Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Visualisering af DNA Reparation Proteiner Interaktion ved Immunofluorescence

doi: 10.3791/61447 Published: June 26, 2020

Summary

Efter DNA-skader aktiverer humane celler vigtige reparationsveje for at genoprette integriteten af deres genom. Her beskriver vi metoden til indirekte immunfluorescens som et middel til at detektere DNA-reparationsproteiner, analysere deres rumlige og tidsmæssige rekruttering og hjælpe med at afhøre proteinproteininteraktion på steder med DNA-skader.

Abstract

Pattedyrceller er konstant udsat for kemikalier, stråling, og naturligt forekommende metaboliske biprodukter, som skaber specifikke typer af DNA-fornærmelser. Genotoksiske midler kan beskadige DNA-rygraden, bryde den eller ændre den kemiske karakter af individuelle baser. Efter DNA-fornærmelse aktiveres DNA-skadesresponsveje (DDR), og proteiner, der er involveret i reparationen, rekrutteres. En overflod af faktorer er involveret i sensing typen af skader og aktivere passende reparation svar. Undladelse af korrekt aktivere og rekruttere DDR faktorer kan føre til genomisk ustabilitet, som ligger til grund for mange menneskelige patologier, herunder kræft. Undersøgelser af DDR-proteiner kan give indsigt i genotoksisk lægemiddelrespons og cellulære mekanismer for lægemiddelresistens.

Der er to vigtige måder at visualisere proteiner in vivo:direkte observation, ved at mærke protein af interesse med et fluorescerende protein og efter det ved levende billeddannelse, eller indirekte immunfluorescens på faste prøver. Mens visualisering af fluorescerende mærkede proteiner giver mulighed for præcis overvågning over tid, direkte mærkning i N- eller C-endestation kan forstyrre protein lokalisering eller funktion. Observation af proteiner i deres uændrede, endogene version foretrækkes. Når DNA reparation proteiner rekrutteres til DNA-fornærmelse, deres koncentration stiger lokalt, og de danner grupper, eller "foci", der kan visualiseres ved indirekte immunfluorescens ved hjælp af specifikke antistoffer.

Selv om påvisning af protein foci ikke giver et endeligt bevis for direkte interaktion, co-lokalisering af proteiner i celler viser, at de omgruppere til stedet for skader og kan informere om rækkefølgen af begivenheder, der kræves for kompleks dannelse. Omhyggelig analyse af foci rumlige overlapning i celler, der udtrykker vilde type eller mutant versioner af et protein kan give dyrebare spor på funktionelle domæner vigtigt for DNA reparation funktion. Sidst, co-lokalisering af proteiner indikerer mulige direkte interaktioner, der kan verificeres ved co-immunoprecipation i celler, eller direkte pulldown ved hjælp af rensede proteiner.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Menneskelige celler er konstant udsat for en række DNA skadelige stoffer af forskellig oprindelse. Eksogene kilder består for det meste af eksponering for stråling, kemikalier (herunder kemoterapeutiske midler og visse antibiotika) og virus, mens de vigtigste endogene kilder omfatter fejl i DNA-replikation og oxidativt stress. De direkte virkninger af genotoksisk eksponering kan variere fra en modificeret base til en potentielt dødelig DNA dobbelt-streng pause (DSB), afhængigt af stress og eksponeringsdosis. I sidste ende, urepareret eller fejlrepareret DNA-skader kan føre til ophobning af mutationer, genomiske rearrangements, genom ustabilitet og i sidste ende føre til carcinogenese1. Pattedyrceller har udviklet komplekse veje til at genkende specifikke typer afDNA-skader 2,,3 og reparere dem i tide, synkroniseret med cellecyklus progression.

Iioniserende stråling (IR) skader DNA dobbelt helix og skaber dobbelt-streng pauser (DSBs), en af de mest skadelige former for DNA-skader. MRN (MRE11, RAD50, NBS1) kompleks fungerer som en sensor af DNA ender og aktiverer protein kinase ataxia telangiectasia muteret (ATM)4,5. Efter den første aktivering af ATM ved DNA ender, ATM udløser en kaskade af DDR begivenheder på det sted, hvor pausen, indlede med en vigtig begivenhed, fosforylering af histone variant H2AX6. H2AX-fosforylering på restprodukt S139 aktiverer det i γH2AX, der spænder over områder op til megabaser omkring DNA-læsionen6,7,8,9. Denne hændelse øger DNA-tilgængeligheden, hvilket fører til rekruttering og akkumulering af andre DNA-reparationsproteiner7. Fordi γH2AX er rigeligt og specifikt induceret omkringliggende DSBs, det kan let visualiseres ved hjælp af specifikke antistoffer, og er almindeligt anvendt som en surrogat markør for DSBs i DNA reparation området. Når bruddet er signaleret, celler aktivere deres DNA reparation veje og behandle DNA-skader. Proteinet MDC1 (mægler af DNA-skader checkpoint protein 1) binder direkte γH2AX10, interagerer med ATM11 og også med NBS112,13. Det bidrager til at øge koncentrationen af MRN-komplekset i DSB og indleder et positivt atm-feedback-loop. γH2AX fjernes hurtigt, når bruddet er repareret, hvilket gør det muligt at overvåge DSB-frigangen. Efterfulgt af mikroskopi giver faldet i γH2AX over tid en indirekte måling af resterende brud og DNA-reparationseffektivitet.

Eukaryote celler kan reparere DSBs ved flere veje, de to vigtigste er ikke-homologe end-sammenføjning (NHEJ) og homolog rekombination (HR) (Figur 1). NHEJ i det væsentlige ligaerer DNA dobbelt-streng ender uden brug af udvidet homologi og opererer i hele cellecyklus 14,15. HR bliver fremherskende i S- og G2-faser, og undertrykkes ellers, da det kræver en søsterkromet som en homolog skabelon til reparation14,16. Pathway valg mellem NHEJ og HR ikke kun afhænger af den fysiske nærhed af søsterchromatid, men også af udvidelsen af DNA ende resektion17, som hæmmer NHEJ.

Homologi-afhængige DSB reparation initiere ved nukleolytisk nedbrydning af 5 'streng fra pausen ender til at generere 3 'single-streng DNA (ssDNA) haler, en proces benævnt 5'-3 'resektion. MRN-komplekset indleder DNA-slutresektion, og yderligere resektion behandles i kombination med BLM/EXO1 (Bloom syndrom protein/exonuclease 1) eller BLM/DNA2 (DNA replikation ATP-afhængig helicase/nuklease)18,19,20,21,22. DNA-slutresektion forstærkes af CtIP (CtBP-interagerende protein) gennem dets direkte interaktion med MRN-kompleks23 og rekruttering af BRCA1 (brystkræfttype 1 modtagelighedsprotein)24,25. Replikering protein A (RPA) straks binder sig til ssDNA eksponeret og derefter fordrevet af recombinase protein RAD51 til at danne en nukleoprotein glødetråd, der katalyserer homolog søgning og strand invasion26,27,28.

Indledningen af resektion er et kritisk skridt for reparation pathway valg. Når resektion er indledt, DNA ender bliver fattige substrater til binding af Ku70/Ku80 heterodimer (komponent af NHEJ vej) og celler er forpligtet til HR17,,29,30. Den Ku70/Ku80 heterodimer binder sig til DSB ender, rekruttere DNA-pc'er og p53 Bindende Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 fungerer som en hindring for resektion i G1 og blokerer således HR og fremmer samtidig NHEJ31,32, men fjernes på en BRCA1-afhængig måde i S-fasen , hvilket gør det muligt at genskrive33,34. Derfor spiller 53BP1 og BRCA1 modsatrettede roller i DSB-reparationen, hvor 53BP1 er NHEJ-facilitator, mens BRCA1 handler, der gør det muligt at reparere gennem HR.

I laboratoriet kan DSB-formationen induceres ved iioniseringsstråling (IR). Mens dette eksempel udnytter en høj dosis på 4 Gy, 1 Gy og 2 Gy også skabe en betydelig mængde af DSBs, egnet til analyse af foci dannelse af rigelige proteiner. Det er vigtigt at bemærke, at den anvendte type og dosis af stråling kan føre til forskellige læsioner i DNA og i cellen: mens IR inducerer DSBs, kan det også forårsage enkelt streng pauser eller base modifikation (se35,36 for en reference på bestråling lineær energioverførsel (LET) og type DNA-skader). For at bestemme kinetik af iionizing stråling-induceret foci (IRIF) dannelse og deres clearance, som indikerer reparation af skader og tilbageførsel af den aktiverede DDR8,9,37,38, foci dannelse kan overvåges på forskellige tidspunkter efter iionizing stråling.9 Timing af aktivering og clearance af alle større DNA-skader proteiner er kendt39, og mange er undersøgt som surrogat markører for vigtige begivenheder. For eksempel, pRPA, som har høj affinitet for ssDNA bruges som et surrogat for pause resektion, MRN proteiner (MRE11, RAD50, NBS1) og exonucleaser kan bruges til at vurdere resektion effektivitet også. Mens RAD51, BRCA1, BRCA2 (brystkræft type 2 modtagelighed protein), og PALB2 (partner og localizer af BRCA2) kan overvåges for at evaluere HR effektivitet, tilstedeværelsen af Ku proteiner eller 53BP1, anvendes som markører for NHEJ (Figur 1).

Som proteiner af DNA reparation maskiner rekruttere hinanden til pause og samle i super-komplekser, DNA-protein og protein-protein interaktioner kan udledes ved at følge deres individuelle lokalisering over tid og analysere co-lokalisering af proteiner, som visualiseret af overlappende signaler i celle40,41,42. I cellelinjer giver indførelsen af punktmutationer eller sletning i specifikke DNA-reparationsgener enten gennem genomredigering eller ved overekspression af plasmidbaserede mutanter mulighed for undersøgelse af specifikke restkoncentrationer og deres mulige rolle i genkendelse af DNA-skader (f.eks. co-lokalisering med γH2AX) eller kompleks samling (sam lokalisering med en anden eller flere proteiner) samt deres indvirkning på DNA-reparationen. Her bruger vi indirekte immunfluorescens som et middel til at undersøge dannelsen og opløsningen af DSB'er ved at følge γH2AX foci over tid. Vi præsenterer også et eksempel på foci formation og co-lokalisering analyse af en stor aktør i DSB reparation: p53 Bindende Protein 1 (53BP1)32. Som tidligere nævnt, 53BP1 anses for centralt for DNA reparation pathway valg. Efter 53BP1 ophobning og dens co-lokalisering med γH2AX giver værdifulde oplysninger om celle cyklus fase, DNA-skader ophobning, og vej bruges til at reparere DSBs. Formålet med indirekte immunolokalkisering er at vurdere effektiviteten af DNA-skade reparation i cellelinjer, efter IR som i denne undersøgelse, eller efter eksponering for forskellige belastninger i celle, fra DNA crosslinking til blokering af replikation gaffel (en liste over DNA skadelige stoffer er fastsat i tabel 1).

Figure 1
Figur 1: DNA dobbelt streng pauser (DSB) reparation veje.
DSB reparation indebærer to store veje: Homolog rekombination (HR, venstre) og ikke-homologe End-Joining (NHEJ, højre). Efter pausen aktiveres proteiner for at markere bruddet (γH2AX), deltager i slutresektionen (MRN), belægger den resected ssDNA (pRPA), fremmer rekombination (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) eller begrænser resektion og fremmer NHEJ (53BP1). Andre proteiner deltager i skadesreparation, men de anførte proteiner efterfølges rutinemæssigt af indirekte immunfluorescens. Klik her for at se en større version af dette tal.

DNA-skademiddel Virkningsmekanisme Anbefalet dosis
γ-stråler/røntgenstråler Stråling
Dannelse af dobbeltstrengede brud med nogle ukontrollerede cellulære effekter
1-4 Gy
kr. Ar ioner Stråling
Dannelse af dobbeltstrengede pauser
270 keV/μm
α-partikler Stråling
Dannelse af dobbeltstrengede pauser
116 keV/μm
Bleomycin Hæmmer af DNA-syntese 0,4-2 μg/ml
Camptothecin Hæmmer af topoisomerase I 10-200 nM
Cisplatin Alkylerende middel
(inducerende intrastrand krydslinks)
0,25-2 μM
Doxorubicin Intercaleringsmiddel
Hæmmer af topoisomerase II
10-200 nM
Etoposide Hæmmer af topoisomerase II 10 μM
Hydroxyurea Hæmmer af DNA-syntese
(ved ribonucleotid reduktase)
10-200 μM
Methylmethanulfonat Alkylerende middel 0,25-2 mM
Mitomycin C Alkylerende middel 0,25-2 μM
Ultraviolet (UV) lys Dannelse af thymidindæmpere
(genererer forvrængning af DNA-kæden)
50-100 mJ/cm2

Tabel 1: Genotoksiske midler. Eksempler på DNA-skadelige stoffer, deres virkningsmekanisme og de skader, der er forårsaget på grundlag af foreslået arbejdskoncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. HeLa celle kultur

  1. Forbehandl rund glasdæksler med 1 M HCl ved 50 °C i 16-18 timer. Skyl med ddH2O og opbevares i 100% EtOH.
  2. Forbered cellekulturmedium: Tilføj 10% (v/v) FBS til DMEM-mediet.
  3. Vokse 4,0 x 104 celler / godt i sterile 12-brønd plade med en 18 mm rund glas coverslip ved 37 °C og 5% CO2 i en befugtet inkubator. Dyrk celler til 80% sammenløb (ca. 24 timer).

2. Cellebehandling med stråling (IR)

  1. For at fremkalde dannelse af dobbelt-streng pauser, udsætte cellerne for 4 Gy γ-bestråling (kontrol: Ingen bestråling, t = 0). I Gamma Cell -40, dette svarer til 4,54 min, ved 0,815 Gy per min.
  2. Inkuber celler ved 37 °C og 5% CO2 i en befugtet inkubator i passende tidslængde (tidspunkter valgt her t=1, 2, 4, 16 h).

3. Nuklear ekstraktion og cellefiksering

  1. Forbered lagerløsninger: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M saccharose, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).
  2. Forbered nuklear ekstraktionsbuffer (NEB): Opløses 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM saccharose, 3 mM MgCl2,1 mM EGTA (pH 8.0) og 0,5% (v/v) Triton X-100 i ddH2O. Bland indtil opløst helt.
  3. Der tilberedes 4% (v/v) paraformaldehyd (PFA): 10 ml 16% PFA vandig opløsning i 30 ml PBS. Bland indtil opløst helt.
  4. På et passende tidspunkt (t=0, 1, 2, 4, 16 timer) vaskes celler to gange med 1 ml PBS. Fjern PBS helt.
  5. Der tilsættes 200 μL NEB til hver brønd til cellekerneekstraktion (cytoplasma nedbrydes, kun kernerester) (Figur 2). Inkuber i 2 minutter ved stuetemperatur og fjern helt.
    BEMÆRK: Må ikke overstige 2 minutter.

Figure 2
Figur 2: Nuklear udvinding.
Repræsentative billeder af celler før (venstre) og post (højre) nuklear ekstraktion. Cytoplasmaet skal fordøjes, men den nukleare struktur bør forblive intakt post udvinding (højre). (A) 20x forstørrelse; skalabar = 20 μm og (B) 40x forstørrelse skalabar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Vask celler med 1 ml PBS. Fjern PBS helt. Tilføj PBS omhyggeligt, celler er meget skrøbelige på dette trin.
  2. Der tilsættes 200 μL af 4 % (v/v) PFA til hver brønd til cellefiksering. Inkuberes i 10 minutter ved 4 °C. Fjern PFA helt.
  3. Der tilsættes 1 ml PBS.
    BEMÆRK: Celler kan opbevares i PBS ved 4 °C.

4. Immunfluorescensfarvning

  1. Forbered blokeringsopløsning: 5% BSA (w/v) opløses i PBS, og der tilsættes 0,3 % (v/v) Triton X-100. Bland indtil helt opløst.
  2. Forbered fortyndingsbuffer: 1% BSA (w/v) opløses i PBS, og der tilsættes 0,3 % (v/v) Triton X-100. Bland indtil helt opløst.
  3. Til blokering tilsættes 200 μL blokereopløsning til hver brønd. Inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur eller 16-18 timer ved 4 °C.
    BEMÆRK: Hvis der anvendes gedeantistof, tilsættes 5% gedeserum til blokerende opløsning.
  4. Fortyndet primært antistof i fortyndingsbuffer (1:500; se tabel 2 for antistofliste) og vortex indtil godt blandet.
    BEMÆRK: Hvis der anvendes gedeantistof, tilsættes 1% gedeserum til fortyndingsbufferen.
  5. I en fugtigheds-/inkubationsboks skal du tilslutte dig et stykke parafilm. Der tilsættes 10 μL primært antistof (i en enkelt dråbe). Juster den ene kant af dækslæbet med dråben og langsomt lavere på parafilmen, så væsken kan spredes over hele (undgå bobler, hvis det er muligt). Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
  6. Dæksler vaskes tre gange i PBS i 1 minut.
  7. Fortyndet sekundært antistof i fortyndingsbuffer (slutkoncentration: 2 μg/ml) og vortex indtil godt blandet.
  8. Der påføres 10 μL sekundært antistof som beskrevet for de primære antistoffer. Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Beskyt mod lys.
Antistof Virksomhed Reference Kilde
53BP1 Signalering af celler 4937 Kanin
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam kr. Æsel
Anti-fosfor-Histone H2A. X (Ser139), klon JBW301 Millipore 05-636 Musen
Anti-Kanin IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam kr. Ged

Tabel 2: Anvendte antistoffer. Liste over antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse.

  1. Dæksler vaskes tre gange i PBS i 1 minut.
  2. Vask dækslæber med H2O i 1 minut.
  3. Kontrastain-DNA med DAPI: Påfør 10 μL 300 nM DAPI (som beskrevet for antistoffer), inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur og monteres derefter på glasslide med et glycerolbaseret monteringsmedie. Alternativt tilsættes en dråbe (10 μL) af kommercielle antifademonteringsmedier, der indeholder DAPI, på et dias og påfør en dækslæd. Tryk forsigtigt på dækslæbet, og fjern overskydende væske omkring den med en køkkenrulle.
  4. Seal coverslips med gennemsigtig neglelak og lad dem tørre i 20 minutter.
  5. Objektglas ved 4 °C.

5. Erhvervelse af image

  1. Placer en dråbe nedsænkning olie på 60x objektivet. Brug DAPI til at finde kernerne gennem øjet stykke.
    1. For XYZ billederhvervelse, åben erhvervelse software og vælge parametre: Scanner type: Galvano; Scannertilstand: Rundtur; Billedstørrelse: 512×512; YDELSESTILSTAND: VBF; YDELSE gennemsnit: ramme (4 gange); YDELSE Sekventiel scanning: linje.
    2. Vælg farvestoffet og detektorerne:
      Kanal (CH1), Dye (DAPI), Detektor (SD1)
      Kanal (CH2), Dye (Alexa Fluor 488), Detektor (HSD3)
      Kanal (CH3), Dye (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)
    3. Vælg TIL i "Z".
  2. Juster livebilledet. Tryk på knappen Live i live-vinduet.
    1. Juster fokus og sæt laser intensitet (%), følsomhed (HV), gain og offset på "PMT" værktøj vindue.
      1. Juster laserintensiteten (%): for lysstyrke og blegning. Jo højere laserintensiteten er, jo stærkere er signalet, men prøven vil fotobleach.
      2. Juster følsomheden (HV): støjniveau. Jo højere HV, jo stærkere signal, men billedet vil være støjende, hvis for højt.
        BEMÆRK: Hold altid spændingen konstant.
      3. Juster forskydningen: baggrundsniveau.
    2. Vælg Start/slut (15 udsnit) for Z-stakke.
  3. Start købet.
    1. Vælg den mappe, der skal gemmes billeder. Tryk på LSM-startknappen for at begynde at hente billedet. Tryk på knappen Serie udført for at fuldføre anskaffelsen af billedet.

6. Dataanalyse

  1. Åbn analysesoftwaren til billedanalyse.
    1. Tryk på vinduet Batchværktøj, vælg de billeder, der skal analyseres, og vælg outputmappe.
    2. Tryk på vinduet Analyseværktøj, og vælg Projektion (viser den maksimale intensitetsprojektion fra 15 udsnit).
    3. Vælg den oprettede batch under input-/outputindstilling.
    4. Tryk proces for billeder, der skal behandles.
    5. Eksporter billeder som .tiff-filer.
  2. Åbn CellProfiler til nuklear foci-kvantificering.
    1. Åbn γH2AX- og 53BP1-foci-kvantificeringspipelinen (se Supplerende oplysninger).
    2. Grafdata ved hjælp af en tabelsoftware.
  3. Åbn CellProfiler til analyse af sam lokalisering.
    1. Åbn Colocalization pipeline (se Supplerende oplysninger). Der oprettes og gemmes en regnearksfil på den foretrukne placering. Grafer gemmes dog ikke automatisk. Det foreslås at tage et øjebliksbillede af vinduerne til at holde til registrering af resultaterne.
    2. Grafdata ved hjælp af en tabelsoftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På dag 2, eller 24 timer efter såning celler på coverslips, celler har gennemgået en division og er 80% sammenløb. Specifikke knock downs eller mutationer i DNA reparation proteiner kan øge fordobling tid, eller sensibilisere celler til genotoksisk behandling, og såning tæthed samt behandling doser bør justeres i overensstemmelse hermed. For at bestemme de bedste arbejdsforhold kan tidspunktet for DNA-skadesresponsen bestemmes ved vestlig blotting af γH2AX over tid, og følsomhed over for bestråling kan identificeres ved koloniformningsanalyse.

Celler, der ikke er behandlet med bestråling, udviser kun lidt, om nogen, γH2AX foci (Figur 3A). γH2AX foci formation kan dog udløses i dyrkede celler ved forskellige belastninger, der er forbundet med vækstbetingelserne: celler, der er tilbage i sammenløbet i syrnede medier, tilstedeværelse af genotoksisk endotoksin i FBS, iltkoncentration, der anvendes til kultur, for at nævne nogle få.

Figure 3
Figur 3: Nuklear foci uden stress.
I mangel af ekstern stressor observeres meget få, hvis der er observeret γH2AX foci (A). I mangel af væsentlige DNA reparation proteiner, γH2AX akkumulering kan observeres som pauser forekommer på grund af endogene kilder ikke repareres (B). Akkumulering af ikke-luftede brud kan føre til, at cellerne bliver præ-apoptotiske, som er præget af en "solid" γH2AX-kernefarvning (C). Skalabar = 5 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Desuden repareres DNA-pauser, der opstår som følge af endogene belastninger som følge af endogene belastninger, ikke som i celler af vild type, i celler, såsom BRCA1 eller BRCA2, og som ophobes. Som følge heraf kan forhøjet γH2AX observeres i HR-mangelfulde celler, selv under normale vækstbetingelser (Figur 3B). En underpopulation af celler kan udvise "fast" nuklear farvning med γH2AX (Figur 3C). Pan-nuklear plet kan indikere, at en celle er overvældet med skader ud reparation, og / eller er præ-apoptotic. Sådanne celler er typisk karakteriseret ved forstørrede kerner, og tilstedeværelsen af cytoplasmatiske vakuoler. Derudover kan γH2AX udløses af replikeret stress i S-fase og blokerede replikationsgafler eller ved G2/M-anholdelse. Hvis det er nødvendigt, kan cellecyklusfaser identificeres ved at farvning af DNA-indholdet eller co-farvning med specifikke markører. Ved udførelse af DNA-skade reparation analyse, pan-nukleare kan kvantificeres uafhængigt af individualiserede foci.

Efter bestråling udviser kerner et stort antal dobbelte strengskift, som γH2AX lokaliserer ekstremt hurtigt(figur 4). Under optimale forhold observeres få, hvis der er nogen γH2AX foci, i mangel af bestråling. Efter bestråling øges dannelsen af γH2AX foci kraftigt. Hvis pauserne behandles og repareres, reduceres focitallet pr. kerner samt antallet af celler, der er positive for foci. Intensiteten og antallet af foci varierer afhængigt af den anvendte cellelinje og den leverede bestrålingsdosis. I helaceller med lav passage, dyrket i endoksinfrit serum, observerede vi rutinemæssigt en kraftig stigning i foci ved 30 minutter og 1 h postbestråling, som topper mellem 1 og 2 timer, hvorefter den faldt gradvist indtil 16 timer. Af denne grund præsenteres repræsentative tidspunkter på 0, 1, 2, 4 og 16 timer efter bestråling her. Opførsel af pause signalering, reparation, og overlevelse til bestråling kan variere meget mellem cellelinjer samt ved udtynding eller mutation af gener. Derfor vil de mest hensigtsmæssige tidspunkter være eksperiment- og celleafhængige. I forsøget har restfoci ved 16 h γH2AX nået samme basale niveau end ikke-bestrålede celler. Overvågning af restfoci til at omfatte senere tidspunkter foreslås, hvis der arbejdes med langsomt skillecellelinjer.

Figure 4
Figur 4: Nuklear foci og kvantificering efter stress (tidsforløb).
γH2AX foci formation ved t=0 (ingen bestråling) og på de angivne tidspunkt efter bestråling (4 Gy, t=1, 2, 4, 16 h). (A) Repræsentative billeder vises. DAPI angiver kernerne. Skalabar = 5 μm. (B) Nuklear foci af γH2AX efter eksponering for γ-bestråling blev scoret ved automatisk kvantificering (CellProfiler) i ≥ 100 kerner for hvert tidspunkt. Afhængigt af det rejste biologiske spørgsmål og den type data, der er erhvervet, er der forskellige muligheder for at præsentere de rådata for at lette sammenligning og kritisk forståelse. i) Skyplot viser gennemsnitlig ± SD. Symbol (*) angiver statistisk signifikans i forhold til kontrol ved hjælp af Student's to tailed t-test: *** p ≤ 0,0001, (ii) induktionskurve viser gennemsnitlig ± SEM, (iii) mere end 10 foci pr. kerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Omvendt ophobes γH2AX foci i celler, der er mangelfulde med hensyn til reparationsfunktioner i DNA-skader, i mangel af bestråling (t=0 h), og reparationen kan forsinkes eller være fraværende selv ved lange tidspunkter (t=16 h, t=24 h) efter bestråling. Direkte sammenligning mellem vilde type og mutant celler kan give værdifulde oplysninger om DNA reparation funktion af genet muteret, og antyder den type reparation. Mens en mangel på NHEJ kan tvinge pausen til at blive repareret af HR i S-fase, vil DSBs, der er blevet resected og skal repareres af HR, ikke blive repareret af NHEJ. Af denne grund kan akkumulering af skader efter S-fase indikere en HR-mangel, og høje γH2AX niveauer efter divisionen antyder NHEJ-defekter.

Når flere proteiner undersøges i de samme celler, kan samlokalisering undersøges ved hjælp af multiplexing primære antistoffer, der er rejst i forskellige dyrearter, og som afslører disse med sekundære antistoffer mærket med forskellige fluorophores (figur 5). Sam lokalisering angiver, om proteiner (i) rekrutteres til pausen (ii) rekrutteres rettidigt, (iii) samles i DNA-reparationskomplekser. Når man ser for co-lokalisering, en almindeligt accepteret kvalitativ metode er at præsentere resultater som en simpel overlejring af de forskellige kanaler (dvs. grøn og rød). Superposition af grøn og rød vil give anledning til gule hotspots, hvor de to proteiner af interesse er til stede i de samme pixels (Figur 5A). Men denne metode har begrænsninger, da den afhænger af den relative signalintensitet, der indsamles i begge kanaler, og de to fluorokromer kan have forskelle i signalstyrke. Overlejringsmetoder hjælper derfor med at generere et visuelt estimat over co-lokaliseringshændelser, men er ikke egnede til kvantitative formål. Kvantitativ analyse af sam lokalisering kan opnås ved en objektbaseret tilgang(figur 5B (i-iii) eller ved en statistisk tilgang, der udfører en intensitetskorrelationskoefficientbaserede (ICCB) analyser(Figur 5B (iv)). Flere værktøjer til co-lokalisering analyse er tilgængelige, herunder JACoP (Just Another Co-lokalisering Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) og "Colocalization" pipeline (CellProfiler) anvendes her, der kan bruges som en ICCB værktøj, for at vurdere forholdet mellem fluorescens intensiteter. Dette gøres for det meste ved at beregne korrelationskoefficienten (Pearsons koefficient), der måler styrken af den lineære relation mellem to variabler. Fluorescens co-lokalisering kan repræsenteres grafisk i scatter plots, hvor intensiteten af en fluorrom (grøn) er afbildet mod intensiteten af den anden fluorromrom (rød) for hver pixel. Komplet co-lokalisering resulterer i punkter grupperet omkring en lige linje, hvis hældning afspejler forholdet mellem fluorescens af de to farver. Tværtimod resulterer mangel på sam lokalisering i fordelingen af punkter i to separate grupper (fordelt langs akserne), der hver viser varierende signalniveauer af en farve med ringe eller intet signal fra den anden farve. Pearsons koefficientværdi varierer fra 1 til -1, med 1 stående for fuldstændig positiv korrelation, -1 for en negativ korrelation og nul, der angiver ingen korrelation. Du kan også bruge Pclc-metoden. Denne metode er blevet anvendt i en række forskellige strålinger (se36 for detaljer og frit tilgængelige metode).

Figure 5
Figur 5: Analyse af sam lokalisering.
Ved at bruge flere antistoffer rejst mod forskellige arter (her, anti-mus γH2AX (rød) og anti-kanin 53BP1 (grøn)), kan flere proteiner undersøges. (A) Repræsentative billeder vises. DAPI angiver kernerne. Sam lokalisering visualiseres efter farve- og områdeoverlapning (her rød + grøn = gul). Skalabar = 5 μm. (B) Individuel og co-lokalisere foci kan kvantificeres individuelt ved hjælp af en af flere software (her, CellProfiler, se andre muligheder i hovedtekst) og plottet. (i-iii) Objektbaseret tilgang, der bruges til at bestemme de samde lokaliseringsresultater (iv), der er opnået ved co-localisering, ved hjælp af en PIXEL-baseret tilgang (ICCB-analyse). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende oplysninger. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Analyse af timingen og effektiviteten af DNA-skader reparation ved mikroskopi har vist sig afgørende for at forstå, hvordan DNA reparation maskiner funktioner, i normale celler og i menneskelige patologier såsom kræft.

Udviklingen af specifikke antistoffer, der gør det muligt at detektionere aktiverede proteiner i deres fosforylerede version (såsom γH2AX, pRPA, pRAD50 og andre10,,23,39,43) har spillet en central rolle i at få en bedre forståelse af DNA reparation timing af begivenheder og dens synkronisering med cellecyklus. Denne succes er eksemplificeret ved en analyse af 53BP1 fosforholdige rester, ved massespektrometri og immunolocalization (se32 til gennemgang), som har bidraget til at forstå funktionen af denne stærkt modificerede protein. Med opstigningen af høj opløsning mikroskopisk teknik såsom STORM og øget brug af små antistoffer (nanostoffer) direkte protein interaktion i celler bliver mere tilgængelige og præcise. Men indirekte immunfluorescens som beskrevet her er fortsat et vigtigt eksperiment at udføre, når man undersøger en ny potentiel DNA reparation protein og leder efter timing af handling og protein partnere.

Succesen med indirekte immunfluorescens afhænger udelukkende af to kriterier: i) kvaliteten af reagenser – især antistoffer, der anvendes til påvisning af fosforrester på aktiverede DNA-reparationsproteiner, og (ii) tidspunktet for forsøget. Anvendelse af offentliggjorte protokoller og antistoffer bør fremmes, når de er tilgængelige. Når et nyt antistof anvendes eller undersøges, skal antistoffet valideres, og specificiteten bør fastlægges ved enten at vælte målproteinet i celler (signalet skal gå tabt) eller proteinudtynding (anvendelse af renset protein til at nedbryde specifikke antistoffer før inkubation, som udført i44 for RAD51AP1).

Der bør fastsættes optimale blokeringsforhold og antistoffortynding for at minimere artefakter og ikke-specifik farvning. Buffere vil blive tilberedt frisk, og hvis nuklear udvinding udføres, skal det være tidsfri for at undgå skadelige kerner. Ved undersøgelsen af reparationseffektiviteten i humane celler bør der foretages kvantificering af nuklear foci, og den nukleare ekstraktion kan hjælpe med at udelukke cytoplasmatiske proteiner. Det kan dog være gavnligt ikke at udføre det nukleare ekstraktionstrin, for eksempel at undersøge, om et mutant protein, der mistænkes for ikke at interagere med dets cellulære partner, ikke kan omfordele til kernen efter DNA-skader.

Desuden er kvaliteten af billeddannelsen af afgørende betydning for at sikre, at data kan erhverves, analyseres og nøjagtige data afbildes korrekt. Parametre, der skal kontrolleres for, er mange og omfatter: specificitet af de primære antistoffer, excitationsspektrum for de valgte fluorstoffer (sekundære antistoffer), beskyttelse af prøver mod fotobleaching, valg af støtte til såningsceller, god prøveudtagning (mindst 30 til 300 kerner, afhængigt af spørgsmålet), og i nogle tilfælde efterbehandling, såsom decentralisering eller spektrale un-blanding. Når det er muligt, automatiseret billedbehandling af en fuld coverslip, som gør det muligt tusindvis af celler, der skal afbildes, foreslås. Inddragelse af billeddiagnostiske specialister såsom et kerneanlæg forud for etableringen af forsøget bør overvejes, da det i høj grad vil forbedre kvaliteten af resultaterne.

Sidst, baseret på de anvendte cellelinjer, den udførte behandling, og de undersøgte proteiner, kan basale niveauer af foci variere meget og gøre resultaterne vanskelige at fortolke. Af denne grund er det vigtigt, at rådata opsummeres, behandles, analyseres og præsenteres i et effektivt format i et lys, som læserne kan forstå; sammenligning og afslørende tendenser og relationer inden for dataene. I figur 4Bafbildes samme kvantificering af foci i tre separate versioner: i) det samlede antal foci (skyplot) efter DSB'er fremkaldt ved bestråling (ii) induktion af foci over tid -kinetik- iii) % af positive celler (>10 foci/kerne).

Cloud-plots foretrækkes, når det er muligt(figur 4B (i)), da de viser alle datapunkter uden forskelsbehandling og dermed giver det mest omfattende overblik over eksperimentet. Men plotte mere selektive og relevante oplysninger, såsom antallet af positive celler over en vilkårlig baggrund afskåret (5 foci i de fleste cellelinjer), antallet af foci co-lokalisere, foci induktion over tid, eller kvalitetsmåling af foci, såsom pixel størrelse eller intensitet, kan være mere hensigtsmæssigt i nogle tilfælde, og er ansvarlig for forfatterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra San Antonio Area Foundation. Mays Cancer Center er støttet af NCI kræft center støtte kerne tilskud P30 CA054174. Vi vil gerne takke Stephen Holloway for hans hjælp sourcing reagenser, og Sung laboratorium for at give plads og mikroskopi kapacitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (4), 016600 (2015).
  2. Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11, (7), (2019).
  3. Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9, (12), (2018).
  4. Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22, (20), 5612-5621 (2003).
  5. Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308, (5721), 551-554 (2005).
  6. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36, (17), 5678-5694 (2008).
  8. Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2, (3), 233-235 (2003).
  9. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146, (5), 905-916 (1999).
  10. Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123, (7), 1213-1226 (2005).
  11. Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21, (2), 187-200 (2006).
  12. Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9, (8), 795-801 (2008).
  13. Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181, (2), 213-226 (2008).
  14. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9, (4), 297-308 (2008).
  15. Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, (5), 012757 (2013).
  16. Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6, (9), 016428 (2014).
  17. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  18. Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17, (1), 11-16 (2010).
  19. Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25, (4), 350-362 (2011).
  20. Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479, (7372), 241-244 (2011).
  21. Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289, (39), 27314-27326 (2014).
  22. Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
  23. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450, (7169), 509-514 (2007).
  24. Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
  25. Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459, (7245), 460-463 (2009).
  26. Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
  27. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
  28. Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5, (11), 012740 (2013).
  29. Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26, (7), 1551-1559 (1998).
  30. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  31. Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290, (38), 22931-22938 (2015).
  32. Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
  33. Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35, (4), 534-541 (2009).
  34. Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24, (2), 108-117 (2014).
  35. Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11, (11), (2019).
  36. Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).
  37. Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12, (2), 162-169 (2002).
  38. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3, (8-9), 959-967 (2004).
  39. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10, (15), 886-895 (2000).
  40. Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (17), 7155-7160 (2009).
  41. Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40, (20), 10312-10323 (2012).
  42. Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11, (1), 819 (2020).
  43. Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101, (2), 255-266 (2017).
  44. Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, (9), 3560-3565 (2011).
Visualisering af DNA Reparation Proteiner Interaktion ved Immunofluorescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).More

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter