Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering av DNA Reparation Proteiner Interaktion genom Immunofluorescens

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61447
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

Summary

Efter DNA-skador aktiverar mänskliga celler viktiga reparationsvägar för att återställa deras arvsmassa. Här beskriver vi metoden för indirekt immunofluorescens som ett sätt att upptäcka DNA-reparationsproteiner, analysera deras rumsliga och tidsmässiga rekrytering och hjälpa till att förhöra protein-protein interaktion på platserna för DNA-skador.

Abstract

Däggdjursceller utsätts ständigt för kemikalier, strålning och naturligt förekommande metaboliska produkter, som skapar specifika typer av DNA-förolämpningar. Genotoxiska medel kan skada DNA-ryggraden, bryta den, eller modifiera den kemiska karaktären av enskilda baser. Efter DNA-förolämpning aktiveras DNA-skaderespons (DDR) och proteiner som deltar i reparationen rekryteras. En uppsjö av faktorer är inblandade i avkänning av typ av skador och aktivera lämplig reparation svar. Underlåtenhet att korrekt aktivera och rekrytera DDR-faktorer kan leda till genomisk instabilitet, vilket ligger till grund för många mänskliga patologier inklusive cancer. Studier av DDR-proteiner kan ge insikter om genotoxiska läkemedelsrespons och cellulära mekanismer för läkemedelsresistens.

Det finns två viktiga sätt att visualisera proteiner in vivo: direkt observation, genom att märka proteinet av intresse med ett fluorescerande protein och följa det genom levande bildframställning, eller indirekt immunofluorescens på fasta prover. Medan visualisering av fluorescerande taggade proteiner tillåter exakt övervakning över tiden, direkt märkning i N- eller C-terminus kan störa proteinet lokalisering eller funktion. Observation av proteiner i deras omodifierade, endogena version är att föredra. När DNA reparera proteiner rekryteras till DNA-förolämpningen, ökar deras koncentration lokalt och de bildar grupper, eller "foci", som kan visualiseras genom indirekt immunofluorescens med hjälp av specifika antikroppar.

Även om detektion av protein-högborgar inte ger ett definitivt bevis på direkt interaktion, visar samlokalisering av proteiner i celler att de omgrupperar till platsen för skador och kan informera om händelseförloppet som krävs för komplex bildning. Noggrann analys av högborgar rumsliga överlappning i celler uttrycker vilda typ eller mutanta versioner av ett protein kan ge dyrbara ledtrådar på funktionella domäner viktigt för DNA reparation funktion. Sist, co-lokalisering av proteiner indikerar möjliga direkta interaktioner som kan verifieras genom co-immunoprecipitation i celler, eller direkt pulldown med hjälp av renade proteiner.

Introduction

Mänskliga celler utsätts ständigt för en mängd DNA skadliga medel av olika ursprung. Exogena källor består mestadels av exponering för strålning, kemikalier (inklusive kemoterapeutiska medel och vissa antibiotika), och virus, medan de viktigaste endogena källorna inkluderar fel i DNA-replikation och oxidativ stress. De direkta effekterna av genotoxisk exponering kan variera från en modifierad bas till ett potentiellt dödligt DNA-dubbelsträngsbrott (DSB), beroende på stress och exponeringsdos. I slutändan kan oreparerade eller felreparerade DNA-skador leda till ansamling av mutationer, genomiska rearrangements, genominstabilitet och så småningom leda till carcinogenes1. Däggdjursceller har utvecklats komplexa vägar att känna igen specifika typer av DNA-skador2,3 och reparera dem i tid, synkroniseras med cellcykeln progression.

Joniserande strålning (IR) skadar DNA dubbel spiral och skapar dubbel-strand raster (DSB), en av de mest skadliga former av DNA-skador. MRN (MRE11, RAD50, NBS1) komplexa funktioner som en sensor av DNA-ändar och aktiverar proteinet Kinas ataxi telangiectasia muterade (ATM)4,5. Efter den inledande aktiveringen av ATM genom DNA-ändar, ATM utlöser en kaskad av DDR händelser på platsen för paus, initiera med en nyckelhändelse, fosforylering av histonvarianten H2AX6. H2AX fosforylering på restsubstans S139 aktiverar den till γH2AX, som spänner över regioner upp till megabaser runt DNA-lesionen6,7,8,9. Denna händelse ökar DNA-tillgänglighet, vilket leder till rekrytering och ackumulering av andra DNA-reparationsproteiner7. Eftersom γH2AX är rikligt och specifikt inducerad omgivande DSBs, det kan lätt visualiseras med hjälp av specifika antikroppar, och används ofta som en surrogat markör för DSBs i DNA reparation fältet. När pausen signaleras aktiverar cellerna sina DNA-reparationsvägar och bearbetar DNA-skadan. Proteinet MDC1 (mediator av DNA-skada kontrollpunkt protein 1) direkt binder γH2AX10, interagerar med ATM11 och även med NBS112,13. Det bidrar till att öka koncentrationen av MRN-komplex vid DSB och initiera en positiv ATM-återkoppling. γH2AX avlägsnas snabbt när pausen har reparerats, följaktligen, vilket möjliggör övervakning av DSB-klarering. Följt av mikroskopi ger minskningen av γH2AX över tid en indirekt mätning av restbrott och DNA-reparationseffektivitet.

Eukaryota celler kan reparera DSB efter flera olika vägar, de två huvudsakliga är icke homologa slut-sammanfogning (NHEJ) och homolog rekombination (HR) (Figur 1). NHEJ i huvudsak ligates DNA dubbel-strand slutar utan användning av utökad homologi och fungerar under hela cellen cykel14,15. HR blir dominerande under S och G2 faser, och är annars förträngda, eftersom det kräver en syster kromatid som en homolog mall för reparation14,16. Pathway val mellan NHEJ och HR inte bara beror på den fysiska närheten av systern kromatid, men också på förlängningen av DNA-slut samband17, som hämmar NHEJ.

Homology-beroende DSB reparation initierar genom nukleolytisk nedbrytning av 5' strand från pausändarna att generera 3' single-strand DNA (ssDNA) svansar, en process som kallas 5'-3' samband. MRN-komplexet initierar DNA-slutresektion och ytterligare resektion bearbetas i kombination med BLM/EXO1 (Bloom syndrome protein/exonuclease 1) eller BLM/DNA2 (DNA-replikation ATP-beroende helicase/nukleas)18,19,20,21,22. DNA-slutresektion förstärks av CtIP (CtBP-interagerande protein) genom sin direkta interaktion med MRN-komplex23 och rekrytering av BRCA1 (bröstcancer typ 1 mottaglighet protein)24,25. Replikeringsprotein A (RPA) binder omgående till ssDNA exponerade och sedan förskjuts av rekombinasproteinet RAD51 för att bilda en nukleoproteinfilament som katalyserar homolog sökning och strand invasion26,27,28.

Initiering av samband är ett kritiskt steg för reparation väg val. När resektion har inletts, DNA-ändarna blir fattiga substrat för bindning av Ku70/Ku80 heterodimer (komponent i NHEJ-vägen) och celler är engagerade i HR17,29,30. Den Ku70/Ku80 heterodimer binder till DSB slutar, rekrytera DNA-PKcs och p53 Bindande Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 fungerar som ett hinder för samband i G1, vilket blockerar HR samtidigt som man främjar NHEJ31,32, men det tas bort på ett BRCA1-beroende sätt i S-fas, följaktligen tillåter samband ske33,34. Därför spelar 53BP1 och BRCA1 motsatta roller i DSB reparation, med 53BP1 är en NHEJ facilitator medan BRCA1 agerar möjliggör raster att reparera genom HR.

I laboratoriet kan DSB-bildning framkallas genom joniserande strålning (IR). Medan detta exempel utnyttjar en hög dos av 4 Gy, 1 Gy och 2 Gy skapar också en betydande mängd DSBs, lämplig för analys av foci bildning av rikliga proteiner. Det är viktigt att notera att den typ och dos av strålning som används kan leda till olika skador i DNA:t och i cellen: medan IR inducerar DSB kan det också orsaka enstaka strängbrott eller basmodifiering (se35,36 för referens på bestrålning linjär energiöverföring (LET) och typ av DNA-skada). För att bestämma kinetiken för joniserande strålningsinducerad foci (IRIF) bildning och deras fria avstånd, som indikerar reparation av skadan och återföring av den aktiverade DDR8,9,37,38, kan focibildning övervakas vid olika tidpunkter efter joniserande strålning. Tidpunkten för aktivering och clearance av alla större DNA-skador proteiner ärkänd 39, och många undersöks som surrogat markörer för viktiga händelser. Till exempel används pRPA, som besitter hög affinitet för ssDNA som ett surrogat av avbrottet samband, MRN proteiner (MRE11, RAD50, NBS1) och exonucéer kan användas för att bedöma samband effektivitet för. Medan RAD51, BRCA1, BRCA2 (bröstcancer typ 2 mottaglighet protein), och PALB2 (partner och localizer av BRCA2) kan övervakas för att utvärdera HR effektivitet, förekomsten av Ku-proteinerna eller 53BP1, används som markörer för NHEJ (Bild 1).

Som proteiner av DNA-reparera maskineri rekrytera varandra till avbrottet och montera i super-komplex, DNA-protein och protein-protein växelverkan kan härledas genom att följa deras individlokalisering över tid och analyserar co-localization av proteiner, som visualiseras av överlappande signalerar i cell40,41,42. I cellinjer, införandet av punktmutationer eller borttagning i specifika DNA reparation gener antingen genom genomet redigering, eller genom överuttryck av plasmid-baserade mutanter, tillåter undersökning av specifika rester och deras eventuella roll i erkännandet av DNA-skador (t.ex., samlokalisering med γH2AX) eller komplex montering (samlokalisering med en annan, eller flera, proteiner), samt deras inverkan på DNA-reparation. Här använder vi indirekt immunofluorescens som ett medelvärde för att undersöka bildandet och upplösningen av DSBs genom att följa γH2AX foci över tiden. Vi presenterar också ett exempel på foci bildning och samlokalisering analys av en större aktör i DSB reparation: p53 Bindande Protein 1 (53BP1)32. Som tidigare nämnts, 53BP1 anses centrala för DNA reparation väg val. Efter 53BP1 ackumulering och dess samlokalisering med γH2AX ger dyrbar information om cellcykelfas, DNA-skador ackumulering och väg som används för att reparera DSB. Syftet med indirekt immunolocalization är att bedöma effektiviteten av DNA-skador reparation i cellinjer, efter IR som i denna studie, eller efter exponering för olika påkänningar i cell, från DNA-tvärlänk till blockering av replikeringsgaffeln (en lista över DNA-skadliga medel tillhandahålls i tabell 1).

Figure 1
Figur 1: DNA dubbelsträngsbrytningar (DSB) reparationsvägar.
DSB reparation innebär två stora vägar: Homolog rekombination (HR, vänster) och icke-homolog end-joining (NHEJ, höger). Efter pausen aktiveras proteiner för att markera pausen (γH2AX), delta i slutresektion (MRN), belägga det redragna ssDNA (pRPA), främja rekombination (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) eller begränsa samband och främja NHEJ (53BP1). Andra proteiner deltar i skadereparation, men proteiner som listas följs rutinmässigt av indirekt immunofluorescens. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

DNA-skadligt medel Verkningsmekanism Rekommenderad dos
γ-strålar/röntgen Strålning
Bildande av dubbelsträngade pauser med några okontrollerade cellulära effekter		 1-4 Gy
36 Ar joner Strålning
Bildande av dubbelsträngade raster		 270 keV/μm
α-partiklar Strålning
Bildande av dubbelsträngade raster		 116 keV/μm
Bleomycin Hämmare av DNA-syntes 0,4-2 μg/mL
Camptothecin Hämmare av topoisomeras I 10-200 nM
Cisplatin Alkylerande medel
(förmå intrastrand tvärlänkar)		 0,25-2 μM
Doxorubicin Intercalating agent
Hämmare av topoisomeras II		 10-200 nM
Etoposide Hämmare av topoisomeras II 10 μM
Hydroxyurea Hämmare av DNA-syntes
(genom reduktas av ribonukleotid)		 10-200 μM
Metyletsulfonat Alkylerande medel 0,25-2 mM
Mitomycin C Alkylerande medel 0,25-2 μM
Ultraviolett (UV) ljus Bildande av tymidin dimers
(generera förvrängning av DNA-kedjan)		 50-100 mJ/cm2

Tabell 1: Genotoxiska medel. Exempel på DNA-skadliga medel, deras verkningsmekanism och den skada som framkallas baserat på företyd arbetskoncentration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HeLa cell kultur

  1. Förbehandla runda glasöverdrag med 1 M HCl vid 50 °C i 16-18 timmar. Skölj med ddH2O och förvara i 100% EtOH.
  2. Förbered cellodlingsmedium: lägg till 10% (v/v) FBS till DMEM medium.
  3. Odla 4,0 x 104 celler/brunn i steril 12-brunnsplatta med en 18 mm rund glasskyddsslip vid 37 °C och 5 % CO2 i en befuktad inkubator. Odla celler till 80% konfluency (cirka 24 timmar).

2. Cellbehandling med strålning (IR)

  1. För att inducera bildandet av dubbelsträngsbrott, exponera celler för 4 Gy γ-bestrålning (kontroll: Ingen bestrålning, t=0). I Gamma Cell -40 motsvarar detta 4,54 min, vid 0,815 Gy per min.
  2. Inkubera celler vid 37 °C och 5 % CO2 i en befuktad inkubator för lämplig tidslängd (tidspunkter som valts här t=1, 2, 4, 16 h).

3. Kärnextraktion och cellfixering

  1. Förbered stamlösningar: 0,2 M RÖR (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sackaros, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).
  2. Förbered kärnutsugningsbuffert (NEB): lös 10 mM RÖR (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM sackaros, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) och 0.5% (v/v) Triton X-100 i ddH2O. Blanda tills lösts fullständigt.
  3. Förbered 4% (v/v) paraformaldehyd (PFA): lös 10 mL av 16% PFA vattenlösning i 30 mL PBS. Blanda tills löst helt.
  4. Vid lämplig tidpunkt (t=0, 1, 2, 4, 16 h), tvätta celler två gånger med 1 mL PBS. Ta bort PBS helt.
  5. Tillsätt 200 μL NEB till varje brunn för utvinning av cellkärnor (cytoplasman bryts ned, endast kärnan kvarstår) (Figur 2). Inkubera i 2 minuter i rumstemperatur och ta bort helt.
    OBS: Överskrid inte 2 minuter.

Figure 2
Bild 2: Kärnutvinning.
Representativa bilder av celler före (vänster) och post (höger) kärnutvinning. Cytoplasman bör smältas men kärnstrukturen bör förbli intakt post extraktion (höger). (A) 20x förstoring; skala bar = 20 μm och (B) 40x förstoring; skalstång = 10 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

  1. Tvätta celler med 1 mL PBS. Ta bort PBS helt. Lägg TILL PBS noggrant, celler är mycket bräckliga i detta steg.
  2. Tillsätt 200 μL på 4% (v/v) PFA till varje brunn för cellfixering. Inkubera i 10 minuter vid 4 °C. Ta bort PFA helt.
  3. Tillsätt 1 mL PBS.
    OBS: Celler kan förvaras i PBS vid 4 °C.

4. Immunfluorescens färgning

  1. Förbered blockeringslösning: lös 5% BSA (w/v) i PBS och tillsätt 0,3% (v/v) Triton X-100. Blanda tills den är helt upplöst.
  2. Förbered spädningsbuffert: lös 1% BSA (w/v) i PBS och tillsätt 0,3% (v/v) Triton X-100. Blanda tills den är helt upplöst.
  3. För blockering, tillsätt 200 μL blockerande lösning till varje brunn. Inkubera i 2 timmar i rumstemperatur eller 16-18 timmar vid 4 °C.
    OBS: Om getantikropp kommer att användas, tillsätt 5% get serum till blockerande lösning.
  4. Späd primärantikropp i spädningsbuffert (1:500; se tabell 2 för antikroppslista) och virvel tills den är väl blandad.
    OBS: Om getantikropp används, tillsätt 1% get serum till spädningsbuffert.
  5. I en fuktighets-/inkubationsbox, följ fast en bit parafilm. Tillsätt 10 μL primär antikropp (i en enda droppe). Rikta in täckplattans ena kant med droppen och sänk långsamt ned på parafilmen, för att vätskan ska spridas över hela (undvik bubblor om möjligt). Inkubera i 2 timmar i rumstemperatur.
  6. Tvätta coverslips tre gånger i PBS i 1 minut.
  7. Späd sekundär antikropp i spädningsbuffert (slutlig koncentration: 2 μg/mL) och virvel tills den är väl blandad.
  8. Applicera 10 μL sekundär antikropp enligt beskrivningen för de primära antikropparna. Inkubera i 2 timmar i rumstemperatur.
    OBS: Skydda mot ljus.
Antikropp Företag Referens Källkod
53 Miljarder Cellsignalering 4937 Kanin
Anti-Mus IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150103 Åsna
Anti-fosfo-histon H2A. X (Ser139), klon JBW301 Millipor 05-636 Musen
Anti-Kanin IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150081 Get

Tabell 2: Använda antikroppar. Lista över antikroppar som används i denna studie.

  1. Tvätta coverslips tre gånger i PBS i 1 minut.
  2. Tvätta täckslips med H2O i 1 minut.
  3. Counterstain DNA med DAPI: applicera 10 μL av 300 nM DAPI (enligt beskrivningen för antikroppar), inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur och montera sedan på glasrutschkana med ett glycerolbaserat monteringsmedier. Alternativt, tillsätt en droppe (10 μL) av kommersiella antifade monteringsmedia som innehåller DAPI på en bild och applicera en täckbild. Tryck försiktigt på täcket och ta bort överflödig vätska runt den med en pappershandduk.
  4. Täta täckslips med genomskinligt nagellack och låt dem torka i 20 minuter.
  5. Förvara glidbanor vid 4 °C.

5. Bild förvärv

  1. Placera en droppe nedsänkning olja på 60x objektivet. Använd DAPI för att lokalisera atomkärnorna genom ögonbiten.
    1. För XYZ bild förvärv, öppna förvärv programvara och välj parametrar: Skanner typ: Galvano; Skannerläge: Roundtrip; Bildstorlek: 512×512; LÄGET PMT: VBF; PMT genomsnitt: ram (4 gånger); PMT sekventiell skanning: linje.
    2. Välj färgämne och detektorer:
      Kanal (CH1), Färgämne (DAPI), Detektor (SD1)
      Kanal (CH2), Färgämne (Alexa Fluor 488), Detektor (HSD3)
      Kanal (CH3), Färgämne (Alexa Fluor 647), Detektor (HSD4)
    3. Välj PÅ i "Z".
  2. Justera den levande bilden. Tryck på knappen Live på Live-fönstret.
    1. Justera fokus och ställ in laserintensitet (%), känslighet (HV), förstärkning och förskjutning på "PMT" verktygsfönster.
      1. Justera laserintensiteten (%): för ljusstyrka och blekning. Ju högre laserintensitet, desto starkare signal, men exemplaret kommer photobleach.
      2. Justera känsligheten (HV): bullernivå. Ju högre HV desto starkare signal, men bilden kommer att vara bullriga om för hög.
        OBS: Håll alltid spänning konstant.
      3. Justera förskjutningen: bakgrundsnivå.
    2. Välj Start/Slut (15 segment), för Z-stackar.
  3. Starta förvärvet.
    1. Välj mappen för att spara bilder. Tryck på LSM Start-knappen för att börja förvärva bilden. Tryck på knappen Serie klar för att slutföra bildförvärvet.

6. Dataanalys

  1. För bildanalys, öppna analysprogramvaran.
    1. Tryck Batch på batch-verktygsfönstret, välj bilderna för att analysera och välj utdatamapp.
    2. Tryck Analysis på analysverktygsfönstret och välj Projektion (kommer att visa den maximala intensitetsprojektionen från 15 segment).
    3. Välj den batch som skapas under Indata-/utdatainställning.
    4. Tryck Process för bilder som ska bearbetas.
    5. Exportera bilder som .tiff-filer.
  2. För kärnfocikvantifiering, öppna CellProfiler.
    1. Öppna γH2AX och 53BP1 foci-kvantifieringspipeline (se Kompletterande information).
    2. Grafdata med hjälp av en tabellprogramvara.
  3. För samlokaliseringsanalys öppnar du CellProfiler.
    1. Öppna Colocalization-pipelinen (se Kompletterande information). En kalkylbladsfil kommer att skapas och sparas på den önskade platsen. Grafer själva kommer dock inte att sparas automatiskt. Det föreslås att ta en ögonblicksbild av fönstren för att hålla för register över resultaten.
    2. Grafdata med hjälp av en tabellprogramvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dag 2, eller 24 h post seeding celler på täckslips, celler har genomgått en division och är 80% konfluent. Specifika knock downs eller mutationer i DNA-reparationsproteiner kan öka fördubblingstiden, eller sensibilisera celler till genotoxisk behandling, och sådddensitet samt behandlingsdoser bör justeras därefter. För att bestämma bästa arbetsförhållanden kan timing av DNA-skadan svaret fastställas genom västra blotting av γH2AX över tiden, och känslighet för bestrålning kan identifieras genom koloniformning assay.

Celler som inte behandlas med bestrålning uppvisar lite, om någon, γH2AX foci (Figur 3A). γH2AX foci bildning kan dock utlösas i odlade celler av olika påfrestningar inneboende till odlingsförhållandena: celler kvar confluent i försurade medier, förekomst av genotoxiska endotoxin i FBS, syre koncentration används för kultur, att citera några.

Figure 3
Figur 3: Kärnfoci utan stress.
I avsaknad av yttre stressfaktor observeras mycket få om någon γH2AX foci (A). I avsaknad av essentiella DNA-reparationsproteiner kan γH2AX-ackumulering observeras eftersom raster som uppstår på grund av endogena källor inte repareras (B). Ackumulering av oreparerade raster kan leda till att cellerna blir pre-apoptotiska, vilket markeras av en "solid" γH2AX-nukleifärgning (C). Skala bar = 5 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Dessutom, i celler utarmat för viktiga DNA-skador proteiner, såsom BRCA1 eller BRCA2 mutanta celler, DNA-brott som uppstår som ett resultat av endogena påfrestningar repareras inte som i vilda celler, och ackumuleras. Som ett resultat kan förhöjda γH2AX observeras i HR-bristfälliga celler, även vid normala odlingsförhållanden (Figur 3B). En delpopulation av celler kan uppvisa "fast" nukleär färgning med γH2AX (Figur 3C). Pan-nukleära fläcken kan tyda på att en cell är överväldigad med skador bortom reparation, och / eller är pre-apoptotiska. Sådana celler kännetecknas vanligtvis av förstorade kärnor, och förekomsten av cytoplasmatiska vacuoles. Dessutom kan γH2AX utlösas av replikiv stress i S-fas och avstannade replikering gafflar, eller genom G2/M gripande. Om det behövs kan cellcykelfaser identifieras genom färgning av DNA-innehållet eller samfärgning med specifika markörer. När du utför DNA-skador reparation analys, pan-nuclear kan kvantifieras oberoende av individualiserade foci.

Efter bestrålning uppvisar atomkärnor ett stort antal dubbelsträngsbrytningar som γH2AX lokaliserar extremt snabbt till (Figur 4). Vid optimala förhållanden observeras få om någon γH2AX-foci i frånvaro av bestrålning. Efter bestrålning ökar bildningen av γH2AX-foci kraftigt. Om pauserna bearbetas och repareras, är foci räkna per kärnor minskade, liksom antalet celler positivt för foci. Intensiteten och antalet foci varierar beroende på vilken cellinje som används och vilken dos bestrålning som levereras. I låg passage HeLa celler, odlas i endotoxin-fritt serum, vi observerade rutinmässigt en kraftig ökning av högborgar vid 30 minuter och 1 h post bestrålning, som toppar mellan 1 och 2 h, minskar sedan successivt tills 16 h. Av denna anledning presenteras här representativa tidspunkter vid 0, 1, 2, 4 och 16 h post bestrålning. Beteende av bryta signalering, reparation, och överlevnad till bestrålning kan variera kraftigt mellan cellinjer samt vid utarmning eller mutation av gener. Av denna anledning kommer de lämpligaste tidpunkterna att vara experiment- och cellberoende. I experimentet, vid 16 h γH2AX restfoci har nått samma basal nivå än icke-bestrålade celler. Övervakning av resterande högborgar för att inkludera senare tidspunkter föreslås om man arbetar med långsamt skiljelinjelinjer.

Figure 4
Figur 4: Kärn- foci och kvantifiering efter stress (time-course).
γH2AX foci-bildning vid t=0 (ingen bestrålning) och vid de angivna tidpunkterna efter bestrålning (4 Gy, t=1, 2, 4, 16 h). (A) Representativa bilder visas. DAPI indikerar kärnorna. Skala bar = 5 μm. (B) Kärnfoci av γH2AX efter exponering för γ-bestrålning poängsteddes av automatiserad kvantifiering (CellProfiler) i ≥ 100 kärnor för varje tidpunkt. Beroende på den biologiska fråga som ställts och vilken typ av data som förvärvats, finns olika alternativ för att presentera rådata, för att underlätta jämförelse och kritisk förståelse. (i) Molnyt visar medelvärde ± SD. Symbol (*) anger statistisk signifikans i förhållande till kontroll, med hjälp av Students två tailed t-test: *** p ≤ 0,0001, (ii) induktionskurvan visar medelvärde ± SEM, (iii) mer än 10 foci per kärna. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Omvänt, i celler bristfällig för DNA-skador reparation funktioner, γH2AX foci ackumuleras i avsaknad av bestrålning (t = 0 h) och reparationen kan fördröjas, eller frånvarande även vid långa tid punkter (t = 16 h, t = 24 h) efter bestrålning. Direkt jämförelse mellan vildtyp och muterade celler kan ge dyrbar information om DNA-reparationsfunktionen hos genen muterad, och antyda vilken typ av reparation. Medan en brist i NHEJ kan tvinga pausen som ska repareras av HR i S-fas, DSBs som har resected och måste repareras av HR kommer inte att repareras av NHEJ. Av denna anledning kan ackumulering av skador efter S-fasen indikera en HR-brist och höga γH2AX-nivåer efter divisionen tips på NHEJ-defekter.

När flera proteiner undersöks i samma celler kan samlokalisering studeras genom multiplexing av primära antikroppar som upptar hos olika djurarter och avslöjar dessa med sekundära antikroppar märkta med distinkta fluoroforer (Figur 5). Samlokalisering anger om proteiner (i) rekryteras till rasten (ii) rekryteras i tid, (iii) samlas i DNA-reparationskomplex. När man letar efter samlokalisering, är en allmänt accepterad kvalitativ metod att presentera resultat som en enkel överlagring av de olika kanalerna (dvs. grönt och rött). Superposition av grönt och rött kommer att ge upphov till gula hotspots, där de två proteiner av intresse finns i samma pixlar (Bild 5A). Denna metod har dock begränsningar, eftersom den är beroende av den relativa signalintensiteten som samlas i båda kanalerna, och de två fluorokromerna kan ha skillnader i signalstyrka. Därför överlägg metoder bidra till att generera en visuell uppskattning av samlokalisering händelser, men är inte lämpliga för kvantitativa ändamål. Kvantitativ analys av samlokalisering kan uppnås genom en objektbaserad metod (Figur 5B (i-iii) eller genom en statistikmetod som utför en intensitet korrelationskoefficient-baserade (ICCB) analyser (Figur 5B (iv)). Flera verktyg för samlokalisering analys finns, inklusive JACoP (Just Another Co-lokalisering Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) och "Colocalization" pipeline (CellProfiler) utnyttjas här, som kan användas som en ICCB verktyg, i syfte att bedöma förhållandet mellan fluorescens intensiteter. Detta sker till största delen genom att beräkna den korrelationskoefficient (Pearsons koefficient) som mäter styrkan i det linjära sambandet mellan två variabler. Fluorescens samlokalisering kan representeras grafiskt i scatter tomter, där intensiteten av en fluorokrom (grön) ritas mot intensiteten i den andra fluorokrom (röd) för varje pixel. Komplett samlokalisering resulterar i punkter klustrade runt en rak linje, vars lutning återspeglar förhållandet mellan fluorescensen av de två färgerna. Tvärtom, brist på samlokalisering resulterar i fördelningen av punkter i två separata grupper (fördelas längs axlarna), var och en visar varierande signalnivåer av en färg med liten eller ingen signal från den andra färgen. Pearsons koefficientvärde varierar från 1 till -1, med 1 stående för fullständig positiv korrelation, -1 för en negativ korrelation och noll som inte anger någon korrelation. Alternativt kan Pclc-metoden användas. Denna metod har tillämpats i en mängd olika strålnings (se36 för detaljer och fritt tillgänglig metod).

Figure 5
Bild 5: Samlokaliseringsanalys.
Genom att använda flera antikroppar upp mot olika arter (här, anti-mus γH2AX (röd) och anti-kanin 53BP1 (grön)), kan flera proteiner undersökas. (A) Representativa bilder visas. DAPI indikerar kärnorna. Samlokalisering visualiseras efter färg och områdesöverlappning (här röd + grön = gul). Skala bar = 5 μm. (B) Individuella och samlokaliserande foci kan kvantifieras individuellt med hjälp av en av flera mjukvaror (här, CellProfiler, se andra alternativ i huvudtext) och ritas. (i-iii) Objektbaserad närmade används för att bestämma samlokalisering (iv) Korrelationsresultat som erhållits för samlokalisering, med hjälp av en pixelbaserad metod (ICCB-analys). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Kompletterande information. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analys av tidpunkten och effektiviteten av DNA-skador reparation genom mikroskopi har visat sig vara avgörande för att förstå hur DNA reparation maskiner fungerar, i normala celler och i mänskliga patologier såsom cancer.

Utvecklingen av specifika antikroppar som möjliggör detektion av aktiverade proteiner i deras fosforylerade version (såsom γH2AX, pRPA, pRAD50 och andra10,23,39,43) har spelat en central roll för att få en bättre förståelse för DNA-reparationstiming av händelser och dess synkronisering med cellcykeln. Denna framgång exemplifieras av analysen av 53BP1 fosforylerat rester, av masspektrometri och immunolocalization (se32 för granskning), som har hjälpt till att förstå funktionen av detta kraftigt modifierade protein. Med uppstigningen av högupplöst mikroskopisk teknik som STORM och ökad användning av små antikroppar (nanokroppar) direkt protein interaktion i celler blir mer tillgänglig och exakt. Men indirekt immunofluorescens som beskrivs här är fortfarande ett viktigt experiment att utföra när man undersöker en ny potentiell DNA reparation protein och letar efter tidpunkten för åtgärder och protein partner.

Framgången för indirekt immunofluorescens vilar helt på två kriterier: (i) kvaliteten på reagenser – särskilt antikroppar som används för att upptäcka phospho-rester på aktiverade DNA-reparationsproteiner, och (ii) tidpunkten för försöket. Användning av publicerade protokoll och antikroppar bör uppmuntras när sådana finns tillgängliga. När man använder en ny antikropp eller undersöker ett nytt protein ska antikroppen valideras, och specificitet bör fastställas genom att antingen slå ner målprotein i celler (signalen ska gå förlorad) eller proteinutarmning (användning av renat protein för att tömma specifika antikroppar före inkubation, somutförts i 44 för RAD51AP1).

Optimala blockeringsförhållanden och antikroppsutspädning bör upprättas för att minimera artefakter och ospecifik infärgning. Buffertar kommer att förberedas färska och om kärnutvinning utförs måste den vara tidsbeställda för att undvika att skada atomkärnor. Vid undersökning av reparationseffektiviteten i mänskliga celler bör kvantifiering av kärnfionaci utföras, och kärnutsuget kan hjälpa till med att utesluta cytoplasmatiska proteiner. Det kan dock vara fördelaktigt att inte utföra kärnutvinningssteget, till exempel för att undersöka om ett muterat protein som misstänks inte interagera med sin cellulära partner inte lyckas flytta till kärnan vid DNA-skador.

Dessutom är kvaliteten på avbildningen av största vikt för att säkerställa att data kan förvärvas, analyseras och korrekta data ritas in på rätt sätt. Parametrar att kontrollera för är många och inkluderar: specificitet av de primära antikropparna, spektrum av excitation av de valda fluorforerna (sekundära antikroppar), skydda prover mot fotobleaching, val av stöd för såddceller, god provtagning (minst 30 till 300 kärnor, beroende på frågan), och i vissa fall efter behandling såsom dekonvolution ellertral spektning. När det är möjligt föreslås automatiserad avbildning av en fullständig täckplatta, som gör att tusentals celler kan avbildas. Att involvera bildspecialister som en kärnanläggning innan experimentet sätts in bör övervägas eftersom det i hög del kommer att förbättra kvaliteten på resultaten.

Sist, baserat på de använda cellinjerna, den behandling som utförs, och de undersökta proteinerna, kan basala nivåer av foci variera kraftigt och göra resultaten svåra att tolka. Av denna anledning är det viktigt att rådata sammanfattas, bearbetas, analyseras och presenteras i ett effektivt format i ett ljus som läsarna kan förstå; underlätta jämförelse och avslöja trender och relationer inom data. I figur 4Britas samma kvantifiering av foci i tre separata versioner: (i) totalt antal foci (molntomt) efter DSB framkallad genom bestrålning ii) induktion av foci över tiden -kinetik- (iii) % av positiva celler (>10 foci/nucleus).

Molntomter är att föredra närhelst det är möjligt (figur 4B (i)) eftersom de visar alla datapunkter utan diskriminering och därmed erbjuder den mest omfattande översikten av experimentet. Men att rita mer selektiv och relevant information, till exempel antal positiva celler över en godtycklig bakgrund avskuren (5 högborgar i de flesta cellinjer), antalet foci samlokalisering, foci induktion över tiden eller kvalitetsmätning av högborgar, såsom pixelstorlek eller intensitet, kan vara mer lämpligt i vissa fall, och är författarnas ansvar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett anslag från San Antonio Area Foundation. Mays Cancer Center stöds av NCI cancer center stöd core bidrag P30 CA054174. Vi vill tacka Stephen Holloway för hans hjälp med att köpa reagenserna och Sung-laboratoriet för att tillhandahålla rymd- och mikroskopikapacitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600 (2015).
  2. Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11 (7), (2019).
  3. Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9 (12), (2018).
  4. Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).
  5. Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308 (5721), 551-554 (2005).
  6. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).
  8. Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).
  9. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).
  10. Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).
  11. Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).
  12. Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).
  13. Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).
  14. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).
  15. Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
  16. Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428 (2014).
  17. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  18. Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).
  19. Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).
  20. Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).
  21. Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).
  22. Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
  23. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  24. Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
  25. Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).
  26. Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
  27. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
  28. Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740 (2013).
  29. Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).
  30. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  31. Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).
  32. Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
  33. Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).
  34. Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).
  35. Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11 (11), (2019).
  36. Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).
  37. Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).
  38. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).
  39. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
  40. Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).
  41. Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).
  42. Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11 (1), 819 (2020).
  43. Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).
  44. Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).

Tags

Biologi Immunofluorescens samlokalisering kärnfoci bestrålning-inducerad foci DNA-skador reparation
Visualisering av DNA Reparation Proteiner Interaktion genom Immunofluorescens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de la Peña Avalos, B., Dray, E. … More

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter