Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في عينات بلازما الدم من مرضى السرطان

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61449
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Cancer Genomics and BioComputing of Complex Diseases laboratory, The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2The Data Science Institute, Bar-Ilan University, 3The Dangoor Centre For Personalized Medicine, Bar-Ilan University

Summary

في هذه الورقة نقدم بروتوكول مفصل لتقنية خزعة السائل غير الغازية، بما في ذلك جمع الدم، البلازما وفصل معطف بافي، استخراج CFDNA والحمض النووي الجرثومي، وتحديد كم CFDNA أو الحمض النووي الجرومي، وتحليل إثراء جزء CFDNA.

Abstract

تحديد الطفرات في أورام مرضى السرطان هو خطوة هامة جدا في إدارة الأمراض. هذه الطفرات بمثابة المؤشرات الحيوية لتشخيص الورم وكذلك لاختيار العلاج واستجابته في مرضى السرطان. الطريقة القياسية الذهبية الحالية للكشف عن الطفرات الورم ينطوي على اختبار وراثي للحمض النووي الورم عن طريق خزعات الورم. ومع ذلك، من الصعب إجراء هذه الطريقة الغازية بشكل متكرر كاختبار متابعة لذخيرة الورم الطفرة. خزعة السائل هو أسلوب جديد وناشئ للكشف عن الطفرات الورمية باعتبارها سهلة الاستخدام وغير الغازية نهج الخزعة.

الخلايا السرطانية تتكاثر بسرعة. بالتوازي، العديد من الخلايا السرطانية تخضع لتخثر الدم. يتم إطلاق الحطام من هذه الخلايا في نظام الدورة الدموية للمريض ، جنبا إلى جنب مع قطع الحمض النووي المجزأة بشكل دقيق ، تسمى شظايا الحمض النووي الخالية من الخلايا (CFDNA) ، والتي تحمل طفرات الحمض النووي الورم. لذلك ، لتحديد المؤشرات الحيوية القائمة على عقود زعنف نا باستخدام تقنية خزعة سائلة ، يتم جمع عينات الدم من مرضى السرطان ، يليها فصل البلازما والمعطف البافي. بعد ذلك ، تتم معالجة البلازما لعزل cfDNA ، ويتم معالجة المعطف الماطفي الخاص به لعزل الحمض النووي الجينومي للمريض. ثم يتم فحص كل من عينات الحمض النووي لكمية ونوعية؛ وتحليلها للطفرات باستخدام الجيل التالي من تقنيات التسلسل (NGS).

في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول مفصل للخزعة السائلة، بما في ذلك جمع الدم، والبلازما، وفصل المعطف البافي، واستخراج الحمض النووي لثنائي cfDNA والجراثيم، وتحديد كمية الحمض النووي للحمض النووي باستخدام الـCFDNA أو الحمض النووي الجرثومي، وتحليل الإثراء لشظايا cfDNA.

Introduction

وقد أدت التطورات التكنولوجية إلى تسلسل مئات من الجينوم السرطان و النسخ1. وقد ساهم هذا في فهم المناظر الطبيعية للتغيرات الجزيئية عبر أنواع السرطان المختلفة2. وقد ساعدت دراسات أخرى على هذه المناظر الطبيعية تميز التعديلات الجسدية المتتابعة والانصهار الجيني3 التي تشارك في السرطان أو تطور الورم ، عن طريق تعطيل مسارات الخلايا المبرمجة تسلسليا4. ولذلك، يمكن أن الطفرات الجسدية وندمج الجينات الجينات تقديم معلومات حول الأورام من خلال العمل كعلامات حيوية في المرضى الفردية لنوع معين من الورم5، وتحديد الأورام الأولية القائمة التكهن6، تصنيف الأورام الثانوية على أساس التغيرات الجزيئية7، وتحديد أهداف الورم القابلة للأدوية8. قد تسهل هذه المعلومات في اختيار العلاج المخصص لمرضى السرطان وفي تحديد ردود إيجابية وسلبية العلاج9. ومع ذلك، الحصول على مواد الورم لتحديد التنميط الجينومي للأنسجة الورم هو إجراء الغازية10. وعلاوة على ذلك, خزعة الورم لا تشمل سوى جزء صغير من ورم غير متجانسة; ويجوز لذلك، لا يكون ممثلا للملامح الجزيئية للورم كله11. يتطلب الرصد المتسلسل والورم genotyping مجموعة متكررة من أنسجة الورم ، والتي ، عادة ، غير مجدية بسبب غزو إجراء خزعة الورم وقضايا السلامة التي تنشأ عن مثل هذه الإجراءات12.

تقنية خزعة السائل، من ناحية أخرى، وقد اكتسبت اهتماما هائلا في علم الأورام الدقة على مدى العقد الماضي13،14. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم الغازية من هذه التقنية، وإمكانية تكرار ذلك في نقاط زمنية متعددة، مما يتيح تقنية سهلة الاستخدام وآمنة لرصد دورات المرض15،16. تعتمد الخزعة السائلة على ظاهرة تتكاثر فيها الخلايا السرطانية بسرعة ، وفي نفس الوقت يخضع العديد منها للتخثر والناخر. وهذا يؤدي إلى إطلاق حطام الخلايا المبرمج في دم المرضى ، جنبا إلى جنب مع شظايا الحمض النووي التي يتم قطعها بأحجام دقيقة خلال المبرمج17. إن موت الخلايا غير السرطانية يؤدي أيضاً إلى إطلاق حطامها الخلوي في الدم، ومع ذلك، فإن معدل موت الخلايا المبرمج في هذه الخلايا أقل بكثير نسبياً من الخلايا السرطانية18. عقلاني من تقنية خزعة السائل هو التقاط الجزيئات المرتبطة بالورم مثل الحمض النووي, RNA, البروتينات, والخلايا السرطانية14,19 التي تدور باستمرار في الدم. تقنيات مختلفة20 يمكن استخدامها لتحليل هذه الجزيئات بما في ذلك الجيل التالي التسلسل (NGS)، الرقمية القطيرة البوليميراز سلسلة التفاعل (DdPCR)، PCR في الوقت الحقيقي، والمناعة المرتبطة الانزيم المقايسة (ELISA). تقنية خزعة السائل تمكن تحديد المؤشرات الحيوية التي هي خصائص الخلايا السرطانية. هذه الجزيئات العلامات الحيوية ليست فقط إطلاقها من أجزاء محددة من الورم، ولكن بدلا من جميع أجزاء الورم21. وبالتالي، علامات محددة في خزعة السائل يمثل التنميط الجزيئي للورم غير متجانسة بالكامل، بالإضافة إلى الأورام الأخرى في الجسم، وبالتالي، وجود مزايا على الأنسجة على أساس تقنية22.

وcfDNA لديه فترة قصيرة نصف العمر في الدم المتداولة تتراوح بين بضع دقائق إلى 1-2 ساعة23. ومع ذلك، فإن فترة نصف العمر القصيرة لـ cfDNA تسهل إجراء التحليلات في الوقت الحقيقي من خلال تقييم استجابة العلاج وتقييمات الورم الديناميكية. تشير مستويات cfDNA المشتقة من الورم إلى التكهن بمرحلة الورم / حجمها الذي أظهرته العديد من الدراسات ، والتي أظهرت وجود علاقة بين مستويات CFDNA ونتائج البقاء على قيد الحياة24. وعلاوة على ذلك، أثبتت الدراسات أن CFDNA لديه قدرة تنبؤ أفضل من علامات الورم الموجودة25. التكهن من cfDNA هو أكثر وضوحا بعد علاج السرطان, مستويات أعلى من cfDNA بعد العلاج يرتبط بشكل جيد مع انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة, ومقاومة للعلاج. في حين, انخفاض مستويات cfDNA بعد العلاج يتوافق عموما مع استجابة إيجابية للعلاج. وبالإضافة إلى ذلك، ييسر نظام cfDNA الكشف المبكر عن الاستجابة للعلاج من طرق الكشف التقليدية.

وcfDNA يزيد من إمكانية الكشف المبكر عن الطفرات المرتبطة بالسرطان: خلال مرحلة مبكرة من المرض15, بداية الأعراض26 وقبل تشخيص السرطان تصل إلى 2 سنة27. كما يتم الافراج عن cfDNA من مناطق أو بؤر متعددة الورم، وتحليلها يوفر نظرة شاملة للجينوم الورم أنه يمثل28. ولذلك، فإن cfDNA تمكن من الكشف عن الطفرات الجسدية التي قد غاب في عينات الأنسجة29. كما يمكن الكشف عن التغايرية داخل الورم والطفرات تحت النسيلة عن طريق التسلسل العميق للمناطق الجينومية التي تمتد على آلاف القواعد، وبالتالي فإن تحليل cfDNA تمكن من الكشف عن أنواع فرعية جزيئية محددة مع تواقيع الجينومية المتميزة13. للحصول على مستوى مماثل من المعلومات من خلال عينة الأنسجة كان هناك حاجة إلى العديد من الخزعات الصلبة.

وعلاوة على ذلك، فإن مستويات cfDNA في المرضى الذين يعانون من مرض محلي مثل القولون, المبيض, وسرطان الرئة بعد العلاج الجراحي و / أو العلاج الكيميائي, أظهرت أن علامة قوية التكهن لتكرار السرطان ونتائج العلاج20. وعلاوة على ذلك، في المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والثدي والرئة، يمكن لتحليلات cfDNA من الدم الكشف بنجاح عن التغيرات الورم محددة، مما أدى إلى التنبؤ الدقيق لتكرار عدة أشهر مقدما13. وعلاوة على ذلك, علامات المقاومة العلاج, مثل الطفرات KRAS في المرضى الذين يعانون من CRC تلقي العلاج المضاد EGFR30; VAFs للجينات مثل PIK3CA, MED1 أو EGFR في المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي بعد العلاج مع العلاجات المختلفة31; وEGFR T790M المقاومة الطفرة في سرطان الرئة المرضى الذين عولجوا مع المعارف التقليدية التي تستهدف EGFRيمكن أيضا تحديدها من خلال تحليل cfDNA.

باختصار، تحليل cfDNA يمكن أن تستخدم لتحديد المؤشرات الحيوية الدقيقة في مجال الأورام13،33. في هذا البروتوكول، تمت معالجة عينات دم من 3 مرضى الورم الدبقي و 3 ضوابط صحية للحصول على الحمض النووي الجينومي من WBCs وCFDNA من البلازما. في سرطان الورم الدبقي، والطفرات في IDH، TERT، ATRX، EGFR، وTP53 بمثابة علامات التشخيص وكذلك التكهن التي قد تساعد في التشخيص المبكر للأورام الدبقية، وتصنيف أنواع مختلفة من الأورام الدبقية، وتوجيه العلاج الدقيق للمريض الفرد وفهم استجابة العلاج34،35. يمكن تحديد الحالة الطفرة لهذه الجينات باستخدام CFDNA المستمدة من الدم. في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول مفصل من cfDNA المشتقة من البلازما التي تم استخدامها لدراسة التغيرات الطفرة في سرطان الورم الدبقي12. مثل هذا بروتوكول خزعة السائل المستندة إلى cfDNA الموضح في هذه المقالة يمكن استخدامه لدراسة التغيرات الطفرة في العديد من أنواع السرطان الأخرى. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة حديثة أن خزعة السائل المستندة إلى CFDNA يمكن الكشف عن 50 نوعا مختلفا منالسرطانات 36.

جمع عينات الدم وتخزينها وشحنها هي خطوات حاسمة في هذا البروتوكول، حيث أن درجة الحرارة غير المنضبطة خلال هذه الخطوات تتسبب في تحلل مراكز حماية الملوثات البرية ، مما يؤدي إلى إطلاق الحمض النووي الجينومي من WBC في البلازما والتسبب في تلوث عينة cfDNA ، مما يؤثر على بقية الإجراء37. يمكن أن ينكمز الانحلال بسبب درجة الحرارة غير المنضبطة عمليات إعداد عينة المصب من cfDNA، مثل خطوات PCR38. يحتوي المصل على نسبة عالية من cfDNA الخط الجرثومي بدلاً من البلازما ، على الرغم من أنه يقدم ضوضاء خلفية كبيرة لـ cfDNA المرتبطة بالورم39. ولذلك، لعزل cfDNA المرتبطة بالورم، البلازما هي عينة مناسبة39. وينبغي طرد الدم المسحوب في مضاد للتخثر يحتوي على أنبوب جمع الدم على الفور أو في غضون ما يصل إلى ساعتين، لفصل البلازما وتجنب التلوث بcfDNA. في هذا البروتوكول، يتم استخدام أنابيب جمع الدم CFDNA التجارية المخصصة (انظر جدول المواد)، والتي هي بديل لتخثر الدم التي تحتوي على أنابيب جمع الدم. هذه الأنابيب المخصصة لجمع الدم تحافظ على CFDNA و CFRNA ، وتمنع تحلل WBCs لمدة تصل إلى 30 يومًا في درجة الحرارة المحيطة ، وما يصل إلى 8 أيام عند 37 درجة مئوية. وهذا يسهل الحفاظ على درجة الحرارة المناسبة أثناء شحنة عينة الدم وحتى يتم فصل البلازما وWBC40.

هناك ثلاثة أنواع من منهجيات استخراج cfDNA المتاحة حاليا: عزل المرحلة، السيليكون غشاء محور العمود، والعزلة المغناطيسية القائمة على الخرز41. وأسفرت طريقة عمود الدوران القائم على غشاء السيليكون عن كمية عالية من cfDNA مع سلامة عالية مقارنة مع أساليب استخراج cfDNA الأخرى42.

التقييم الكمي للحمض النووي هو شرط أساسي في خزعة السائل، وهناك حاجة لتطوير بسيطة، بأسعار معقولة، وإجراء موحدة لتنفيذها سهلة والاستخدام على نطاق واسع. ثلاث طرق شائعة الاستخدام لقياس كمي cfDNA هي القياس الطيفي، الفلوريمترية، و qPCR. وثبت أن الأسلوب الفلوريمتري أفضل من الطرق الأخرى المتعلقة بدقة وتكلفة وسهولة إجراء43.

يمكن تقدير سلامة ونقاء cfDNA إما بواسطة الأجاجوز الكهربائي أو الكهربائي الشعري. Agarose electrophoresis لا يظهر حساسية في تركيز منخفض من cfDNA ولا دقة عالية لإظهار حجم جزء دقيق من cfDNA. من ناحية أخرى، الكهربائي الشعري لديه ميزة على الكهربائي agarose من خلال التغلب على التحديات المرتبطة بها، وبالتالي، تستخدم على نطاق واسع من قبل الباحثين لتحليل حجم الجزء cfDNA. في هذا البروتوكول، تم تقدير توزيع حجم جزء من cfDNA معزولة باستخدام أداة كهربائية شعرية آلية (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

قبل جمع الدم، يجب الحصول على موافقة مستنيرة من الأشخاص المشاركين في البحث ويجب الحصول عليها. تم إجراء البحث الموصوف في هذه المخطوطة وفقاً والامتثال لمركز رابين الطبي، ولجنة أخلاقيات إسرائيل (رمز الأخلاقيات: 0039-17-RMC) وكلية الطب دير كريستيان-ألبريخت-Universität zu كييل، لجنة أخلاقيات ألمانيا (رمز الأخلاق: D 405/14).

1- جمع عينات الدم وتخزينها في أنابيب المواد الحافظة لcfDNA أو CFRNA

  1. تسمية بشكل صحيح أنابيب الحفظ
  2. جمع ~ 8 مل من الدم في أنبوب الحفاظ على CF-DNA (انظر جدول المواد)،وذلك باستخدام مجموعة جمع الدم وحامل، وفقا للبروتوكول المؤسسي القياسية ل venipuncture كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: قد يؤدي استخدام مجموعة جمع الدم إلى منع التدفق الخلفي المحتمل للدم من الأنبوب.
    1. محاذاة المريض مع الذراع في وضع الهبوط.
    2. عقد أنبوب تستقيم، مع غطاء تواجه التصاعدي، مع التأكد من أن محتويات أنبوب لا تلمس الغطاء أو طرف إبرة.
    3. كما يبدأ الدم تتدفق في الأنبوب، وإطلاق سراح tourniquet ببطء.
  3. مباشرة بعد أن يتم تعبئة أنبوب مع الدم (قدرة قصوى: 8.4 مل من الدم كله)، عكس بلطف أنبوب (بدوره معصم الذراع التي هي عقد الأنبوب بنسبة 180 درجة إلى أسفل والعودة) 5 مرات لتثبيت العينة.
    ملاحظة: يضمن الانعكاس خلط المادة الحافظة بشكل موحد مع العينة. ومع ذلك، لا يهز محتويات مرة أخرى، حتى قبل إعداد البلازما. يؤدي عدم كفاية خلط المواد الحافظة مع عينة الدم إلى زعزعة استقرار المحتويات وتشكيل الجلطات الدقيقة أو الانحلال الدموي. في هذه المرحلة، يمكن الاستمرار في البروتوكول فورا لفصل البلازما أو أنابيب مملوءة بالدم يمكن الانتظار لمدة تصل إلى 30 يوما في درجة الحرارة المحيطة (15-25 درجة مئوية)، و 8 أيام في 37 درجة مئوية.

2. البلازما وبافي معطف الفصل والتخزين

  1. الطرد المركزي أنبوب الحفظ مملوءة بالدم في 425 × ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لفصل البلازما.
    ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 2.2 و 2.3 في خزانة السلامة الحيوية.
  2. الماص بعناية من طبقة البلازما العليا إلى أنبوب جديد في 1 مل aliquots، دون إزعاج الطبقات السفلى.
  3. نقل بعناية الطبقة التالية من معطف بافي إلى أنبوب جديد (تظهر الطبقة كخاتم فوق الكريات RBC)، مع تجنب RBCs في الطبقة السفلى.
  4. المضي قدما إلى الخطوة 3 مع البلازما والخطوة 4 مع معطف بافي. إذا لزم الأمر تخزين محتويات فصل في -80 درجة مئوية.

3. تنقية تداول cfDNA من 1 مل من البلازما

ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة مع مجموعة تجارية (راجع جدول المواد). يتم توفير كافة المخازن المؤقتة مع مجموعة.

  1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف
    تنبيه: لا تضيف حلول حمضية أو تبيض مباشرة إلى نفايات إعداد العينة. أملاح الغوانيدين الموجودة في عازلة Lysis، ملزم العازلة، وغسل العازلة-1 عند دمجها مع التبييض أو الأحماض يمكن أن تنتج مركبات تفاعلية للغاية.
    1. العازلة ملزمة: مزيج 300 مل من تركيز العازلة ملزمة مع 200 مل من isopropanol 100٪ لجعل 500 مل من العمل العازلة ملزم. يُخزن في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يسمح العازلة الربط الأمثل الربط من الأحماض النووية المتداولة إلى غشاء السيليكا. 500 مل من العازلة ملزمة كافية لمعالجة 276، 138، 92، 69 أو 55 عينات من 1، 2، 3، 4 أو 5 مل من البلازما على التوالي ومستقرة لمدة 1 سنة في درجة حرارة الغرفة.
    2. غسل العازلة-1: مزيج 19 مل من غسل العازلة-1 التركيز مع 25 مل من 96-100٪ الإيثانول لجعل 44 مل من العمل غسل العازلة-1. يُخزن في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: غسل العازلة-1 يزيل الملوثات المرتبطة غشاء السيليكا. 44 مل من العمل غسل العازلة-1 كافية لمعالجة 73 عينات من 1/2/3/4/5 مل من البلازما ومستقرة لمدة 1 سنة في درجة حرارة الغرفة.
    3. غسل العازلة-2: مزيج جيدا 13 مل غسل العازلة-2 التركيز مع 30 مل من 96-100٪ الإيثانول لجعل 43 مل من العمل غسل العازلة-2. يُخزن في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: غسل العازلة-2 يزيل الملوثات المرتبطة غشاء السيليكا. 43 مل من العمل غسل العازلة-2 كافية لمعالجة ~ 56 عينات من 1/2/3/4/5 مل من البلازما ومستقرة لمدة 1 سنة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إلى أنبوب يحتوي على 310 ميكروغرام الناقل النيضبي RNA، إضافة 1550 ميكرولتر من العازلة Elution، لإعداد حل RNA الناقل من 0.2 ميكروغرام /ميكرولتر. بعد حل شامل الناقل RNA، تقسيم الحل إلى aliquots مناسبة، وتخزينها في -30 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية. لا تجميد ذوبان هذه aliquots أكثر من 3 مرات. إلى العازلة Lysis، كما هو مبين في الجدول S1، إضافة الناقل المعاد تشكيله RNA المذابة في العازلة Elution.
      ملاحظة: لأن الناقل RNA لا يذوب مباشرة في مخزن Lysis المؤقت، فإنه يحتاج إلى أن يتم حل أولاً في مخزن مؤقت Elution ثم في Lysis Buffer. أولا، يتم تعزيز الأحماض السيليكا الغشاء النووي ملزمة عندما يكون هناك عدد قليل جدا من الجزيئات المستهدفة الموجودة في العينة. وثانيا، يقل خطر تدهور الحمض النووي الريبي بسبب وجود كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي الحامل.
  2. قبل البدء في العزلة، وجلب الأعمدة والعينات إلى درجة حرارة الغرفة وضبط حجم العينة إلى 1 مل مع المالحة المعقمة الفوسفات المخزنة (PBS)، إذا لزم الأمر. قبل 2 الحرارة حمامات المياه أو كتل التدفئة التي تحتوي على 50 أنابيب أجهزة الطرد المركزي مل و 2 مل أنابيب جمع إلى 60 درجة مئوية و 56 درجة مئوية، على التوالي.
  3. إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل، إضافة 100 ميكرولتر من البروتينات K، 1 مل البلازما، و0.8 مل من العازلة تحلل التي تحتوي على 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الناقل (أعدت في الخطوة 3.1.4). أغلق أنبوب الطرد المركزي بغطاء وخلط المحتويات عن طريق نبض الدوامة لمدة 30 s، مع ضمان دوامة مرئية في الأنبوب. خلط شامل للمحتويات مهم لتحلل كفاءة.
    ملاحظة: مباشرة بعد vortexing انتقل إلى الخطوة 3.4 دون تأخير.
  4. احتضان الحل عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. قم بإزالة الغطاء، وأضف 1.8 مل من المخزن المؤقت للربط إلى الأنبوب، واخلط جيداً مع نبضات النبض لمدة 15-30 s بعد وضع الغطاء.
  6. احتضان الخليط الناتج لمدة 5 دقائق على الجليد وإدراج عمود غشاء السيليكا في جهاز فراغ التي ترتبط مضخة فراغ. ثم، إدراج بقوة تمديد أنبوب 20 مل في العمود المفتوح لمنع تسرب العينة.
  7. صب بعناية خليط المحتضنة في موسع أنبوب العمود والتبديل على مضخة فراغ. بعد كل خليط lysate يعمل تماما من خلال الأعمدة، إيقاف مضخة فراغ، والافراج عن الضغط إلى 0 mbar، وإزالة وتجاهل موسع أنبوب.
    ملاحظة: تجنب التلوث المتبادل، يجب أن يتم تجاهل موسع الأنبوب بعناية، لمنع انتشاره عبر الأعمدة المجاورة.
  8. إزالة العمود من جهاز فراغ، إدراج في أنبوب جمع، والطرد المركزي في 11،000 س ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة، لإزالة أي lysate المتبقية. تجاهل التدفق من خلال.
  9. إضافة 600 μL من غسل العازلة -1 في العمود، والطرد المركزي في 11،000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، والتخلص من تدفق من خلال.
  10. أضف 750 ميكرولتر من الغسيل العازل-2 إلى العمود، والطرد المركزي عند 11000 × ز لمدة دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل التدفق من خلال.
  11. أضف 750 ميكرولتر من الإيثانول (96-100٪) إلى العمود، الطرد المركزي في 11،000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من تدفق من خلال.
  12. الطرد المركزي العمود في 20،000 س ز لمدة 3 دقائق، عن طريق وضعه في أنبوب جمع 2 مل نظيفة.
  13. جفف تجميع عمود الغشاء تمامًا عن طريق وضعه في أنبوب جمع جديد 2 مل مع غطاء مفتوح واحتضان في 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  14. ضع العمود في أنبوب 1.5 مل اِل اِل 1. إلى مركز غشاء العمود، وتطبيق 20-150 ميكرولتر من عازل Elution واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق مع غطاء مغلقة.
    ملاحظة: تأكد من أن المخزن المؤقت Elution هو توازن درجة حرارة الغرفة. في حالة استخدام عازلة elution أقل من 50 ميكرولتر، تأكد من أن يتم الاستغناء عنها بعناية على مركز الغشاء. وهذا يساعد مع elution كاملة من الحمض النووي ملزمة. ومع ذلك، وحدة تخزين elution غير ثابتة ويمكن تغيير حسب التطبيقات المتلقين للمعلومات. يمكن أن يكون eluate المستردة تصل إلى 5 ميكرولتر وبالتأكيد أقل من حجم elution المطبقة على العمود.
  15. الطرد المركزي eluate المستردة في microcentrifuge في 20،000 س ز لمدة 1 دقيقة ل elute الأحماض النووية، وتخزينها في -20 درجة مئوية.

4. تنقية الحمض النووي الجينومي من معطف بافي

ملاحظة: ترد مجموعة الأدوات التجارية المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. المخازن المؤقتة والكواشف المذكورة في البروتوكول أدناه أي، Lysis العازلة A، Lysis العازلة B، غسل العازلة X، غسل العازلة Y، المخزن المؤقت Proteinase، العازلة Elution، وK البروتينات هي جزء من هذه المجموعة التجارية.

  1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف
    تنبيه: لا تضيف حلول حمضية أو تبيض مباشرة إلى نفايات إعداد العينة. أملاح غوانيدين الموجودة في Lysis العازلة B وغسل العازلة X عندما جنبا إلى جنب مع التبييض أو الأحماض، يمكن أن تنتج مركبات تفاعلية للغاية.
    1. غسل العازلة Y: مزيج جيدا 12 مل من غسل العازلة Y التركيز مع الإيثانول 48 مل (96-100٪) للحصول على 60 مل من العمل غسل العازلة Y. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: 60 مل من العمل غسل العازلة Y كافية لمعالجة 100 عينات معطف بافي ومستقرة لمدة 1 سنة.
    2. البروتينات K: إعداد محلول البروتينات K عن طريق حل 30 ملغ البروتينات الlyophilized K في 1.35 مل من البروتينات العازلة.
      ملاحظة: مجموع حل العمل من البروتينات K كافية لمعالجة 52 عينات معطف بافي. يمكن تخزين محلول عمل Proteinase K لمدة 6 أشهر على الأقل عند -20 درجة مئوية.
  2. الخطوات قبل بدء الإجراء
    1. إكويلاب المعطف المُبَافى لدرجة حرارة الغرفة
    2. تعيين كتلة الحرارة أو حمام الماء في 56 درجة مئوية.
  3. تعليق معطف بافي في عازلة Lysis A للحصول على حجم النهائي من 200 ميكرولتر. ثم إضافة 25 ميكرولتر من محلول البروتينات K، و 200 ميكرولتر من Lysis buffer B. مزيج من خلال دوامة واحتضان في 70 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة. تأكد من أن يتم تغطية العينات بالكامل مع حل تحلل.
    ملاحظة: بالنسبة لسلسلة معالجة العينات، قد يكون Buffer Lysis Lysis و Proteinase K مُزَمَجَدًا قبل 10-15 دقيقة من الإجراء، ولكن لم يعد قبل ذلك، حيث أن Proteinase K ذاتيًا في مخزن التحلل A بدون الركيزة.
  4. إضافة 210 μL من 96-100٪ الإيثانول إلى الخليط أعلاه ودوامة بقوة.
    ملاحظة: قد تشكل إضافة الإيثانول عجلاً وتري؛ ومع ذلك، وهذا لن يؤثر على عزل الحمض النووي. تأكد من تحميل الترسب أيضا على العمود، كما هو مبين في الخطوات التالية.
  5. قم بتحميل العينة بأكملها على عمود السيليكا الموضوع في أنبوب جمع. جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة في 11000 x ز. ضع العمود في أنبوب جمع جديد وتجاهل الأنبوب السابق مع التدفق من خلال.
    ملاحظة: كرر خطوة الطرد المركزي إذا لم يتم رسم العينة تماماً خلال المصفوفة.
  6. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل X، وطاردة مركزية لمدة دقيقة عند 11000 × ز، وتجاهل التدفق.
  7. ضع العمود في أنبوب التجميع، وأضف 600 ميكرولتر من الغسيل المؤقت Y على العمود، وطاردة مركزية لمدة 1 دقيقة عند 11000 × ز، وتجاهل التدفق.
  8. مرة أخرى، ضع العمود في أنبوب جمع، والطرد المركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 20،000 س ز لتجفيف غشاء السيليكا.
  9. احتضان العمود في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة، وضعت في أنبوب microcentuge 1.5 مل، ثم إضافة 100 ميكرولتر من عازلة Elution. ثم، elute الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 11،000 ز وتخزينها في -20 درجة مئوية.

5- القياس الكمي للحمض النووي للفلورو والدنا الجينومي

  1. قبل بدء تشغيل البروتوكول، نفذ الخطوات التالية.
    1. تخفيف 2 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي المائل (من الخطوة 4.9) في 1:10 النسب مع المياه فائقة الخطورة خالية من النوى. ونظراً للتركيزات المنخفضة المتوقعة، لا تمييع عينات من الـCFDNA من الخطوة 3-15.
    2. اكويبيل معيار #1 معيار الفحص #2 معيار الفحص لدرجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد ما مجموعه 6 أنابيب واضحة رقيقة الجدران من حجم 0.5 مل.
    ملاحظة: البروتوكول المقدم هو من أجل القياس الكمي لـ 2 cfDNA وعينات الحمض النووي الجينومية 2 ، وبالتالي ، 4 أنابيب لـ 4 عينات ويتطلب هذا الفحص 2 المعايير.
  3. تسمية أغطية الأنبوب.
    ملاحظة: يمكن أن تتداخل عملية وضع العلامات على جانب الأنبوب مع القراءة. بالإضافة إلى ذلك، يتم تسمية أنابيب معيار الفحص بعناية، حيث تتطلب معايرة مقياس الفلور أن تكون المعايير في الترتيب الصحيح.
  4. تمييع الكاشف في 1:200 مع المخزن المؤقت Assay لإعداد حل العمل. ل 4 عينات و 2 المعايير، واستخدام 6 ميكرولتر من الكاشف مقول بالإضافة إلى 1،194 μL من العازلة المقايسة لجعل 1200 ميكرولتر (200 ميكرولتر في كل أنبوب) من حل العمل.
    ملاحظة: لا تستخدم حاوية زجاجية، بدلاً من ذلك استخدام أنبوب بلاستيكي نظيف. يجب أن يحتوي كل أنبوب على ما يقرب من 200 ميكرولتر من الحجم النهائي (يجب أن يحتوي أنبوب معيار الفحص على 190 ميكرولتر من محلول العمل ، ويجب أن يحتوي أنبوب العينة على 180-199 ميكرولتر من محلول العمل). يجب إعداد حل عمل كاف لاستيعاب جميع معايير الفحص والعينات.
  5. في أنابيب معيار القياسات العاملة، أضف 190 ميكرولتر من محلول العمل و10 ميكرولتر معيار اختبار وخلط الحل من خلال دوامة لمدة 2-3 s. تجنب تشكيل فقاعات داخل الحل.
  6. في عينات الأنابيب، إضافة 198 μL حل العمل و 2 ميكرولتر من cfDNA أو الحمض النووي الجينومي. اخلطي الحل عن طريق الدوامة لمدة 2-3 s، واحفظيها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
  7. فيالشاشةالرئيسية للأداة الفلورية، اضغط على 'DNA' وحدد 'dsDNA عالية الحساسية AssDNA Assay'، لعرض شاشة 'معايير'، ثم اضغط على 'نعم' على جهاز قياس الفلور 'معايير' الشاشة لقراءة المعايير.
  8. في غرفة العينة، أدخل أنبوب #1 القياسي، أغلق الغطاء، واضغط على 'اقرأ. إزالة أنبوب بمجرد الانتهاء من القراءة (حوالي 3 s) وتكرار نفس الخطوة #2 القياسية.
  9. يتم عرض عينة الشاشة بعد الانتهاء من عملية المعايرة، ثم إدراج أنبوب عينة وتكرار الخطوة '5.8'. ثم تعرض "عينة الشاشة" قيمة تتوافق مع تركيز العينة بعد التخفيف في أنبوب العينة.
  10. لكل عينة تكرار الخطوة '5.9'، حتى يتم قراءة كافة العينات.
  11. استخدم المعادلة التالية لحساب التركيز الفعلي للعينة.
    Equation 1
    ملاحظة: قيم الفحص هي في نانوغرام / مل ويتوافق مع التركيز بعد التخفيف في أنبوب الفحص. المعادلة المذكورة أعلاه في الخطوة 5.11، قيمة مؤسسة قطر هي القيمة التي تعطى من قبل أداة الفلورمتر، وx هو عدد ميكرولتردات العينة المضافة إلى أنبوب المقايسة. وتتشابه وحدات قيم مؤسسة قطر التي يتم إنشاؤها بواسطة المعادلة مع القيمة التي يوفرها مقياس الفلور. فعلى سبيل المثال، إذا كانت قيمة مقياس الفلور في نانوغرام/مل، تكون وحدات التركيز المحسوبة بالمعادلة هي نانوغرام/مل.

6. توزيع حجم جزء الحمض النووي من cfDNA بواسطة محلل جزء

  1. الخطوة قبل بدء الإجراء: اكويريبرات تركيز صبغة الحمض النووي ومصفوفة هلام الحمض النووي لدرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. إعداد مزيج هلام صبغ
    تنبيه: التعامل مع الحلول بحذر كما هو معروف DMSO لتسهيل دخول الجزيئات العضوية في الأنسجة.
    1. ذوبان بدقة DMSO عن طريق دوامة صبغة الحمض النووي قارورة مركزة لمدة 10 s. Pipette من أصل 15 ميكرولتر من هذا التركيز في قارورة مصفوفة هلام الحمض النووي وتخزينها عند 4 درجة مئوية في الظلام.
    2. مرة أخرى، دوامة القارورة توج لمدة 10 s حتى يتم تصور خلط الجل والصبغة.
    3. صب المزيج على مرشح تدور إلى وعاء أعلى.
    4. ميكروcentة تصفية الدوران في 2240 × ز ± 20٪ لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. تسمية صبغة هلام المعدة في الأنبوب والتخلص من المرشح، وفقا للممارسات المختبرية الجيدة. تسمية الأنبوب وتسجيل تاريخ التحضير.
      ملاحظة: تخلص من الترشيحات حسب الممارسات المختبرية الجيدة. ويمكن استخدام مزيج هلام صبغ ل5 عالية الحساسية (HS) رقائق الحمض النووي. إذا لم يتم استخدامها لأكثر من 1 ساعة، يُخزن عند 4 درجة مئوية. يمكن تخزينها في الظلام لمدة تصل إلى 6 أسابيع.
  3. لتحميل مزيج هلام صبغ، وضمان موقف لوحة قاعدة من رقاقة فتيلة محطة وضبط مقطع في أدنى موقف.
    1. اكويبيل مزيج هلام صبغ إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، مع رصد التعرض للضوء.
    2. اتخاذ رقاقة الحمض النووي HS جديدة من كيس مختومة ووضعها على محطة فتيلة رقاقة، ثم إزالة 9.0 ميكرولتر من مزيج هلام صبغ والاستغناء عنه في الجزء السفلي من رقاقة جيدا، وضعت باسم 'G'.
      ملاحظة: قم برسم مزيج صبغة الجل، وتجنب الجسيمات التي قد تتراكم في الجزء السفلي من القارورة. في حين الاستغناء عن مزيج هلام صبغ في رقاقة الحمض النووي HS جيدا، إدراج غيض من ماصة تماما، لمنع تشكيل فقاعات الهواء كبيرة. وعلاوة على ذلك، فإن لمس الماصات على حواف البئر سوف يؤدي إلى نتائج سيئة.
    3. ضع المكبس عند 1 مل واغلق محطة الـ رقاقة فتيلة. ضمان قفل من النقرات مزلاج وتعيين جهاز ضبط الوقت إلى 60 ق، ثم اضغط على المكبس لأسفل حتى يتم عقده من قبل مقطع، وبعد 60 ث بالضبط، والإفراج عن المكبس مع آلية كليب الإفراج.
    4. عندما يتراجع المكبس على الأقل إلى علامة 0.3 مل، انتظر لمدة 5 ثانية، ثم سحب ببطء إلى موقف 1 مل، ثم فتح محطة فتيلة رقاقة وإزالة مرة أخرى 9.0 ميكرولتر من هلام- صبغ مزيج والاستغناء في الجزء السفلي من رقاقة الحمض النووي HS جيدا، وضعت باسم 'G'.
  4. لتحميل علامة الحمض النووي، الاستغناء 5 ميكرولتر من علامة الحمض النووي في البئر، مع وضع علامة سلم. كرر الإجراء لجميع الآبار عينة 11.
  5. لتحميل السلم والعينات، استغنّي 1 ميكرولتر من سلم الحمض النووي في البئر، مع وضع علامة على رمز السلم، ثم أضف 1 ميكرولتر من العينة (الآبار المستعملة) أو 1 ميكرولتر من العلامة (الآبار غير المستخدمة) في جميع آبار العينة الـ 11.
  6. دوامة رقاقة الحمض النووي HS لمدة 60 s في 2400 دورة في الدقيقة عن طريق وضع رقاقة أفقيا في المحول. تأكد من أن الانتفاخ الذي يصلح رقاقة الحمض النووي HS لا يتلف أثناء الدوامة.
  7. لإدراج رقاقة الحمض النووي HS في أداة محلل التجزئة، افتح الغطاء وتأكد من إدخال خرطوشة القطب بشكل صحيح، ويتم وضع محدد الشريحة إلى "الحمض النووي للحساسية" في أداة محلل التجزئة.
  8. قم بتركيب رقاقة الحمض النووي HS بعناية في الوعاء ، والذي يناسب طريقة واحدة فقط ، ثم تفقد الغطاء من خلال ضمان أن خرطوشة القطب تناسبها تمامًا في آبار رقاقة الحمض النووي HS.
  9. تشير شاشة برنامج محلل الأجزاء إلى شريحة الحمض النووي HS المدرجة والغطاء المغلق، من خلال أيقونة الشريحة في أعلى يسار الشاشة.
  10. لبدء تشغيل شريحة الحمض النووي HS، حدد DsDNA عالية الحساسية AssDna من القائمة 'Assay' على شاشة الصك، ثم ملء الجدول بشكل صحيح من أسماء العينات عن طريق تغذية المعلومات مثل أسماء العينات والتعليقات وبدء تشغيل رقاقة عن طريق النقر على زر'ابدأ' في الجزء العلوي الأيمن من الشاشة.
  11. تنظيف القطب بعد تشغيل رقاقة الحمض النووي HS: على الفور إزالة رقاقة الحمض النووي HS المستخدمة، بمجرد الانتهاء من الفحص والتخلص منه وفقا للممارسات المختبرية الجيدة. تنفيذ الإجراء التالي لضمان الأقطاب نظيفة، دون بقايا بقايا من المقايسة السابقة.
    1. املأ ببطء 350 ميكرولتر من المياه ذات الصف التحليلي في واحدة من آبار أنظف القطب ووضع منظف القطب في أداة محلل التجزئة عن طريق فتح الغطاء ثم إغلاق الغطاء وانتظر حوالي 10 s.
    2. قم بإزالة منظف القطب الكهربائي عن طريق فتح الغطاء وانتظر 10 ق أخرى، حتى يتبخر الماء على الأقطاب الكهربائية قبل إغلاق الغطاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فصل البلازما
8.5-9 مل الدم التي تم جمعها في cfDNA أو CFRNA أنابيب المواد الحافظة تسفر عن حوالي ~ 4 مل البلازما في الحجم. قد يختلف حجم البلازما المنفصلة عن الدم الذي يتم جمعه في أنابيب EDTA وفقًا لدرجة الحرارة. التعرض لأنابيب EDTA التي تحتوي على الدم في درجة حرارة أعلى من 37 درجة مئوية يؤدي إلى انخفاض حجم البلازما العائد44.

نتائج قياس الفلور
التركيز cfDNA في البلازما 1 مل من كل من المرضى الدبقية #1 #3 والضوابط الصحية #H1، #H2، #H3 كانت 137 نانوغرام، 12.6 نانوغرام، 6.52 نانوغرام، 2.26 نانوغرام، و 2.48 نانوغرام، على التوالي. ومع ذلك، في المريض الدبقي #2 التركيز cfDNA كان منخفضا جدا ليتم الكشف عنها في عداد الفلور. تركيز cfDNA في البلازما مريض السرطان 1 مل يتراوح من 0.5 إلى>1000 نانوغرام18، مع قيمة متوسطة من 20 نانوغرام. في الأشخاص الأصحاء، يتراوح تركيز cfDNA من تركيز لا يمكن اكتشافه إلى 16 نانوغرام، بقيمة متوسطة قدرها 8 نانوغرام45. الحمض النووي الجينومي معزولة من 200 ميكرولتر معطف بافي (PBMCs) تسفر عن حوالي 25-50 ميكروغرام من الحمض النووي.

نتائج تحليل تحليل جزء الحمض النووي
وفقا لدراسة سابقة، يتم إثراء CFDNA في 166-bp شظايا طويلة، والتي تمثل ~ 85٪ من cfDNA الإجمالي في بلازما المريض. في المقابل، تمثل شظايا 332-bp طويلة 10٪، و498 نقطة بريتيش بتروليوم تمثل 5٪ من cfDNA46. وهناك عاملان رئيسيان يؤثران على نتائج مقايسة تحليل أجزاء cfDNA هما تلوث الحمض النووي الجينومي من PBMCs وانخفاض تركيز cfDNA. ويبين الشكل 1 الرسم البياني البيولوجي تحليلية cfDNA المتوقعة من #1 المريض الورم الدبقي، والتي يتم إثراء شظايا cfDNA في 166 bp وليس هناك تلوث الحمض النووي الجينومي في العينة21. ويبين الشكل 2 الرسم البياني لإثراء جزء بعد إعداد مكتبة NGS من cfDNA من #1 المريض الدبقية ويتم تحويل التخصيب جزء من 166 bp إلى 291 bp، وذلك بسبب مرفق من 125 مؤشر bp والمحولات إليها. ويبين الشكل 3 الإثراء الطفيف جدا لشظايا cfDNA من المريض الدبقية #2. على الرغم من تركيز cfDNA المنخفض في #2 المريض الدبقية، إضافة محولات NGS إلى خطوات التضخيم CFDNA و PCR يؤدي إلى ذروة مكتبة cfDNA مرئية على الرسم البياني التخصيب جزء 4. ولذلك، تم إعداد المكتبة بنجاح من هذه العينة cfDNA تركيز منخفض، كما هو مبين في الشكل 4. في الشكل 5، تظهر شظايا cfDNA من #3 المريض الدبقي إلى ذروتها بالقرب من 166 bp ولكن تلوث الحمض النووي الجينومي واضح أيضًا بالقرب من ذروة السلم المرجعي 10380 bp.

Figure 1
الشكل 1: رسم بياني مثالي لتحليل أجزاء cfDNA لعينة الورم الدبقي #1 cfDNA. ولوحظت ذروة رئيسية عند 166 نقطة بريتيش في الولايات المتحدة ولوحظت ذروة أصغر عند 332 نقطة بريتيش بتروليوم. لم يكن هناك تلوث الجينومي ينظر في هذه العينة، والتي تحدث بالقرب من علامة 10380 BP العليا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: رسم بياني مثالي لتحليل أجزاء cfdNA لعينة الورم الدبقي #1 مكتبة cfDNA. بعد ربط 125 bp الجيل التالي من محولات مكتبة التسلسل ، أظهرت 166 bp و 332 bp cfDNA ذروة رئيسية عند 291 بريتيش بتروليوم وذروة أصغر عند 457 بريتيش بتروليوم على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: رسم بياني لتحليل جزء cfDNA لعينة الورم الدبقي #2 cfDNA، مما يظهر ذروة صغيرة جدًا عند 166 نقطة بريتيش قدمًا. بسبب انخفاض تركيز cfDNA، كانت الذروة عند 166 نقطة بريتيش بتروليوم بالكاد مرئية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: رسم بياني لتحليل جزء cfDNA من مكتبة cfDNA لعينة الورم الدبقي #2. بعد ربط 125 bp الجيل التالي من محولات مكتبة التسلسل وأداء دورات PCR أثناء إعداد المكتبة ، كانت ذروة cfDNA المرئية بالكاد عند 166 bp أو قمم غير مرئية تمامًا عند 332 bp و 498 bp ، مرئية بوضوح. وكانت ذروة رئيسية موجودة بالقرب من 291 نقطة بريتيش بتروليوم وذرية أصغر عند 457 نقطة بريتيش بتروليوم و623 نقطة بريتيش بتروليوم و789 نقطة بريتيش بتروليوم وبالقرب من 2500 نقطة أساس لوحظت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مقايسة محللات أجزاء cfDNA التي تُظهر تلوث الحمض النووي الجينومي في عينة الورم الدبقي #3 cfDNA. وأشارت ذروة صغيرة عند 166 نقطة بريتيش بتروليوم إلى وجود cfDNA والتخصيب بالقرب من العلامة العليا (10,380 bp) كان تلوث الحمض النووي الجينومي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول S1: وحدات التخزين من العازلة تحلل والناقل RNA (حل في العازلة AVE) اللازمة لمعالجة 1 مل من عينات البلازما. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

جمع دم المريض في أنبوب, شحنة وتخزين الخطوات الأولية الحاسمة في خزعة السائل. يمكن أن تعيق المعالجة غير السليمة جودة البلازما ، وبالتالي ، يمكن أن تتداخل مع نتائج خزعة السائل47. إذا تم جمع عينة دم في أنبوب الدم EDTA، يجب فصل البلازما في غضون ساعتين من جمع الدم لتجنب تحلل من WBCs وإطلاق الحمض النووي الجينومي في البلازما48. WBCs يمكن أيضا الخضوع للاختصاص المبرمج في أنبوب EDTA إذا أبقى لفترة أطول، وشظايا cfDNA الناتجة يمكن أن تلوث CFDNA الأصلي في البلازما48. التعرض لعينة الدم إلى درجة حرارة عالية (> 37 درجة مئوية) أو اهتزاز مفرط للأنبوب قبل فصل البلازما يسبب الانحلال. الهيموغلوبين الذي يبقى بالتالي كملوث في البلازما يؤثر على عمليات المصب من cfDNA مثل أثناء إعداد المكتبة49. ارتفاع درجة الحرارة (> 37 درجة مئوية) يؤثر أيضا على العائد من البلازما في أنبوب الدم EDTA. ولذلك، والفصل الفوري من البلازما بعد جمعها في أنبوب EDTA50 هو خطوة هامة في مراقبة الجودة من الأسلوب. إذا تم جمع الدم في cfDNA التجارية أو CFRNA حفظ أنبوب، يجب خلط المادة الكيميائية الحافظة مع الدم مباشرة بعد جمع الدم40. يؤدي الفشل في مزج المادة الكيميائية الحافظة بشكل صحيح إلى تكوين الميكلوستات الدقيقة في البلازما. هذه تسد أغشية السيليكا في عمود أثناء عملية استخراج cfDNA وتخفض من العائد من cfDNA. اهتزاز معتدل من الدم في الأنبوب لا يسبب الانحلال. على الرغم من أن الإفراط في اهتزاز يمكن أن يسبب الانحلال حتى في هذه الأنابيب40. لذلك، أثناء الشحن أو المناولة من هذه الأنابيب، وينبغي تجنب اهتزاز المفرط. ويوصى أنابيب الدم ليتم شحنها في وضعها تستقيم.

إن القياس الكمي الدقيق وتقييم تركيز cfDNA لكل وحدة بلازما هو خطوة مهمة في خزعة السائل ، حيث يرتبط تركيز CFDNA البلازما بشكل مباشر بالعملية الفسيولوجية والمرضية51. تركيز cfDNA أعلى في المرضى الذين يعانون من السرطان مما كانت عليه في المواضيع الصحية52. زيادة تركيز cfDNA في الدم البشري ليست محددة للسرطان; تميل النساء الحوامل والمرضى الذين يتلقون عمليات زرع أيضا إلى أن يكون تركيزات cfDNA مرتفعة في دمهم21. وقد أظهرت الجمعيات أيضا لالتهاب, صدمة الأنسجة, مرض السكري, احتشاء عضلة القلب, وتعفن الدم مع زيادة مستوى تركيز CFDNA53. تركيز CFDNA البلازما في مرحلة مبكرة من مرضى السرطان يميل إلى أن يكون أقل مما كانت عليه في المرضى الذين يعانون من الأورام المتقدمة أو النقيلي. وهذا يدعم اقتران مباشر من cfDNA مع عبء الورم54. تركيز cfDNA في الدم يختلف بشكل كبير يتراوح بين 0.5 و> 1000 نانوغرام / مل في مرضى السرطان وبين 0 و 100 نانوغرام / مل في مواضيع صحية18. لإعداد المكتبة، الحد الأدنى 0.5 نانوغرام من cfDNA المطلوبة. لتحقيق الحد الأدنى من كمية الطلب من cfDNA لتسلسل, يمكن للمرء أن تبدأ مع الحد الأدنى من 2 مل من عينة الدم أو 1 مل عينة البلازما. وعلاوة على ذلك، فإن الأخطاء التقنية أثناء استخراج cfDNA البلازما أيضا يقلل من العائد cfDNA، والتركيز الناتج، وبالتالي الانحراف عن التركيز الفعلي cfDNA البلازما. قد يحدث تحلل cfDNA بسبب مضادات التخثر في أنابيب EDTA أو بسبب عملية ذوبان وتجميد عينات البلازما المتعددة. كما أن ضعف نشاط البروتينات K أثناء عملية التحلل يؤدي أيضاً إلى انخفاض غلة cfDNA. بروتينات K النشاط ينخفض بسبب التعرض لفترات طويلة لدرجات حرارة عالية. استخدام الإيثانول منخفض التركيز بدلا من 96-100٪ أثناء خطوة غسل استخراج cfDNA يسبب أيضا انخفاض العائد من cfDNA. لذلك، تجنب الأخطاء التقنية في تقنية خزعة السائل مهم لتحقيق نتائج دقيقة وموثوق بها.

التحليل النوعي لـ cfDNA هو خطوة مركزية، حيث يتم خلالها تقدير التوزيع الفعلي لشظايا الحمض النووي الموجودة في عينة cfDNA المستخرجة. النتائج الكمية لcfDNA يمكن الاعتماد عليها إلا بعد التأكد من نقائه عن طريق التحليل النوعي. لذلك، يظهر رسم بياني مثالي لـ cfDNA تم إنشاؤه في مقايسة محلل جزء الحمض النووي إثراء الذروة الرئيسية لشظايا cfDNA بالقرب من 166 نقطة بريتيش قدم، وذرية أصغر قرب طول 332 بريتيش قدمًا. وهذا يشير إلى أن عينة cfDNA المستخرجة ليست ملوثة بالحمض النووي الجينومي من WBCs. إذا تم إثراء جزء من 7000 bp إلى السلم المرجعي (10,380bp) وما بعدها، فهذا يشير إلى تلوث عينة من cfDNA مع الحمض النووي الجينومي WBC. إذا كان التلوث بالحمض النووي الجينومي ينظر في عينة cfDNA بعد تقدير حجم جزء الحمض النووي يمكن تشغيل العينة على هلام agarose 2٪ مع سلم 100 BP، ويمكن استئصال الجل بين نطاق ~ 150-200 BP، تليها مقايسة استخراج هلام. يتم فقدان بعض كمية من cfDNA خلال عملية اختيار حجم هلام agarose. ومع ذلك، تتطلب خطوة إعداد مكتبة NGS حدًا أدنى قدره 0.5 نانوغرام و1000 نانوغرام كحد أقصى من مواد الحمض النووي للإدخال لإعداد المكتبات لتسلسلها. لذلك، إذا كان إجمالي كمية من cfDNA يساوي أو أكثر من 0.5 نانوغرام، هو كمية كافية لخطوة إعداد المكتبة. وعلاوة على ذلك، تمر هذه العينات بعملية إعداد المكتبة بنجاح، وتظهر المكتبة الناتجة عن ذلك ذروة رئيسية قريبة من 291 نقطة بريتيش بتروليوم وذرية أصغر عند 457 نقطة بريتيش بتروليوم، وذلك بسبب إضافة 125 مؤشرًا ومحولات بريتيش بتروليوم.

تحليل البيانات NGS هو الخطوة الأخيرة في تقنية الخزعة السائلة المستندة إلى NGS ، وقوائم الطفرات ونسيج الجينات3،55،56،57 يتم إنشاؤها في هذه الخطوة. ويمكن تقييم الطفرات واالانصهار الجيني الجيني التي يتم تحديدها وفقا لدراسات سابقة على المناظر الطبيعية لطفرات السرطان58,59, سابقا تتميز الطفرات الجينية60 أو الجيناتالانصهار 61,62,63. هذه قد تكون بمثابةالتكهن 64 والتشخيص7 المؤشرات الحيوية في مرضى السرطان. على سبيل المثال، فإن طفرة R132H في الإيزوسيترات ديهيدروجيناز 1(IDH1)هو علامة حاسمة لسرطان الورم الأرومي الدبقي الثانوي، ويميز أيضا عن الورم الأرومي الأولي الذي تغيب فيه هذه الطفرة عادة65. وعلاوة على ذلك، يتميز سرطان الدم النقوي المزمن (CML) من قبل الانصهار الجيني BCR/ABL1 الناتجة عن نقل متوازن بين الكروموسوم 9 و 2261. الجين BCR/ABL1 وهرة مرنا والبروتين الانصهار هي فريدة من نوعها لذروي CML، وبالتالي، تشكل هدفا جيدا للعلاج66.

التشخيص المتقدم ، والتدريج الصحيح للورم ومراقبة العلاج هو استراتيجية الحالية لإدارة فعالة من السرطان. حتى وقت قريب، كانت خزعة الأنسجة المعيار الذهبي للتقييم النسيجي للأنسجة. ومع ذلك ، بعد أبحاث واسعة في هذا المجال وظهور التكنولوجيا ، فقد ثبت أن خزعة واحدة غير قادرة على توفير المناظر الطبيعية الطفرة الكاملة للورم وأن الخزعات التسلسلية عادة ما تكون غير عملية ليتم تنفيذها بسبب غزوها ، خاصة في الورم الأرومي الدبقي وسرطان الغدد الليمفاوية ، حيث تكون الخزعات شديدة التوغل. بالإضافة إلى ذلك، ترتبط حوالي 16٪ من خزعات إبرة مع التعقيدات الإجرائية67. وعلاوة على ذلك، يتطلب التنميط الجيني عالي الجودة كمية كافية من الأنسجة، وهو الطلب الذي عادة ما لا يتحقق من قبل خزعة إبرة68.

تم العثور على الخزعات السائلة، من عينة دم روتينية عن طريق تحليل الحمض النووي المستمد من الورم لتحل محل أو مساعد إجراءات خزعة الأنسجة إبرة روتينية12. تحليل الحمض النووي المشتق من الورم / CFDNA من خلال البلازما عن طريق خزعة السائل هو إجراء طفيف وفعال للتنميط الجزيئي للأورام. ويمكن أن تسمح أساسا الرصد العلاج عن طريق أخذ العينات تسلسلي مع مرور الوقت دون المخاطر المحتملة والمضاعفات المرتبطة عادة مع خزعة أنسجة الورم التقليدية بسبب طبيعته الغازية69. وعلاوة على ذلك، وجدت الدراسات المقارنة بين خزعة الإبرة مع تحليل cfDNA بواسطة خزعة سائلة من آفة ورم واحدة أن التنميط cfDNA يمكن أن تقدم عدم تجانسية جزيئية كاملة أن الورم يمكن أن يكون مأوى من قبل مجموعات سكانية منفصلة متعددة70.

ومع ذلك، على الرغم من البلازما تعتمد على التشخيص cfDNA له العديد من المزايا على خزعة أنسجة الورم، لا تزال هناك بعض القيود الحاسمة التي تعوق تطبيقه في الممارسة السريرية العامة. القيود المفروضة على التشخيص خزعة السائل على أساس عقود نا تشمل ارتفاع تكلفة الإجراء الشامل، والحاجة إلى الحمض النووي عالية الجودة وخصوري المعلوماتية الحيوية لضرورة تحليل البيانات واسعةالنطاق 71. بسبب مشكلة إدارة البيانات المرتبطة بتحليل cfDNA ، فإن NGS تطرح أيضًا مشكلات في تطبيقها الفوري في العيادة. إن تحديات إدارة البيانات التي تطرحها NGS ترجع في المقام الأول إلى صعوبة التمييز بين الضوضاء الخلفية الجوهرية لتسلسل عميق والانحرافات المرتبطة بالورم72. وأخيراً، ونظراً لعدم توافر بيانات الصلاحية السريرية والبيانات المساعدة لغالبية مقايسات الخزعة السائلة، فإنها تقتصر حالياً على الدراسات السريرية والبحوث الأساسية13.

ومن المتوقع أن التطورات المستقبلية في تقنية خزعة السائل، من خلال الجهود المشتركة من قبل البحوث الأساسية في مجال علم الأحياء، وعلم وظائف الأعضاء، والبيولوجيا الجزيئية، وتقنيات الفحص، والتحليل الإحصائي لإدارة البيانات، وتكنولوجيا تعلم الآلة73،74. بالإضافة إلى ذلك، العديد من التجارب السريرية على أساس تقييم المؤشرات الحيوية CFDNA مستمرة، وسوف تساعد نتائجها على تحديد صحة هذه التقنية. نأمل أن هذه الجهود مجتمعة إنشاء منصة خزعة السائل من خلال تحليل cfDNA باعتبارها قوية التشخيص التشخيص، وأداة الرصد العلاج في الإعداد السريري الأورام خلال السنوات الخمس المقبلة70,75.

في الختام، توفر خزعة السائل القائمة على عقود من أجل السلام في الولايات المتحدة نهجًا آمنًا وغير جراحيًا لتحديد المؤشرات الحيوية الجينومية المفيدة في إدارة مرض السرطان. ومع ذلك ، لتحقيق نتائج موثوقة ودقيقة ، بروتوكولات موحدة لجمع الدم ، البلازما / WBC الفصل ، واستخراج CFDNA ، وتحليلها الكمي والنوعي CFDNA مطلوبة بشكل خاص74،75.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر علم الجينوم السرطاني والتراكم البيولوجي للأمراض المعقدة على إسهاماتهم الملاحظةية الشديدة ومشاركتهم في مناقشات متعددة في مختلف مراحل هذا المشروع. ويشمل الدعم التمويلي منحة من جمعية إسرائيل للسرطان (ICA منحة M.F-M 2017-2019) ومنحة Kamin من هيئة الابتكار الإسرائيلية (ل M.F-M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, P. J., et al. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).
  2. Liotta, L., Petricoin, E. Molecular profiling of human cancer. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 48-56 (2000).
  3. Balamurali, D., et al. ChiTaRS 5.0: the comprehensive database of chimeric transcripts matched with druggable fusions and 3D chromatin maps. Nucleic Acids Research. 48 (1), 825-834 (2019).
  4. Trédan, O., et al. Molecular screening program to select molecular-based recommended therapies for metastatic cancer patients: Analysis from the ProfiLER trial. Annals of Oncology. 30 (5), 757-765 (2019).
  5. Oliveira, K. C. S., et al. Current perspectives on circulating tumor DNA, precision medicine, and personalized clinical management of cancer. Molecular Cancer Research. 18 (4), 517-528 (2020).
  6. Siegal, T. Clinical impact of molecular biomarkers in gliomas. Journal of Clinical Neuroscience. 22 (3), 437-444 (2015).
  7. Komori, T. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System: The Major Points of Revision. Neurologia medico-chirurgica. 57 (7), 301-311 (2017).
  8. Duffy, M. J., O'Donovan, N., Crown, J. Use of molecular markers for predicting therapy response in cancer patients. Cancer Treatment Reviews. 37 (2), 151-159 (2011).
  9. Saenz-Antoñanzas, A., et al. Liquid Biopsy in Glioblastoma: Opportunities, Applications and Challenges. Cancers. 11 (7), 950 (2019).
  10. Marrugo-Ramírez, J., Mir, M., Samitier, J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopsy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2877 (2018).
  11. Pantel, K., Alix-Panabières, C. Liquid biopsy in 2016: Circulating tumour cells and cell-free DNA in gastrointestinal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 73-74 (2017).
  12. Bronkhorst, A. J., et al. The emerging role of cell-free DNA as a molecular marker for cancer management. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100087 (2019).
  13. Cescon, D. W., Bratman, S. V., Chan, S. M., Siu, L. L. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer. 1 (3), 276-290 (2020).
  14. Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, 175883591879463 (2018).
  15. Cohen, J. D. J., et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 926-930 (2018).
  16. Wan, J. C. M., et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 223-238 (2017).
  17. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nature Reviews Genetics. 20 (2), 71-88 (2018).
  18. Thierry, A. R., et al. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (3), 347-376 (2016).
  19. Buscail, E., et al. High Clinical Value of Liquid Biopsy to Detect Circulating Tumor Cells and Tumor Exosomes in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients Eligible for Up-Front Surgery. Cancers. 11 (11), 1656 (2019).
  20. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry. 61 (1), 112-123 (2015).
  21. Kustanovich, A., Schwartz, R., Peretz, T., Grinshpun, A. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biology and Therapy. 20 (8), 1057-1067 (2019).
  22. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
  23. Celec, P., et al. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, (2018).
  24. Gautschi, O., et al. Origin and prognostic value of circulating KRAS mutations in lung cancer patients. Cancer Letters. 254 (2), 265-273 (2007).
  25. Bidard, F., et al. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. International Journal of Cancer. 134 (5), 1207-1213 (2013).
  26. Chan, K. C. A., et al. Analysis of Plasma Epstein–Barr Virus DNA to Screen for Nasopharyngeal Cancer. New England Journal of Medicine. 377 (6), 513-522 (2017).
  27. Mao, L., et al. Detection of Oncogene Mutations in Sputum Precedes Diagnosis of Lung Cancer. Cancer Research. 54 (7), 1634-1637 (1994).
  28. De Mattos-Arruda, L., et al. Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nature communications. 6 (1), 8839 (2015).
  29. Khier, S., Lohan, L. Kinetics of circulating cell-free DNA for biomedical applications: critical appraisal of the literature. Future science OA. 4 (4), 295 (2018).
  30. Misale, S., et al. Resistance to Anti-EGFR therapy in colorectal cancer: From heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discovery. 4 (11), 1269-1280 (2014).
  31. Beddowes, E., Sammut, S. J., Gao, M., Caldas, C. Predicting treatment resistance and relapse through circulating DNA. Breast. 34, 31-35 (2017).
  32. Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA oncology. 2 (8), 1014-1022 (2016).
  33. Vaidyanathan, R., et al. Cancer diagnosis: from tumor to liquid biopsy and beyond. Lab on a Chip. 19 (1), 11-34 (2019).
  34. Kelly, P. Gliomas: Survival, origin and early detection. Surgical Neurology International. 1 (1), 96 (2010).
  35. Faria, G., Silva, E., Da Fonseca, C., Quirico-Santos, T. Circulating Cell-Free DNA as a Prognostic and Molecular Marker for Patients with Brain Tumors under Perillyl Alcohol-Based Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1610 (2018).
  36. Liu, M. C., et al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Annals of Oncology. 31 (6), 745-759 (2020).
  37. Enko, D., Halwachs-Baumann, G., Kriegshäuser, G. Plasma free DNA: Evaluation of temperature-associated storage effects observed for roche cell-free DNA collection tubes. Biochemia Medica. 29 (1), 153-156 (2019).
  38. Streleckiene, G., et al. Effects of Quantification Methods Isolation Kits, Plasma Biobanking, and Hemolysis on Cell-Free DNA Analysis in Plasma. Biopreservation and Biobanking. 17 (6), 553-561 (2019).
  39. Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
  40. Ward Gahlawat, A., et al. Evaluation of Storage Tubes for Combined Analysis of Circulating Nucleic Acids in Liquid Biopsies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 704 (2019).
  41. Lu, J. L., Liang, Z. Y. Circulating free DNA in the era of precision oncology: Pre- and post-analytical concerns. Chronic Diseases and Translational Medicine. 2 (4), 223-230 (2016).
  42. Iyapparaj, P., et al. Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus sp. MSU3IR against shrimp bacterial pathogens. Aquatic Biosystems. 9 (1), 12 (2013).
  43. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clinica Chimica Acta. 479, 14-19 (2018).
  44. Medina Diaz, I., et al. Performance of Streck cfDNA blood collection tubes for liquid biopsy testing. PLoS One. 11 (11), 0166354 (2016).
  45. Perkins, G., et al. Multi-Purpose Utility of Circulating Plasma DNA Testing in Patients with Advanced Cancers. PLoS One. 7 (11), 47020 (2012).
  46. Mouliere, F., et al. Multi-marker analysis of circulating cell-free DNA toward personalized medicine for colorectal cancer. Molecular Oncology. 8 (5), 927-941 (2014).
  47. Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
  48. Risberg, B., et al. Effects of Collection and Processing Procedures on Plasma Circulating Cell-Free DNA from Cancer Patients. Journal of Molecular Diagnostics. 20 (6), 883-892 (2018).
  49. Markus, H., et al. Evaluation of pre-analytical factors affecting plasma DNA analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7375 (2018).
  50. Chen, Z., et al. Comprehensive Evaluation of the Factors Affecting Plasma Circulating Cell-Free DNA Levels and Their Application in Diagnosing Nonsmall Cell Lung Cancer. Genetic Testing and Molecular Biomarkers. 23 (4), 270-276 (2019).
  51. Schwarzenbach, H., Hoon, D. S. B., Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11 (6), 426-437 (2011).
  52. Malyuchenko, N. V., et al. PARP1 Inhibitors: antitumor drug design. Acta Naturae. 7 (3), 27-37 (2015).
  53. Fleischhacker, M., Schmidt, B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-A survey. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1775 (1), 181-232 (2007).
  54. Jung, K., Fleischhacker, M., Rabien, A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker—A critical appraisal of the literature. Clinica Chimica Acta. 411 (21-22), 1611-1624 (2010).
  55. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS: a database of human, mouse and fruit fly chimeric transcripts and RNA-sequencing data. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 142-151 (2013).
  56. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS 2.1--an improved database of the chimeric transcripts and RNA-seq data with novel sense-antisense chimeric RNA transcripts. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 68-75 (2015).
  57. Gorohovski, A., et al. ChiTaRS-3.1-the enhanced chimeric transcripts and RNA-seq database matched with protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 45 (1), 790-795 (2017).
  58. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Research. 47 (1), 941-947 (2019).
  59. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  60. Szopa, W., Burley, T. A., Kramer-Marek, G., Kaspera, W. Diagnostic and Therapeutic Biomarkers in Glioblastoma: Current Status and Future Perspectives. BioMed Research International. 2017, 1-13 (2017).
  61. Salesse, S., Verfaillie, C. M. BCR/ABL: from molecular mechanisms of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia. Oncogene. 21 (56), 8547-8559 (2002).
  62. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28 (12), 67-74 (2012).
  63. Frenkel-Morgenstern, M., et al. Chimeras taking shape: Potential functions of proteins encoded by chimeric RNA transcripts. Genome Research. 22 (7), 1231-1242 (2012).
  64. Simon, M., et al. TERT promoter mutations: a novel independent prognostic factor in primary glioblastomas. Neuro-Oncology. 17 (1), 45-52 (2015).
  65. Waitkus, M. S., Diplas, B. H., Yan, H. Isocitrate dehydrogenase mutations in gliomas. Neuro-Oncology. 18 (1), 16-26 (2016).
  66. Kindler, T., Meyer, R. G., Fischer, T. BCR-ABL as a target for novel therapeutic interventions. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 6 (1), 85-101 (2002).
  67. Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2013).
  68. Vanderlaan, P. A., et al. Success and failure rates of tumor genotyping techniques in routine pathological samples with non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 84 (1), Amsterdam, Netherlands. 39-44 (2014).
  69. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. 228-229, 169-179 (2018).
  70. Normanno, N., et al. The liquid biopsy in the management of colorectal cancer patients: Current applications and future scenarios. Cancer Treatment Reviews. 70, 1-8 (2018).
  71. Hufnagl, C., et al. Evaluation of circulating cell-free DNA as a molecular monitoring tool in patients with metastatic cancer. Oncology Letters. 19 (2), 1551-1558 (2020).
  72. Petit, J., et al. Cell-Free DNA as a Diagnostic Blood-Based Biomarker for Colorectal Cancer: A Systematic Review. The Journal of Surgical Research. 236, 184-197 (2019).
  73. Poulet, G., Massias, J., Taly, V. Liquid Biopsy: General Concepts. Acta Cytologica. 63 (6), 449-455 (2019).
  74. Alix-Panabières, C. The future of liquid biopsy. Nature. 579 (7800), 9 (2020).
  75. Eisenstein, M. Could liquid biopsies help deliver better treatment. Nature. 579 (7800), 6-8 (2020).

Tags

أبحاث السرطان العدد 163 خزعة سائلة الحمض النووي الخالي من الخلايا الطب الدقيق الورم الدبقي تشخيص السرطان بلازما الدم
الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في عينات بلازما الدم من مرضى السرطان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palande, V., Raviv Shay, D.,… More

Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter