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Biology

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

doi: 10.3791/61447 Published: June 26, 2020

Summary

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Abstract

Les cellules de mammifères sont constamment exposées à des produits chimiques, des radiations et des sous-produits métaboliques naturels, qui créent des types spécifiques d’insultes à l’ADN. Les agents génotoxiques peuvent endommager l’épine dorsale de l’ADN, la briser ou modifier la nature chimique des bases individuelles. Suite à l’insulte à l’ADN, les voies de réponse aux dommages à l’ADN (DDR) sont activées et les protéines impliquées dans la réparation sont recrutées. Une pléthore de facteurs sont impliqués dans la détection du type de dommages et l’activation de la réponse de réparation appropriée. L’incapacité d’activer et de recruter correctement des facteurs de DDR peut conduire à l’instabilité génomique, qui sous-tend de nombreuses pathologies humaines, y compris le cancer. Les études sur les protéines DDR peuvent fournir des informations sur la réponse aux médicaments génotoxiques et les mécanismes cellulaires de la résistance aux médicaments.

Il existe deux façons principales de visualiser les protéines in vivo : l’observationdirecte, en taguant la protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente et en la suivant par imagerie vivante, ou l’immunofluorescence indirecte sur des échantillons fixes. Bien que la visualisation des protéines étiquetées fluorescentes permette une surveillance précise au fil du temps, le marquage direct dans le terminus N ou C peut interférer avec la localisation ou la fonction des protéines. L’observation des protéines dans leur version endogène non modifiée est préférable. Lorsque les protéines de réparation d’ADN sont recrutées à l’insulte de l’ADN, leur concentration augmente localement et elles forment des groupes, ou « foyers », qui peuvent être visualisés par immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps spécifiques.

Bien que la détection des foyers protéiques ne fournisse pas de preuve définitive de l’interaction directe, la co-localisation des protéines dans les cellules indique qu’elles se regroupent jusqu’au site des dommages et peuvent éclairer la séquence des événements nécessaires à la formation complexe. Une analyse minutieuse des foyers se chevauchent dans les cellules exprimant des versions sauvages ou mutantes d’une protéine peut fournir des indices précieux sur des domaines fonctionnels importants pour la fonction de réparation de l’ADN. Enfin, la co-localisation des protéines indique des interactions directes possibles qui peuvent être vérifiées par co-immunoprécipation dans les cellules, ou retrait direct à l’aide de protéines purifiées.

Introduction

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Les cellules humaines sont constamment exposées à une variété d’agents d’ADN endommageant de diverses origines. Les sources exogènes consistent principalement en l’exposition aux radiations, aux produits chimiques (y compris les agents chimiothérapeutiques et certains antibiotiques) et aux virus, tandis que les principales sources endogènes comprennent des erreurs dans la réplication de l’ADN et le stress oxydatif. Les effets directs de l’exposition génotoxique peuvent aller d’une base modifiée à une rupture potentiellement mortelle à double brin d’ADN (DSB), selon le stress et la dose d’exposition. En fin de compte, les dommages non réparés ou mal réparés à l’ADN peuvent entraîner l’accumulation de mutations, les réarrangements génomiques, l’instabilité du génome et éventuellement conduire à la carcinogenèse1. Les cellules de mammifères ont développé des voies complexes pour reconnaître des types spécifiques de dommages à l’ADN2,3 et les réparer en temps opportun, synchronisés avec la progression du cycle cellulaire.

Le rayonnement ionisant (IR) endommage la double hélice de l’ADN et crée des ruptures à double brin (DSB), l’une des formes les plus nocives de dommages à l’ADN. Le complexe MRN (MRE11, RAD50, NBS1) fonctionne comme un capteur d’ADN se termine et active la protéine kinase ataxie telangiectasia muté (ATM)4,5. Suite à l’activation initiale de l’ATM par les extrémités de l’ADN, ATM déclenche une cascade d’événements DDR sur le site de la pause, initiant avec un événement clé, la phosphorylation de la variante histone H2AX6. La phosphorylation H2AX sur les résidus S139 l’active en γH2AX, couvrant les régions jusqu’à des mégabases autour de la lésion de l’ADN6,7,8,9. Cet événement augmente l’accessibilité de l’ADN, conduisant au recrutement et à l’accumulation d’autres protéines de réparation d’ADN7. Étant donné que γH2AX est abondamment et spécifiquement induit par les DSB environnants, il peut être facilement visualisé à l’aide d’anticorps spécifiques, et est couramment utilisé comme marqueur de substitution pour les DSB dans le domaine de la réparation de l’ADN. Une fois la rupture signalée, les cellules activent leurs voies de réparation de l’ADN et traitent les dommages causés par l’ADN. La protéine MDC1 (mediator de la protéine de point de contrôle des dommages de l’ADN 1) lie directement γH2AX10, interagit avec atm11 et aussi avec NBS112,13. Il contribue à accroître la concentration du complexe MRN à l’ORD et à lancer une boucle de rétroaction positive aux guichets automatiques. γH2AX est rapidement enlevé une fois la rupture réparée, ce qui permet la surveillance du dégagement d’ORD. Suivie d’une microscopie, la diminution du γH2AX au fil du temps fournit une mesure indirecte des ruptures résiduelles et de l’efficacité de la réparation de l’ADN.

Les cellules eucaryotes peuvent réparer les DSB par plusieurs voies, les deux principales étant l’assemblage final non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR) (Figure 1). NHEJ ligates essentiellement ADN double brin se termine sans l’utilisation de l’homologie étendue et fonctionne tout au long du cycle cellulaire14,15. Hr devient prédominant pendant les phases S et G2, et est autrement réprimé, car il nécessite une sœur chromatid comme un modèle homologue pour la réparation14,16. Le choix de la voie entre le NHEJ et le HR dépend non seulement de la proximité physique du chromatid sœur, mais aussi de l’extension de la résection d’extrémité de l’ADN17, qui inhibe le NHEJ.

La réparation d’ADN homologie-dépendante initie par la dégradation nucléolytique du brin de 5' des extrémités de rupture pour produire 3' queues d’ADN à un brin (ssDNA), un processus appelé résection de 5'-3'. Le complexe MRN initie la résection finale de l’ADN et la résection est traitée en combinaison avec BLM/EXO1 (protéine du syndrome de Bloom/exonucléase 1) ou BLM/DNA2 (réplication de l’ADN hélicase/nucléase dépendante de l’ATP)18,19,20,21,22. La résection finale de l’ADN est améliorée par le CtIP (protéine d’interaction CtBP) par son interaction directe avec le complexeMRN 23 et le recrutement de BRCA1 (protéine de susceptibilité de type 1 du cancer du sein)24,25. La protéine de réplication A (RPA) se lie rapidement à l’ADN SsDN exposée et est ensuite déplacée par la protéine recombinase RAD51 pour former un filament de nucléoprotéine qui catalyse la recherche homologue et l’invasion de brin26,27,28.

L’initiation de la résection est une étape critique pour le choix de la voie de réparation. Une fois la résection commencée, les extrémités d’ADN deviennent de pauvres substrats pour la liaison par l’hétérodimer Ku70/Ku80 (composant de la voie NHEJ) et les cellules sont engagées à HR17,29,30. L’hétérodimère Ku70/Ku80 se lie aux extrémités de l’ORD, recrutant des ADN-PKcs et p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 agit comme un obstacle à la résection en G1, bloquant ainsi hr tout en faisant la promotion de NHEJ31,32, mais il est supprimé d’une manière BRCA1-dépendante dans la phase S, permettant par conséquent la résection de se produire33,34. Par conséquent, 53BP1 et BRCA1 jouent un rôle opposé dans la réparation de l’ORD, avec 53BP1 étant un facilitateur NHEJ tandis que BRCA1 agit permettant des pauses pour réparer par hr.

En laboratoire, la formation d’ORD peut être induite par le rayonnement ionisant (IR). Bien que cet exemple utilise une dose élevée de 4 Gy, 1 Gy et 2 Gy également créer une quantité significative de DSBs, adapté à l’analyse de la formation de foyers par des protéines abondantes. Il est important de noter que le type et la dose de rayonnement utilisé peuvent conduire à différentes lésions dans l’ADN et dans la cellule: tandis que l’IR induit DSBs, il peut également causer des ruptures de brin unique ou la modification de la base (voir35,36 pour une référence sur le transfert d’énergie linéaire irradiation (LET) et le type de dommages à l’ADN). Pour déterminer la cinétique de la formation de foyers induits par rayonnement ionisant (IRIF) et leur dégagement, qui indiquent la réparation des dommages et l’inversion du DDRactivé 8,9,37,38, la formation de foyers peut être surveillée à différents points de temps après rayonnement ionisant. Le moment de l’activation et le dégagement de toutes les protéines majeures de dommages d’ADN est connu39, et beaucoup sont étudiés en tant que marqueurs de substitution des événements principaux. Par exemple, pRPA, qui possède une forte affinité pour l’ADN SsDN est utilisé comme un substitut de la résection de rupture, protéines MRN (MRE11, RAD50, NBS1) et exonucleases peuvent être utilisés pour évaluer l’efficacité de la résection aussi. Bien que RAD51, BRCA1, BRCA2 (protéine de susceptibilité de type 2 du cancer du sein) et PALB2 (partenaire et localisateur de BRCA2) puissent être surveillés pour évaluer l’efficacité des RH, la présence des protéines Ku ou 53BP1, sont utilisés comme marqueurs de NHEJ (Figure 1).

Comme les protéines des machines de réparation de l’ADN se recrutent les unes les autres à la rupture et s’assemblent dans des super-complexes, l’ADN-protéine et les interactions protéines-protéines peuvent être déduites en suivant leur localisation individuelle au fil du temps et en analysant la co-localisation des protéines, telle que visualisée par des signaux qui se chevauchent dans la cellule40,41,42. Dans les lignées cellulaires, l’introduction de mutations ponctuelles ou la suppression dans des gènes spécifiques de réparation de l’ADN, soit par l’édition du génome, soit par surexpression de mutants à base de plasmide, permet d’enquêter sur des résidus spécifiques et leur rôle possible dans la reconnaissance des dommages à l’ADN (p. ex., co-localisation avec γH2AX) ou d’assemblage complexe (co-localisation avec une autre ou plusieurs protéines), ainsi que leur impact sur la réparation de l’ADN. Ici, nous utilisons l’immunofluorescence indirecte comme moyen d’étudier la formation et la résolution des DSB en suivant les foyers γH2AX au fil du temps. Nous présentons également un exemple de formation de foyers et d’analyse de co-localisation par un acteur majeur de la réparation de l’ORD : p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Comme mentionné précédemment, 53BP1 est considéré comme central pour le choix de la voie de réparation de l’ADN. Après l’accumulation de 53BP1 et sa co-localisation avec γH2AX fournit des informations précieuses sur la phase de cycle cellulaire, l’accumulation de dommages d’ADN, et la voie utilisée pour réparer les DSB. Le but de l’immunolocalisation indirecte est d’évaluer l’efficacité de la réparation des dommages à l’ADN dans les lignées cellulaires, à la suite de l’IR comme dans cette étude, ou après l’exposition à diverses contraintes dans les cellules, de croisement d’ADN au blocage de la fourche de réplication (une liste d’agents d’endommagement de l’ADN est fournie dans le tableau 1).

Figure 1
Figure 1 : Ruptures de ruptures à double brin d’ADN (DSB) voies de réparation.
La réparation d’ORD implique deux voies principales : la recombinaison homologue (HR, gauche) et l’assemblage non homologue (NHEJ, à droite). Après la pause, les protéines sont activées pour marquer la rupture (γH2AX), participer à la résection finale (MRN), enrober le ssDNA réséqué (pRPA), promouvoir la recombinaison (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) ou limiter la résection et promouvoir la SSDNA (pRPA), promouvoir la recombinaison (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) ou limiter la résection et promouvoir la resEJ (53BP1). D’autres protéines participent à la réparation des dommages, mais les protéines énumérées sont systématiquement suivies d’immunofluorescence indirecte. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Agent d’endommagement d’ADN Mécanisme d’action Dose recommandée
rayons γ/rayons X Rayonnement
Formation de ruptures à double brin avec certains effets cellulaires incontrôlés
1-4 Gy
36 Ions Ar Rayonnement
Formation de pauses à double brin
270 keV/μm
α-particules Rayonnement
Formation de pauses à double brin
116 keV/μm
Bleomycine Inhibiteur de la synthèse de l’ADN 0,4 à 2 μg/mL
Camptothécine Inhibiteur de la topoisomérase I 10-200 nM
Cisplatine Agent alcalin
(induisant des liens croisés intrastrand)
0,25 à 2 μM
Doxorubicine Agent intercalaire
Inhibiteur de la topoisomerase II
10-200 nM
Etoposide Inhibiteur de la topoisomerase II 10 μM
Hydroxyurea Inhibiteur de la synthèse de l’ADN
(par ribonucléotide reductase)
10-200 μM
Méthane de méthyle Agent alcalin 0,25 à 2 mM
Mitomycine C Agent alcalin 0,25 à 2 μM
Lumière ultraviolette (UV) Formation de dimers thymidine
(générant une distorsion de la chaîne d’ADN)
50-100 mJ/cm2

Tableau 1 : Agents génotoxiques. Exemples d’agents d’ADN nuisibles, leur mécanisme d’action et les dommages induits en fonction de la concentration de travail suggérée.

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Protocol

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1. Culture cellulaire HeLa

  1. Prétraiter les couvercles ronds en verre de 1 M HCl à 50 °C pendant 16-18 heures. Rincer avec ddH2O et conserver dans 100% EtOH.
  2. Préparer le milieu de culture cellulaire : ajouter 10 % (v/v) FBS au milieu DMEM.
  3. Cultiver 4,0 x 104 cellules/puits dans une plaque stérile de 12 puits avec une couverture en verre rond de 18 mm à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Développer les cellules à 80% de confluence (environ 24 heures).

2. Traitement cellulaire par rayonnement (IR)

  1. Pour induire la formation de ruptures à double brin, exposez les cellules à 4 Gy γ-irradiation (contrôle : Pas d’irradiation, t=0). Dans la cellule Gamma -40, cela correspond à 4,54 min, à 0,815 Gy par min.
  2. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié pour la durée appropriée (points de temps choisis ici t=1, 2, 4, 16 h).

3. Extraction nucléaire et fixation cellulaire

  1. Préparer des solutions de stock : 0,2 M PIPES (pH 6,8), 5 M NaCl, 2 M de saccharose, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8,0).
  2. Préparer un tampon d’extraction nucléaire (NEB): dissoudre 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM saccharose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) et 0,5% (v/v) Triton X-100 en ddH2O. Mix jusqu’à dissolution complète.
  3. Préparer 4% (v/v) paraformaldéhyde (PFA): dissoudre 10 mL de 16% PFA solution aqueuse dans 30 mL PBS. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
  4. Au moment opportun (t=0, 1, 2, 4, 16 h), laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS. Retirez complètement PBS.
  5. Ajouter 200 μL d’ONÉ à chaque puits pour l’extraction des noyaux cellulaires (le cytoplasme est dégradé, il ne reste que le noyau) (figure 2). Incuber pendant 2 minutes à température ambiante et retirer complètement.
    REMARQUE : Ne dépassez pas 2 minutes.

Figure 2
Figure 2 : Extraction nucléaire.
Images représentatives des cellules avant (à gauche) et post (droite) extraction nucléaire. Le cytoplasme doit être digéré, mais la structure nucléaire doit rester intacte après l’extraction (à droite). (A) grossissement 20x; barre d’échelle = 20 μm et (B) 40x grossissement; barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

  1. Laver les cellules avec 1 mL de PBS. Retirez complètement PBS. Ajoutez PBS soigneusement, les cellules sont très fragiles à cette étape.
  2. Ajouter 200 μL de 4 % (v/v) PFA à chaque puits pour la fixation cellulaire. Incuber pendant 10 minutes à 4 °C. Retirez complètement la PFA.
  3. Ajouter 1 mL de PBS.
    REMARQUE : Les cellules peuvent être stockées dans pbs à 4 °C.

4. Coloration d’immunofluorescence

  1. Préparer la solution de blocage : dissoudre 5 % de BSA (w/v) dans PBS et ajouter 0,3 % (v/v) Triton X-100. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
  2. Préparer la tampon de dilution : dissoudre 1 % de BSA (w/v) dans pbs et ajouter 0,3 % (v/v) Triton X-100. Mélanger jusqu’à dissolution complète.
  3. Pour le blocage, ajoutez 200 μL de solution de blocage à chaque puits. Incuber pendant 2 heures à température ambiante ou 16-18 heures à 4 °C.
    REMARQUE : Si l’anticorps de chèvre est utilisé, ajoutez 5 % de sérum de chèvre à la solution de blocage.
  4. Diluer l’anticorps primaire dans le tampon de dilution (1:500; voir tableau 2 pour la liste des anticorps) et vortex jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé.
    REMARQUE : Si l’anticorps de chèvre est utilisé, ajoutez 1% de sérum de chèvre au tampon de dilution.
  5. Dans une boîte d’humidité/incubation, adhérez à un morceau de parafilm. Ajouter 10 μL d’anticorps primaires (en une seule goutte). Aligner un bord du couvercle avec la goutte et baisser lentement sur le parafilm, pour que le liquide se répande tout au long (éviter les bulles si possible). Incuber pendant 2 heures à température ambiante.
  6. Laver les couvercles trois fois dans PBS pendant 1 minute.
  7. Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de dilution (concentration finale : 2 μg/mL) et vortex jusqu’à ce qu’il soit bien mélangé.
  8. Appliquer 10 μL d’anticorps secondaires tels que décrits pour les anticorps primaires. Incuber pendant 2 heures à température ambiante.
    REMARQUE : Protégez-vous de la lumière.
Anticorps Société Référence Source
53BP1 Signalisation cellulaire 4937 Lapin
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150103 Âne
Anti-phospho-Histone H2A. X (Ser139), clone JBW301 Millipore 05-636 Souris
Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150081 Chèvre

Tableau 2 : Anticorps utilisés. Liste des anticorps utilisés dans cette étude.

  1. Laver les couvercles trois fois dans PBS pendant 1 minute.
  2. Laver les couvercles avec H2O pendant 1 minute.
  3. Contrestain DE L’ADN avec DAPI : appliquer 10 μL de 300 nM DAPI (comme décrit pour les anticorps), incuber pendant 30 minutes à température ambiante, puis monter sur une lame de verre avec un milieu de montage à base de glycérol. Sinon, ajoutez une goutte (10 μL) de support de montage antifade commercial contenant du DAPI sur une diapositive et appliquez un couvercle. Appuyez doucement sur le couvercle et retirez l’excès de liquide autour de lui avec une serviette en papier.
  4. Sceller les couvercles avec du vernis à ongles transparent et les laisser sécher pendant 20 minutes.
  5. Stockez les diapositives à 4 °C.

5. Acquisition d’images

  1. Placez une goutte d’huile d’immersion sur l’objectif 60x. Utilisez DAPI pour localiser les noyaux à travers un morceau d’œil.
    1. Pour l’acquisition d’images XYZ, logiciel d’acquisition ouverte et certains paramètres : Type de scanner : Galvano ; Mode scanner : Aller-retour; Taille de l’image: 512×512; Mode PMT: VBF; Moyenne pmt : cadre (4 fois); Analyse séquentielle PMT : ligne.
    2. Sélectionnez le colorant et les détecteurs :
      Canal (CH1), Colorant (DAPI), Détecteur (SD1)
      Canal (CH2), Colorant (Alexa Fluor 488), Détecteur (HSD3)
      Canal (CH3), Colorant (Alexa Fluor 647), Détecteur (HSD4)
    3. Sélectionnez ON dans « Z ».
  2. Ajustez l’image en direct. Appuyez sur le bouton En direct de la fenêtre En direct.
    1. Ajuster la mise au point et définir l’intensité laser (%), la sensibilité (HV), le gain et le décalage sur la fenêtre d’outils « PMT ».
      1. Ajuster l’intensité laser (%): pour la luminosité et le blanchiment. Plus l’intensité laser est élevée, plus le signal est fort, mais le spécimen se photoblera.
      2. Ajuster la sensibilité (HV): niveau de bruit. Plus le HV est élevé, plus le signal est fort, mais l’image sera bruyante si elle est trop haute.
        REMARQUE : Maintenez toujours la tension constante.
      3. Ajuster le décalage : niveau d’arrière-plan.
    2. Sélectionnez Démarrer/Fin (15 tranches) pour les piles Z.
  3. Démarrer l’acquisition.
    1. Sélectionnez le dossier pour enregistrer des images. Appuyez sur le bouton Démarrer LSM pour commencer à acquérir l’image. Appuyez sur le bouton Série Done pour compléter l’acquisition d’image.

6. Analyse des données

  1. Pour l’analyse d’image, ouvrez le logiciel d’analyse.
    1. Appuyez sur la fenêtre de l’outil Batch, sélectionnez les images à analyser et sélectionnez le dossier de sortie.
    2. Appuyez sur la fenêtre de l’outil Analyse et sélectionnez Projection (affichez la projection d’intensité maximale à partir de 15 tranches).
    3. Sous Paramètre Entrée/Sortie, sélectionnez le lot créé.
    4. Appuyez sur Processus pour que les images soient traitées.
    5. Exporter des images sous forme de fichiers .tiff.
  2. Pour la quantification des foyers nucléaires, ouvrez CellProfiler.
    1. Ouvrez le pipeline de quantification γH2AX et 53BP1 foyers (voir Informations supplémentaires).
    2. Graphiques à l’aide d’un logiciel de table.
  3. Pour l’analyse de co-localisation, ouvrez CellProfiler.
    1. Ouvrez le pipeline colocalisation (voir Informations supplémentaires). Un fichier de feuille de calcul sera créé et enregistré à l’emplacement préféré. Toutefois, les graphiques eux-mêmes ne seront pas automatiquement enregistrés. Il est suggéré de prendre un instantané des fenêtres pour garder pour enregistrer les résultats.
    2. Graphiques à l’aide d’un logiciel de table.

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Representative Results

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Le jour 2, ou 24 h après les cellules d’ensemencement sur les couvercles, les cellules ont subi une division et sont confluentes à 80%. Des baisses ou des mutations spécifiques dans les protéines de réparation de l’ADN peuvent augmenter le temps de doublement, ou sensibiliser les cellules au traitement génotoxique, et la densité d’ensemencement ainsi que les doses de traitement devraient être ajustées en conséquence. Pour déterminer les meilleures conditions de travail, le moment de la réponse aux dommages à l’ADN peut être établi par le blotting occidental de γH2AX au fil du temps, et la sensibilité à l’irradiation peut être identifiée par l’essai de formation de colonie.

Les cellules non traitées avec irradiation présentent peu, voire aucune, de foyers γH2AX (Figure 3A). Cependant, la formation de foyers γH2AX peut être déclenchée dans les cellules cultivées par divers stress inhérents aux conditions de croissance : cellules laissées confluentes dans les milieux acidifiés, présence d’endotoxine génotoxique dans le FBS, concentration d’oxygène utilisée pour la culture, pour en citer quelques-uns.

Figure 3
Figure 3 : Foyers nucléaires sans stress.
En l’absence de facteur de stress externe, très peu ou pas de foyers γH2AX sont observés (A). En l’absence de protéines essentielles de réparation de l’ADN, l’accumulation de γH2AX peut être observée car les ruptures se produisant dues à des sources endogènes ne sont pas réparées (B). L’accumulation de ruptures non réparées peut conduire les cellules à devenir pré-apoptotiques, ce qui est marqué par une coloration « solide » des noyaux γH2AX (C). Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

En outre, dans les cellules épuisées pour les principaux dommages à l’ADN des protéines, telles que les cellules mutantes BRCA1 ou BRCA2, les ruptures d’ADN qui se produisent à la suite de stress endogènes ne sont pas réparées comme dans les cellules de type sauvage, et s’accumulent. En conséquence, γH2AX élevé peut être observé dans les cellules déficientes en RH, même dans des conditions de croissance normales (Figure 3B). Une sous-population de cellules peut présenter des taches nucléaires « solides » avec γH2AX (figure 3C). La tache pannucléaire peut indiquer qu’une cellule est submergée de dommages irréparables et/ou pré-apoptotique. Ces cellules sont généralement caractérisées par des noyaux agrandis, et la présence de vacuoles cytoplasmiques. En outre, γH2AX peut être déclenché par un stress réplictif dans les fourches de réplication en phase S et au point mort, ou par l’arrêt G2/M. Si nécessaire, les phases du cycle cellulaire peuvent être identifiées en tachant la teneur en ADN ou en co-tacheant avec des marqueurs spécifiques. Lors de l’analyse de réparation des dommages à l’ADN, le pannucléaire peut être quantifié indépendamment des foyers individualisés.

Après irradiation, les noyaux présentent un grand nombre de ruptures à double brin auxquelles γH2AX se localise extrêmement rapidement (figure 4). Dans des conditions optimales, peu ou pas de foyers γH2AX sont observés en l’absence d’irradiation. Après irradiation, la formation de foyers γH2AX augmente fortement. Si les ruptures sont traitées et réparées, le nombre de foyers par noyaux est diminué, ainsi que le nombre de cellules positives pour les foyers. L’intensité et le nombre de foyers varient en fonction de la lignée cellulaire utilisée et de la dose d’irradiation livrée. Dans les cellules HeLa à faible passage, cultivées dans le sérum sans endotoxine, nous avons régulièrement observé une forte augmentation des foyers à 30 minutes et 1 h après l’irradiation, qui culmine entre 1 et 2 h, puis diminue progressivement jusqu’à 16 h. Pour cette raison, les points de temps représentatifs à 0, 1, 2, 4 et 16 h après irradiation sont présentés ici. Le comportement de la signalisation de rupture, la réparation, et la survie à l’irradiation peut varier considérablement entre les lignes cellulaires ainsi que sur l’épuisement ou la mutation des gènes. Pour cette raison, les points de temps les plus appropriés seront dépendants de l’expérience et des cellules. Dans l’expérience, à 16 h γH2AX foyers résiduels ont atteint le même niveau basal que les cellules non irradiées. La surveillance des foyers résiduels pour inclure des points de temps ultérieurs est suggérée si vous travaillez avec des lignes cellulaires qui divisent lentement.

Figure 4
Figure 4 : Foyers nucléaires et quantification suivant le stress (cours dans le temps).
formation de foyers γH2AX à t=0 (pas d’irradiation) et aux points de temps indiqués après irradiation (4 Gy, t=1, 2, 4, 16 h). (A) Des images représentatives sont affichées. DAPI indique les noyaux. Barre d’échelle = 5 μm. (B) Les foyers nucléaires de γH2AX après l’exposition à l’irradiation γ ont été marqués par quantification automatisée (CellProfiler) dans ≥ 100 noyaux pour chaque point de temps. Selon la question biologique soulevée et le type de données acquises, différentes options sont disponibles pour présenter les données brutes, afin de faciliter la comparaison et la compréhension critique. (i) La parcelle nuageuse montre la moyenne ± SD. Le symbole (*) indique une signification statistique par rapport au contrôle, à l’aide du test t à deux queues de l’étudiant : *** p ≤ 0,0001, ii) la courbe d’induction montre la moyenne ± SEM, (iii) plus de 10 foyers par noyau. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Inversement, dans les cellules déficientes pour les fonctions de réparation des dommages à l’ADN, les foyers γH2AX s’accumulent en l’absence d’irradiation (t=0 h) et la réparation peut être retardée, ou absente même à de longs moments (t=16 h, t=24 h) après l’irradiation. La comparaison directe entre le type sauvage et les cellules mutantes peut donner des informations précieuses sur la fonction de réparation de l’ADN du gène muté, et faire allusion au type de réparation. Bien qu’une carence en NHEJ puisse forcer la rupture à être réparée par les RH en phase S, les DSB qui ont été réséqués et doivent être réparés par les RH ne seront pas réparés par le NHEJ. Pour cette raison, l’accumulation des dommages après la phase S pourrait indiquer une insuffisance de HR, et les niveaux élevés de γH2AX après la division indiquent des défauts de NHEJ.

Lorsque plusieurs protéines sont étudiées dans les mêmes cellules, la co-localisation peut être étudiée en multiplexant les anticorps primaires élevés chez différentes espèces animales et en les révélant avec des anticorps secondaires étiquetés avec des fluorophores distincts (figure 5). La co-localisation indique si les protéines (i) sont recrutées à la rupture (ii) sont recrutées en temps opportun, (iii) se rassemblent dans des complexes de réparation d’ADN. Lorsqu’on cherche la co-localisation, une méthode qualitative communément acceptée consiste à présenter les résultats comme une simple superposition des différents canaux (c.-à-d. vert et rouge). La superposition du vert et du rouge donnera lieu à des points chauds jaunes, où les deux protéines d’intérêt sont présentes dans les mêmes pixels (Figure 5A). Cependant, cette méthode a des limites, car elle dépend de l’intensité relative du signal recueillie dans les deux canaux, et les deux fluorochromes peuvent avoir des différences dans la force du signal. Par conséquent, les méthodes de superposition aident à générer une estimation visuelle des événements de co-localisation, mais ne sont pas appropriées à des fins quantitatives. L’analyse quantitative de la co-localisation peut être réalisée par une approche basée sur des objets(figure 5B (i-iii) ou par une approche statistique qui effectue une analyse basée sur le coefficient de corrélation d’intensité (ICCB)(figure 5B (iv)). Plusieurs outils d’analyse de co-localisation sont disponibles, dont JACoP (Just Another Co-locaization Plugin; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) et le pipeline « Colocalization » (CellProfiler) utilisé ici, qui peut être utilisé comme un outil ICCB, afin d’évaluer la relation entre les intensités de fluorescence. Cela se fait principalement en calculant le coefficient de corrélation (coefficient de Pearson) qui mesure la force de la relation linéaire entre deux variables. La co-localisation de fluorescence peut être représentée graphiquement dans les parcelles de dispersion, où l’intensité d’un fluorochrome (vert) est tracée par rapport à l’intensité du deuxième fluorochrome (rouge) pour chaque pixel. La co-localisation complète se traduit par des points regroupés autour d’une ligne droite, dont la pente reflète le rapport de fluorescence des deux couleurs. Au contraire, l’absence de co-localisation entraîne la distribution de points en deux groupes distincts (répartis le long des axes), chacun montrant des niveaux de signal variables d’une couleur avec peu ou pas de signal de l’autre couleur. La valeur du coefficient de Pearson varie de 1 à -1, avec 1 pour une corrélation positive complète, -1 pour une corrélation négative et zéro indiquant qu’aucune corrélation. Alternativement, la méthode Pclc peut être utilisée. Cette méthode a été appliquée dans une variété de rayonnements (voir36 pour plus de détails et méthode librement disponible).

Figure 5
Figure 5 : Analyse de co-localisation.
En utilisant plusieurs anticorps élevés contre différentes espèces (ici, anti-souris γH2AX (rouge) et anti-lapin 53BP1 (vert)), plusieurs protéines peuvent être étudiées. (A) Des images représentatives sont affichées. DAPI indique les noyaux. La co-localisation est visualisée par la couleur et le chevauchement de la zone (ici rouge + vert = jaune). Barre d’échelle = 5 μm. (B) Les foyers individuels et co-localisateurs peuvent être quantifiés individuellement à l’aide de l’un des nombreux logiciels (ici, CellProfiler, voir d’autres options dans le texte principal) et tracés. (i-iii) Approche basée sur des objets utilisée pour déterminer la co-localisation (iv) Résultats de corrélation obtenus pour la co-localisation, à l’aide d’une approche basée sur les pixels (analyse ICCB). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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L’analyse du moment et de l’efficacité de la réparation des dommages à l’ADN par microscopie s’est avérée essentielle pour comprendre le fonctionnement de la machinerie de réparation de l’ADN, dans les cellules normales et dans les pathologies humaines telles que le cancer.

Le développement d’anticorps spécifiques qui permettent la détection de protéines activées dans leur version phosphorylé (tels que γH2AX, pRPA, pRAD50 et autres10,23,39,43) a joué un rôle central dans l’acquisition d’une meilleure compréhension du calendrier de réparation de l’ADN des événements et sa synchronisation avec le cycle cellulaire. Ce succès est illustré par l’analyse des résidus phosphorylés 53BP1, par spectrométrie de masse et immunolocalisation (voir32 pour examen), qui a aidé à comprendre la fonction de cette protéine fortement modifiée. Avec l’ascension de la technique microscopique à haute résolution comme STORM et l’utilisation accrue de petits anticorps (nanobodies) l’interaction directe des protéines dans les cellules devient plus accessible et précise. Cependant, l’immunofluorescence indirecte telle que décrite ici reste une expérience essentielle à effectuer lors de l’étude d’une nouvelle protéine potentielle de réparation d’ADN et de la recherche de calendrier de l’action et des partenaires protéiques.

Le succès de l’immunofluorescence indirecte repose entièrement sur deux critères : (i) la qualité des réactifs – en particulier les anticorps utilisés pour détecter les résidus de phospho sur les protéines de réparation d’ADN activées, et (ii) le moment de l’expérience. L’utilisation de protocoles et d’anticorps publiés devrait être encouragée lorsqu’elle est disponible. Lors de l’utilisation d’un nouvel anticorps ou de l’étude d’une nouvelle protéine, l’anticorps doit être validé, et la spécificité doit être établie soit par l’élimination de la protéine cible dans les cellules (le signal doit être perdu) ou l’épuisement des protéines (utilisation de protéines purifiées pour épuiser des anticorps spécifiques avant l’incubation, comme effectué dans44 pour RAD51AP1).

Des conditions de blocage optimales et une dilution des anticorps devraient être établies afin de minimiser les artefacts et les taches non spécifiques. Les tampons seront préparés frais et si l’extraction nucléaire est effectuée, il doit être chronométré pour éviter d’endommager les noyaux. En étudiant l’efficacité de réparation dans les cellules humaines, la quantification des foyers nucléaires devrait être effectuée, et l’extraction nucléaire peut aider à exclure les protéines cytoplasmiques. Cependant, il peut être bénéfique de ne pas effectuer l’étape d’extraction nucléaire, par exemple pour déterminer si une protéine mutante soupçonnée de ne pas interagir avec son partenaire cellulaire ne parvient pas à se translocaliser au noyau sur les dommages causés par l’ADN.

En outre, la qualité de l’imagerie est d’une importance capitale pour s’assurer que les données peuvent être correctement acquises, analysées et des données précises tracées. Les paramètres à contrôler sont nombreux et comprennent : la spécificité des anticorps primaires, le spectre de l’excitation des fluorophores choisis (anticorps secondaires), la protection des échantillons contre le photobleaching, le choix du soutien pour les cellules d’ensemencement, un bon échantillonnage (minimum de 30 à 300 noyaux, selon la question), et dans certains cas post-traitement comme la déconvolution ou le non-mélange spectral. Dans la mesure du possible, l’imagerie automatisée d’un couvercle complet, qui permet d’imaginer des milliers de cellules, est suggérée. Il faut envisager de faire participer des spécialistes de l’imagerie, comme une installation de base avant la mise en place de l’expérience, car elle améliorera grandement la qualité des résultats.

Enfin, en fonction des lignées cellulaires utilisées, du traitement effectué et des protéines étudiées, les niveaux basaux des foyers peuvent varier considérablement et rendre les résultats difficiles à interpréter. Pour cette raison, il est important que les données brutes soient résumées, traitées, analysées et présentées dans un format efficace dans un éclairage que les lecteurs peuvent comprendre; faciliter la comparaison et révéler les tendances et les relations au sein des données. Dans la figure 4B, la même quantification des foyers est tracée en trois versions distinctes : (i) nombre total de foyers (parcelle de nuage) après les DSB induits par irradiation (ii) induction de foyers au fil du temps -cinétique- (iii) % des cellules positives (>10 foci/noyau).

Les parcelles de nuages doivent être préférées dans la mesure du possible(figure 4B i)) car elles montrent tous les points de données sans discrimination et offrent ainsi la vue d’ensemble la plus complète de l’expérience. Toutefois, tracer des informations plus sélectives et pertinentes, telles que le nombre de cellules positives au-dessus d’une coupure arbitraire de fond (5 foyers dans la plupart des lignées cellulaires), le nombre de foyers co-localisant, l’induction de foyers au fil du temps, ou la mesure de la qualité des foyers, tels que la taille ou l’intensité des pixels, peut être plus approprié dans certains cas, et est la responsabilité des auteurs.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention de la San Antonio Area Foundation. Le Mays Cancer Center est soutenu par NCI cancer center support core grant P30 CA054174. Nous tenons à remercier Stephen Holloway pour son aide à l’approvisionnement des réactifs, et le laboratoire Sung pour fournir l’espace et la capacité de microscopie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

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References

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Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence
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de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).More

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