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Biology

Visualização de Proteínas de Reparação de DNA Interação por Imunofluorescência

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61447
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

Summary

Após danos no DNA, as células humanas ativam caminhos essenciais de reparação para restaurar a integridade de seu genoma. Aqui, descrevemos o método de imunofluorescência indireta como um meio de detectar proteínas de reparação de DNA, analisar seu recrutamento espacial e temporal e ajudar a interrogar a interação proteína-proteína nos locais de danos ao DNA.

Abstract

As células mamíferas são constantemente expostas a produtos químicos, radiações e subprodutos metabólicos que ocorrem naturalmente, que criam tipos específicos de insultos de DNA. Agentes genotóxicos podem danificar a espinha dorsal do DNA, quebrá-la ou modificar a natureza química das bases individuais. Após insulto de DNA, vias de resposta a danos de DNA (DDR) são ativadas e proteínas envolvidas no reparo são recrutadas. Uma infinidade de fatores estão envolvidos na detecção do tipo de dano e na ativação da resposta adequada ao reparo. A falha em ativar e recrutar corretamente fatores de DDR pode levar à instabilidade genômica, que está por trás de muitas patologias humanas, incluindo o câncer. Estudos de proteínas DDR podem fornecer insights sobre a resposta de medicamentos genotóxicos e mecanismos celulares de resistência a medicamentos.

Existem duas principais formas de visualizar proteínas in vivo: observação direta, marcando a proteína de interesse com uma proteína fluorescente e seguindo-a por imagem viva, ou imunofluorescência indireta em amostras fixas. Embora a visualização de proteínas fluorescentes marcadas permita um monitoramento preciso ao longo do tempo, a marcação direta em N ou C-terminus pode interferir na localização ou função da proteína. A observação de proteínas em sua versão endógena não modificada é preferida. Quando as proteínas de reparação de DNA são recrutadas para o insulto do DNA, sua concentração aumenta localmente e formam grupos, ou "focos", que podem ser visualizados por imunofluorescência indireta usando anticorpos específicos.

Embora a detecção de focos proteicos não forneça uma prova definitiva de interação direta, a co-localização de proteínas nas células indica que elas se reagrupam ao local do dano e podem informar sobre a sequência de eventos necessários para formação complexa. A análise cuidadosa da sobreposição espacial de focos em células expressas do tipo selvagem ou versões mutantes de uma proteína pode fornecer pistas preciosas sobre domínios funcionais importantes para a função de reparação de DNA. Por último, a co-localização de proteínas indica possíveis interações diretas que podem ser verificadas por co-imunoprecipitação nas células, ou retirada direta usando proteínas purificadas.

Introduction

Células humanas são constantemente expostas a uma variedade de DNA danificando agentes de várias origens. Fontes exógenas consistem principalmente em exposição a radiações, produtos químicos (incluindo agentes quimioterápicos e alguns antibióticos), e vírus, enquanto as principais fontes endógenas incluem erros na replicação do DNA e estresse oxidativo. Os efeitos diretos da exposição genotoxica podem variar de uma base modificada a uma quebra de duplo fio de DNA potencialmente letal (DSB), dependendo do estresse e da dose de exposição. Em última análise, danos de DNA não reparados ou mal reparados podem levar ao acúmulo de mutações, rearranjos genômicos, instabilidade do genoma e eventualmente levar à carcinogênese1. As células mamíferas desenvolveram caminhos complexos para reconhecer tipos específicos de dano de DNA2,3 e repará-los em tempo hábil, sincronizados com a progressão do ciclo celular.

A radiação ionizante (IR) danifica a dupla hélice do DNA e cria quebras de dois fios (DSBs), uma das formas mais deletérias de dano de DNA. O complexo MRN (MRE11, RAD50, NBS1) funciona como um sensor de extremidades de DNA e ativa a proteína quinase ataxia telangiectasia mutada (ATM)4,5. Após a ativação inicial do ATM por extremidades de DNA, o ATM desencadeia uma cascata de eventos de DDR no local do rompimento, iniciando com um evento-chave, a fosforilação da variante histona H2AX6. Fosforilação H2AX sobre resíduo S139 ativa-o em γH2AX, abrangendo regiões até megabases em torno da lesão de DNA6,,7,,8,9. Este evento aumenta a acessibilidade ao DNA, levando ao recrutamento e acúmulo de outras proteínas de reparação de DNA7. Como o γH2AX é abundante e especificamente induzido em DSBs circundantes, ele pode ser facilmente visualizado usando anticorpos específicos, e é comumente usado como um marcador substituto para DSBs no campo de reparação de DNA. Uma vez que a ruptura é sinalizada, as células ativam suas vias de reparação de DNA e processam o dano de DNA. A proteína MDC1 (mediadora da proteína de ponto de verificação de dano de DNA 1) liga diretamente γH2AX10,interage com o ATM11 e também com NBS112,13. Contribui para aumentar a concentração do complexo de MRN no DSB e iniciar um ciclo positivo de feedback atm. γH2AX é rapidamente removido uma vez que a ruptura é reparada, consequentemente, permitindo o monitoramento da liberação DSB. Seguida pela microscopia, a diminuição do γH2AX ao longo do tempo fornece uma medição indireta de quebras residuais e eficiência de reparação de DNA.

As células eucarióticas podem reparar DSBs por várias vias, sendo as duas principais não homólogos a junção final (NHEJ) e recombinação homólogo (HR)(Figura 1). NHEJ essencialmente liga extremidades de dupla cadeia de DNA sem o uso de homologia estendida e opera durante todo o ciclo celular14,15. O RH torna-se predominante durante as fases S e G2, e é reprimido de outra forma, uma vez que requer uma cromátide irmã como modelo homólogo para reparo14,16. A escolha do caminho entre nhej e RH não depende apenas da proximidade física da cromátide irmã, mas também da extensão da ressecção final de DNA17,que inibe o NHEJ.

O reparo de DSB dependente de ecologia inicia-se pela degradação nucleolítica do fio de 5' das extremidades de ruptura para gerar caudas de DNA de 3' de fios únicos (ssDNA), um processo chamado de ressecção de 5'-3'. O complexo MRN inicia a ressecção final do DNA e a ressecção adicional é processada em combinação com BLM/EXO1 (proteína da síndrome de Bloom/exonuclease 1) ou BLM/DNA2 (replicação de DNA atp-dependente helicase/nuclease)18,19,20,21,22. A ressecção final do DNA é aprimorada pela CtIP (Proteína Interagindo com ADCBP) através de sua interação direta com o complexo MRN23 e recrutamento do BRCA1 (proteína de suscetibilidade tipo 1 do câncer de mama)24,25. Proteína de replicação A (RPA) se liga prontamente ao ssDNA exposto e, em seguida, é deslocada pela proteína recombinase RAD51 para formar um filamento nucleoproteína que catalisa a busca homólogo e a invasão de fios26,,27,28.

O início da ressecção é um passo crítico para a escolha do caminho de reparo. Uma vez iniciada a ressecção, as extremidades do DNA tornam-se substratos pobres para ligação pelo heterodimer Ku70/Ku80 (componente da via NHEJ) e as células são comprometidas com o HR17,,29,30. O heterodimer Ku70/Ku80 se liga aos fins do DSB, recrutando DNA-PKcs e p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. O 53BP1 atua como uma barreira à ressecção no G1, bloqueando assim o RH ao promover a NHEJ31,32, mas é removido de forma dependente do BRCA1 na fase S, permitindo, consequentemente, que ocorra a ressecção33,34. Portanto, 53BP1 e BRCA1 desempenham papéis opostos no reparo do DSB, sendo 53BP1 um facilitador NHEJ enquanto o BRCA1 atua permitindo que as quebras sejam reparadas pelo RH.

Em laboratório, a formação de DSB pode ser induzida por radiação ionizante (IR). Enquanto este exemplo utiliza uma alta dose de 4 Gy, 1 Gy e 2 Gy também criam uma quantidade significativa de DSBs, adequado para a análise da formação de focos por proteínas abundantes. É importante notar que o tipo e a dose de radiação utilizada podem levar a diferentes lesões no DNA e na célula: enquanto o IR induz DSBs, também pode causar quebras de fios únicos ou modificação de base (ver35,36 para uma referência sobre transferência de energia linear de irradiação (LET) e tipo de dano de DNA). Para determinar a cinética da formação de focos induzidos por radiação ionizante (IRIF) e sua desobstrução, que indicam reparação dos danos e reversão da formação ativada de DDR8,,9,,37,,38, os focos podem ser monitorados em diferentes pontos de tempo após a radiação ionizante. O tempo de ativação e liberação de todas as principais proteínas de dano de DNA é conhecidocomo 39, e muitos são investigados como marcadores substitutos de eventos-chave. Por exemplo, pRPA, que possui alta afinidade com ssDNA é usado como substituto da ressecção de quebra, proteínas MRN (MRE11, RAD50, NBS1) e exonucleases também podem ser usadas para avaliar a eficiência da ressecção. Enquanto rad51, BRCA1, BRCA2 (proteína de suscetibilidade ao câncer de mama tipo 2) e PALB2 (parceiro e localizador do BRCA2) podem ser monitorados para avaliar a eficiência do RH, a presença das proteínas Ku ou 53BP1, são utilizados como marcadores do NHEJ (Figura 1).

À medida que as proteínas das máquinas de reparação de DNA recrutam umas às outras para a quebra e montagem em superconsetos, as interações DNA-proteína e proteína-proteína podem ser inferidas seguindo sua localização individual ao longo do tempo e analisando a co-localização de proteínas, conforme visualizado por sinais sobrepostos na célula40,,41,,42. Nas linhas celulares, a introdução de mutações pontuais ou exclusão em genes específicos de reparação de DNA, seja através da edição de genomas, ou pela superexpressão de mutantes à base de plasmídeos, permite a investigação de resíduos específicos e seu possível papel no reconhecimento de danos de DNA (por exemplo, co-localização com γH2AX) ou montagem complexa (co-localização com outra, ou várias proteínas), bem como seu impacto na reparação do DNA. Aqui, usamos a imunofluorescência indireta como meio para investigar a formação e resolução de DSBs seguindo os focos γH2AX ao longo do tempo. Também apresentamos um exemplo de formação de focos e análise de co-localização por um dos principais players no reparo de DSB: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Como mencionado anteriormente, 53BP1 é considerado central para a escolha da via de reparação de DNA. Após o acúmulo de 53BP1 e sua co-localização com γH2AX fornece informações preciosas sobre a fase de ciclo celular, acúmulo de danos de DNA e via usada para reparar DSBs. O objetivo da imunolocalização indireta é avaliar a eficiência da reparação de danos do DNA nas linhas celulares, seguindo o IR como neste estudo, ou após a exposição a várias tensões na célula, desde o cruzamento de DNA até o bloqueio do garfo de replicação (uma lista de agentes nocivos ao DNA é fornecida na Tabela 1).

Figure 1
Figura 1: DNA quebra o fio duplo (DSB) caminhos de reparo.
O reparo do DSB envolve duas vias principais: Recombinação Homologous (RH, à esquerda) e End-Joining Não Homólogo (NHEJ, à direita). Após a quebra, as proteínas são ativadas para marcar a quebra (γH2AX), participar da ressecção final (MRN), revestir o ssDNA ressecado (pRPA), promover a recombinação (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) ou limitar a ressecção e promover o NHEJ (53BP1). Outras proteínas participam da reparação de danos, mas as proteínas listadas são rotineiramente seguidas por imunofluorescência indireta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Agente prejudicial ao DNA Mecanismo de ação Dose recomendada
raios-X Radiação
Formação de quebras duplas com alguns efeitos celulares descontrolados		 1-4 Gy
36 Íons ar Radiação
Formação de quebras duplas encalhadas		 270 keV/μm
α-partículas Radiação
Formação de quebras duplas encalhadas		 116 keV/μm
Bleomicina Inibidor da síntese de DNA 0.4-2 μg/mL
Camptothecin Inibidor de topoisomerase I 10-200 nM
Cisplatina Agente alquilante
(induzir intrastras e crosslinks)		 0,25-2 μM
Doxorrubicina Agente de intercalação
Inibidor de topoisomerase II		 10-200 nM
Etoposide Inibidor de topoisomerase II 10 μM
Hidroxiuréia Inibidor da síntese de DNA
(por reductase ribonucleotídeo)		 10-200 μM
Metano-metil Agente alquilante 0,25-2 mM
Mitomicina C Agente alquilante 0,25-2 μM
Luz ultravioleta (UV) Formação de dimers de timmidina
(gerando distorção da cadeia de DNA)		 50-100 mJ/cm2

Tabela 1: Agentes genotóxicos. Exemplos de agentes nocivos do DNA, seu mecanismo de ação e os danos induzidos com base na concentração de trabalho sugerida.

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Protocol

1. Cultura celular HeLa

  1. As tampas de vidro redondo pré-tratamento com 1 M HCl a 50 °C durante 16-18 horas. Enxágüe com ddH2O e armazene 100% EtOH.
  2. Prepare o meio de cultura celular: adicione 10% (v/v) FBS ao meio DMEM.
  3. Cresça 4,0 x 104 células/bem em placa estéril de 12 poços com uma tampa de vidro redonda de 18 mm a 37 °C e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada. Aumentar as células para 80% de confluência (aproximadamente 24 horas).

2. Tratamento celular com radiação (IR)

  1. Para induzir a formação de quebras de dois fios, exponha as células a 4 Gy γ-irradiação (controle: Sem irradiação, t=0). Na Célula Gama -40, isso corresponde a 4,54 min, a 0,815 Gy por minuto.
  2. Incubar células a 37 °C e 5% de CO2 em uma incubadora umidificada para o período de tempo adequado (pontos de tempo escolhidos aqui t=1, 2, 4, 16 h).

3. Extração nuclear e fixação celular

  1. Preparar soluções de estoque: 0,2 M PIPES (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M de sacarose, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).
  2. Prepare o tampão de extração nuclear (NEB): dissolver tubos de 10 mM (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) e 0,5% (v/v) Triton X-100 no ddH2O. Mix até dissolver completamente.
  3. Prepare 4% (v/v) paraformaldeído (PFA): dissolver 10 mL de solução aquosa PFA de 16% pfa em PBS de 30 mL. Misture até dissolver completamente.
  4. No momento apropriado (t=0, 1, 2, 4, 16 h), lave as células duas vezes com 1 mL de PBS. Remova completamente o PBS.
  5. Adicione 200 μL de NEB a cada poço para extração de núcleos celulares (citoplasma é degradado, apenas núcleo permanece)(Figura 2). Incubar por 2 minutos em temperatura ambiente e remover completamente.
    NOTA: Não exceda 2 minutos.

Figure 2
Figura 2: Extração nuclear.
Imagens representativas de células antes (esquerda) e extração nuclear pós (direita). O citoplasma deve ser digerido, mas a estrutura nuclear deve permanecer intacta após a extração (à direita). (A) ampliação de 20x; barra de escala = 20 μm e (B) 40x de ampliação; barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Lave as células com 1 mL de PBS. Remova completamente o PBS. Adicione PBS cuidadosamente, as células são muito frágeis nesta etapa.
  2. Adicione 200 μL de 4% (v/v) PFA a cada poço para fixação celular. Incubar por 10 minutos a 4 °C. Remova a PFA completamente.
  3. Adicione 1 mL de PBS.
    NOTA: As células podem ser armazenadas em PBS a 4 °C.

4. Mancha de imunofluorescência

  1. Prepare a solução de bloqueio: dissolva 5% de BSA (w/v) no PBS e adicione 0,3% (v/v) Triton X-100. Misture até dissolver completamente.
  2. Prepare o tampão de diluição: dissolva 1% de BSA (w/v) no PBS e adicione 0,3% (v/v) Triton X-100. Misture até dissolver completamente.
  3. Para o bloqueio, adicione 200 μL de solução de bloqueio a cada poço. Incubar por 2 horas em temperatura ambiente ou 16-18 horas a 4 °C.
    NOTA: Se o anticorpo de cabra for usado, adicione 5% de soro de cabra à solução de bloqueio.
  4. Diluir o anticorpo primário no tampão de diluição (1:500; ver tabela 2 para lista de anticorpos) e vórtice até ficar bem misturado.
    NOTA: Se for usado anticorpo de cabra, adicione 1% de soro de cabra ao tampão de diluição.
  5. Em uma caixa de umidade/incubação, adere a um pedaço de parafilm. Adicione 10 μL de anticorpo primário (em uma única gota). Alinhe uma borda da tampa com a gota e lentamente abaixe para o parafilme, para que o líquido se espalhe por toda parte (evite bolhas, se possível). Incubar por 2 horas em temperatura ambiente.
  6. A lavagem cobre deslizamentos três vezes em PBS por 1 minuto.
  7. Diluir anticorpo secundário no tampão de diluição (concentração final: 2 μg/mL) e vórtice até ficar bem misturado.
  8. Aplique 10 μL de anticorpo secundário conforme descrito para os anticorpos primários. Incubar por 2 horas em temperatura ambiente.
    NOTA: Proteja contra a luz.
Anticorpo Empresa Referência Fonte
53BP1 Sinalização celular 4937 Coelho
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150103 Burro
Anti-fosfo-Histone H2A. X (Ser139), clone JBW301 Miliporo 05-636 Mouse
Anti-Coelho IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150081 Cabra

Tabela 2: Anticorpos utilizados. Lista de anticorpos utilizados neste estudo.

  1. A lavagem cobre deslizamentos três vezes em PBS por 1 minuto.
  2. Lave as tampas com H2O por 1 minuto.
  3. Contra-reter DNA com DAPI: aplicar 10 μL de 300 nM DAPI (como descrito para anticorpos), incubar por 30 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, montar em lâmina de vidro com uma mídia de montagem baseada em glicerol. Alternativamente, adicione uma gota (10 μL) de mídia comercial de montagem antifade contendo DAPI em um slide e aplique um deslizamento de tampa. Pressione suavemente a mancha de cobertura e remova o excesso de fluido ao seu redor com uma toalha de papel.
  4. As tampas do selo com esmalte transparente e deixe-as secar por 20 minutos.
  5. Armazenar slides a 4 °C.

5. Aquisição de imagens

  1. Coloque uma gota de óleo de imersão na lente objetiva de 60x. Use DAPI para localizar os núcleos através da peça ocular.
    1. Para aquisição de imagens XYZ, software de aquisição aberto e parâmetros selecionados: Tipo de scanner: Galvano; Modo scanner: Ida e volta; Tamanho da imagem: 512×512; Modo PMT: VBF; Média pmt: quadro (4 vezes); Varredura sequencial pmt: linha.
    2. Selecione o corante e os detectores:
      Canal (CH1), Corante (DAPI), Detector (SD1)
      Canal (CH2), Corante (Alexa Fluor 488), Detector (HSD3)
      Canal (CH3), Corante (Alexa Fluor 647), Detector (HSD4)
    3. Selecione ON em "Z".
  2. Ajuste a imagem ao vivo. Pressione o botão Viver na janela Ao Vivo.
    1. Ajuste o foco e ajuste a intensidade do laser (%), sensibilidade (HV), ganho e deslocamento na janela da ferramenta "PMT".
      1. Ajuste a intensidade do laser (%): para brilho e branqueamento. Quanto maior a intensidade do laser, mais forte o sinal, mas o espécime irá fotobleach.
      2. Ajuste a sensibilidade (HV): nível de ruído. Quanto maior o HV, mais forte o sinal, mas a imagem será ruidosa se muito alta.
        NOTA: Mantenha sempre a tensão constante.
      3. Ajuste o deslocamento: nível de fundo.
    2. Selecione Start/End (15 fatias) para pilhas Z.
  3. Comece a aquisição.
    1. Selecione a pasta para salvar imagens. Pressione o botão LSM Start para começar a adquirir a imagem. Pressione o botão Series Done para concluir a aquisição da imagem.

6. Análise de dados

  1. Para análise de imagens, abra o software de análise.
    1. Pressione a janela da ferramenta Batch, selecione as imagens para analisar e selecione a pasta de saída.
    2. Pressione a janela da ferramenta Análise e selecione Projeção (exibirá a projeção de intensidade máxima de 15 fatias).
    3. Na configuração Entrada/Saída,selecione o lote criado.
    4. Pressione processo para que as imagens sejam processadas.
    5. Exportar imagens como arquivos .tiff.
  2. Para quantificação de focos nucleares, abra cellprofiler.
    1. Abra o pipeline de quantificação de focos γH2AX e 53BP1 (ver informações suplementares).
    2. Dados de gráficos usando um software de tabela.
  3. Para análise de co-localização, abra cellprofiler.
    1. Abra o gasoduto colocalização (ver informações suplementares). Um arquivo de planilha será criado e salvo no local preferido. No entanto, os gráficos em si não serão salvos automaticamente. Sugere-se tirar uma foto das janelas para manter o registro dos resultados.
    2. Dados de gráficos usando um software de tabela.

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Representative Results

No dia 2, ou 24 h postando células em tampas, as células sofreram uma divisão e são 80% confluentes. Derrubadas específicas ou mutações em proteínas de reparação de DNA podem aumentar o tempo de duplicação, ou sensibilizar as células para o tratamento genotoxico, e a densidade de semeadura, bem como as doses de tratamento devem ser ajustadas em conformidade. Para determinar as melhores condições de trabalho, o tempo da resposta aos danos no DNA pode ser estabelecido pela mancha ocidental de γH2AX ao longo do tempo, e a sensibilidade à irradiação pode ser identificada por um ensaio formador de colônias.

As células não tratadas com irradiação exibem pouco, se houver, focos γH2AX(Figura 3A). No entanto, a formação de focos γH2AX pode ser desencadeada em células cultivadas por várias tensões inerentes às condições de crescimento: células deixadas confluentes em mídia acidificada, presença de endotoxina genoóxica no FBS, concentração de oxigênio usada para a cultura, para citar algumas.

Figure 3
Figura 3: Focos nucleares sem estresse.
Na ausência de estressor externo, muito poucos se algum foco γH2AX for observado (A). Na ausência de proteínas essenciais de reparação de DNA, o acúmulo de γH2AX pode ser observado à medida que as quebras ocorridas devido a fontes endógenas não são reparadas (B). O acúmulo de quebras não reparadas pode levar as células a se tornarem pré-apoptóticas, que é marcada por uma coloração "sólida" dos núcleos γH2AX (C). Barra de escala = 5 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Além disso, em células esgotadas para proteínas de dano de DNA chave, como células mutantes BRCA1 ou BRCA2, quebras de DNA que ocorrem como resultado de estresses endógenos não são reparadas como em células do tipo selvagem, e se acumulam. Como resultado, o γH2AX elevado pode ser observado em células deficientes de RH, mesmo em condições normais de crescimento(Figura 3B). Uma subsumão de células pode apresentar coloração nuclear "sólida" com γH2AX(Figura 3C). A mancha pan-nuclear pode indicar que uma célula está sobrecarregada com danos além do reparo, e/ou é pré-apoptótica. Tais células são tipicamente caracterizadas por núcleos ampliados, e a presença de vacólos citoplasmados. Além disso, o γH2AX pode ser acionado por estresse replicativo na fase S e garfos de replicação paralisados, ou por prisão G2/M. Se necessário, as fases do ciclo celular podem ser identificadas colorindo o conteúdo do DNA ou co-manchando com marcadores específicos. Ao realizar a análise de reparação de danos de DNA, a pan-nuclear pode ser quantificada independentemente de focos individualizados.

Após a irradiação, os núcleos exibem um grande número de quebras duplas de fios para as quais γH2AX localiza extremamente rapidamente(Figura 4). Em condições ideais, poucos se algum foco γH2AX for observado na ausência de irradiação. Após a irradiação, a formação de focos γH2AX aumenta acentuadamente. Se as quebras forem processadas e reparadas, a contagem de focos por núcleos é diminuída, assim como o número de células positivas para focos. A intensidade e o número de focos variam dependendo da linha celular utilizada e da dose de irradiação entregue. Em baixa passagem as células HeLa, cultivadas em soro livre de endotoxinas, observamos rotineiramente um aumento acentuado de focos em 30 minutos e 1 h pós irradiação, que atinge picos entre 1 e 2 h, depois diminui progressivamente até 16 h. Por essa razão, são apresentados pontos de tempo representativos em 0, 1, 2, 4 e 16 h pós irradiação. O comportamento da sinalização de ruptura, reparação e sobrevivência à irradiação pode variar muito entre as linhas celulares, bem como sobre o esgotamento ou mutação dos genes. Por essa razão, os pontos de tempo mais apropriados serão experimentados e dependentes de células. No experimento, às 16 h γH2AX os focos residuais atingiram o mesmo nível basal que as células não irradiadas. O monitoramento dos focos residuais para incluir pontos de tempo posteriores é sugerido se trabalhar com linhas celulares divididas lentamente.

Figure 4
Figura 4: Focos nucleares e quantificação após estresse (tempo-curso).
formação de focos γH2AX em t=0 (sem irradiação) e nos pontos de tempo indicados pós irradiação (4 Gy, t=1, 2, 4, 16 h). (A) Imagens representativas são mostradas. DAPI indica os núcleos. Barra de escala = 5 μm. (B) Os focos nucleares de γH2AX após a exposição à irradiação γ foram pontuados por quantificação automatizada (CellProfiler) em ≥ 100 núcleos para cada ponto de tempo. Dependendo da questão biológica levantada e do tipo de dados adquiridos, diferentes opções estão disponíveis para apresentar os dados brutos, a fim de facilitar a comparação e a compreensão crítica. (i) Gráfico de nuvem mostra média ± SD. Símbolo (*) indica significância estatística relativa ao controle, utilizando o teste t-t de duas caudas do aluno: *** p ≤ 0,0001, (ii) curva de indução mostra média ± SEM, (iii) mais de 10 focos por núcleo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Por outro lado, em células deficientes para funções de reparação de danos de DNA, os focos γH2AX acumulam-se na ausência de irradiação (t=0 h) e o reparo pode ser atrasado, ou ausente mesmo em longos pontos de tempo (t=16 h, t=24 h) pós irradiação. A comparação direta entre células selvagens e mutantes pode dar informações preciosas sobre a função de reparação de DNA do gene mutado, e sugerir o tipo de reparo. Embora uma deficiência no NHEJ possa forçar a quebra a ser reparada pelo RH em fase S, os DSBs que foram ressecados e devem ser reparados pelo RH não serão reparados pelo NHEJ. Por essa razão, o acúmulo de danos pós-fase S pode indicar uma deficiência de RH, e os altos níveis de γH2AX pós-divisão sugerem defeitos NHEJ.

Quando várias proteínas são investigadas nas mesmas células, a co-localização pode ser estudada por multiplexar anticorpos primários criados em diferentes espécies animais e revelá-los com anticorpos secundários rotulados com fluoroforos distintos(Figura 5). A co-localização indica se as proteínas (i) são recrutadas para o intervalo (ii) são recrutadas em tempo hábil, (iii) montagem em complexos de reparação de DNA. Ao procurar a co-localização, um método qualitativo comumente aceito é apresentar resultados como uma simples sobreposição dos diferentes canais (ou seja, verde e vermelho). A superposição de verde e vermelho dará origem a hotspots amarelos, onde as duas proteínas de interesse estão presentes nos mesmos pixels(Figura 5A). No entanto, este método tem limitações, uma vez que depende da intensidade relativa do sinal coletada em ambos os canais, e os dois fluorochromes podem ter diferenças na força do sinal. Portanto, os métodos de sobreposição ajudam a gerar uma estimativa visual de eventos de co-localização, mas não são apropriados para fins quantitativos. A análise quantitativa da co-localização pode ser alcançada por uma abordagem baseada em objetos (Figura 5B (i-iii) ou por uma abordagem estatística que realize uma análise baseada em coeficiente de correlação de intensidade (ICCB)(Figura 5B (iv)). Várias ferramentas para análise de co-localização estão disponíveis, incluindo o JACoP (Just Another Co-localization Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) e o pipeline "Colocalization" (CellProfiler) utilizado aqui, que pode ser usado como uma ferramenta ICCB, a fim de avaliar a relação entre as intensidades de fluorescência. Isso é feito principalmente pelo cálculo do coeficiente de correlação (coeficiente de Pearson) que mede a força da relação linear entre duas variáveis. A co-localização da fluorescência pode ser representada graficamente em parcelas de dispersão, onde a intensidade de um fluorocromo (verde) é plotada contra a intensidade do segundo fluorocromo (vermelho) para cada pixel. A co-localização completa resulta em pontos agrupados em torno de uma linha reta, cuja inclinação reflete a razão da fluorescência das duas cores. Pelo contrário, a falta de co-localização resulta na distribuição de pontos em dois grupos separados (distribuídos ao longo dos eixos), cada um mostrando níveis de sinal variados de uma cor com pouco ou nenhum sinal da outra cor. O valor do coeficiente de Pearson varia de 1 a -1, sendo 1 em posição de correlação positiva completa, -1 para correlação negativa e zero sem correlação. Alternativamente, o método Pclc pode ser usado. Este método foi aplicado em uma variedade de radiações (ver36 para obter detalhes e método livremente disponível).

Figure 5
Figura 5: Análise de co-localização.
Usando vários anticorpos criados contra diferentes espécies (aqui, anti-rato γH2AX (vermelho) e anti-coelho 53BP1 (verde),várias proteínas podem ser investigadas. (A) Imagens representativas são mostradas. DAPI indica os núcleos. A co-localização é visualizada por sobreposição de cor e área (aqui vermelho + verde = amarelo). Barra de escala = 5 μm. (B) Os focos individuais e co-localizadores podem ser quantificados individualmente usando um dos vários softwares (aqui, CellProfiler, ver outras opções no texto principal) e plotados. (i-iii) Abordagem baseada em objetos utilizada para determinar os resultados de correlação de co-localização (iv) obtidos para a co-localização, usando uma abordagem baseada em pixels (análise ICCB). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A análise do tempo e eficiência do reparo de danos no DNA por microscopia tem se mostrado essencial para entender como funciona o maquinário de reparação de DNA, em células normais e em patologias humanas como o câncer.

O desenvolvimento de anticorpos específicos que permitem a detecção de proteínas ativadas em sua versão fosfoilada (como γH2AX, pRPA, pRAD50 e outros10,23,39,43) tem desempenhado um papel central na obtenção de uma melhor compreensão do tempo de reparação do DNA dos eventos e sua sincronização com o ciclo celular. Esse sucesso é exemplificado pela análise de resíduos fosforilados de 53BP1, por espectrometria de massa e imunolocalização (ver32 para revisão), o que ajudou a entender a função dessa proteína fortemente modificada. Com a ascensão da técnica microscópica de alta resolução, como o STORM e o aumento do uso de pequenos anticorpos (nano corpos) a interação direta de proteína nas células está se tornando mais acessível e precisa. No entanto, a imunofluorescência indireta como descrito aqui continua sendo um experimento essencial a ser realizado ao investigar uma nova proteína potencial de reparação de DNA e procurar o tempo de ação e parceiros proteicos.

O sucesso da imunofluorescência indireta repousa inteiramente em dois critérios: (i) a qualidade dos reagentes – especialmente anticorpos usados para detectar resíduos de fosfo em proteínas ativadas de reparação de DNA, e (ii) o tempo do experimento. O uso de protocolos e anticorpos publicados deve ser encorajado quando disponível. Ao usar um novo anticorpo ou investigar uma nova proteína, o anticorpo deve ser validado, e a especificidade deve ser estabelecida por derrubar a proteína alvo nas células (o sinal deve ser perdido) ou esgotamento de proteína (uso de proteína purificada para esgotar anticorpos específicos antes da incubação, como realizado em44 para RAD51AP1).

As condições ideais de bloqueio e diluição de anticorpos devem ser estabelecidas para minimizar artefatos e manchas não específicas. Os buffers serão preparados frescos e, se a extração nuclear for realizada, deve ser cronometrado para evitar danificar núcleos. Na investigação da eficiência de reparo em células humanas, a quantificação de focos nucleares deve ser realizada, e a extração nuclear pode ajudar na exclusão de proteínas citoplasmáticas. No entanto, pode ser benéfico não realizar a etapa de extração nuclear, por exemplo, investigar se uma proteína mutante suspeita de não interagir com seu parceiro celular não consegue se translocar para o núcleo após danos no DNA.

Além disso, a qualidade da imagem é de suma importância para garantir que os dados possam ser devidamente adquiridos, analisados e dados precisos plotados. Parâmetros para controlar são muitos e incluem: especificidade dos anticorpos primários, espectro de excitação dos fluoroforos escolhidos (anticorpos secundários), proteção de amostras contra fotobleaching, escolha de apoio para células de semeadura, boa amostragem (mínimo de 30 a 300 núcleos, dependendo da questão), e em alguns casos pós-tratamento, como desconvolução ou não-mistura espectral. Quando possível, é sugerida uma imagem automatizada de um deslizamento completo, que permite que milhares de células sejam imagens. Envolver especialistas em imagem, como uma instalação central antes da montagem do experimento, deve ser considerado, pois melhorará muito a qualidade dos resultados.

Por último, com base nas linhas celulares utilizadas, o tratamento realizado e as proteínas investigadas, os níveis basais de focos podem variar muito e dificultar a interpretação dos resultados. Por essa razão, é importante que os dados brutos seja resumido, processado, analisado e apresentado em um formato efetivo, a uma luz que os leitores possam entender; facilitando a comparação e revelando tendências e relacionamentos dentro dos dados. Na Figura 4B,a mesma quantificação de focos é traçada em três versões separadas: (i) número total de focos (gráfico de nuvens) após DSBs induzidos por irradiação (ii) indução de focos ao longo do tempo -cinética- (iii) % de células positivas (>10 focos/núcleo).

As parcelas em nuvem devem ser preferidas sempre que possível(Figura 4B (i)) pois mostram todos os pontos de dados sem discriminação e, portanto, oferecem a visão geral mais abrangente do experimento. No entanto, traçar informações mais seletivas e relevantes, como o número de células positivas acima de um fundo arbitrário cortado (5 focos na maioria das linhas celulares), o número de focos co-localizando, indução de focos ao longo do tempo ou medição de qualidade dos focos, como tamanho ou intensidade de pixel, pode ser mais apropriado em alguns casos, e é responsabilidade dos autores.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação De San Antonio. O Mays Cancer Center é apoiado pelo núcleo de apoio ao centro de câncer NCI P30 CA054174. Gostaríamos de agradecer a Stephen Holloway por sua ajuda para fornecer os reagentes, e o laboratório Sung para fornecer espaço e capacidade de microscopia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

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References

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de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

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