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Biology

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61447
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

Summary

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Abstract

Las células de mamíferos están constantemente expuestas a sustancias químicas, radiaciones y subproductos metabólicos de origen natural, que crean tipos específicos de insultos de ADN. Los agentes genotóxicos pueden dañar la columna vertebral del ADN, romperlo o modificar la naturaleza química de las bases individuales. Después del insulto al ADN, se activan las vías de respuesta al daño del ADN (DDR) y se reclutan proteínas implicadas en la reparación. Una gran cantidad de factores están involucrados en la detección del tipo de daño y la activación de la respuesta de reparación adecuada. No activar y reclutar correctamente factores DDR puede conducir a una inestabilidad genómica, lo que subyace a muchas patologías humanas, incluido el cáncer. Los estudios de proteínas DDR pueden proporcionar información sobre la respuesta de fármacos genotóxicos y los mecanismos celulares de resistencia a los medicamentos.

Hay dos formas principales de visualizar las proteínas in vivo:la observación directa, etiquetando la proteína de interés con una proteína fluorescente y siguiéndola por imágenes en vivo, o inmunofluorescencia indirecta en muestras fijas. Mientras que la visualización de proteínas etiquetadas fluorescentemente permite una monitorización precisa con el tiempo, el etiquetado directo en N- o C-terminus puede interferir con la localización o función de la proteína. Se prefiere la observación de proteínas en su versión endógena no modificada. Cuando las proteínas de reparación del ADN son reclutadas para el insulto del ADN, su concentración aumenta localmente y forman grupos, o "foci", que pueden ser visualizados por inmunofluorescencia indirecta utilizando anticuerpos específicos.

Aunque la detección de focos proteicos no proporciona una prueba definitiva de interacción directa, la co-localización de proteínas en las células indica que se reagrupan en el lugar del daño y pueden informar de la secuencia de eventos necesarios para la formación compleja. Un análisis cuidadoso de la superposición espacial de los focos en células que expresan versiones de tipo salvaje o mutantes de una proteína puede proporcionar pistas preciosas sobre dominios funcionales importantes para la función de reparación del ADN. Por último, la co-localización de proteínas indica posibles interacciones directas que pueden ser verificadas por co-inmunoprecipitación en las células, o extracción directa usando proteínas purificadas.

Introduction

Las células humanas están constantemente expuestas a una variedad de agentes dañinos del ADN de diversos orígenes. Las fuentes exógenas consisten principalmente en la exposición a radiaciones, productos químicos (incluidos agentes quimioterápticos y algunos antibióticos) y virus, mientras que las principales fuentes endógenas incluyen errores en la replicación del ADN y el estrés oxidativo. Los efectos directos de la exposición genotóxica pueden variar de una base modificada a una rotura de doble cadena de ADN potencialmente letal (DSB), dependiendo de la tensión y la dosis de exposición. En última instancia, el daño del ADN no reparado o mal reparado puede conducir a la acumulación de mutaciones, reordenamientos genómicos, inestabilidad del genoma y eventualmente conducir a la carcinogénesis1. Las células de mamíferos han evolucionado vías complejas para reconocer tipos específicos de daño del ADN2,3 y repararlos de manera oportuna, sincronizados con la progresión del ciclo celular.

La radiación ionizante (IR) daña la doble hélice del ADN y crea roturas de doble cadena (DSB), una de las formas más perjudiciales de daño al ADN. El complejo MRN (MRE11, RAD50, NBS1) funciona como un sensor de ADN termina y activa la proteína quinasa ataxia telangiectasia mutada (ATM)4,5. Después de la activación inicial de ATM por los extremos de ADN, ATM desencadena una cascada de eventos DDR en el sitio de la rotura, iniciando con un evento clave, la fosforilación de la variante de histona H2AX6. La fosforilación H2AX en el residuo S139 la activa en el OH2AX, abarcando regiones hasta megabases alrededor de la lesión de ADN6,7,8,9. Este evento aumenta la accesibilidad del ADN, lo que lleva al reclutamiento y acumulación de otras proteínas de reparación del ADN7. Debido a que el S2AX es abundante y específicamente inducido por DSB, se puede visualizar fácilmente utilizando anticuerpos específicos, y se utiliza comúnmente como un marcador suplente para DSB en el campo de reparación del ADN. Una vez que se señala la rotura, las células activan sus vías de reparación del ADN y procesan el daño del ADN. La proteína MDC1 (mediador de la proteína de control de daño del ADN 1) se une directamente a la proteína de control de daño del ADN10, interactúa con el ATM11 y también con NBS112,,13. Contribuye a aumentar la concentración del complejo MRN en el OSD e iniciar un bucle de retroalimentación ATM positivo. En consecuencia, se elimina rápidamente el H2AX una vez que se repara la rotura, lo que permite la supervisión del aclaramiento del OSD. Seguido de la microscopía, la disminución de la V2AX con el tiempo proporciona una medición indirecta de las roturas residuales y la eficiencia de la reparación del ADN.

Las células eucariotas pueden reparar DSB por varias vías, siendo las dos principales la unión final no homóloga (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR) (Figura 1). NHEJ esencialmente liga los extremos de doble hebra de ADN sin el uso de homología extendida y opera a lo largo del ciclo celular14,15. HR se vuelve predominante durante las fases S y G2, y de lo contrario se reprime, ya que requiere un cromátido hermano como plantilla homóloga para la reparación14,16. La elección de la vía entre NHEJ y HR no sólo depende de la proximidad física del cromátido hermano, sino también de la extensión de la resección final del ADN17,que inhibe el NHEJ.

La reparación del DSB dependiente de la homología inicia por degradación nucleolítica de la hebra de 5' desde los extremos de rotura para generar colas de ADN de una sola cadena (ssDNA) de 3', un proceso denominado resección de 5'-3'. El complejo MRN inicia la resección del extremo del ADN y la resección posterior se procesa en combinación con BLM/EXO1 (proteína del síndrome de Bloom/exonucleasa 1) o BLM/DNA2 (helicasa/nucleasa dependiente de la replicación del ADN)18,19,20,21,22. La resección final del ADN se ve reforzada por CtIP (proteína que interactúa con CtBP) a través de su interacción directa con el complejo MRN23 y el reclutamiento de BRCA1 (proteína de susceptibilidad tipo 1 de cáncer de mama)24,,25. La proteína de replicación A (RPA) se une rápidamente al ssDNA expuesto y luego es desplazada por la proteína recombinase RAD51 para formar un filamento de nucleoproteína que cataliza la búsqueda homóloga y la invasión dehebras 26,,27,,28.

El inicio de la resección es un paso crítico para la elección de la vía de reparación. Una vez iniciada la resección, los extremos del ADN se convierten en sustratos pobres para la unión por heterodista Ku70/Ku80 (componente de la vía NHEJ) y las células se comprometen a HR17,,29,,30. El heterodimero Ku70/Ku80 se une a los extremos del OSD, reclutando DNA-PKcs y p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 actúa como barrera de resección en G1, bloqueando así los recursos humanos mientras se promueve NHEJ31,32, pero se elimina de forma dependiente de BRCA1 en la fase S, permitiendo así que se produzca la resección33,,34. Por lo tanto, 53BP1 y BRCA1 desempeñan funciones opuestas en la reparación del OSD, siendo 53BP1 un facilitador DE NHEJ, mientras que BRCA1 actúa permitiendo la reparación a través de HR.

En el laboratorio, la formación de DSB puede ser inducida por radiación ionizante (IR). Mientras que este ejemplo utiliza una dosis alta de 4 Gy, 1 Gy y 2 Gy también crean una cantidad significativa de DSBs, adecuado para el análisis de la formación de focos por proteínas abundantes. Es importante tener en cuenta que el tipo y la dosis de radiación utilizada pueden conducir a diferentes lesiones en el ADN y en la célula: mientras que ir ir induce DSB, también puede causar roturas de una sola hebra o modificación de la base (ver35,36 para una referencia sobre la irradiación de transferencia de energía lineal (LET) y el tipo de daño del ADN). Para determinar la cinética de la formación de focos inducidos por radiación ionizante (IRIF) y su aclaramiento, que indican la reparación del daño y la reversión de la ACTIVA DDR8,9,37,38, la formación de focos puede ser monitoreada en diferentes puntos de tiempo después de la radiación ionizante.38 El tiempo de activación y aclaramiento de todas las proteínas de daño del ADN importante se conoce39, y muchos se investigan como marcadores sustitutos de eventos clave. Por ejemplo, pRPA, que posee una alta afinidad por ssDNA se utiliza como sustituto de la resección de rotura, las proteínas MRN (MRE11, RAD50, NBS1) y las exonucleas también se pueden utilizar para evaluar la eficiencia de la resección. Mientras que RAD51, BRCA1, BRCA2 (proteína de susceptibilidad tipo 2 de cáncer de mama), y PALB2 (socio y localizador de BRCA2) se pueden monitorear para evaluar la eficiencia de HR, la presencia de las proteínas Ku o 53BP1, se utilizan como marcadores de NHEJ (Figura 1).

A medida que las proteínas de la maquinaria de reparación del ADN se reclutan entre sí para la ruptura y se ensamblan en supera complexios, las interacciones ADN-proteína y proteína-proteína se pueden inferir siguiendo su localización individual a lo largo del tiempo y analizando la co-localización de proteínas, visualizadas por señales superpuestas en las células40,,41,,42. En las líneas celulares, la introducción de mutaciones puntuales o la deleción en genes específicos de reparación del ADN, ya sea a través de la edición del genoma, o mediante la sobreexpresión de mutantes a base de plásmidos, permite la investigación de residuos específicos y su posible papel en el reconocimiento del daño del ADN (por ejemplo, la co-localización con el OH2AX) o el montaje complejo (co-localización con otra, o varias, proteínas), así como su impacto en la reparación del ADN. Aquí, utilizamos la inmunofluorescencia indirecta como medio para investigar la formación y la resolución de los DSB siguiendo a los focos de H2AX a lo largo del tiempo. También presentamos un ejemplo de formación de focos y análisis de co-localización por un actor importante en la reparación del DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Como se mencionó anteriormente, 53BP1 se considera fundamental para la elección de la vía de reparación del ADN. Después de la acumulación de 53BP1 y su co-localización con el S2AX proporciona información valiosa sobre la fase del ciclo celular, la acumulación de daño en el ADN y la vía utilizada para reparar DSB. El propósito de la inmunolocalización indirecta es evaluar la eficiencia de la reparación del daño del ADN en las líneas celulares, después de IR como en este estudio, o después de la exposición a diversas tensiones en la célula, desde la reticulación del ADN hasta el bloqueo de la horquilla de replicación (se proporciona una lista de agentes que dañan el ADN en la Tabla 1).

Figure 1
Figura 1: Dna double strand breaks (DSB) vías de reparación.
La reparación del DSB implica dos vías principales: recombinación homóloga (HR, izquierda) y unión final no homóloga (NHEJ, derecha). Después de la rotura, las proteínas se activan para marcar la rotura ( H2AX), participar en la resección final (MRN), recubrir el ssDNA resecado (pRPA), promover la recombinación (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) o limitar la resección y promover NHEJ (53BPBP). Otras proteínas participan en la reparación del daño, pero las proteínas enumeradas son seguidas rutinariamente por inmunofluorescencia indirecta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Agente dañante del ADN Mecanismo de acción Dosis recomendada
Rayos/rayos X Radiación
Formación de roturas de doble cadena con algunos efectos celulares incontrolados		 1-4 Gy
36 Incendios Radiación
Formación de roturas de doble cadena		 270 keV/m
partículas Radiación
Formación de roturas de doble cadena		 116 keV/m
Bleomicina Inhibidor de la síntesis de ADN 0,4-2 g/ml
Camptotecina Inhibidor de la topoisomerasa I 10-200 nM
Cisplatino Agente alquilante
(induciendo reticulaciones intrastrand)		 0,25-2 M
Doxorrubicina Agente intercalador
Inhibidor de la topoisomerasa II		 10-200 nM
Etoposide Inhibidor de la topoisomerasa II 10 M
Hidroxiurea Inhibidor de la síntesis de ADN
(por ribonucleótido reductasa)		 10-200 m
Metanoesulfonato de metilo Agente alquilante 0,25-2 mM
Mitomicina C Agente alquilante 0,25-2 M
Luz ultravioleta (UV) Formación de dimers de timidina
(generando distorsión de la cadena de ADN)		 50-100 mJ/cm2

Tabla 1: Agentes genotóxicos. Ejemplos de agentes dañinos para el ADN, su mecanismo de acción y el daño inducido en función de la concentración de trabajo sugerida.

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Protocol

1. Cultivo celular de HeLa

  1. Pretrata los cubreobjetos redondos de vidrio con 1 M HCl a 50oC durante 16-18 horas. Enjuagar con ddH2O y conservar en 100% EtOH.
  2. Preparar el medio de cultivo celular: añadir 10% (v/v) FBS al medio DMEM.
  3. Cultivar 4,0 x 104 células/pozo en una placa estéril de 12 pozos con un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 mm a 37 oC y 5% deCO2 en una incubadora humidificada. Crecer las células al 80% de confluencia (aproximadamente 24 horas).

2. Tratamiento celular con radiación (IR)

  1. Para inducir la formación de roturas de doble hebra, exponga las células a 4 Gy -irradiación (control: Sin irradiación, t-0). En la célula gamma -40, esto corresponde a 4.54 min, a 0.815 Gy por minuto.
  2. Incubar células a 37oC y 5% deCO2 en una incubadora humidificada para la duración adecuada (puntos de tiempo elegidos aquí t-1, 2, 4, 16 h).

3. Extracción nuclear y fijación celular

  1. Preparar soluciones de stock: 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M sacarosa, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).
  2. Preparar el tampón de extracción nuclear (NEB): disolver 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM de sacarosa, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) y 0.5% (v/v) Tritón X-100 en ddH2O. Mix hasta que se disuelva completamente.
  3. Preparar 4% (v/v) paraformaldehído (PFA): disolver 10 ml de 16% de solución acuosa de PFA en PBS de 30 ml. Mezclar hasta que se disuelva por completo.
  4. En el punto de tiempo apropiado (t-0, 1, 2, 4, 16 h), lave las células dos veces con 1 ml de PBS. Retire PBS por completo.
  5. Añadir 200 l de NEB a cada pocómo para la extracción de núcleos celulares (el citoplasma se degrada, sólo queda el núcleo) (Figura 2). Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente y retirar completamente.
    NOTA: No exceda los 2 minutos.

Figure 2
Figura 2: Extracción nuclear.
Imágenes representativas de las células antes de la extracción nuclear (izquierda) y posterior (derecha). El citoplasma debe ser digerido, pero la estructura nuclear debe permanecer intacta después de la extracción (derecha). (A) aumento de 20x; barra de escala de 20 m y (B) aumento de 40x; barra de escala a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Lavar las células con 1 ml de PBS. Retire PBS por completo. Agregue PBS cuidadosamente, las células son muy frágiles en este paso.
  2. Añadir 200 l de 4% (v/v) PFA a cada pocóptil para la fijación de la célula. Incubar durante 10 minutos a 4oC. Retire PFA por completo.
  3. Añadir 1 mL de PBS.
    NOTA: Las celdas se pueden almacenar en PBS a 4 oC.

4. Tinción de inmunofluorescencia

  1. Preparar la solución de bloqueo: disolver 5% BSA (p/v) en PBS y añadir 0.3% (v/v) Tritón X-100. Mezclar hasta que se disuelva por completo.
  2. Preparar el tampón de dilución: disolver 1% BSA (p/v) en PBS y añadir 0.3% (v/v) Tritón X-100. Mezclar hasta que se disuelva por completo.
  3. Para el bloqueo, agregue 200 l de solución de bloqueo a cada pocól. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente o 16-18 horas a 4oC.
    NOTA: Si se utilizará un anticuerpo caprino, añada un 5% de suero de cabra a la solución de bloqueo.
  4. Diluir el anticuerpo primario en el tampón de dilución (1:500; ver Tabla 2 para la lista de anticuerpos) y el vórtice hasta que esté bien mezclado.
    NOTA: Si se utiliza anticuerpo de cabra, agregue 1% de suero de cabra al tampón de dilución.
  5. En una caja de humedad/incubación, adhiera un trozo de parafilm. Añadir 10 l de anticuerpo primario (en una sola gota). Alinee un borde del cubreobjetos con la gota y baje lentamente sobre la parapelta, para que el líquido se propague por todas partes (evitar burbujas si es posible). Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
  6. Lave los cubreobjetos tres veces en PBS durante 1 minuto.
  7. Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de dilución (concentración final: 2 g/ml) y el vórtice hasta que esté bien mezclado.
  8. Aplicar 10 l de anticuerpo secundario como se describe para los anticuerpos primarios. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
    NOTA: Proteger de la luz.
Anticuerpo Empresa Referencia Fuente
53BP1 Señalización celular 4937 Conejo
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150103 Burro
Anti-fosfo-histona H2A. X (Ser139), clon JBW301 Millipore 05-636 Ratón
Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150081 Cabra

Tabla 2: Anticuerpos utilizados. Lista de anticuerpos utilizados en este estudio.

  1. Lave los cubreobjetos tres veces en PBS durante 1 minuto.
  2. Lave los cubreobjetos con H2O durante 1 minuto.
  3. Contrate el ADN con DAPI: aplicar 10 l de DAPI de 300 nM (como se describe para los anticuerpos), incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego montar en un portaobjetos de vidrio con un medio de montaje a base de glicerol. Alternativamente, agregue una gota (10 l) de soportes comerciales de montaje antifada que contengan DAPI en una diapositiva y aplique un cubreobjetos. Presione suavemente el cubreobjetos y retire el exceso de líquido a su alrededor con una toalla de papel.
  4. Selle los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y déjelos secar durante 20 minutos.
  5. Almacene los portaobjetos a 4oC.

5. Adquisición de imágenes

  1. Coloque una gota de aceite de inmersión en la lente objetivo 60x. Utilice DAPI para localizar los núcleos a través de la pieza ocular.
    1. Para la adquisición de imágenes XYZ, abra el software de adquisición y seleccione parámetros: Tipo de escáner: Galvano; Modo escáner: ida y vuelta; Tamaño de la imagen: 512-512; Modo PMT: VBF; Promedio de PMT: marco (4 veces); Escaneo secuencial PMT: línea.
    2. Seleccione el tinte y los detectores:
      Canal (CH1), Tinte (DAPI), Detector (SD1)
      Canal (CH2), Tinte (Alexa Fluor 488), Detector (HSD3)
      Canal (CH3), Tinte (Alexa Fluor 647), Detector (HSD4)
    3. Seleccione ON en "Z".
  2. Ajuste la imagen en vivo. Pulse el botón Live en la ventana Live.
    1. Ajuste el enfoque y ajuste la intensidad del láser (%), la sensibilidad (HV), la ganancia y el desplazamiento en la ventana de herramientas "PMT".
      1. Ajustar la intensidad del láser (%): para el brillo y el blanqueo. Cuanto mayor sea la intensidad del láser, más fuerte será la señal, pero la muestra fotoblanqueará.
      2. Ajuste la sensibilidad (HV): nivel de ruido. Cuanto mayor sea el HV, más fuerte será la señal, pero la imagen será ruidosa si es demasiado alta.
        NOTA: Mantenga siempre constante el voltaje.
      3. Ajuste el desfase: nivel de fondo.
    2. Seleccione Inicio/Fin (15 sectores) para Pilas Z.
  3. Inicie la adquisición.
    1. Seleccione la carpeta para guardar las imágenes. Pulse el botón Inicio de LSM para empezar a adquirir la imagen. Pulse el botón Series Done para completar la adquisición de la imagen.

6. Análisis de datos

  1. Para el análisis de imágenes, abra el software de análisis.
    1. Presione la ventana de herramientas Lote, seleccione las imágenes que desea analizar y seleccione la carpeta de salida.
    2. Pulse la ventana Herramienta Análisis y seleccione Proyección (mostrará la proyección de intensidad máxima de 15 sectores).
    3. En Configuración de entrada/salida, seleccione el lote creado.
    4. Pulse Procesar para que se procesen las imágenes.
    5. Exportar imágenes como archivos .tiff.
  2. Para la cuantificación de focos nucleares, abra CellProfiler.
    1. Abra la canalización de cuantificación de focos de 2AX y 53BP1 (consulte Información complementaria).
    2. Graficar datos utilizando un software de tabla.
  3. Para el análisis de co-localización, abra CellProfiler.
    1. Abra la canalización de colocación (consulte Información complementaria). Se creará un archivo de hoja de cálculo y se guardará en la ubicación preferida. Sin embargo, los gráficos en sí no se guardarán automáticamente. Se sugiere tomar una instantánea de las ventanas para mantener un registro de los resultados.
    2. Graficar datos utilizando un software de tabla.

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Representative Results

En el día 2, o 24 h después de las células de siembra en los cubreobjetos, las células han sufrido una división y son 80% confluentes. Los derribos o mutaciones específicos en las proteínas de reparación del ADN pueden aumentar el tiempo de duplicación, o sensibilizar a las células al tratamiento genotóxico, y la densidad de siembra, así como las dosis de tratamiento, deben ajustarse en consecuencia. Para determinar las mejores condiciones de trabajo, el tiempo de la respuesta al daño del ADN puede ser establecido por la hinchazón occidental de ÉH2AX con el tiempo, y la sensibilidad a la irradiación se puede identificar mediante un ensayo de formación de colonias.

Las células no tratadas con irradiación presentan poco, si los hay, focos de H2AX (Figura 3A). Sin embargo, la formación de focos de H2AX puede ser desencadenada en células cultivadas por diversas tensiones inherentes a las condiciones de crecimiento: células que dejan confluentes en medios acidificados, presencia de endotoxina genotóxica en la FBS, concentración de oxígeno utilizada para el cultivo, por citar algunas.

Figure 3
Figura 3: Focos nucleares sin estrés.
En ausencia de un estresor externo, se observan muy pocos focos de H2AX (A). En ausencia de proteínas esenciales de reparación del ADN, se puede observar la acumulación de H2AX a medida que no se reparan las roturas debido a fuentes endógenas (B). La acumulación de roturas no reparadas puede llevar a las células a volverse pre-apoptóticas, que está marcada por una tinción "sólida" de núcleos de H2AX (C). Barra de escala a 5 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Además, en las células agotadas para proteínas clave de daño del ADN, como las células mutantes BRCA1 o BRCA2, las roturas de ADN que se producen como resultado de tensiones endógenas no se reparan como en las células de tipo salvaje, y se acumulan. Como resultado, se puede observar un elevado "H2AX" en células deficientes en HR, incluso en condiciones normales de crecimiento(Figura 3B). Una subcuescción de células puede exhibir tinción nuclear "sólida" con el valor de lafigura 3C ( S2AX). La mancha pannuclear puede indicar que una célula está agobiada por daños irreparables y/o es pre-apoptótica. Estas células se caracterizan típicamente por núcleos agrandados, y la presencia de vacuolas citoplasmáticos. Además, se puede desencadenar el valor de H2AX mediante tensiones replicativas en las bifurcaciones de replicación de fase S y estancadas, o mediante el detención de G2/M. Si es necesario, las fases del ciclo celular se pueden identificar manchando el contenido del ADN o co-tining con marcadores específicos. Al realizar análisis de reparación de daños en el ADN, la pannuclear se puede cuantificar independientemente de los focos individualizados.

Después de la irradiación, los núcleos exhiben un gran número de roturas de hebras dobles a las que el valor de H2AX se localiza muy rápidamente(Figura 4). En condiciones óptimas, se observan pocos o medio de F2AX en ausencia de irradiación. Después de la irradiación, la formación de los focos de H2AX aumenta considerablemente. Si las pausas se procesan y reparan, el recuento de focos por núcleos disminuye, así como el número de células positivas para los focos. La intensidad y el número de focos varía dependiendo de la línea celular utilizada y de la dosis de irradiación suministrada. En las células heLa de bajo paso, cultivadas en suero libre de endotoxinas, observamos rutinariamente un fuerte aumento de los focos a los 30 minutos y 1 h después de la irradiación, que alcanza los picos entre 1 y 2 h, luego disminuye progresivamente hasta las 16 h. Por esta razón, los puntos de tiempo representativos en 0, 1, 2, 4 y 16 h después de la irradiación se presentan aquí. El comportamiento de la señalización de rotura, reparación y supervivencia a la irradiación puede variar mucho entre las líneas celulares, así como el agotamiento o mutación de genes. Por esta razón, los puntos de tiempo más adecuados dependerán del experimento y de la célula. En el experimento, a las 16 h, los focos residuales de H2AX han alcanzado el mismo nivel basal que las células no irradiadas. Se sugiere monitorear los focos residuales para incluir puntos de tiempo posteriores si se trabaja con líneas celulares que se dividen lentamente.

Figure 4
Figura 4: Focos nucleares y cuantificación tras el estrés (curso de tiempo).
Formación de focos de H2AX en t-0 (sin irradiación) y en los puntos de tiempo indicados después de la irradiación (4 Gy, t-1, 2, 4, 16 h). (A) Se muestran imágenes representativas. DAPI indica los núcleos. Barra de escala a 5 m. (B) Los focos nucleares de la unidad de V2AX después de la exposición a la irradiación de la marca se obtuvieron mediante la cuantificación automatizada (CellProfiler) en 100 núcleos por cada punto de tiempo. Dependiendo de la cuestión biológica planteada y del tipo de datos adquiridos, se dispone de diferentes opciones para presentar los datos en bruto, con el fin de facilitar la comparación y la comprensión crítica. (i) La gráfica de la nube muestra la media sd. Símbolo (*) indica significancia estadística en relación con el control, utilizando la prueba t de dos colas del estudiante: *** p a 0.0001, (ii) la curva de inducción muestra la media de SEM, (iii) más de 10 focos por núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Por el contrario, en las células deficientes para las funciones de reparación del daño del ADN, los focos de H2AX se acumulan en ausencia de irradiación (t-0 h) y la reparación puede retrasarse, o ausente incluso en puntos de tiempo largos (t-16 h, t-24 h) después de la irradiación. La comparación directa entre el tipo salvaje y las células mutantes puede proporcionar información valiosa sobre la función de reparación del ADN del gen mutado, e insinuar el tipo de reparación. Mientras que una deficiencia en NHEJ puede forzar la rotura para ser reparada por HR en la fase S, los DSB que han sido resectados y deben ser reparados por HR no serán reparados por NHEJ. Por esta razón, la acumulación de daño después de la fase S podría indicar una deficiencia de HR, y los niveles altos de H2AX después de la pista de división de defectos NHEJ.

Cuando se investigan varias proteínas en las mismas células, la co-localización se puede estudiar mediante la multiplexación de anticuerpos primarios criados en diferentes especies animales y revelando estos con anticuerpos secundarios etiquetados con fluoróforos distintos (Figura 5). La co-localización indica si las proteínas (i) son reclutadas para la ruptura (ii) se reclutan de manera oportuna, (iii) ensamblar en complejos de reparación del ADN. Cuando se busca la co-localización, un método cualitativo comúnmente aceptado es presentar resultados como una simple superposición de los diferentes canales (es decir, verde y rojo). La superposición de verde y rojo dará lugar a puntos críticos amarillos, donde las dos proteínas de interés están presentes en los mismos píxeles(Figura 5A). Sin embargo, este método tiene limitaciones, ya que depende de la intensidad de la señal relativa recogida en ambos canales, y los dos fluorocromos pueden tener diferencias en la intensidad de la señal. Por lo tanto, los métodos de superposición ayudan a generar una estimación visual de los eventos de co-localización, pero no son adecuados para fines cuantitativos. El análisis cuantitativo de la co-localización se puede lograr mediante un enfoque basado en objetos(Figura 5B (i-iii) o mediante un enfoque estadístico que realiza análisis basados en el coeficiente de correlación de intensidad (ICCB)(Figura 5B iv)). Hay disponibles varias herramientas para el análisis de la co-localización, incluyendo JACoP (Just Another Co-localization Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) y la canalización "Colocalization" (CellProfiler) utilizada aquí, que se puede utilizar como una herramienta ICCB, con el fin de evaluar la relación entre las intensidades de fluorescencia. Esto se hace principalmente calculando el coeficiente de correlación (coeficiente de Pearson) que mide la fuerza de la relación lineal entre dos variables. La co-localización de fluorescencia se puede representar gráficamente en gráficas de dispersión, donde la intensidad de un fluorocromo (verde) se traza contra la intensidad del segundo fluorocromo (rojo) para cada píxel. La co-localización completa da como resultado puntos agrupados alrededor de una línea recta, cuya pendiente refleja la relación de la fluorescencia de los dos colores. Por el contrario, la falta de co-localización da como resultado la distribución de puntos en dos grupos separados (distribuidos a lo largo de los ejes), cada uno de los dos mostrando diferentes niveles de señal de un color con poca o ninguna señal del otro color. El valor del coeficiente de Pearson oscila entre 1 y -1, con 1 representación de correlación positiva completa, -1 para una correlación negativa y cero que indica que no hay correlación. Alternativamente, se puede utilizar el método Pclc. Este método se ha aplicado en una variedad de radiaciones (ver36 para más detalles y método de libre disponibilidad).

Figure 5
Figura 5: Análisis de co-localización.
Mediante el uso de varios anticuerpos elevados contra diferentes especies (aquí, antiratón -H2AX (rojo) y anti-conejo 53BP1 (verde)), se pueden investigar varias proteínas. (A) Se muestran imágenes representativas. DAPI indica los núcleos. La co-localización se visualiza por color y superposición de área (aquí rojo + verde - amarillo). Barra de escala a 5 m. (B) Los focos individuales y co-localizadores se pueden cuantificar individualmente utilizando uno de los varios softwares (aquí, CellProfiler, ver otras opciones en el texto principal) y trazar. (i-iii) Enfoque basado en objetos utilizado para determinar la co-localización (iv) Resultados de correlación obtenidos para la co-localización, utilizando un enfoque basado en píxeles (análisis ICCB). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El análisis del momento y la eficiencia de la reparación del daño del ADN por microscopía ha demostrado ser esencial para entender cómo funciona la maquinaria de reparación del ADN, en las células normales y en patologías humanas como el cáncer.

El desarrollo de anticuerpos específicos que permitan la detección de proteínas activadas en su versión fosforilada (como el 10,10,23,39,,43)ha desempeñado un papel central en la obtención de una mejor comprensión del tiempo de reparación del ADN de los eventos y su sincronización con el ciclo celular., Este éxito se ejemplifica mediante el análisis de residuos fosforilados 53BP1, por espectrometría de masas e inmunolocalización (ver32 para su revisión), lo que ha ayudado a entender la función de esta proteína muy modificada. Con el ascenso de la técnica microscópica de alta resolución como STORM y el aumento del uso de pequeños anticuerpos (nanocuerpos) la interacción directa de proteínas en las células es cada vez más accesible y precisa. Sin embargo, la inmunofluorescencia indirecta como se describe aquí sigue siendo un experimento esencial para realizar al investigar una nueva proteína de reparación potencial del ADN y buscar el momento de la acción y los socios de proteínas.

El éxito de la inmunofluorescencia indirecta se basa enteramente en dos criterios: (i) la calidad de los reactivos, especialmente los anticuerpos utilizados para detectar fosfo-residuos en proteínas reactivas de reparación del ADN, y (ii) el momento del experimento. Se debe fomentar el uso de protocolos y anticuerpos publicados cuando estén disponibles. Cuando se utiliza un nuevo anticuerpo o se investiga una proteína nueva, se debe validar el anticuerpo, y la especificidad debe establecerse mediante la eliminación de la proteína diana en las células (se debe perder la señal) o el agotamiento de proteínas (uso de proteína purificada para agotar anticuerpos específicos antes de la incubación, como se realiza en44 para RAD51AP1).

Se deben establecer condiciones óptimas de bloqueo y dilución de anticuerpos para minimizar los artefactos y las manchas no específicas. Los tampones se prepararán frescos y, si se realiza la extracción nuclear, se debe cronometrando para evitar dañar los núcleos. Al investigar la eficiencia de reparación en células humanas, se debe cuantificar los focos nucleares, y la extracción nuclear puede ayudar a excluir las proteínas citoplasmicas. Sin embargo, puede ser beneficioso no realizar el paso de extracción nuclear, por ejemplo para investigar si una proteína mutante sospechosa de no interactuar con su pareja celular no se transloca al núcleo tras el daño del ADN.

Además, la calidad de las imágenes es de suma importancia para garantizar que los datos se puedan adquirir, analizar y trazar datos precisos. Los parámetros a controlar son muchos e incluyen: especificidad de los anticuerpos primarios, espectro de excitación de los fluoróforos elegidos (anticuerpos secundarios), protección de muestras contra el fotoblanquido, elección de soporte para células de siembra, buen muestreo (mínimo de 30 a 300lei núcleos, dependiendo de la pregunta), y en algunos casos post-tratamiento como la desconvolución o la no mezcla espectral. Cuando sea posible, se sugiere la creación de imágenes automatizadas de un cubreobjetos completo, que permite tomar imágenes de miles de células. Debe considerarse que los especialistas en imágenes, como una instalación central antes de establecer el experimento, mejorarán en gran medida la calidad de los resultados.

Por último, en función de las líneas celulares utilizadas, el tratamiento realizado y las proteínas investigadas, los niveles basales de focos pueden variar mucho y dificultar la interpretación de los resultados. Por esta razón, es importante que los datos sin procesar se resuman, procesen, analicen y presenten en un formato eficaz en una luz que los lectores puedan entender; facilitando la comparación y revelando tendencias y relaciones dentro de los datos. En la Figura 4B, la misma cuantificación de los focos se traza en tres versiones separadas: (i) número total de focos (gráfico de nubes) después de DSB inducidos por irradiación (ii) inducción de focos en el tiempo -cinética- (iii) % de células positivas (>10 focos/núcleo).

Las gráficas de nubes deben preferirse siempre que sea posible(Figura 4B (i)) ya que muestran todos los puntos de datos sin discriminación y, por lo tanto, ofrecen la visión general más completa del experimento. Sin embargo, trazar información más selectiva y relevante, como el número de celdas positivas por encima de un fondo arbitrario cortado (5 focos en la mayoría de las líneas celulares), el número de focos que co-localizan, la inducción de focos a lo largo del tiempo o la medición de calidad de los focos, como el tamaño o la intensidad de píxeles, puede ser más apropiado en algunos casos, y es responsabilidad de los autores.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación del área de San Antonio. El Mays Cancer Center está respaldado por la subvención principal del centro oncológico NCI P30 CA054174. Nos gustaría agradecer a Stephen Holloway por su ayuda para obtener los reactivos, y al laboratorio Sung por proporcionar espacio y capacidad de microscopía.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

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References

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Biología Número 160 Inmunofluorescencia co-localización focos nucleares focos inducidos por irradiación reparación de daños en el ADN
Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia
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de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

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