Канал (CH3), краситель (Alexa Fluor 647), детектор (HSD4)
    3. Выберите ON в "Я".
  2. Отрегулируйте живое изображение. Нажмите кнопку Live на окне Live.
    1. Отрегулируйте фокусировку и установите интенсивность лазера (%), чувствительность (HV), на получите и компенсируйте на окне инструмента «PMT».
      1. Отрегулируйте интенсивность лазера (%): для яркости и отбеливания. Чем выше интенсивность лазера, тем сильнее сигнал, но образец будет photobleach.
      2. Отрегулируйте чувствительность (HV): уровень шума. Чем выше HV, тем сильнее сигнал, но изображение будет шумно, если слишком высока.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите напряжение постоянным.
      3. Отрегулируйте смещения: фоновый уровень.
    2. Выберите Start/End (15 ломтиков), для стеков.
  3. Начните приобретение.
    1. Выберите папку для сохранения изображений. Нажмите кнопку LSM Start, чтобы начать получение изображения. Нажмите кнопку Серия Готово, чтобы завершить получение изображения.

6. Анализ данных

  1. Для анализа изображений откройте программное обеспечение для анализа.
    1. Нажмите на окно инструмента Batch, выберите изображения для анализа и выбора папки вывода.
    2. Нажмите на окно инструмента анализа и выберите Проекцию (будет отображаться максимальная проекция интенсивности из 15 срезов).
    3. При настройке ввода/выводавыберите созданную партию.
    4. Процесс прессы для обработки изображений.
    5. Экспортные изображения как файлы .tiff.
  2. Для количественной оценки ядерных очагов откройте CellProfiler.
    1. Откройте конвейер количественной оценки фоций noH2AX и 53BP1 (см. Дополнительную информацию).
    2. Графические данные с помощью программного обеспечения таблицы.
  3. Для совместного анализа локализации откройте CellProfiler.
    1. Откройте конвейер Colocalization (см. Дополнительную информацию). Файл электронной таблицы будет создан и сохранен в предпочтительном месте. Однако сами графики не будут автоматически сохранены. Предлагается сделать снимок окон, чтобы сохранить для записи результатов.
    2. Графические данные с помощью программного обеспечения таблицы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

На второй день, или 24 ч после посева клеток на крышки, клетки претерпели одно деление и 80% стечения. Конкретные нокдауны или мутации в белках восстановления ДНК могут увеличить время удвоения, или сенсибилизировать клетки для генотоксического лечения, и плотность посева, а также дозы лечения должны быть скорректированы соответствующим образом. Для определения наилучших условий труда, сроки реакции повреждения ДНК могут быть установлены путем западного blotting из QH2AX с течением времени, и чувствительность к облучению может быть определена путем колонии формирования анализа.

Клетки, не обработанные облучением, проявляют мало, если таковые имеются, qH2AX foci(рисунок 3A). Тем не менее, образование очагов NO2AX может быть вызвано в культурных клетках различными стрессами, присущими условиям выращивания: клетки, оставленные в подкисленных средствах массовой информации, наличие генотоксического эндотоксина в FBS, концентрация кислорода, используемая для культуры, чтобы привести несколько.

Figure 3
Рисунок 3: Ядерные очаги без стресса.
При отсутствии внешнего стрессора, очень немногие, если какие-либо очаги NOH2AX наблюдаются (A). При отсутствии необходимых белков для восстановления ДНК, накопление Х2АКС может наблюдаться, так как разрывы, происходящие из-за эндогенных источников, не восстанавливаются (B). Накопление невосстановленных разрывов может привести к тому, что клетки станут доапоптотичными, что характеризуется «твердым» окрашиванием ядер (C). Шкала планки 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Кроме того, в клетках, истощенных для ключевых белков повреждения ДНК, таких как клетки-мутанты BRCA1 или BRCA2, разрывы ДНК, которые возникают в результате эндогенных стрессов, не восстанавливаются, как в клетках дикого типа, а накапливаются. В результате, повышенный qH2AX можно наблюдать в HR дефицитных клеток, даже в нормальных условиях выращивания(рисунок 3B). Поднаселения клеток может проявлять "твердое" ядерное окрашивание с qH2AX(рисунок 3C). Пан-ядерное пятно может указывать на то, что клетка перегружена повреждениями, не подлежит ремонту, и/или является предапоптотической. Такие клетки, как правило, характеризуются увеличенными ядрами и наличием цитоплазмических вакуолов. Кроме того, ЗГ2АКС может быть вызван репликационный стресс в S-фазе и застопорился репликации вилки, или G2 / M арест. При необходимости фазы клеточного цикла можно определить путем окрашивания содержимого ДНК или совместного окрашивания с помощью конкретных маркеров. При проведении анализа повреждения ДНК пан-ядерный может быть количественно независимо от индивидуальных очагов.

После облучения ядра обладают большим количеством двойных разрывов нитей, к которым очень быстро локализуется qH2AX(рисунок 4). В оптимальных условиях при отсутствии облучения наблюдаются лишь немногие очаги ЗГ2АКС. После облучения резко увеличивается образование очагов ЗГ2АКС. Если перерывы обрабатываются и восстанавливаются, количество очагов на ядра снижается, а также количество клеток, положительных для очагов. Интенсивность и количество очагов варьируется в зависимости от используемой клеточной линии и дозы облучения доставлено. При низком прохождении клеток HeLa, выращенных в сыворотке без эндотоксина, мы регулярно наблюдали резкое увеличение очага на 30 минут и 1 ч после облучения, которое достигает пика от 1 до 2 ч, а затем постепенно уменьшается до 16 ч. По этой причине здесь представлены репрезентативные точки времени на 0, 1, 2, 4 и 16 ч после облучения. Поведение сигнализации разрыва, ремонта и выживания к облучению может сильно варьироваться между клеточными линиями, а также при истощении или мутации генов. По этой причине наиболее подходящими точками времени будут экспериментировать и зависеть от клеток. В эксперименте, при 16 h qH2AX остаточные очаги достигли того же базального уровня, что и необлученные клетки. Мониторинг остаточного очага для включения более поздних точек времени предлагается при работе с медленно разделяющими клеточными линиями.

Figure 4
Рисунок 4: Ядерные очаги и количественная оценка после стресса (курс времени).
Формирование очагов h2AX при t'0 (без облучения) и в указанных точках времени после облучения (4 Г., т.1, 2, 4, 16 ч). (A) Показаны репрезентативные изображения. DAPI указывает на ядра. Шкала планки 5 мкм. (B) Ядерные очаги ЗГ2АКС после воздействия облучения были забиты автоматизированной количественной оценкой (CellProfiler) в 100 ядрах для каждой точки времени. В зависимости от поднятого биологического вопроса и типа полученных данных имеются различные варианты представления необработанных данных, с тем чтобы облегчить сопоставление и критическое понимание. i) Облачный график показывает среднее значение SD. Символ (я) указывает на статистическую значимость по отношению к контролю, используя двуххвостый t-test студента: p 0.0001, (ii) кривая индукции показывает среднее значение SEM, (iii) более 10 foci на ядро. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

С другой стороны, в клетках, не хватает для функций восстановления повреждений ДНК, очаги H2AX накапливаются при отсутствии облучения (т.0 ч) и ремонт может быть отложен, или отсутствует даже в течение длительного времени точек (t'16 h, t'24 h) после облучения. Прямое сравнение между диким типом и клетками-мутантами может дать ценную информацию о функции восстановления ДНК мутировавшего гена и намекнуть на тип ремонта. В то время как недостаток в NHEJ может заставить перерыв быть отремонтированы HR в S-фазе, DSBs, которые были resected и должны быть отремонтированы HR не будут отремонтированы NHEJ. По этой причине накопление повреждений после S-фазы может указывать на дефицит кадров, а высокие уровни qH2AX после разделения намекают на дефекты NHEJ.

Когда несколько белков исследованы в тех же клетках, ко-локализация может быть изучена путем мультиплексирования первичных антител, поднятых в различных видах животных и выявление их со вторичными антителами помечены с различными флюорофоров (Рисунок 5). Ко-локализация указывает на то, набираются ли белки (i) на перерыв (ii) своевременно, (iii) собираются в комплексах по ремонту ДНК. При поиске совместной локализации общепринятым качественным методом является представление результатов как простого наложения различных каналов (т.е. зеленого и красного). Суперпозиция зеленого и красного цвета приведет к желтым точкам доступа, где два белка, представляющие интерес, присутствуют в тех же пикселях(рисунок 5A). Однако этот метод имеет ограничения, так как он зависит от относительной интенсивности сигнала, собранного в обоих каналах, и два фторхрома могут иметь различия в силе сигнала. Таким образом, методы наложения помогают генерировать визуальную оценку событий совместной локализации, но не подходят для количественных целей. Количественный анализ совместной локализации может быть достигнут на основе объектного подхода(рисунок 5B (i-iii) или статистического подхода, который выполняет анализ коэффициента интенсивности (ICCB)(рисунок 5B (iv)). Имеется несколько инструментов для совместного анализа локализации, в том числе JACoP (Просто еще один ко-локализации Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) и "Colocalization" трубопровода (CellProfiler) используется здесь, которые могут быть использованы в качестве инструмента ICCB, для того, чтобы оценить связь между флуоресценции интенсивности. В основном это делается путем расчета коэффициента корреляции (коэффициент Пирсона), который измеряет прочность линейной взаимосвязи между двумя переменными. Флуоресценция ко-локализации может быть графически представлена на участках рассеяния, где интенсивность одного флюорохрома (зеленого) построена против интенсивности второго флюорохрома (красного) для каждого пикселя. Полная локализация приводит к кластеризации точек вокруг прямой линии, наклон которых отражает соотношение флуоресценции двух цветов. Напротив, отсутствие совместной локализации приводит к распределению точек на две отдельные группы (распределенные по осям), каждая из которых показывает различные уровни сигнала одного цвета практически без сигнала от другого цвета. Значение коэффициента Пирсона колеблется от 1 до -1, при этом 1 значение для полной положительной корреляции, -1 для отрицательной корреляции и ноль, указывающие на отсутствие корреляции. Кроме того, метод Pclc может быть использован. Этот метод применялся в различных излучениях (см.36 для получения подробной информации и свободно доступного метода).

Figure 5
Рисунок 5: Анализ совместной локализации.
С помощью нескольких антител, поднятых против различных видов (здесь, анти-мышь NoH2AX (красный) и анти-кролик 53BP1 (зеленый)), несколько белков могут быть исследованы. (A) Показаны репрезентативные изображения. DAPI указывает на ядра. Ко-локализация визуализируется по цвету и перекрытию области (здесь красный и зеленый и желтый). Шкала планки 5 мкм. (B) Индивидуальные и коло локализующие очаги можно количественно количественно определить с помощью одного из нескольких программ (здесь, CellProfiler, см. другие варианты в основном тексте) и построен. (i-iii) Подход на основе объектов, используемый для определения результатов совместной локализации (iv) корреляции, полученных для совместной локализации, с использованием пиксельного подхода (анализ ICCB). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная информация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Анализ сроков и эффективности ремонта повреждений ДНК с помощью микроскопии оказался необходимым для понимания того, как функционирует механизм восстановления ДНК, в нормальных клетках и в патологиях человека, таких как рак.

Разработка специфических антител, позволяющих обнаруживать активированные белки в их фосфорилированной версии (например, NOH2AX, pRPA, pRAD50 идр. 10,,23,,39,,43)сыграла центральную роль в получении лучшего понимания времени восстановления ДНК событий и ее синхронизации с клеточным циклом. Этот успех подтверждается анализом фосфорилированных остатков 53BP1, масс-спектрометрией и иммунолокализации(см. 32 для обзора), который помог понять функцию этого сильно модифицированного белка. С восхождением микроскопической техники высокого разрешения, такой как STORM и более широкое использование небольших антител (нанободи), прямое белковое взаимодействие в клетках становится все более доступным и точным. Тем не менее, косвенные иммунофторесценции, как описано здесь остается важным экспериментом для выполнения при расследовании новых потенциальных ДНК ремонт белка и ищет сроки действия и белка партнеров.

Успех косвенного иммунофторесценции полностью зависит от двух критериев: i) качество реагентов - особенно антител, используемых для обнаружения фосфо-остатков на активированных белках восстановления ДНК, и ii) сроки проведения эксперимента. При наличии следует поощрять использование опубликованных протоколов и антител. При использовании нового антитела или исследования нового белка, антитела должны быть проверены, и специфичность должна быть установлена либо сбить целевого белка в клетках (сигнал должен быть потерян) или белка истощения (использование очищенного белка для истощения конкретных антител до инкубации, как этовыполняется в 44 для RAD51AP1).

Для минимизации артефактов и неспецифического окрашивания должны быть созданы оптимальные условия блокирования и разбавления антителами. Буферы будут подготовлены свежими, и если ядерная добыча будет выполнена, она должна быть приуготовна, чтобы избежать повреждения ядер. При расследовании эффективности ремонта в клетках человека, количественная оценка ядерных очагов должны быть выполнены, и ядерная экстракция может помочь с исключением цитоплазмических белков. Тем не менее, это может быть полезно, чтобы не выполнять этап ядерной добычи, например, чтобы исследовать ли мутант белка подозреваемых не взаимодействовать со своим клеточным партнером не может транслокироваться в ядро при повреждении ДНК.

Кроме того, качество изображения имеет первостепенное значение для обеспечения того, чтобы данные могли быть должным образом получены, проанализированы и точные данные построены. Параметры для контроля много и включают в себя: специфичность первичных антител, спектр возбуждения флюорофоров выбрали (вторичные антитела), защиты образцов от фотоотвержения, выбор поддержки для посевных клеток, хорошая выборка (минимум от 30 до 300 ядер, в зависимости от вопроса), а в некоторых случаях после лечения, такие как деконволюция или спектральный не-смешивания. По возможности предлагается автоматизированная визуализация полного обложки, которая позволяет изображениям тысяч ячеек. Следует рассмотреть вопрос о привлечении специалистов по визуализации, таких как основной объект до начала эксперимента, поскольку это значительно повысит качество результатов.

Последнее, на основе клеточных линий, используемых, лечение выполняется, и белки исследованы, базальные уровни очагов может сильно варьироваться и сделать результаты трудно интерпретировать. По этой причине важно, чтобы необработанные данные обобщались, обрабатывались, анализировались и представлялись в эффективном формате в свете, который читатели могут понять; содействие сопоставлению и выявление тенденций и взаимосвязей в рамках данных. На рисунке 4Bодна и та же количественная оценка очагов строится в трех отдельных версиях: i) общее количество очагов (облачный участок) после DSB, вызванных облучением (ii) индукцией очагов с течением времени -кинетики- (iii) % положительных клеток (Nogt;10 foci/nucleus).

Облачные участки должны быть предпочтительнее,когда это возможно (рисунок 4B (i)), поскольку они показывают все точки данных без дискриминации и, таким образом, предлагают наиболее полный обзор эксперимента. Тем не менее, построение более избирательной и актуальной информации, такой как количество положительных ячеек выше произвольного фона отрезали (5 очагов в большинстве клеточных линий), количество очагов совместной локализации, foci индукции с течением времени, или качество измерения очагов, таких как размер пикселей или интенсивность, может быть более подходящим в некоторых случаях, и ответственность авторов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Фонда района Сан-Антонио. Онкологический центр Мэйс поддерживается NCI онкологический центр поддержки основной грант P30 CA054174. Мы хотели бы поблагодарить Стивена Холлоуэя за помощь в поиске реагентов, а также лабораторию Sung за предоставление пространства и микроскопии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (4), 016600 (2015).
  2. Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11, (7), (2019).
  3. Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9, (12), (2018).
  4. Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22, (20), 5612-5621 (2003).
  5. Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308, (5721), 551-554 (2005).
  6. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36, (17), 5678-5694 (2008).
  8. Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2, (3), 233-235 (2003).
  9. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146, (5), 905-916 (1999).
  10. Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123, (7), 1213-1226 (2005).
  11. Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21, (2), 187-200 (2006).
  12. Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9, (8), 795-801 (2008).
  13. Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181, (2), 213-226 (2008).
  14. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9, (4), 297-308 (2008).
  15. Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, (5), 012757 (2013).
  16. Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, (9), 016428 (2014).
  17. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  18. Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17, (1), 11-16 (2010).
  19. Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25, (4), 350-362 (2011).
  20. Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479, (7372), 241-244 (2011).
  21. Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289, (39), 27314-27326 (2014).
  22. Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
  23. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450, (7169), 509-514 (2007).
  24. Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
  25. Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459, (7245), 460-463 (2009).
  26. Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
  27. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
  28. Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, (11), 012740 (2013).
  29. Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26, (7), 1551-1559 (1998).
  30. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  31. Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290, (38), 22931-22938 (2015).
  32. Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
  33. Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35, (4), 534-541 (2009).
  34. Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24, (2), 108-117 (2014).
  35. Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11, (11), (2019).
  36. Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).
  37. Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12, (2), 162-169 (2002).
  38. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3, (8-9), 959-967 (2004).
  39. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10, (15), 886-895 (2000).
  40. Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (17), 7155-7160 (2009).
  41. Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40, (20), 10312-10323 (2012).
  42. Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11, (1), 819 (2020).
  43. Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101, (2), 255-266 (2017).
  44. Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, (9), 3560-3565 (2011).
Визуализация взаимодействия белков ДНК по иммунофлюоресценции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).More

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter