Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التصور من الحمض النووي إصلاح البروتينات التفاعل من قبل immunofluorescence

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61447
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

Summary

بعد تلف الحمض النووي، تقوم الخلايا البشرية بتنشيط مسارات الإصلاح الأساسية لاستعادة سلامة جينومها. هنا، نحن وصف طريقة من المناعة غير المباشرةflufluorescence كوسيلة للكشف عن البروتينات إصلاح الحمض النووي، وتحليل توظيفها المكانية والزمانية، والمساعدة في استجواب التفاعل البروتين البروتيني في مواقع الضرر الحمض النووي.

Abstract

تتعرض خلايا الثدييات باستمرار للمواد الكيميائية والإشعاعات والمنتجات الثانوية الأيضية التي تحدث بشكل طبيعي ، والتي تخلق أنواعًا محددة من إهانات الحمض النووي. يمكن أن تضر العوامل السامة جينيًا العمود الفقري للحمض النووي أو تكسره أو تعدل الطبيعة الكيميائية للقواعد الفردية. بعد إهانة الحمض النووي، يتم تنشيط مسارات الاستجابة لتلف الحمض النووي (DDR) ويتم تجنيد البروتينات المشاركة في الإصلاح. وتشارك مجموعة كبيرة من العوامل في استشعار نوع الضرر وتفعيل استجابة الإصلاح المناسبة. يمكن أن يؤدي الفشل في تنشيط وتوظيف عوامل نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج بشكل صحيح إلى عدم الاستقرار الجينومي ، الذي يكمن وراء العديد من الأمراض البشرية بما في ذلك السرطان. ويمكن أن توفر دراسات بروتينات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج رؤى في الاستجابة للأدوية السمية الجينية والآليات الخلوية لمقاومة الأدوية.

هناك طريقتان رئيسيتان لتصور البروتينات في الجسم الحي:المراقبة المباشرة، عن طريق وضع علامات على البروتين الذي يهمك مع بروتين الفلورسنت واتباعه عن طريق التصوير الحي، أو الفلوروسين غير المباشر على عينات ثابتة. في حين أن التصور من البروتينات الموسومة الفلورسنت يسمح الرصد الدقيق مع مرور الوقت، ووضع علامات مباشرة في N- أو C-terminus يمكن أن تتداخل مع توطين البروتين أو وظيفة. ويفضل مراقبة البروتينات في إصدارها غير المعدلة، الذاتية. عندما يتم تجنيد البروتينات إصلاح الحمض النووي لإهانة الحمض النووي، وزيادة تركيزها محليا، وأنها تشكل مجموعات، أو "بؤر"، التي يمكن تصورها من قبل immunofluorescence غير مباشر باستخدام أجسام مضادة محددة.

على الرغم من أن الكشف عن بؤر البروتين لا يقدم دليلا قاطعا على التفاعل المباشر، فإن التعريب المشترك للبروتينات في الخلايا يشير إلى أنها تجمع إلى موقع الضرر ويمكن أن تبلغ عن تسلسل الأحداث المطلوبة لتشكيل معقد. تحليل دقيق للتراكب المكاني البؤري في الخلايا التي تعبر عن النوع البري أو الإصدارات المتحولة من البروتين يمكن أن توفر أدلة ثمينة على المجالات الوظيفية الهامة لوظيفة إصلاح الحمض النووي. وأخيراً، يشير التعريب المشترك للبروتينات إلى التفاعلات المباشرة المحتملة التي يمكن التحقق منها عن طريق المشاركة في المناعة في الخلايا، أو السحب المباشر باستخدام البروتينات النقية.

Introduction

تتعرض الخلايا البشرية باستمرار لمجموعة متنوعة من العوامل الضارة الحمض النووي من أصول مختلفة. المصادر الخارجية تتكون في الغالب من التعرض للإشعاعات والمواد الكيميائية (بما في ذلك العوامل العلاجية الكيميائية وبعض المضادات الحيوية) والفيروسات، في حين أن المصادر الذاتية الرئيسية تشمل أخطاء في تكرار الحمض النووي والإجهاد التأ المؤدّس. ويمكن أن تتراوح الآثار المباشرة للتعرض للسمية الجينية من قاعدة معدلة إلى كسر مزدوج حبل الحمض النووي القاتل المحتمل ، اعتمادا على الإجهاد وجرعة التعرض. في نهاية المطاف، يمكن أن يؤدي تلف الحمض النووي غير المصلح أو غير إصلاحه إلى تراكم الطفرات وإعادة ترتيب الجينوم وعدم استقرار الجينوم ويؤدي في نهاية المطاف إلى الإصابة بالسرطان1. وقد تطورت خلايا الثدييات مسارات معقدة للتعرف على أنواع محددة من الضرر الحمض النووي2,3 وإصلاحها في الوقت المناسب, تزامن مع تطور دورة الخلية.

الإشعاع المؤين (IR) يضر الحلزون المزدوج الحمض النووي ويخلق فواصل حبلا مزدوج (DSBs)، واحدة من أكثر أشكال الضرر الضارة الحمض النووي. وMN (MRE11، RAD50، NBS1) وظائف معقدة كمستشعر من ينتهي الحمض النووي وينشط كيناز البروتين ترنح تيلانغيكتسيا تحور (ATM)4،5. بعد التنشيط الأولي من أجهزة الصراف الآلي من قبل ينتهي الحمض النووي، أجهزة الصراف الآلي يؤدي سلسلة من الأحداث DDR في موقع الاستراحة، والشروع مع حدث رئيسي، وفسفورل من البديل هيستون H2AX6. H2AX الفوسفور على بقايا S139 ينشط في γH2AX ، تمتد المناطق حتى megabases حول آفة الحمض النووي6،7،8،9. هذا الحدث يزيد من إمكانية الحصول على الحمض النووي، مما يؤدي إلى تجنيد وتراكم البروتينات إصلاح الحمض النووي الأخرى7. لأن γH2AX هو بزفير وعلى وجه التحديد المستحثة DSBs المحيطة، فإنه يمكن تصور بسهولة باستخدام أجسام مضادة محددة، ويستخدم عادة كعلامة بديلة لDSBs في مجال إصلاح الحمض النووي. بمجرد الإشارة إلى الكسر ، تقوم الخلايا بتنشيط مسارات إصلاح الحمض النووي ومعالجة تلف الحمض النووي. البروتين MDC1 (وسيط الحمض النووي الضرر نقطة تفتيش البروتين 1) يربط مباشرة γH2AX10, يتفاعل مع أجهزة الصراف الآلي11 وأيضا مع NBS112,13. وهو يساهم في زيادة تركيز مركب MRN في DSB وبدء حلقة تغذية مرتدة إيجابية الصراف الآلي. تتم إزالة γH2AX بسرعة بمجرد إصلاح الكسر ، وبالتالي ، مما يسمح بمراقبة إزالة DSB. تليها المجهر، وانخفاض في γH2AX مع مرور الوقت يوفر قياس غير مباشر من فواصل المتبقية وكفاءة إصلاح الحمض النووي.

يمكن للخلايا النوى إصلاح DSBs من قبل عدة مسارات، وهما الرئيسية التي يجري غير متجانسة نهاية الانضمام (NHEJ) وإعادة التركيب المتماثل (الموارد البشرية) (الشكل 1). NHEJ أساسا ربط الحمض النووي مزدوجة حبلا ينتهي دون استخدام homology الموسعة وتعمل في جميع أنحاء دورة الخلية14،15. الموارد البشرية تصبح الغالبة خلال مراحل S و G2 ، وقمعها على خلاف ذلك ، لأنه يتطلب chromatid الشقيقة كقالب متجانس لإصلاح14،16. اختيار المسار بين NHEJ و الموارد البشرية لا يعتمد فقط على القرب المادي من الكروماتيد الشقيقة، ولكن أيضا على تمديد استئصال نهاية الحمض النووي17، مما يمنع NHEJ.

إصلاح DSB المعتمد على Homology يبدأ عن طريق التحلل النووي من حبلا 5 'من ينتهي الكسر لتوليد 3 'واحد حبلا الحمض النووي (ssDNA) ذيول، وهي عملية يشار إليها باسم 5 '-3' استئصال. مجمع MRN يبدأ استئصال نهاية الحمض النووي ويتم معالجة مزيد من استئصال في تركيبة مع BLM /EXO1 (بلوم متلازمة البروتين / exonuclease 1) أو BLM / DNA2 (الحمض النووي النسخ المتماثل ATP- تعتمد على helicase/nuclease)18,19,20,21,22. يتم تعزيز استئصال الحمض النووي نهاية بواسطة CtIP (CtBP التفاعل البروتين) من خلال تفاعلها المباشر مع MRN مجمع23 وتجنيد BRCA1 (سرطان الثدي نوع 1 البروتين القابلية للحساسية)24,25. بروتين النسخ المتماثل A (RPA) يربط على الفور إلى ssDNA يتعرض ومن ثم يتم إزاحة من قبل البروتين إعادة الكومبيناز RAD51 لتشكيل خيوط البروتين النووي الذي يحفز البحث المتجانسة وغزو حبلا26،27،28.

بدء عملية استئصال هو خطوة حاسمة لإصلاح المسار الاختيار. مرة واحدة وقد بدأت استئصال, ينتهي الحمض النووي تصبح ركائز الفقراء للربط بواسطة ku70/Ku80 heterodimer (مكون من مسار NHEJ) وتلتزم الخلايا إلى الموارد البشرية17,29,30. وKu70/Ku80 هيتيروديمر يربط إلى ينتهي DSB, تجنيد الحمض النووي-PKcs وp53 البروتين ملزمة 1 (53BP1)29,30. 53BP1 بمثابة حاجز للتشفط في G1، وبالتالي منع الموارد البشرية في حين تعزيز NHEJ31،32، ولكن تتم إزالته بطريقة BRCA1 تعتمد في المرحلة S، وبالتالي السماح للتشفط أن يحدث33،34. ولذلك، 53BP1 و BRCA1 تلعب أدوارا متعارضة في إصلاح DSB، مع 53BP1 كونه ميسر NHEJ في حين BRCA1 أعمال تمكين فواصل لإصلاح من خلال الموارد البشرية.

في المختبر، يمكن أن يكون سبب تكوين DSB الإشعاع المؤين (IR). في حين أن هذا المثال يستخدم جرعة عالية من 4 Gy، 1 غي و 2 غي أيضا إنشاء كمية كبيرة من DSBs، ومناسبة لتحليل تشكيل بؤر بواسطة البروتينات وفيرة. من المهم أن نلاحظ أن نوع وجرعة الإشعاع المستخدمة يمكن أن تؤدي إلى آفات مختلفة في الحمض النووي وفي الخلية: في حين أن الأشعة تحت الحمراء تحفز DSBs، يمكن أن تسبب أيضا فواصل حبلا واحد أو تعديل قاعدة (انظر35،,36 للاطلاع على مرجع على نقل الطاقة الخطي المشع (LET) ونوع الضرر الحمض النووي). لتحديد الحركية من المؤينة الناجمة عن الإشعاع تشكيل بؤر (IRIF) وإزالتها، والتي تشير إلى إصلاح الضرر وعكس من DDR تنشيط8،9،37،38، ويمكن رصد تشكيل بؤر في نقاط زمنية مختلفة بعد الإشعاع المؤين. ومن المعروف توقيت التنشيط وإزالة جميع البروتينات الضرر الحمض النووي الرئيسية39, ويتم التحقيق في العديد من علامات بديلة للأحداث الرئيسية. على سبيل المثال، pRPA، التي تمتلك تقارب عالية لSSDNA يستخدم كبديل للاستئصال كسر، يمكن استخدام البروتينات MRN (MRE11، RAD50، NBS1) والإفلات من الدهون لتقييم كفاءة استئصال أيضا. في حين RAD51، BRCA1، BRCA2 (سرطان الثدي نوع 2 البروتين القابلة للحساسية)، وPALB2 (شريك و localizer من BRCA2) يمكن رصدها لتقييم كفاءة الموارد البشرية، ووجود بروتينات كو أو 53BP1، وتستخدم كعلامات من NHEJ (الشكل 1).

كما البروتينات من آلات إصلاح الحمض النووي تجنيد بعضها البعض لكسر والتجمع في مجمعات فائقة، يمكن الاستدلال على التفاعلات الحمض النووي البروتين والبروتين من خلال اتباع التعريب الفردية مع مرور الوقت وتحليل التعريب المشترك للبروتينات، كما تصورها إشارات متداخلة في الخلية40،41،42. في خطوط الخلايا، يسمح إدخال طفرات نقطة أو حذف في جينات إصلاح الحمض النووي المحددة إما من خلال تحرير الجينوم، أو عن طريق التعبير الزائد عن مسوخ البلازميد، بالتحقيق في بقايا محددة ودورها المحتمل في التعرف على تلف الحمض النووي (على سبيل المثال، التعريب المشترك مع γH2AX) أو التجميع المعقد (التعريب المشترك مع بروتينات أخرى أو عدة)، فضلاً عن تأثيرها على إصلاح الحمض النووي. هنا، نستخدم الفلورا المناعية غير المباشرة كوسيلة للتحقيق في تشكيل وحل DSBs باتباع بؤر γH2AX مع مرور الوقت. كما نقدم مثالاً واحداً على تشكيل البؤر وتحليل التعريب المشترك من قبل لاعب رئيسي في إصلاح DSB: p53 ملزمة البروتين 1 (53BP1)32. كما ذكر سابقا، يعتبر 53BP1 مركزية لإصلاح الحمض النووي اختيار المسار. بعد تراكم 53BP1 وتوطينه المشترك مع γH2AX يوفر معلومات ثمينة عن مرحلة دورة الخلية ، وتراكم تلف الحمض النووي ، والمسار المستخدم لإصلاح DSBs. الغرض من تخصيص المناعة غير المباشرة هو تقييم كفاءة إصلاح تلف الحمض النووي في خطوط الخلايا ، بعد الأشعة تحت الحمراء كما في هذه الدراسة ، أو بعد التعرض لضغوط مختلفة في الخلية ، من ربط الحمض النووي إلى انسداد شوكة النسخ المتماثل (يتم توفير قائمة من العوامل الضارة للحمض النووي في الجدول 1).

Figure 1
الشكل 1: فواصل الحمض النووي المزدوجة فواصل (DSB) مسارات الإصلاح.
إصلاح DSB ينطوي على مسارين رئيسيين: إعادة التركيب المتماثل (HR, اليسار) وغير متجانسة نهاية-صلة (NHEJ, حق). بعد الاستراحة، يتم تنشيط البروتينات للاحتفال بالكسر (γH2AX)، والمشاركة في استئصال نهاية (MRN)، أو معطف SsDNA (pRPA)، والترويج لإعادة الكومبونيشن (BRCA1، PALB2، BRCA2، RAD51) أو الحد من استئصال وترقية NHEJ (53BP1). البروتينات الأخرى المشاركة في إصلاح الضرر، ولكن البروتينات المذكورة تليها بشكل روتيني مناعي غير مباشر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عامل إتلاف الحمض النووي آلية العمل الجرعة الموصى بها
γ أشعة / الأشعة السينية الاشعاع
تشكيل فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل مع بعض الآثار الخلوية غير المنضبط		 1-4 غي
36 آر أيونات الاشعاع
تشكيل فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل		 270 كيلو متر/ميكرومتر
α-الجسيمات الاشعاع
تشكيل فواصل مزدوجة تقطعت بها السبل		 116 كيلو/ميكرومتر
بلوميسين مثبط تخليق الحمض النووي 0.4-2 ميكروغرام/مل
كامبتويثسين مثبط توبواomerase الأول 10-200 nM
سيسبلاتين وكيل Alkylating
(تحريض الروابط المتقاطعة داخل العلامة التجارية)		 0.25-2 ميكرومتر
دوكسوروبسين عامل المعايرة البينية
مثبطات توبواomerase II		 10-200 nM
إيتوبوسيد مثبطات توبواomerase II 10 ميكرومتر
هيدروكسي يوريا مثبط تخليق الحمض النووي
(بواسطة ريبونوكليوتيد الاستئصال)		 10-200 ميكرومتر
ميثيل الميثان وكيل Alkylating 0.25-2 mM
ميتوميسين سي وكيل Alkylating 0.25-2 ميكرومتر
الأشعة فوق البنفسجية (UV) الخفيفة تشكيل خافمات الثيميدين
(توليد تشويه من سلسلة الحمض النووي)		 50-100 mJ / سم2

الجدول 1: العوامل السمية الجينية أمثلة على عوامل إتلاف الحمض النووي، وآلية عملها والأضرار الناجمة عن ذلك استناداً إلى التركيز المقترح للعمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية HeLa ثقافة

  1. قبل علاج يغطي الزجاج المستدير مع 1 M HCl في 50 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة. شطف مع ddH2O وتخزينها في EtOH 100٪.
  2. إعداد خلية ثقافة المتوسطة: إضافة 10٪ (v/v) FBS إلى متوسط DMEM.
  3. تنمو 4.0 × 104 خلايا / جيدا في لوحة معقمة 12-well مع غطاء زجاجي مستدير 18 ملم في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة مرطبة. تنمو الخلايا إلى 80٪ التقاء (ما يقرب من 24 ساعة).

2. معالجة الخلايا مع الإشعاع (IR)

  1. للحث على تشكيل فواصل مزدوجة حبلا، وفضح الخلايا إلى 4 غي γ-تشعيع (السيطرة: لا تشعيع، t = 0). في خلية غاما -40، وهذا يتوافق مع 4.54 دقيقة، في 0.815 غي لكل دقيقة.
  2. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في حاضنة مرطبة لطول الوقت المناسب (نقاط زمنية مختارة هنا t= 1، 2، 4، 16 h).

3- الاستخراج النووي و تثبيت الخلايا

  1. إعداد حلول الأسهم: 0.2 M PIPES (pH 6.8)، 5 M NaCl، 2 M سكروز، 1 M MgCl2، 0.1 M EGTA (pH 8.0).
  2. إعداد العازلة استخراج النووية (NEB): حل 10 mM PIPES (pH 6.8)، 100 mM NaCl، 300 mM السكروز، 3 mM MgCl2،1 mM EGTA (pH 8.0) و 0.5٪ (v/v) Triton X-100 في DdH2O. ميكس حتى يذوب تماما.
  3. إعداد 4٪ (v/v) شبهformaldehyde (PFA): تذوب 10 مل من 16٪ PFA محلول مائي في PBS 30 مل. تخلط حتى يذوب تماما.
  4. عند نقطة زمنية مناسبة (t = 0، 1، 2، 4، 16 h)، وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني تماما.
  5. إضافة 200 μL من NEB إلى كل بئر لاستخراج نواة الخلية (تحلل السيتوبلازم، يبقى نواة فقط) (الشكل 2). احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وإزالة تماما.
    ملاحظة: لا تتجاوز دقيقتين.

Figure 2
الشكل 2: الاستخراج النووي.
صور تمثيلية للخلايا قبل (اليسار) والناشر (يمين) استخراج نووي. وينبغي هضم السيتوبلازم ولكن ينبغي أن يظل الهيكل النووي سليماً بعد الاستخراج (يمين). (أ) 20x التكبير؛ شريط مقياس = 20 ميكرومتر و (ب) 40x التكبير؛ شريط مقياس = 10 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. غسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني تماما. إضافة برنامج تلفزيوني بعناية، والخلايا هشة جدا في هذه الخطوة.
  2. إضافة 200 μL من 4٪ (v/v) PFA إلى كل بئر لتثبيت الخلايا. احتضان لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية. إزالة PFA تماما.
  3. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا في برنامج تلفزيوني عند 4 درجة مئوية.

4. وصمة المناعة

  1. إعداد حل حجب: حل 5٪ BSA (ث / الخامس) في برنامج تلفزيوني وإضافة 0.3٪ (v/v) تريتون X-100. تخلط حتى يذوب تماما.
  2. إعداد العازلة التخفيف: حل 1٪ BSA (ث / الخامس) في برنامج تلفزيوني وإضافة 0.3٪ (v/v) تريتون X-100. تخلط حتى يذوب تماما.
  3. للحظر، أضف 200 ميكرولتر من محلول الحجب إلى كل بئر. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو 16-18 ساعة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا سيتم استخدام الأجسام المضادة الماعز، إضافة مصل الماعز 5٪ إلى حل حظر.
  4. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في عازلة التخفيف (1:500؛ انظر الجدول 2 لقائمة الأجسام المضادة) ودوامة حتى مختلطة جيدا.
    ملاحظة: إذا تم استخدام الأجسام المضادة الماعز، إضافة 1٪ مصل الماعز إلى العازلة التخفيف.
  5. في علبة الرطوبة/الحضانة، التزم بقطعة من البارا فيلم. أضف 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (في قطرة واحدة). محاذاة حافة واحدة من الغطاء مع قطرة وانخفاض ببطء على parafilm، السائل لتنتشر في جميع أنحاء (تجنب فقاعات إذا كان ذلك ممكنا). احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل يغطي ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 1 دقيقة.
  7. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في العازلة التخفيف (التركيز النهائي: 2 ميكروغرام / مل) ودوامة حتى مختلطة جيدا.
  8. تطبيق 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية كما هو موضح للأجسام المضادة الأولية. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: حماية من الضوء.
جسم الشركه مرجع مصدر
53BP1 إشارة الخلية 4937 الارنب
مكافحة ماوس IgG H & L (اليكسا فلور 647) Abcam ab150103 الحمار
مضاد للفوسفو-هيستون H2A. X (Ser139)، استنساخ JBW301 ميليبور 05-636 الماوس
مكافحة الأرنب IgG H & L (اليكسا فلور 488) Abcam ab150081 الماعز

الجدول 2: الأجسام المضادة المستخدمة. قائمة الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة.

  1. غسل يغطي ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 1 دقيقة.
  2. غسل الأغطية مع H2O لمدة 1 دقيقة.
  3. الحمض النووي المضاد مع DAPI: تطبيق 10 ميكرولتر من 300 NM DAPI (كما هو موضح للأجسام المضادة)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم جبل على الشريحة الزجاجية مع وسائل الإعلام تصاعد الجلسرين القائمة. بدلاً من ذلك، إضافة قطرة واحدة (10 ميكرولتر) من الوسائط التجارية المتصاعدة antifade التي تحتوي على DAPI على شريحة وتطبيق غطاء. اضغط بلطف على غطاء الغطاء وأزل السوائل الزائدة حوله بمنشفة ورقية.
  4. يغطي الختم مع طلاء الأظافر شفافة والسماح لهم الجافة لمدة 20 دقيقة.
  5. تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية.

5. الحصول على صورة

  1. ضع قطرة من زيت الغمر على العدسة الهدف 60x. استخدام DAPI لتحديد موقع النوى من خلال قطعة العين.
    1. للحصول على صورة XYZ، فتح اقتناء البرمجيات وتحديد المعلمات: نوع الماسح الضوئي: غالفانو؛ وضع الماسح الضوئي: دائري؛ حجم الصورة: 512×512; وضع PMT: VBF; متوسط PMT: الإطار (4 مرات)؛ PMT فحص متسلسل: خط.
    2. حدد الصبغة وأجهزة الكشف:
      قناة (CH1)، صبغ (DAPI)، كاشف (SD1)
      قناة (CH2)، صبغ (اليكسا فلور 488)، كاشف (HSD3)
      قناة (CH3)، صبغ (اليكسا فلور 647)، كاشف (HSD4)
    3. حدد ON في "Z".
  2. ضبط الصورة الحية. اضغط على الزر Live في إطار Live.
    1. ضبط التركيز وتعيين كثافة الليزر (٪)، والحساسية (HV)، والحصول على وموازنة على "PMT" نافذة أداة.
      1. ضبط كثافة الليزر (٪): للسطوع والتبييض. كلما زادت كثافة الليزر ، كلما كانت الإشارة أقوى ، ولكن العينة سوف photobleach.
      2. ضبط حساسية (HV): مستوى الضوضاء. كلما ارتفع HV ، كلما كانت الإشارة أقوى ، ولكن الصورة ستكون صاخبة إذا كانت عالية جدًا.
        ملاحظة: دائما الحفاظ على الجهد ثابت.
      3. ضبط الإزاحة: مستوى الخلفية.
    2. حدد البدء/النهاية (15 شريحة)، للرصاصات Z.
  3. ابدأ عملية الاستحواذ.
    1. حدد المجلد لحفظ الصور. اضغط الزر ابدأ LSM لبدء الحصول على الصورة. اضغط على الزر سلسلة تم لإكمال الحصول على الصورة.

6 - تحليل البيانات

  1. لتحليل الصور، افتح برنامج التحليل.
    1. اضغط على نافذة أداة الدفعة، حدد الصور لتحليل وتحديد مجلد الإخراج.
    2. اضغط على نافذة أداة التحليل وحدد الإسقاط (سيعرض إسقاط الحد الأقصى للكثافة من 15 شريحة).
    3. ضمن إعداد الإدخال/الإخراج، حدد المجموعة التي تم إنشاؤها.
    4. اضغط على العملية من أجل معالجة الصور.
    5. تصدير الصور كملفات .tiff.
  2. بالنسبة إلى القياس الكمي لـ foci النووي، افتح CellProfiler.
    1. فتح خط أنابيب γH2AX و 53BP1 foci quantification (انظر المعلومات التكميلية).
    2. بيانات الرسم البياني باستخدام برنامج جدول.
  3. لتحليل التعريب المشترك، افتح CellProfiler.
    1. فتح خط أنابيب التكلس (راجع المعلومات التكميلية). سيتم إنشاء ملف جدول بيانات وحفظه في الموقع المفضل. ومع ذلك، لن يتم حفظ الرسومات البيانية نفسها تلقائيا. ويقترح أن تأخذ لقطة من النوافذ للحفاظ على سجل النتائج.
    2. بيانات الرسم البياني باستخدام برنامج جدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في اليوم 2، أو 24 ح خلايا البذر على الأغطية، وقد خضعت الخلايا قسمة واحدة و80٪ التقاء. يمكن أن تؤدي السقطات أو الطفرات المحددة في بروتينات إصلاح الحمض النووي إلى زيادة الوقت المضاعف، أو توعية الخلايا بالعلاج السمية الجينية، وينبغي تعديل كثافة البذر وكذلك جرعات العلاج وفقًا لذلك. لتحديد أفضل ظروف العمل، توقيت الاستجابة تلف الحمض النووي يمكن تحديدها من قبل النشاف الغربية من γH2AX مع مرور الوقت، ويمكن تحديد حساسية للإشعاع من قبل مستعمرة تشكيل المقايسة.

لا تظهر الخلايا التي لم تعالج بالإشعاع سوى القليل، إن وجدت، γH2AX(الشكل 3A). ومع ذلك، يمكن أن يتم تشغيل تشكيل بؤر γH2AX في الخلايا المستزرعة من خلال ضغوط مختلفة متأصلة في الظروف المتنامية: تركت الخلايا التقاء في الوسائط الحمضية، وجود السمية السامة للأجناس في FBS، تركيز الأكسجين المستخدم في الثقافة، على سبيل المثال لا الحصر.

Figure 3
الشكل 3: بؤر نووية بدون إجهاد.
في حالة عدم وجود الإجهاد الخارجي ، لوحظ عدد قليل جداً إن وجدت بؤر γH2AX (A). في حالة عدم وجود بروتينات إصلاح الحمض النووي الأساسية ، يمكن ملاحظة تراكم γH2AX حيث لا يتم إصلاح الفواصل التي تحدث بسبب المصادر الذاتية (B). تراكم فواصل غير مُحَدَّد قد يؤدي الخلايا إلى أن تصبح قبل بروتوث، والذي يتميز بتلوين نوية "صلبة" γH2AX (C). شريط مقياس = 5 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وبالإضافة إلى ذلك، في الخلايا المنضب للبروتينات الرئيسية الضرر الحمض النووي، مثل BRCA1 أو BRCA2 الخلايا المتحولة، لا يتم إصلاح فواصل الحمض النووي التي تحدث نتيجة لضغوط داخلية كما هو الحال في الخلايا من نوع البرية، وتتراكم. ونتيجة لذلك، يمكن ملاحظة ارتفاع γH2AX في خلايا نقص الموارد البشرية، حتى في ظروف النمو العادي(الشكل 3B). ويمكن أن يعرض السكان الفرعية من الخلايا "الصلبة" تلطيخ نووي مع γH2AX (الشكل 3C). يمكن أن تشير البقعة النووية إلى أن الخلية غارقة في التلف الذي لا يمكن إصلاحه ، و / أو هو ما قبل المبرمج. تتميز هذه الخلايا عادةً بالنويات الموسعة ، ووجود فاكوليات السيتوبلازمية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تشغيل γH2AX عن طريق الإجهاد التكراري في S-المرحلة وشوك النسخ المتماثل المتوقفة، أو بواسطة G2/M الاعتقال. ويمكن، إذا لزم الأمر، تحديد مراحل دورة الخلية عن طريق تلطيخ محتوى الحمض النووي أو التلطيخ المشترك مع علامات محددة. عند إجراء تحليل إصلاح تلف الحمض النووي ، يمكن تحديد كمية الطاقة النووية بشكل مستقل عن البؤر الفردية.

بعد التشعيع، تظهر نوى عدد كبير من فواصل حبلا مزدوجة التي γH2AX تعريب بسرعة فائقة (الشكل 4). في الظروف المثلى، لوحظ القليل من البؤر γH2AX في غياب التشعيع. بعد التشعيع، تشكيل بؤر γH2AX يزيد بشكل حاد. إذا تم معالجة الفواصل وإصلاحها ، يتم تقليل عدد البؤر لكل نواة ، وكذلك عدد الخلايا الإيجابية لـ foci. وتختلف شدة البؤر وعددها تبعا لخط الخلية المستخدم وجرعة الإشعاعات التي يتم تسليمها. في انخفاض مرور خلايا HeLa، التي تزرع في مصل خال من السموم، لاحظنا بشكل روتيني زيادة حادة من بؤر في 30 دقيقة و 1 ح آخر التشعيع، الذي يبلغ ذروته بين 1 و 2 ح، ثم ينخفض تدريجيا حتى 16 ساعة. ولهذا السبب، فإن نقاط الزمن التمثيلية في 0 و1 و2 و4 و16 ساعة تُعرض هنا. سلوك الكسر إشارة, إصلاح, والبقاء على قيد الحياة إلى تشعيع يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا بين خطوط الخلية وكذلك عند استنفاد أو طفرة الجينات. لهذا السبب، ستكون نقاط الوقت الأكثر ملاءمة التجربة والخلايا تعتمد. في التجربة، في 16 ساعة γH2AX بؤر المتبقية قد وصلت إلى نفس المستوى القاعدي من الخلايا غير المشععة. يتم اقتراح مراقبة البؤر المتبقية لتضمين نقاط الوقت في وقت لاحق إذا كان العمل مع خطوط الخلايا المقسمة ببطء.

Figure 4
الشكل 4: البؤر النووية وتحديد الكميات بعد الإجهاد (الوقت).
تشكيل بؤرية في t=0 (لا تشعيع) وعند نقاط الوقت المشار إليها بعد التشعيع (4 Gy, t=1, 2, 4, 16 h). (أ) تظهر صور الممثل. يشير DAPI إلى النوى. شريط مقياس = 5 μm. (ب) تم تسجيل البؤر النووية لـ γH2AX بعد التعرض للإشعاع بواسطة القياس الكمي الآلي (CellProfiler) في ≥ 100 نوى لكل نقطة زمنية. اعتمادا على المسألة البيولوجية المطروحة ونوع البيانات المكتسبة، تتوفر خيارات مختلفة لعرض البيانات الأولية، من أجل تسهيل المقارنة والفهم النقدي. (ط) مؤامرة سحابة يظهر يعني ± SD. الرمز (*) يشير إلى أهمية إحصائية بالنسبة للسيطرة، وذلك باستخدام الطالب اثنين الذيل t-اختبار: *** p ≤ 0.0001، (ii) منحنى التعريفي يظهر متوسط ± SEM، (3) أكثر من 10 foci لكل نواة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وعلى العكس من ذلك، في الخلايا التي تعاني من نقص في وظائف إصلاح الضرر بالحمض النووي، تتراكم البؤرة γH2AX في غياب التشعيع (t=0 h) ويمكن تأخير الإصلاح، أو عدمه حتى في نقاط زمنية طويلة (t=16 h، t=24 h) بعد التشعيع. يمكن أن تعطي المقارنة المباشرة بين النوع البري والخلايا المتحولة معلومات ثمينة عن وظيفة إصلاح الحمض النووي للجين المتحول ، والتلميح إلى نوع الإصلاح. في حين أن نقص في NHEJ يمكن أن يجبر على إصلاح الكسر من قبل الموارد البشرية في المرحلة S ، فإن DSBs التي تم إعادة تقسيمها ويجب إصلاحها من قبل الموارد البشرية لن يتم إصلاحها من قبل NHEJ. لهذا السبب، قد يشير تراكم الضرر بعد مرحلة S إلى نقص الموارد البشرية، وارتفاع مستويات γH2AX بعد تلميح القسمة في عيوب NHEJ.

عندما يتم التحقيق في العديد من البروتينات في نفس الخلايا، يمكن دراسة التعريب المشترك من قبل الأجسام المضادة الأولية متعددة التي أثيرت في أنواع الحيوانات المختلفة والكشف عن هذه مع الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع الفلوروفورات متميزة (الشكل 5). يشير التعريب المشترك إلى ما إذا كان يتم توظيف البروتينات (1) في فترة الاستراحة (2) يتم توظيفها في الوقت المناسب ، (3) التجمع في مجمعات إصلاح الحمض النووي. عند البحث عن التعريب المشترك، فإن الطريقة النوعية المقبولة بشكل شائع هي تقديم النتائج كتراكب بسيط للقنوات المختلفة (أي الأخضر والأحمر). سوف superposition الأخضر والأحمر تؤدي إلى النقاط الساخنة الصفراء، حيث اثنين من البروتينات من الفائدة موجودة في نفس بكسل(الشكل 5A). ومع ذلك، فإن هذه الطريقة لها حدود، لأنها تعتمد على كثافة الإشارة النسبية التي يتم جمعها في كلتا القناتين، وقد يكون هناك اختلافات بين الفلوروكررومين في قوة الإشارة. لذلك، أساليب تراكب تعليمات لإنشاء تقدير مرئي أحداث الترجمة المشتركة ولكن غير مناسبة لأغراض الكمية. يمكن تحقيق التحليل الكمي للتوطين المشترك من خلال نهج قائم على الكائن(الشكل 5B (i-iii) أو عن طريق نهج إحصائي يقوم بتحليلات معامل ارتباط الكثافة (ICCB)(الشكل 5B (4)). تتوفر العديد من الأدوات لتحليل التعريب المشترك ، بما في ذلك JACoP (فقط آخر المساعد التعريب المشترك ؛ https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) وخط أنابيب "الكولوكيث" (CellProfiler) المستخدمة هنا ، التي يمكن استخدامها كأداة ICCB ، من أجل تقييم العلاقة بين شدة الفلوريسنس. ويتم ذلك في الغالب عن طريق حساب معامل الارتباط (معامل بيرسون) الذي يقيس قوة العلاقة الخطية بين متغيرين. يمكن تمثيل التوطين المشترك Fluorescence بيانيًا في قطع الأراضي المبعثرة ، حيث يتم رسم شدة واحدة من الفلوروكروم (الأخضر) ضد شدة الفلوروكروم (الأحمر) الثاني لكل بكسل. كاملة نتائج التعريب المشترك في نقاط تتجمع حول خط مستقيم، الذي يعكس المنحدر نسبة الفلوريسنس من اثنين من الألوان. على العكس من ذلك، يؤدي عدم وجود التعريب المشترك إلى توزيع النقاط إلى مجموعتين منفصلتين (موزعتين على طول المحاور)، حيث تُظهر كل منهما مستويات إشارة مختلفة من لون واحد مع إشارة قليلة أو معدومة من اللون الآخر. تتراوح قيمة معامل Pearson من 1 إلى -1، مع 1 الدائمة للارتباط الإيجابي الكامل، -1 للارتباط السلبي وصفر يشير إلى عدم وجود ارتباط. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الأسلوب Pclc. وقد طبقت هذه الطريقة في مجموعة متنوعة من الإشعاعات (انظر36 للاطلاع على التفاصيل وطريقة متاحة مجانا).

Figure 5
الشكل 5: تحليل التعريب المشترك.
باستخدام العديد من الأجسام المضادة التي أثيرت ضد أنواع مختلفة (هنا، المضادة للماوس γH2AX (الأحمر) ومكافحة الأرانب 53BP1 (الأخضر))، ويمكن التحقيق في العديد من البروتينات. (أ) تظهر صور الممثل. يشير DAPI إلى النوى. يتم تصور التعريب المشترك حسب اللون وتداخل المنطقة (هنا أحمر + أخضر = أصفر). شريط مقياس = 5 μm. (ب) يمكن تحديد حجم البؤر الفردية والمشاركة في الترجمة بشكل فردي باستخدام أحد البرامج المتعددة (هنا CellProfiler ، انظر الخيارات الأخرى في النص الرئيسي) ورسمها. (ط - 3) نهج مستند إلى كائن يستخدم لتحديد التعريب المشترك (4) نتائج الارتباط التي تم الحصول عليها للتعريب المشترك، وذلك باستخدام نهج يستند إلى البكسل (تحليل ICCB). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معلومات تكميلية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد ثبت أن تحليل توقيت وكفاءة إصلاح تلف الحمض النووي عن طريق المجهر ضروري لفهم كيفية عمل آلات إصلاح الحمض النووي ، في الخلايا العادية وفي الأمراض البشرية مثل السرطان.

وقد لعبت تطوير الأجسام المضادة المحددة التي تسمح للكشف عن البروتينات المنشطة في النسخة الفوسفورية (مثل γH2AX، pRPA، pRAD50 وغيرها10،23،39،43) دورا مركزيا في الحصول على فهم أفضل من توقيت إصلاح الحمض النووي للأحداث وتزامنها مع دورة الخلية. ويتجلى هذا النجاح في تحليل المخلفات الفوسفورية 53BP1، من خلال قياس الطيف الكتلي وإضفاء الطابع المناعي (انظر32 للمراجعة)، مما ساعد على فهم وظيفة هذا البروتين المعدل بشكل كبير. مع صعود تقنية مجهرية عالية الدقة مثل STORM وزيادة استخدام الأجسام المضادة الصغيرة (الأجسام النانوية) التفاعل البروتين المباشر في الخلايا أصبح أكثر سهولة ودقة. ومع ذلك ، فإن الفلوروس المناعية غير المباشرة كما هو موضح هنا لا تزال تجربة أساسية لأداء عند التحقيق في بروتين إصلاح الحمض النووي الجديد المحتمل ويبحث عن توقيت العمل وشركاء البروتين.

يعتمد نجاح الفلور المناعية غير المباشرة بالكامل على معيارين: (1) جودة الكواشف – وخاصة الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن بقايا الفوسفات على بروتينات إصلاح الحمض النووي المنشطة ، و (2) توقيت التجربة. وينبغي تشجيع استخدام البروتوكولات والأجسام المضادة المنشورة عند توافرها. عند استخدام الأجسام المضادة الجديدة أو التحقيق في بروتين جديد، ينبغي التحقق من صحة الجسم المضاد، وينبغي إثبات خصوصيته إما من خلال هدم البروتين المستهدف في الخلايا (يجب أن تفقد الإشارة) أو استنفاد البروتين (استخدام البروتين النقي لنضوب أجسام مضادة محددة قبل الحضانة، كما هو الحال في44 لراد51AP1).

وينبغي وضع ظروف الحجب الأمثل وتخفيف الأجسام المضادة لتقليل القطع الأثرية والتلطيخ غير المحدد. وسيتم إعداد مخازن جديدة وإذا تم استخراج النووية، يجب أن يكون توقيت لتجنب النوى الضارة. في التحقيق في كفاءة إصلاح في الخلايا البشرية، ينبغي أن يتم إجراء تحديد كمي من بؤر النووية، واستخراج النووية يمكن أن تساعد مع استبعاد البروتينات السيتوبلازمية. ومع ذلك، يمكن أن يكون من المفيد عدم تنفيذ خطوة الاستخراج النووي، على سبيل المثال للتحقيق فيما إذا كان بروتين متحول يشتبه في عدم التفاعل مع شريكه الخلوي يفشل في نقل إلى النواة عند تلف الحمض النووي.

بالإضافة إلى ذلك، فإن جودة التصوير ذات أهمية قصوى لضمان إمكانية الحصول على البيانات وتحليلها ورسمها بدقة. معلمات للسيطرة على العديد وتشمل: خصوصية الأجسام المضادة الأولية، الطيف من استثارة الفلوروفور المختارة (الأجسام المضادة الثانوية)، وحماية العينات ضد photobleaching، واختيار الدعم لخلايا البذر، وأخذ عينات جيدة (الحد الأدنى من 30 إلى 300 نوى، اعتمادا على السؤال)، وفي بعض الحالات بعد العلاج مثل deconvolution أو الطيفية غير خلط. عندما يكون ذلك ممكنا، ويقترح التصوير الآلي من غطاء كامل، والذي يسمح الآلاف من الخلايا أن تكون صورة. وينبغي النظر في إشراك أخصائيي التصوير مثل مرفق أساسي قبل إنشاء التجربة لأنها ستعزز إلى حد كبير من جودة النتائج.

أخيرا، استنادا إلى خطوط الخلية المستخدمة، والعلاج الذي تم القيام به، والبروتينات التحقيق، قد تختلف مستويات القاعدية من بؤر إلى حد كبير ويجعل النتائج صعبة التفسير. ولهذا السبب، من المهم أن يتم تلخيص البيانات الخام ومعالجتها وتحليلها وتقديمها في شكل فعال في ضوء يمكن للقراء فهمه؛ تسهيل المقارنة وكشف الاتجاهات والعلاقات داخل البيانات. في الشكل 4B، يتم رسم نفس القياس الكمي للوُصَب في ثلاثة إصدارات منفصلة: (1) العدد الإجمالي لـ البؤر (مؤامرة السحب) بعد DSBs الناجمة عن التشعيع (ii) تحريض البؤر عبر الزمن - الحركية - (iii) ٪ من الخلايا الإيجابية (> 10 foci /nucleus).

المؤامرات السحابية هي المفضلة كلما كان ذلك ممكنا(الشكل 4B (ط)) لأنها تظهر جميع نقاط البيانات دون تمييز ، وبالتالي تقديم نظرة عامة أشمل من التجربة. ومع ذلك، يمكن أن يكون من الأنسب في بعض الحالات رسم معلومات أكثر انتقائية وذات صلة، مثل عدد الخلايا الإيجابية فوق قطع الخلفية التعسفية (5 بؤر في معظم خطوط الخلية)، وعدد من البؤر المشتركة، أو تحريض البؤر على مر الزمن، أو قياس جودة البؤر، مثل حجم البكسل أو شدته، ويكون أكثر ملاءمة في بعض الحالات، وهو مسؤولية المؤلفين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل منحة من مؤسسة منطقة سان انطونيو. ويدعم مركز مايس للسرطان من قبل مركز دعم مركز NCI الأساسية منحة P30 CA054174. ونود أن نشكر ستيفن هولواي على مساعدته في الحصول على الكواشف، ومختبر سونغ لتوفير المساحة وسعة الفحص المجهري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600 (2015).
  2. Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance. Cancers (Basel). 11 (7), (2019).
  3. Oh, J., Symington, L. S. Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity. Genes (Basel). 9 (12), (2018).
  4. Uziel, T., et al. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage. The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).
  5. Lee, J. H., Paull, T. T. ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex. Science. 308 (5721), 551-554 (2005).
  6. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).
  7. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).
  8. Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. Histone H2AX in DNA damage repair. Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).
  9. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).
  10. Stucki, M., et al. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks. Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).
  11. Lou, Z., et al. MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals. Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).
  12. Chapman, J. R., Jackson, S. P. Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage. EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).
  13. Melander, F., et al. Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin. Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).
  14. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).
  15. Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. Repair of double-strand breaks by end joining. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).
  16. Mehta, A., Haber, J. E. Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428 (2014).
  17. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).
  18. Huertas, P. DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).
  19. Nimonkar, A. V., et al. BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair. Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).
  20. Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1. Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).
  21. Sturzenegger, A., et al. DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells. Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).
  22. Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation. DNA Repair. 32, 66-74 (2015).
  23. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  24. Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair. Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).
  25. Yun, M. H., Hiom, K. CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle. Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).
  26. Sung, P., Klein, H. Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions. Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).
  27. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanisms of eukaryotic homologous recombination. Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).
  28. Jasin, M., Rothstein, R. Repair of strand breaks by homologous recombination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740 (2013).
  29. Dynan, W. S., Yoo, S. Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids. Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).
  30. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  31. Cejka, P. DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination. Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).
  32. Mirman, Z., de Lange, T. 53BP1: a DSB escort. Genes & Development. 34, 7-23 (2020).
  33. Cao, L., et al. A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency. Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).
  34. Zimmermann, M., de Lange, T. 53BP1: Pro choice in DNA repair. Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).
  35. Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance. Cancers (Basel). 11 (11), (2019).
  36. Nikitaki, Z., et al. Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET). Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).
  37. Redon, C., et al. Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).
  38. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).
  39. Paull, T. T., et al. A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).
  40. Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).
  41. Buisson, R., Masson, J. Y. PALB2 self-interaction controls homologous recombination. Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).
  42. Belotserkovskaya, R., et al. PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1. Nature Communications. 11 (1), 819 (2020).
  43. Betts, J. A., et al. Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage. American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).
  44. Dray, E., et al. Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1). Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).

Tags

علم الأحياء، الإصدار 160، الفلوروس، التوطين المشترك، البؤر النووية، البؤر الناجمة عن الإشعاع، إصلاح تلف الحمض النووي
التصور من الحمض النووي إصلاح البروتينات التفاعل من قبل immunofluorescence
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de la Peña Avalos, B., Dray, E. … More

de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter