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Biology

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

Published: June 26, 2020 doi: 10.3791/61447
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Mays Cancer Center at UT Health San Antonio MD Anderson Cancer Center

Summary

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

Abstract

포유류 세포는 화학 물질, 방사선 및 자연적으로 발생하는 신진 대사 부산물, DNA 모욕의 특정 유형을 생성합니다. 독독성 제는 DNA 백본을 손상시키거나, 부러뜨리거나, 개별 기지의 화학적 특성을 수정할 수 있습니다. DNA 모욕에 따라 DNA 손상 반응(DDR) 경로가 활성화되고 수리에 관련된 단백질이 채용됩니다. 손상 유형을 감지하고 적절한 수리 응답을 활성화하는 데 많은 요인이 관여합니다. DDR 요인을 올바르게 활성화하고 모집하지 못하면 유전체 불안정으로 이어질 수 있으며 암을 포함한 많은 인간의 병리학에 기초가 됩니다. DDR 단백질의 연구는 약물 내성의 물질독성 약물 반응 과 세포 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

생체 내에서단백질을 시각화하는 두 가지 주요 방법이 있습니다 : 직접 관찰, 형광 단백질로 관심있는 단백질을 태그하고 라이브 이미징에 의해 다음, 또는 고정 된 샘플에 간접 적인 면역 형광. 형광 태그 단백질의 시각화는 시간이 지남에 따라 정밀한 모니터링을 허용하지만, N-또는 C 종면에서 직접 태그는 단백질 국소화 또는 기능을 방해할 수 있습니다. 수정되지 않은 내생성 버전에서 단백질을 관찰하는 것이 바람직합니다. DNA 복구 단백질이 DNA 모욕에 모집될 때, 그들의 농도는 현지에서 증가하고 특정 항체를 사용하여 간접적인 면역 형광에 의해 가시화될 수 있는 그룹, 또는 "foci"를 형성합니다.

단백질 foci의 검출은 직접적인 상호 작용의 확실한 증거를 제공하지 않지만, 세포에 있는 단백질의 공동 현지화는 손상의 사이트에 다시 그룹화하고 복잡한 형성을 위해 요구되는 사건의 순서를 알릴 수 있다는 것을 나타냅니다. 단백질의 야생 모형 또는 돌연변이 버전을 표현하는 세포에 있는 foci 공간 중첩의 주의깊은 분석은 DNA 복구 기능에 중요한 기능적인 도메인에 귀중한 단서를 제공할 수 있습니다. 마지막으로, 단백질의 공동 국소화는 세포의 공동 면역 침전성 또는 정제 된 단백질을 사용하여 직접 풀다운하여 검증 될 수있는 가능한 직접적인 상호 작용을 나타냅니다.

Introduction

인간 세포는 다양한 기원의 다양한 DNA 손상 제에 지속적으로 노출됩니다. 외인성 근원은 주로 방사선, 화학물질 (화학요법 에이전트 및 몇몇 항생제를 포함하여), 바이러스에 노출로 이루어져 있고, 주요 내인성 근원은 DNA 복제 및 산화 긴장에 있는 오류를 포함하는 동안. 물질독성 노출의 직접적인 영향은 응력과 노출 량에 따라 변형된 베이스에서 잠재적으로 치명적인 DNA 이중 가닥 브레이크(DSB)까지 다양할 수 있습니다. 궁극적으로, 수리되지 않거나 잘못 수리된 DNA 손상은 돌연변이, 게놈 재배치, 게놈 불안정의 축적으로 이어질 수 있고 결국 발암발생 1으로이어질 수 있다. 포유류 세포는 DNA손상2,,3의 특정 유형을 인식하고 세포 주기 진행과 동기화된 적시 방식으로 복구하기 위해 복잡한 경로를 진화시켰다.

이온화 방사선 (IR)은 DNA 이중 나선을 손상시키고 DNA 손상의 가장 해로운 형태 중 하나 인 이중 가닥 휴식 (DSBs)을 만듭니다. MRN(MRE11, RAD50, NBS1) 복합기능은 DNA의 센서로서 기능하며 단백질 키나제 실조(ATM)4,,5를활성화한다. DNA 에 의해 ATM의 초기 활성화에 따라, ATM은 휴식의 사이트에서 DDR 이벤트의 폭포를 트리거, 키 이벤트, 히스톤 변형 H2AX6의인산화를 시작. 잔류물 S139에 H2AX 인산화는 dna 병변,,6,7,8,9주위에 메가베이스까지 영역까지 에 걸쳐, γH2AX로 활성화한다.8 이 이벤트는 DNA 접근성을 증가시켜 다른 DNA 수리 단백질7의모집 및 축적으로 이어진다. γH2AX는 주변 DSB를 풍부하고 구체적으로 유도하기 때문에 특정 항체를 사용하여 쉽게 시각화할 수 있으며 DNA 수리 분야에서 DSBs에 대한 대리 마커로 일반적으로 사용됩니다. 휴식이 신호되면 세포는 DNA 복구 경로를 활성화하고 DNA 손상을 처리합니다. 단백질 MDC1(DNA 손상 검사점 단백질 1의 중재자)은 γH2AX10을직접 결합하고 ATM11과 상호 작용하며 NBS112,,13과도상호 작용한다. DSB에서 MRN 단지의 농도를 높이고 양성 ATM 피드백 루프를 시동하는 데 기여합니다. γH2AX는 휴식이 수리되면 빠르게 제거되므로 DSB 클리어런스를 모니터링할 수 있습니다. 현미경 검사법에 이어, 시간이 지남에 따라 γH2AX의 감소는 잔류 휴식 및 DNA 수리 효율의 간접적인 측정을 제공합니다.

진핵 세포는 여러 경로에 의해 DSB를 복구 할 수 있으며, 두 가지 주요 것들은 비 동상화 종조 (NHEJ) 및 상동성 재조합 (HR)(도1)입니다. NHEJ는 본질적으로 확장 된 상동성의 사용없이 DNA 이중 가닥 끝을 ligates 및 세포 주기 에 걸쳐 작동14,,15. HR은 S 및 G2 단계에서 우세하게 되고, 그렇지 않으면 억압된다, 그것은수리를위한상동성 템플릿으로 자매 크로마티드를 필요로하기 때문에14,16. NHEJ와 HR 사이의 통로 선택은 자매 크로마티드의 물리적 근접성뿐만 아니라 NHEJ를 억제하는 DNA 끝 절제술17의연장에 달려 있습니다.

편집 의존DSB 복구는 휴식 끝에서 5'가닥의 뉴클레오분해성 분해에 의해 시작되어 3'단일 가닥 DNA(ssDNA) 꼬리를 생성하며, 이는 5'-3'절제라고 하는 과정이다. MRN 복합체는 DNA 엔드 절제술을 개시하고 추가 절제술은 BLM/EXO1(블룸 증후군 단백질/엑소뉴클레아제 1) 또는 BLM/DNA2(DNA 복제 ATP 의존헬리케이스/뉴클레아제)18,,19,,20,21,22와함께 처리된다.,, DNA 최종 절제술은 MRN복합체(23)와의 직접적인 상호작용및 BRCA1(유방암형 1형 감수성 단백질),24,25의모집을 통해 CtIP(CtBP-상호작용 단백질)에 의해 강화된다. 복제 단백질 A(RPA)는 즉시 ssDNA에 노출되어 재조합 단백질 RAD51에 의해 변위되어 상동성 검색 및 가닥침입(26,,27,,28)을촉매화하는 뉴클레오단백질 필라멘트를 형성한다.

절제술의 개시는 수리 통로 선택을 위한 중요한 단계입니다. 일단 절제술이 시작되면, DNA 끝은 Ku70/Ku80 이종수(NHEJ 통로의 성분)에 의해 결합을 위한 가난한 기판이 되고 세포는 HR17,,29,,30에투입된다. Ku70/Ku80 이성애는 DSB에 결합하여 DNA-PKcs 및 p53 결합 단백질 1(53BP1)29,,30을모집한다. 53BP1은 G1에서 절제하는 장벽역할을 하여 NHEJ31,,32를홍보하면서 HR을 차단하지만, S 단계에서 BRCA1 의존적 방식으로 제거되어,33,34의절제술이 발생할 수 있다. 따라서 53BP1과 BRCA1은 DSB 수리에서 반대 역할을 하며, 53BP1은 NHEJ 촉진제이며 BRCA1은 HR을 통해 파손을 복구할 수 있습니다.

실험실에서, DSB 형성은 이온화 방사선(IR)에 의해 유도될 수 있다. 이 예는 4 Gy의 고용량을 활용하지만, 1 Gy 및 2 Gy는 또한 풍부한 단백질에 의한 포시 형성의 분석에 적합한 상당한 양의 DSB를 생성한다. 사용되는 방사선의 종류와 투여량은 DNA와 세포에서 다른 병변으로 이어질 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다: IR은 DSB를 유도하는 동안, 또한 단일 가닥 파손 또는 염기 수정을 일으킬 수 있습니다 (조사 선형 에너지 전송에 대한참조35,,36 및 DNA 손상의 유형). 이온화 방사선 유도 포시(IRIF) 형성 및 이들의 클리어런스의 운동을 결정하기 위해, 이는 활성DDR8,9,,37,,38의손상 및 반전의 수리를 나타내며, 이온화 후 다른 시점에서 포시 형성을 모니터링할 수 있다., 모든 주요 DNA 손상 단백질의 활성화 및 클리어런스의 타이밍은39로알려져 있으며, 많은 사람들이 주요 사건의 대리 마커로 조사된다. 예를 들어, ssDNA에 대한 높은 친화력을 지닌 pRPA는 휴식 절제의 대리로서 사용되며, MRN 단백질(MRE11, RAD50, NBS1) 및 엑소뉴클레아제도 절제술 효율을 평가하는데 사용될 수 있다. RAD51, BRCA1, BRCA2(유방암 형 2형 감수성 단백질) 및 PALB2(BRCA2의 파트너 및 국소화)가 HR 효율을 평가하기 위해 모니터링될 수 있지만, 쿠 단백질 또는 53BP1의 존재는 NHEJ(도1)의마커로 사용된다.

DNA 수리 기계의 단백질이 서로 를 모집하여 슈퍼 복합체에서 서로 모집하고 조립함에 따라, DNA 단백질 및 단백질 단백질 상호 작용은 시간이 지남에 따라 개별 적인 국소화를 따르고 단백질의 공동 국소화를 분석함으로써 추론 될 수 있으며, 세포40,,41,,42에서신호가 겹쳐서 시각화됩니다. 세포주에서, 게놈 편집을 통해 또는 플라스미드 기반 돌연변이의 과발현에 의해 특정 DNA 복구 유전자에 포인트 돌연변이 또는 삭제의 도입은 DNA 손상(예를 들어, γH2AX를 가진 공동 국소화) 또는 복잡한 조립(예를 들어, 다른 단백질과 공동 국소화) 또는 복잡한 조립(다른 단백질과 공동 국소화) DNA 에 대한 영향을 받아 특정 잔류물 및 가능한 역할에 대한 조사를 가능하게 합니다. 여기서, 우리는 시간이 지남에 따라 γH2AX foci를 따라 DSB의 형성 및 해상도를 조사하기 위한 의미로 간접 면역 형광을 사용합니다. 또한 DSB 수리의 주요 플레이어에 의한 포시 형성 및 공동 국소화 분석의 한 가지 예를 제시합니다: p53 결합 단백질 1 (53BP1)32. 앞에서 언급했듯이, 53BP1은 DNA 수리 경로 선택의 중심으로 간주됩니다. 53BP1 축적 및 γH2AX와의 공동 국소화에 따라 세포 주기 단계, DNA 손상 축적 및 DSB를 복구하는 데 사용되는 경로에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 간접 면역국화의 목적은 세포주에서 DNA 손상 복구의 효율을 평가하는 것입니다, 이 연구에서와 같은 IR에 이어, 또는 세포의 다양한 스트레스에 노출 후, DNA 교차링크에서 복제 포크의 막힘에 이르기까지(DNA 손상 제의 목록은 표 1에제공된다).

Figure 1
그림 1: DNA 이중 가닥 브레이크(DSB) 수리 경로.
DSB 수리에는 두 가지 주요 경로가 포함됩니다: 동종 재조합(HR, 왼쪽) 및 비동호동성 최종 결합(NHEJ, 오른쪽). 휴식 후, 단백질은 휴식(γH2AX)을 표시하고, 최종 절제술(MRN)에 참여하고, 절제된 ssDNA(pRPA)를 코팅하고, 재조합(BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) 또는 제한 절제술을 촉진하고 NHEJ(53BP1)를 촉진한다. 그밖 단백질은 손상 복구에 참여합니다, 그러나 열거된 단백질은 간접적인 면역 형광에 선행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

DNA 손상 에이전트 행동 메커니즘 권장 용량
γ 선/엑스레이 방사선
일부 통제되지 않는 세포 효과와 이중 좌초 휴식의 형성		 1-4 Gy
36 아르 이온 방사선
이중 좌초 휴식의 형성		 270 케브/μm
α 입자 방사선
이중 좌초 휴식의 형성		 116 케브/μm
블레오마이신 DNA 합성 억제제 0.4-2 μg/mL
캄프토테신 포포아소아제I의 억제제 I 10-200 nM
시스플라틴 알키라팅 에이전트
(인트라스트랜드 크로스링크 유도)		 0.25-2 μM
독소루비신 상호 작용 에이전트
토포이소머라제 II의 억제제		 10-200 nM
에토포사이드 토포이소머라제 II의 억제제 10 μM
하이드록수레아 DNA 합성 억제제
(리보뉴클레오티드 환원효소)		 10-200 μM
메틸 메탄술포네이트 알키라팅 에이전트 0.25-2 mM
미토마이신 C 알키라팅 에이전트 0.25-2 μM
자외선(UV) 티미딘 디머 의 형성
(DNA 사슬의 왜곡 생성)		 50-100 mJ/cm2

표 1: 제독독성 제고품. DNA 손상 에이전트의 예, 행동의 그들의 기계장치 및 제안된 작업 농도에 근거를 둔 유도된 손상.

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Protocol

1. HeLa 세포 배양

  1. 16-18 시간 동안 50 °C에서 1 M HCl로 둥근 유리 커버립을 사전 처리하십시오. ddH2O로 헹구고 100 % EtOH에 보관하십시오.
  2. 세포 배양 배지 준비: DMEM 배지에 10%(v/v) FBS를 추가합니다.
  3. 멸균 12웰 플레이트에서 4.0 x 104 셀/잘 성장하여 가습된 인큐베이터에서 18mm 원형 유리 커버슬립과 5% CO2를 제공합니다. 세포를 80%의 합류(약 24시간)로 증가시다.

2. 방사선을 가진 세포 처리 (IR)

  1. 이중 가닥 파손의 형성을 유도하기 위해 세포를 4 Gy γ-조사(대조군: 조사 없음, t=0)에 노출시킵니다. 감마셀-40에서는 분당 0.815Gy에서 4.54분에 해당합니다.
  2. 적절한 시간 길이에 대한 가습 된 인큐베이터에서 37 °C 및 5 % CO2에서 세포를 배양하십시오 (여기서 선택된 시간 점은 t = 1, 2, 4, 16 h).

3. 핵 추출 및 세포 고정

  1. 재고 솔루션 준비: 0.2 M PIPES (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M 자당, 1 M MgCl2,0.1 M EGTA (pH 8.0).
  2. 원자력 추출 버퍼(NEB) 준비: 용해 10m M PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM 자당, 3 mM MgCl2,1 mM EGTA (pH 8.0) 및 0.5% (v/v) dDH2O믹스.
  3. 4% (v/v) 파라포름알데히드(PFA): 30mL PBS에서 16% PFA 수성 용액의 10mL를 용해하십시오. 완전히 녹을 때까지 섞습니다.
  4. 적절한 시점(t=0, 1, 2, 4, 16h)에서 PBS 1mL로 두 번 세척합니다. PBS를 완전히 제거합니다.
  5. 세포 핵 추출을 위해 각 웰에 NEB200 μL을 추가합니다(세포질은 저하되고 핵만 남아 있음)(도2). 실온에서 2분 동안 배양하고 완전히 제거하십시오.
    참고: 2분을 초과하지 마십시오.

Figure 2
그림 2: 핵 추출.
(왼쪽) 및 포스트 (오른쪽) 핵 추출 전에 세포의 대표적인 이미지. 세포질은 소화되어야 하지만 핵 구조는 그대로 포스트 추출(오른쪽)으로 유지되어야 합니다. (A) 20배 배율; 스케일 바 = 20 μm 및 (B) 40배율; 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. PBS의 1 mL로 셀을 씻으시면. PBS를 완전히 제거합니다. PBS를 신중하게 추가하면 세포는 이 단계에서 매우 취약합니다.
  2. 세포 고정을 위해 각 웰에 4% (v/v) PFA의 200 μL을 추가합니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. PFA를 완전히 제거합니다.
  3. PBS 1mL를 추가합니다.
    참고: 셀은 4°C에서 PBS에 저장할 수 있습니다.

4. 면역 형광 염색

  1. 차단 솔루션 준비: PBS에서 5% BSA(w/v)를 용해하고 0.3% (v/v) 트리톤 X-100을 추가합니다. 완전히 녹을 때까지 섞습니다.
  2. 희석 버퍼 준비: PBS에서 1% BSA(w/v)를 용해하고 0.3% (v/v) 트리톤 X-100을 추가합니다. 완전히 녹을 때까지 섞습니다.
  3. 블로킹의 경우 각 웰에 200μL의 블로킹 솔루션을 추가합니다. 실온에서 2시간 또는 4°C에서 16-18시간 동안 배양합니다.
    참고: 염소 항체가 사용되는 경우 블로킹 용액에 염소 세럼을 5%를 추가합니다.
  4. 희석 완충제에서 1 차 항체를 희석 (1:500; 항체 목록에 대한 표 2 참조) 잘 혼합 될 때까지 소용돌이.
    참고: 염소 항체를 사용하는 경우 1% 염소 세럼을 희석 버퍼에 추가합니다.
  5. 습도/인큐베이션 박스에 파라필름 조각을 부착합니다. 1차 항체의 10 μL을 추가합니다(한 방울에). 커버슬립의 한 가장자리를 드롭과 정렬하고 파라필름에 천천히 낮게 정렬하여 액체가 전체에 퍼지도록 합니다(가능한 경우 거품을 피하십시오). 실온에서 2시간 동안 배양하세요.
  6. PBS에서 1분간 세 번 세탁커버를 합니다.
  7. 희석 완충제(최종 농도: 2 μg/mL) 및 소용돌이에 이차 항체를 잘 섞일 때까지 희석시 희석합니다.
  8. 1차 항체에 대해 설명된 바와 같이 이차 항체의 10 μL을 적용한다. 실온에서 2시간 동안 배양하세요.
    참고: 빛으로부터 보호합니다.
항 체 회사 참조 소스
53BP1 셀 시그널링 4937 토끼
안티 마우스 IgG H&L (알렉사 플루어 647) 아캄 (주) ab150103 당나귀
안티 인 - 히스톤 H2A. X (Ser139), 클론 JBW301 밀리포어 05-636 마우스
안티 래빗 IgG H&L (알렉사 플루어 488) 아캄 (주) ab150081 염소

표 2: 사용된 항체. 이 연구에서 사용되는 항체 목록.

  1. PBS에서 1분간 세 번 세탁커버를 합니다.
  2. H2O로 1분간 커버립을 세척합니다.
  3. DAPI를 가진 카운터스테인 DNA: 300 nM DAPI의 10 μL (항체에 대해 설명된 대로), 실온에서 30 분 동안 배양한 다음 글리세롤 기반 마운팅 미디어로 유리 슬라이드에 장착하십시오. 또는 DAPI가 포함된 상업용 안티페이드 장착 매체의 1방울(10μL)을 슬라이드에 넣고 커버슬립을 적용한다. 커버슬립을 부드럽게 누르고 종이 타월로 여분의 액체를 제거합니다.
  4. 투명 매니큐어로 커버립을 밀봉하고 20 분 동안 건조하게하십시오.
  5. 4 °C에서 슬라이드를 저장합니다.

5. 이미지 수집

  1. 침지 오일 한 방울을 60배 의 객관적 렌즈에 놓습니다. DAPI를 사용하여 눈조각을 통해 핵을 찾습니다.
    1. XYZ 이미지 수집의 경우, 오픈 획득 소프트웨어 및 선택 매개 변수: 스캐너 유형: 갈바노; 스캐너 모드: 왕복; 이미지 크기: 512×512; PMT 모드: VBF; PMT 평균: 프레임(4회); PMT 순차 스캔: 라인.
    2. 염료와 검출기를 선택합니다.
      채널(CH1), 염료(DAPI), 검출기(SD1)
      채널(CH2), 염료(알렉사 플루어 488), 검출기(HSD3)
      채널(CH3), 염료(알렉사 플루어 647), 검출기(HSD4)
    3. "Z"에서 ON을 선택합니다.
  2. 라이브 이미지를 조정합니다. 라이브 창의 라이브 버튼을 누릅니다.
    1. 초점을 조정하고 레이저 강도(%), 감도(HV), "PMT" 공구 창에서 게인 및 오프셋을 설정합니다.
      1. 레이저 강도(%)를 조정합니다: 밝기 및 표백을 위해. 레이저 강도가 높을수록 신호가 강해지지만 시편은 표백을 합니다.
      2. 감도(HV): 노이즈 레벨을 조정합니다. HV가 높을수록 신호가 강해지지만 너무 높으면 이미지가 시들게 됩니다.
        참고: 항상 전압을 일정하게 유지합니다.
      3. 오프셋: 배경 레벨을 조정합니다.
    2. Z 스택의 경우 시작/끝(15개 슬라이스)을 선택합니다.
  3. 인수를 시작합니다.
    1. 이미지를 저장하려면 폴더를 선택합니다. LSM 시작 버튼을 눌러 이미지 수집을 시작합니다. 시리즈 완료 버튼을 눌러 이미지 수집을 완료합니다.

6. 데이터 분석

  1. 이미지 분석을 위해 분석 소프트웨어를 엽니다.
    1. 배치 도구 창을 누르고 이미지를 선택하여 출력 폴더를 분석하고 선택합니다.
    2. 분석 도구 창을 누르고 투영을 선택합니다(15개의 슬라이스에서 최대 강도 투영이 표시됩니다).
    3. 입력/출력 설정에서만든 일괄 처리를 선택합니다.
    4. 이미지가 처리될 수 있도록 프로세스를 누릅니다.
    5. 이미지를 .tiff 파일로 내보냅니다.
  2. 핵 포시 정량화를 위해 CellProfiler를 엽니다.
    1. γH2AX 및 53BP1 포시 정량화 파이프라인을 엽니다(보충 정보참조).
    2. 테이블 소프트웨어를 사용하여 그래프 데이터입니다.
  3. 공동 지역화 분석을 위해 CellProfiler를 엽니다.
    1. 지역화 파이프라인을 엽니다(추가 정보참조). 스프레드시트 파일이 생성되어 기본 위치에 저장됩니다. 그러나 그래프 자체는 자동으로 저장되지 않습니다. 결과의 기록을 유지하기 위해 창의 스냅 샷을 하는 것이 좋습니다.
    2. 테이블 소프트웨어를 사용하여 그래프 데이터입니다.

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Representative Results

2일째, 또는 24h 포스트 시드 세포에 커버립, 세포는 한 분열을 겪고 80% 컨실수있습니다. DNA 수리 단백질의 특정 노크 다운 또는 돌연변이는 두 배의 시간을 증가시킬 수 있으며, 유전 독성 치료에 세포를 민감하게 할 수 있으며, 종자 밀도뿐만 아니라 치료 용량도 그에 따라 조정되어야 한다. 최상의 작업 조건을 결정하기 위해, DNA 손상 반응의 타이밍은 시간이 지남에 따라 γH2AX의 서양 블로팅에 의해 확립될 수 있고, 조사에 대한 민감도는 식민지 형성 분석에 의해 식별될 수 있다.

조사로 처리되지 않은 세포는 거의, 있는 경우, γH2AX 포시(도3A)를나타낸다. 그러나, γH2AX 포시 형성은 성장하는 조건에 내재된 각종 응력에 의해 배양된 세포에서 시작될 수 있다: 산성화 된 매체에 컨실루를 남긴 세포, FBS에 있는 물질독성 내독소의 존재, 문화에 사용되는 산소 농도, 몇몇을 인용하기 위하여.

Figure 3
그림 3: 스트레스가 없는 핵 초점.
외부 스트레스가 없는 경우, γH2AX 포시가 관찰되는 경우(A)는 극히 드실 수 있다. 필수 DNA 수리 단백질이 없는 경우, γH2AX 축적은 내인성 소스로 인해 발생하는 파손(B)으로 인해 발생하는 것을 관찰할 수 있다. 수리되지 않은 휴식의 축적은 세포가 "고체" γH2AX 핵 염색(C)으로 표시된 사전 석식이 될 수 있다. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

또한 BRCA1 또는 BRCA2 돌연변이 세포와 같은 주요 DNA 손상 단백질을 고갈시킨 세포에서 내인성 응력의 결과로 발생하는 DNA 파손은 야생형 세포와 같이 수리되지 않고 축적된다. 그 결과, 높은 γH2AX는 정상적인 성장조건(도 3B)에서도HR 결핍 세포에서 관찰될 수 있다. 세포의 하위 인구는 γH2AX(도3C)로"고체" 핵 염색을 나타낼 수 있다. 범핵 얼룩은 세포가 수리 를 넘어 손상으로 압도되고/ 또는 사전 세포가 있음을 나타낼 수 있습니다. 이러한 세포는 전형적으로 확대된 핵, 및 세포질 균 바쿠올의 존재를 특징으로 한다. 또한, γH2AX는 S-phase 및 정지된 복제 포크또는 G2/M 체포에 의해 복제 응력에 의해 트리거될 수 있다. 필요한 경우, 세포 주기 단계는 DNA 함량을 염색하거나 특정 마커와 공동 염색하여 확인할 수 있습니다. DNA 손상 복구 분석을 수행할 때 범핵은 개별화된 초점과 독립적으로 정량화될 수 있습니다.

조사 후, 핵은 γH2AX가 매우 빠르게 국소화되는 이중 가닥 나누기의 큰 숫자를나타낸다(도 4). 최적의 조건에서, 어떤 γH2AX 포시가 조사의 부재에서 관찰되는 경우 는 거의 없다. 조사 후, γH2AX 포시의 형성은 급격히 증가한다. 휴식이 처리되고 수리되면 핵당 포시 수가 감소하고 foci에 대해 양성 세포 수가 줄어듭니다. 초점의 강도와 수는 사용되는 세포주 및 전달 된 조사의 복용량에 따라 다릅니다. 내독신없는 혈청에서 자란 낮은 통로 HeLa 세포에서, 우리는 일상적으로 1과 2 시간 사이에서 피크30 분 및 1 시간 사후 조사에서 foci의 급격한 증가를 관찰한 다음 16 h까지 점진적으로 감소합니다. 이러한 이유로 0, 1, 2, 4 및 16h 게시물 조사의 대표 시간 포인트가 여기에 표시됩니다. 방사 신호, 수리 및 조사에 대한 생존의 행동은 세포주 뿐만 아니라 유전자의 고갈 또는 돌연변이 에 따라 크게 다를 수 있습니다. 이러한 이유로 가장 적합한 시간 점은 실험 및 세포 의존입니다. 실험에서, 16h γH2AX 잔류 포시에서 비조사 세포와 동일한 기저 수준에 도달하였다. 세포주를 천천히 나누는 것으로 작업하면 나중에 시간을 포함하도록 잔류 포시를 모니터링하는 것이 좋습니다.

Figure 4
그림 4: 핵 포시 및 응력(시간 과정)에 따른 정량화.
γH2AX 포시 형성은 t=0(조사 없음)과 표시된 시점에서 조사 후조사(4Gy, t=1, 2, 4, 16h). (A) 대표적인 이미지가 표시됩니다. DAPI는 핵을 나타낸다. 스케일 바 = 5 μm. (B) γH2AX의 핵 포시는 각 시점에 대해 ≥ 100 핵에서 자동화된 정량화(CellProfiler)에 의해 득점되었다. 제기된 생물학적 질문과 수집된 데이터의 유형에 따라 비교및 비판적 이해를 용이하게 하기 위해 원시 데이터를 제시할 수 있는 다양한 옵션을 사용할 수 있습니다. (i) 클라우드 플롯은 평균 ±SD. 기호(*)를 나타내며, 학생의 두 개의 꼬리 t-테스트를 사용하여 제어에 비해 통계적 유의를 나타낸다: *** p ≤ 0.0001, (ii) 유도 곡선은 평균 ±SEM, (iii) 핵당 10개 이상의 포시를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

반대로, DNA 손상 수리 기능에 대한 결핍된 세포에서, γH2AX 포시는 조사(t=0h)의 부재시 축적되고, 장기간조사(t=16h, t=24h)에서도 수리를 지연하거나 결석할 수 있다. 야생 유형과 돌연변이 세포 사이의 직접 비교는 돌연변이 된 유전자의 DNA 수리 기능에 대한 귀중한 정보를 제공하고 수리 유형을 암시 할 수 있습니다. NHEJ의 결핍은 S-phase에서 HR에 의해 수리하도록 강요 할 수 있지만, HR에 의해 절제되고 HR에 의해 수리되어야하는 DSB는 NHEJ에 의해 수리되지 않습니다. 이러한 이유로, 손상 포스트 S-phase의 축적은 NHEJ 결함에 대한 HR 결핍, 높은 γH2AX 수준 사후 부서 힌트를 나타낼 수 있다.

여러 단백질이 동일한 세포에서 조사될 때, 상이한 동물 종에서 제기된 1차 항체를 멀티플렉싱하고 뚜렷한 형광으로 표지된 이차 항체로 이를 드러냄으로써 공동 국소화를 연구할 수있다(도 5). 공동 국소화는 단백질(i)이 휴식(ii)에 채용되는지 여부를 적시에 모집하는지, (iii) DNA 수리 단지에서 조립되는지를 나타낸다. 공동 지역화를 원할 때, 일반적으로 받아들여지는 질적 방법은 다른 채널(즉, 녹색 및 빨간색)의 간단한 오버레이로 결과를 제시하는 것이다. 녹색과 빨간색의 중첩은 두 가지 단백질이 동일한픽셀(그림 5A)에존재하는 노란색 핫스팟을 야기합니다. 그러나, 이 방법은 두 채널에서 수집된 상대신호 강도에 의존하기 때문에 한계가 있고, 두 형광은 신호 강도에 차이가 있을 수 있다. 따라서 오버레이 메서드는 공동 지역화 이벤트의 시각적 추정치를 생성하는 데 도움이 되지만 정량적 목적에는 적합하지 않습니다. 공동 국소화의 정량적 분석은 개체 기반 접근법(도 5B(i-iii) 또는 강도 상관계수계(ICCB) 분석(도5B(iv)을 수행하는 통계 접근법에 의해 달성될 수 있다.Figure 5B 공동 지역화 분석을 위한 몇 가지 도구를 사용할 수 있습니다., JACoP 포함 (그냥 또 다른 공동 지역화 플러그인; https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html) 그리고 "Colocalization" 파이프라인 (CellProfiler) 여기에 활용, ICCB 도구로 사용할 수 있습니다., 형광 강도 사이의 관계를 평가 하기 위해. 이는 주로 두 변수 간의 선형 관계의 강도를 측정하는 상관 관계 계수(Pearson의 계수)를 계산하여 수행됩니다. 형광 공동 국소화는 각 픽셀에 대한 두 번째 형광(red)의 강도에 대해 하나의 형광(녹색)의 강도가 플롯되는 산란 플롯에서 그래픽으로 나타낼 수 있다. 완전한 공동 지역화는 직선 주위에 클러스터된 점을 생성하며, 경사는 두 색상의 형광 비율을 반영합니다. 반대로, 공동 지역화가 부족하면 두 개의 개별 그룹(축을 따라 분산됨)으로 포인트를 분포하게 되는데, 각 그룹은 다른 색상에서 신호가 거의 또는 전혀 없는 한 색상의 다양한 신호 수준을 보여줍니다. Pearson의 계수 값은 1에서 -1까지이며, 완전한 양수 상관 관계에 대해 1, 음의 상관 관계에 대한 -1, 상관 관계가 없음을 나타내는 0이 있습니다. 또는 Pclc 방법을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 방사선에 적용되었습니다 (세부 사항 및 자유롭게 사용할 수있는 방법에 대한36 참조).

Figure 5
그림 5: 공동 지역화 분석.
상이한 종에 대하여 제기된 몇몇 항체를 사용하여 (여기, 항 마우스 γH2AX (빨강) 및 반대로 토끼 53BP1 (녹색)), 몇몇 단백질을 조사할 수 있습니다. (A) 대표적인 이미지가 표시됩니다. DAPI는 핵을 나타낸다. 공동 지역화는 색상과 영역 중복으로 시각화됩니다(여기에 빨간색 + 녹색 = 노란색). 스케일 바 = 5 μm. (B) 개인 및 공동 지역화 포시는 여러 소프트웨어 중 하나를 사용하여 개별적으로 정량화할 수 있습니다(여기, CellProfiler, 메인 텍스트의 다른 옵션 참조) 플롯. (i-iii) 픽셀 기반 접근 방식(ICCB 분석)을 사용하여 공동 지역화를 위해 얻은 공동 지역화(iv) 상관 관계 결과를 결정하는 데 사용되는 개체 기반 접근 방식입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

현미경 검사법에 의한 DNA 손상 수리의 타이밍 그리고 효율의 분석은 DNA 복구 기계가 일반적인 세포 및 암과 같은 인간 병리에서 어떻게 작동하는지 이해하는 데 필수적임이 입증되었습니다.

인계판에서 활성단백질을 검출할 수 있는 특정 항체의 개발(예: γH2AX, pRPA, pRAD50 등10,,23,,39,,43)사건의 DNA 수리 타이밍과 세포 주기와의 동기화를 더 잘 이해하는 데 중심적인 역할을 해왔다. 이러한 성공은 질량 분석 및 면역 국소화(검토를 위한32참조)에 의해 53BP1 인산 잔류물의 분석에 의해 예시되며, 이는 이 무겁게 변형된 단백질의 기능을 이해하는 데 도움이 되었다. STORM과 같은 고해상도 현미경 기술의 상승과 세포에서 작은 항체 (나노 체) 직접 단백질 상호 작용의 사용 증가와 함께 더 접근하고 정확해지고 있습니다. 그러나, 여기에서 설명한 것과 같은 간접적인 면역 불광은 새로운 잠재적인 DNA 복구 단백질을 조사하고 행동 및 단백질 파트너의 타이밍을 찾고 있을 때 능력을 발휘하기 위하여 필수적인 실험 남아 있습니다.

간접 면역 불면의 성공은 전적으로 두 가지 기준에 달려 있습니다: (i) 시약의 질 - 특히 활성 DNA 수리 단백질에 인잔류물을 검출하는 데 사용되는 항체, (ii) 실험의 타이밍. 출판 된 프로토콜과 항체를 사용 하 여 사용 가능 하면 권장 해야 합니다. 새로운 항체를 사용하거나 새로운 단백질을 조사할 때, 항체는 항체가 검증되어야 하며, 특이성은 세포내 표적 단백질을 노크하여 확립되어야 하며(신호가 손실되어야 함) 또는 단백질 고갈(RAD51AP1에 대해44에서 수행된 바와 같이, 인큐베이션 전에 특정 항체를 고갈시키기 위한 정제단백질의 사용).

최적의 차단 조건 및 항체 희석은 유물및 비특이적 얼룩을 최소화하기 위해 확립되어야 합니다. 완충제는 신선하게 준비되고 핵 추출이 수행되면 핵손상을 피하기 위해 시간을 정해야 합니다. 인간 세포의 수리 효율을 조사할 때 핵 포시의 정량화를 수행해야 하며 핵 추출은 세포질 단백질을 제외하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 핵 추출 단계를 수행하지 않는 것이 유익할 수 있습니다, 예를 들어 그것의 세포 파트너와 상호 작용하지 않는 것으로 의심되는 돌연변이 단백질이 DNA 손상에 핵으로 전이하는 것을 실패하는지 여부를 조사하기 위하여.

또한 이미징의 품질은 데이터를 적절하게 수집, 분석 및 정확한 데이터 플롯을 확보할 수 있도록 하는 데 가장 중요합니다. 1차 항체의 특이성, 선택된 형광의 특이성(이차 항체)의 특이성, 광표백에 대한 시료 보호, 파종 세포 에 대한 지원 선택, 좋은 샘플링(질문에 따라 최소 30~300개의 핵) 및 경우에 따라 후처리(deconvolution 또는 스펙트럼 혼합)가 포함된다. 가능하면 수천 개의 셀을 이미지화 할 수있는 전체 커버 슬립의 자동화 된 이미징이 제안됩니다. 실험을 설정하기 전에 핵심 시설과 같은 이미징 전문가를 참여시키는 것은 결과의 품질을 크게 향상시킬 수 있으므로 고려해야합니다.

마지막으로, 사용되는 세포주를 기반으로, 수행된 치료, 및 조사된 단백질에 기초하여, 초점의 기저 수준은 크게 달라질 수 있으며 해석하기 어려운 결과를 만들 수 있다. 이러한 이유로 원시 데이터는 독자가 이해할 수 있는 관점에서 효과적인 형식으로 요약, 처리, 분석 및 표시되는 것이 중요합니다. 비교를 촉진하고 데이터 내에서 추세와 관계를 공개합니다. 도 4B에서,동일한 정량화는 세 가지 버전으로 플롯된다: (i) DSBs 후 초점의 총 수 (구름 플롯) 시간이 지남에 따라 초점의 조사 (ii) 유도 -운동학- (iii) 양세포의 %(>10 foci/nucleus).

클라우드 플롯은 가능한 한 선호되어야합니다(그림 4B(i)는 모든 데이터 포인트를 차별 없이 표시하므로 실험에 대한 가장 포괄적인 개요를 제공합니다. 그러나, 임의배경 차단(대부분의 세포주에서 5foci) 이상의 양수 세포의 수, 시간이 지남에 따라 포시 공동 지역화, 포시 유도, 또는 픽셀 크기 또는 강도와 같은 초점의 품질 측정과 같은 보다 선택적이고 관련성 있는 정보를 플로팅하는 것은 경우에 따라 더 적합할 수 있으며, 저자의 책임이다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 샌안토니오 지역 재단의 보조금에 의해 지원되었다. 메이스 암 센터는 NCI 암 센터 지원 코어 보조금 P30 CA054174에 의해 지원됩니다. 시약을 조달하는 데 도움을 준 스티븐 할로웨이와 우주 및 현미경 용량 제공에 대한 성 연구소에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution Electron Microscopy Sciences 15710 Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059 Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) Neuvitro NC0308920 Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] Gibco 11965118 Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Research Products International E57060 Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 104370028 The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2) Research Products International M24000 Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) Research Products International P40150 Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI Invitrogen S36973 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl) Research Products International S23020 Nuclear extraction buffer.
Sucrose Research Products International S24060 Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides Fisherbrand 1255015 Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells Costar 3513 Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100 AmericanBio AB02025 Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red Gibco 12604021 Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red Gibco 15400054 TrypLE can be used instead.

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References

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생물학 제160 면역형광 공동 국소화 핵포시 조사 유도 포시 DNA 손상 수리
면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화
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de la Peña Avalos, B., Dray, E. Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (160), e61447, doi:10.3791/61447 (2020).

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