Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

कैंसर रोगियों के रक्त प्लाज्मा नमूनों में सेल मुक्त डीएनए का पता लगाना

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61449
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Cancer Genomics and BioComputing of Complex Diseases laboratory, The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2The Data Science Institute, Bar-Ilan University, 3The Dangoor Centre For Personalized Medicine, Bar-Ilan University

Summary

इस पेपर में हम गैर-इनवेसिव लिक्विड बायोप्सी तकनीक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें रक्त संग्रह, प्लाज्मा और बफी कोट सेपरेशन, सीएफडीएनए और जर्मलाइन डीएनए निष्कर्षण, सीएफडीएनए या जर्मलाइन डीएनए का मात्राकरण, और सीएफडीएनए खंड संवर्धन विश्लेषण शामिल हैं।

Abstract

कैंसर रोगियों के ट्यूमर में म्यूटेशन की पहचान रोग प्रबंधन में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है। ये उत्परिवर्तन ट्यूमर निदान के साथ-साथ उपचार चयन और कैंसर रोगियों में इसकी प्रतिक्रिया के लिए बायोमार्कर के रूप में काम करते हैं। ट्यूमर म्यूटेशन का पता लगाने के लिए वर्तमान सोने के मानक विधि ट्यूमर बायोप्सी के माध्यम से ट्यूमर डीएनए का एक आनुवंशिक परीक्षण शामिल है । हालांकि, इस आक्रामक विधि को ट्यूमर उत्परिवर्तनीय प्रदर्शनों की सूची के अनुवर्ती परीक्षण के रूप में बार-बार किया जाना मुश्किल है। तरल बायोप्सी एक आसान उपयोग और गैर-इनवेसिव बायोप्सी दृष्टिकोण के रूप में ट्यूमर म्यूटेशन का पता लगाने के लिए एक नई और उभरती हुई तकनीक है।

कैंसर की कोशिकाएं तेजी से गुणा करती हैं। समानांतर में, कई कैंसर कोशिकाओं को एपोप्टोसिस से गुजरना पड़ता है। इन कोशिकाओं से मलबे एक मरीज के संचार प्रणाली में जारी कर रहे हैं, एक साथ पतले खंडित डीएनए टुकड़े के साथ, सेल मुक्त डीएनए (cfDNA) टुकड़े कहा जाता है, जो ट्यूमर डीएनए उत्परिवर्तन ले । इसलिए, तरल बायोप्सी तकनीक का उपयोग करके सीएफडीएनए आधारित बायोमार्कर की पहचान करने के लिए, कैंसर रोगियों से रक्त के नमूने एकत्र किए जाते हैं, जिसके बाद प्लाज्मा और बफी कोट का पृथक्करण होता है। इसके बाद, प्लाज्मा को सीएफडीएनए के अलगाव के लिए संसाधित किया जाता है, और संबंधित बफी कोट को रोगी के जीनोमिक डीएनए के अलगाव के लिए संसाधित किया जाता है। दोनों न्यूक्लिक एसिड के नमूनों को उनकी मात्रा और गुणवत्ता के लिए जांच की जाती है; और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) तकनीकों का उपयोग कर म्यूटेशन के लिए विश्लेषण किया ।

इस पांडुलिपि में, हम तरल बायोप्सी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जिसमें रक्त संग्रह, प्लाज्मा, और बफी कोट सेपरेशन, सीएफडीएनए और जर्मलाइन डीएनए निष्कर्षण, सीएफडीएनए या जर्मलाइन डीएनए का मात्राकरण, और सीएफडीएनए खंड संवर्धन विश्लेषण शामिल हैं।

Introduction

तकनीकी प्रगति के कारण सैकड़ों कैंसर जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम1का अनुक्रमण हुआ है । इसने विभिन्न प्रकार ों में आणविक परिवर्तनों के परिदृश्य को समझने में योगदान दिया है2. इन परिदृश्यों पर आगे के अध्ययनों ने अनुक्रमिक दैहिक परिवर्तन और जीन-जीन संलयन3 की विशेषता में मदद की है जो कैंसर या ट्यूमर प्रगति में शामिल हैं, जो क्रमिक रूप से एपोप्टोसिसपाथवे 4को बाधित करके हैं। इसलिए, दैहिक उत्परिवर्तन और जीन-जीन संलयन एक विशेष ट्यूमर प्रकार5के लिए व्यक्तिगत रोगियों में बायोमार्कर के रूप में सेवा करके ट्यूमर के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, मौजूदा प्राथमिक ट्यूमर रोग का निदान6की पहचान, आणविक परिवर्तन7के आधार पर माध्यमिक ट्यूमर वर्गीकृत, और नशा ट्यूमर लक्ष्य की पहचान8। इस तरह की जानकारी कैंसर रोगियों के लिए व्यक्तिगत उपचार का चयन करने और सकारात्मक और नकारात्मक उपचार प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करने में सुविधाजनक हो सकती है9. हालांकि, ट्यूमर ऊतक की जीनोमिक प्रोफाइलिंग की पहचान करने के लिए ट्यूमर सामग्री प्राप्त करना एक आक्रामक प्रक्रिया10है। इसके अलावा, एक ट्यूमर बायोप्सी में विषम ट्यूमर का केवल एक छोटा सा हिस्सा शामिल है; और, इसलिए, पूरे ट्यूमर11के आणविक प्रोफ़ाइल के लिए प्रतिनिधि नहीं हो सकता है . सीरियल मॉनिटरिंग और ट्यूमर जेनोटीपिंग को ट्यूमर ऊतकों के बार-बार संग्रह की आवश्यकता होती है, जो आमतौर पर ट्यूमर बायोप्सी प्रक्रिया की आक्रामकता और ऐसी प्रक्रियाओं से उत्पन्न होने वाले सुरक्षा मुद्दों के कारण संभव नहीं होता है12।

दूसरी ओर, तरल बायोप्सी तकनीक ने पिछले13, 14दशक में सटीक ऑन्कोलॉजी में जबरदस्त ध्यान दिया है। यह मुख्य रूप से इस तकनीक की गैर-आक्रामकता के कारण है, और इसे कई समय बिंदुओं पर दोहराया जा रहा है, जिससे रोगपाठ्यक्रमों 15, 16के लिए एक आसान उपयोग और सुरक्षित निगरानी तकनीक को सक्षम कियाजासकता है। तरल बायोप्सी एक घटना पर आधारित है जो ट्यूमर कोशिकाओं को तेजी से गुणा करती है, और साथ ही उनमें से कई एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस से गुजरते हैं। इससे मरीजों के रक्त में एपोटोटिक सेल मलबे की रिहाई होती है, साथ ही डीएनए के टुकड़े होते हैं जो एपोप्टोसिस17के दौरान सटीक आकार में काटे जाते हैं। गैर-कैंसर कोशिकाओं का एपोप्टोसिस भी रक्त में अपने सेलुलर मलबे को छोड़ने की ओर जाता है, हालांकि, इन कोशिकाओं में एपोप्टोसिस दर ट्यूमर कोशिकाओं की तुलना में अपेक्षाकृत बहुत कम है18। तरल बायोप्सी तकनीक का तर्कसंगत डीएनए, आरएनए, प्रोटीन और ट्यूमर कोशिकाओं14, 19 जैसे ट्यूमर से जुड़े अणुओं को कैप्चर करना है जो रक्त में लगातार प्रसारित होते हैं। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस), डिजिटल बूंद बहुलक चेन रिएक्शन (डीडीपीसीआर), रीयल-टाइम पीसीआर और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) सहित इन अणुओं के विश्लेषण के लिए विभिन्न तकनीकों20 का उपयोग किया जा सकता है। तरल बायोप्सी तकनीक उन बायोमार्कर की पहचान करने में सक्षम बनाती है जो ट्यूमर कोशिकाओं की विशेषताएं हैं। ये बायोमार्कर अणु सिर्फ ट्यूमर के विशिष्ट हिस्सों से नहीं छोड़े जाते हैं, बल्कि ट्यूमर21के सभी हिस्सों से होते हैं। इसलिए, तरल बायोप्सी में पहचाने गए मार्कर शरीर में अन्य ट्यूमर के अलावा एक पूरे विषम ट्यूमर की आणविक प्रोफाइलिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं, इस प्रकार, ऊतक बायोप्सी-आधारित तकनीक22पर लाभ होते हैं।

सीएफडीएनए में कुछ मिनट से लेकर 1-2 घंटे23तक के रक्त में एक छोटा आधा जीवन समय होता है । हालांकि, CFDNA के छोटे आधे जीवन समय उपचार प्रतिक्रिया और गतिशील ट्यूमर आकलन का मूल्यांकन करके वास्तविक समय विश्लेषण की सुविधा । ट्यूमर से व्युत्पन्न cfDNA स्तर ट्यूमर चरण के शकुन का संकेत/ इसके अलावा, अध्ययनों से साबित हो गया है कि सीएफडीएनए में मौजूदा ट्यूमर मार्कर25की तुलना में बेहतर भविष्यवाणी क्षमता है । सीएफडीएनए का शकुन कैंसर के इलाज के बाद और भी अधिक स्पष्ट है, उपचार के बाद सीएफडीएनए का उच्च स्तर जीवित रहने की कम दर और उपचार के प्रतिरोध के साथ अच्छी तरह से संबंधित है। जबकि, चिकित्सा के बाद सीएफडीएनए का निचला स्तर आम तौर पर सकारात्मक उपचार प्रतिक्रिया से मेल खाता है। इसके अतिरिक्त, सीएफडीएनए पारंपरिक पहचान विधियों की तुलना में उपचार प्रतिक्रिया का जल्दी पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है।

सीएफडीएनए कैंसर से जुड़े म्यूटेशन का जल्दी पता लगाने की संभावना को बढ़ाता है: प्रारंभिक चरण की बीमारी15के दौरान, लक्षणों की शुरुआत26 और कैंसर निदान से पहले 2 साल27तक । चूंकि सीएफडीएनए कई ट्यूमर क्षेत्रों या फोसी से जारी किया जाता है, इसका विश्लेषण ट्यूमर जीनोम का एक व्यापक दृश्य प्रदान करता है जो यह28का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए, सीएफडीएनए दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम बनाता है जो ऊतक के नमूनों में29को याद किया गया हो सकता है। के रूप में इंट्रा-ट्यूमर विषमता और उपकग्नल म्यूटेशन हजारों ठिकानों में फैले जीनोमिक क्षेत्रों के गहरे अनुक्रमण द्वारा पता लगाया जा सकता है, इसलिए सीएफडीएनए का विश्लेषण विशिष्ट जीनोमिक हस्ताक्षर13के साथ विशिष्ट आणविक उपप्रकारों को उजागर करने में सक्षम बनाता है। ऊतक नमूने के माध्यम से जानकारी के एक समान स्तर प्राप्त करने के लिए कई ठोस बायोप्सी की जरूरत होती ।

इसके अलावा, एक शल्य चिकित्सा उपचार और/ इसके अलावा, पेट, स्तन और फेफड़ों के कैंसर वाले रोगियों में, रक्त से सीएफडीएनए के विश्लेषण से ट्यूमर-विशिष्ट परिवर्तनों का सफलतापूर्वक पता लगाया जा सकता है, जिसके कारण13महीने पहले कई महीनों की पुनरावृत्ति की सटीक भविष्यवाणी हुई। इसके अलावा, उपचार प्रतिरोध मार्कर, जैसे सीआरसी के साथ रोगियों में KRAS म्यूटेशन एंटी-ईजीएफआर थेरेपी30प्राप्त करते हैं; विभिन्न उपचारों के साथ उपचार के बाद स्तन कैंसर वाले रोगियों में PIK3CA, MED1 या EGFR जैसे जीन के लिए VAFs31। और EGFR T790M फेफड़ों के कैंसर के रोगियों में प्रतिरोध उत्परिवर्तन EGFR के साथ इलाज-लक्षित TKIs३२ भी cfDNA विश्लेषण द्वारा पहचाना जा सकता है ।

संक्षेप में, सीएफडीएनए विश्लेषण का उपयोग ऑन्कोलॉजी13, 33के क्षेत्र में सटीक बायोमार्कर की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, 3 ग्लियोमा रोगियों और 3 स्वस्थ नियंत्रणों के रक्त नमूनों को डब्ल्यूबीसी और प्लाज्मा से सीएफडीएनए से जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए संसाधित किया गया था। ग्लियोमा कैंसर में, आईडीएच, टीईआरटी, एटीआरएक्स, ईजीएफआर और टीपी53 में उत्परिवर्तन एक नैदानिक के साथ-साथ शकुन मार्कर के रूप में कार्य करता है जो ग्लियोमा ट्यूमर के प्रारंभिक निदान में मदद कर सकते हैं, विभिन्न प्रकार के ग्लियोमा ट्यूमर को वर्गीकृत कर सकते हैं, व्यक्तिगत रोगी के लिए सटीक उपचार का मार्गदर्शन करते हैं और उपचार प्रतिक्रिया34, 35को समझते हैं। इन जीनों की उत्परिवर्तनीय स्थिति की पहचान रक्त-व्युत्पन्न सीएफडीएनए का उपयोग करके की जा सकती है। इस पांडुलिपि में, हम प्लाज्मा-व्युत्पन्न सीएफडीएनए का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग ग्लियोमा कैंसर12में उत्परिवर्तनीय परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया गया है। इस लेख में समझाए गए इस तरह के सीएफडीएनए-आधारित तरल बायोप्सी प्रोटोकॉल का उपयोग कई अन्य प्रकार के कैंसर में उत्परिवर्तनात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, हाल ही में हुए एक अध्ययन से पता चला है कि सीएफडीएनए आधारित तरल बायोप्सी ५० विभिन्न प्रकार के कैंसर३६का पता लगा सकती है ।

रक्त नमूना संग्रह, भंडारण और शिपमेंट इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं, क्योंकि इन चरणों के दौरान अनियंत्रित तापमान डब्ल्यूबीसी के लाइसिस का कारण बनता है, जिससे डब्ल्यूबीसी से प्लाज्मा में जीनोमिक डीएनए की रिहाई होती है और सीएफडीएनए नमूने का संदूषण होता है, जो बाकी प्रक्रिया37को प्रभावित करता है। अनियंत्रित तापमान के कारण हीमोलिसिस सीएफडीएनए की डाउनस्ट्रीम नमूना तैयारी प्रक्रियाओं को ख़राब कर सकता है, जैसे पीसीआर चरण38। सीरम में प्लाज्मा के बजाय जर्मलाइन सीएफडीएनए का एक उच्च अनुपात होता है, हालांकि यह ट्यूमर से जुड़े सीएफडीएनए39के लिए एक बड़ी पृष्ठभूमि शोर प्रस्तुत करता है। इसलिए, ट्यूमर से जुड़े सीएफडीएनए को अलग करने के लिए, प्लाज्मा एक उपयुक्त नमूना39है। रक्त संग्रह ट्यूब युक्त एक एंटी-स्कंदबंद में खींचा गया रक्त प्लाज्मा को अलग करने और सीएफडीएनए संदूषण से बचने के लिए तुरंत या दो घंटे के भीतर अपकेंद्रित्र किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, समर्पित वाणिज्यिक सीएफडीएनए संरक्षण रक्त संग्रह ट्यूबों का उपयोग किया जाता है (सामग्री की तालिकादेखें), जो रक्त संग्रह ट्यूबों वाले एंटीकोगुलैंट का विकल्प है। ये समर्पित रक्त संग्रह ट्यूब सीएफडीएनए और सीएफआरएनए को संरक्षित करते हैं, और परिवेश के तापमान पर 30 दिनों तक और 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 दिनों तक WBCs के लाइसिस को रोकता है। यह रक्त नमूना शिपमेंट के दौरान उचित तापमान को बनाए रखने में सुविधा प्रदान करता है और जब तक प्लाज्मा और डब्ल्यूबीसी40अलग नहीं हो जाते ।

वर्तमान में उपलब्ध तीन प्रकार के सीएफडीएनए निष्कर्षण पद्धतियां हैं: चरण अलगाव, सिलिकॉन-झिल्ली आधारित स्पिन कॉलम, और चुंबकीय मनका-आधारित अलगाव41। सिलिकॉन-झिल्ली आधारित स्पिन कॉलम विधि में अन्य सीएफडीएनए निष्कर्षण विधियों की तुलना में उच्च अखंडता के साथ सीएफडीएनए की उच्च मात्रा उत्पन्नहुई।

डीएनए का मात्रात्मक मूल्यांकन तरल बायोप्सी में एक मौलिक आवश्यकता है, उनके आसान कार्यान्वयन और व्यापक उपयोग के लिए एक सरल, सस्ती और मानकीकृत प्रक्रिया विकसित करने की आवश्यकता है। सीएफडीएनए क्वांटिफिकेशन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले तीन तरीके स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक, फ्लोरोरमेट्रिक और क्यूपीसीआर हैं। फ्लोरिमेट्रिक विधि सटीकता, लागत और चालकता में आसानी43से संबंधित अन्य तरीकों पर बेहतर साबित होती है।

सीएफडीएनए की अखंडता और शुद्धता का अनुमान या तो एगरॉग्रेस इलेक्ट्रोफोरेसिस या केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है। एगरल्ड इलेक्ट्रोफोरेसिस न तो सीएफडीएनए की कम एकाग्रता पर संवेदनशीलता दिखाता है और न ही सीएफडीएनए के सटीक टुकड़े आकार को दिखाने के लिए उच्च संकल्प है। दूसरी ओर, केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस से जुड़ी चुनौतियों पर काबू पाने के द्वारा एगरॉल्ड इलेक्ट्रोफोरेसिस पर एक लाभ है और इसलिए, व्यापक रूप से सीएफडीएनए टुकड़ा आकार विश्लेषण के लिए शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में, एक स्वचालित केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके अलग-थलग सीएफडीएनए के टुकड़े आकार के वितरण का अनुमान लगाया गया था।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

रक्त संग्रह से पहले, अनुसंधान में भाग लेने वाले विषयों से सूचित सहमति की आवश्यकता है और प्राप्त किया जाना चाहिए । इस पांडुलिपि में वर्णित शोध राइन मेडिकल सेंटर, इज़राइल एथिक्स कमेटी (एथिक्स कोड: 0039-17-आरएमसी) और फैकल्टी ऑफ मेडिसिन डेर क्रिश्चियन-अल्ब्रेक्ट्स-यूनीवर्सिट ज़ू कील, जर्मनी एथिक्स कमेटी (एथिक्स कोड: डी 405/14) के अनुसार और अनुपालन में किया गया था।

1. सीएफडीएनए या सीएफआरएनए परिरक्षक ट्यूबों में रक्त नमूना संग्रह और भंडारण

  1. संरक्षण ट्यूबों को ठीक से लेबल करें
  2. नीचे वर्णित वेनिपुपंक्चर के लिए मानक संस्थागत प्रोटोकॉल के अनुसार, रक्त संग्रह सेट और धारक का उपयोग करके, सीएफ-डीएनए संरक्षण ट्यूब (सामग्री की तालिकादेखें) में ~ 8 एमएल रक्त एकत्र करें।
    नोट: रक्त संग्रह सेट का उपयोग ट्यूब से रक्त के संभावित बैकफ्लो को रोक सकता है।
    1. रोगी को नीचे की स्थिति में हाथ से संरेखित करें।
    2. ट्यूब सामग्री टोपी या सुई टिप को छूने नहीं है, जबकि ऊपर की ओर का सामना करना पड़ा टोपी के साथ, सीधे पकड़।
    3. जैसे ही खून ट्यूब में बहने लगता है, टूनीकेट को धीरे-धीरे छोड़ दें।
  3. ट्यूब के तुरंत बाद रक्त से भर जाता है (अधिकतम क्षमता: पूरे रक्त की 8.4 मिलील), धीरे-धीरे ट्यूब को उलटा करें (हाथ की कलाई को 180 डिग्री नीचे और पीछे तक घुमाएं) नमूने को स्थिर करने के लिए 5 बार।
    नोट: उलटा सुनिश्चित करता है कि परिरक्षक नमूने के साथ समान रूप से मिश्रित है। हालांकि, प्लाज्मा तैयार करने से पहले भी सामग्री को फिर से हिलाएं नहीं। रक्त नमूने के साथ संरक्षक के अपर्याप्त मिश्रण सामग्री को अस्थिर करने और सूक्ष्म थक्के या हीमोलिसिस के गठन की ओर जाता है। इस स्तर पर, प्लाज्मा जुदाई के लिए प्रोटोकॉल तुरंत जारी रखा जा सकता है या रक्त से भरी ट्यूब परिवेश के तापमान (15-25 डिग्री सेल्सियस) पर 30 दिनों तक और 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 दिनों तक इंतजार कर सकती हैं।

2. प्लाज्मा और बफी कोट जुदाई और भंडारण

  1. सेंट्रलाइज 425 x g पर खून से भरे संरक्षण ट्यूब को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अलग प्लाज्मा के लिए।
    नोट: चरण 2.2 और 2.3 जैवसेफ्टी कैबिनेट में किया जाना चाहिए।
  2. निचली परतों को परेशान किए बिना, 1 एमएल एलिकोट में एक ताजा ट्यूब के लिए ऊपरी प्लाज्मा परत को ध्यान से बाहर निकालें।
  3. निचली परत में आरबीसी से बचते हुए बफी कोट की अगली परत को एक ताजा ट्यूब (परत आरबीसी छर्रों के ऊपर एक अंगूठी के रूप में दिखाई देती है) को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
  4. प्लाज्मा के साथ 3 कदम और बफी कोट के साथ 4 कदम आगे बढ़ें। यदि आवश्यक हो तो -80 डिग्री सेल्सियस पर अलग सामग्री स्टोर करें।

3. प्लाज्मा के 1 एमएल से परिसंचारी सीएफडीएनए का शुद्धिकरण

नोट: यह कदम एक वाणिज्यिक किट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ किया जाता है। सभी बफर किट के साथ प्रदान की जाती हैं।

  1. बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी
    सावधानी: नमूना तैयार करने वाले कचरे में अम्लीय समाधान या ब्लीच न जोड़ें। लाइसिस बफर, बाइंडिंग बफर, और वॉश बफर-1 में मौजूद ग्वानिडीन लवण जब ब्लीच या एसिड के साथ संयुक्त अत्यधिक प्रतिक्रियाशील यौगिकों का उत्पादन कर सकते हैं।
    1. बाइंडिंग बफर: 500 एमएल वर्किंग बाइंडिंग बफर बनाने के लिए 100% आइसोप्रोपेनॉल के 200 एमएल के साथ बाइंडिंग बफर के 300 एमएल को मिलाएं। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      नोट: बाइंडिंग बफर सिलिका झिल्ली में परिसंचारी न्यूक्लिक एसिड के इष्टतम बाध्यकारी की अनुमति देता है। बाध्यकारी बफर का 500 एमएल क्रमशः प्लाज्मा के 1, 2, 3, 4 या 5 एमएल के 276, 138, 92, 69 या 55 नमूनों के प्रसंस्करण के लिए पर्याप्त है और कमरे के तापमान पर 1 वर्ष के लिए स्थिर है।
    2. वॉश बफर-1: वॉश बफर-1 के 19 एमएल को मिलाएं 96-100% इथेनॉल के 25 एमएल के साथ 44 एमएल वर्किंग वॉश बफर-1 बनाने के लिए ध्यान केंद्रित करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      नोट: बफर-1 धोएं सिलिका झिल्ली से बंधे संदूषकों को समाप्त करता है। वर्किंग वॉश बफर-1 का 44 एमएल प्लाज्मा के 1/2/3/4/5 एमएल के 73 नमूनों को प्रोसेस करने के लिए पर्याप्त है और कमरे के तापमान पर 1 साल के लिए स्थिर है।
    3. वॉश बफर-2: 13 एमएल वॉश बफर-2 96-100% इथेनॉल के 30 एमएल के साथ अच्छी तरह से मिलाएं वर्किंग वॉश बफर-2 का 43 एमएल बनाने के लिए। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
      नोट: बफर-2 धोएं सिलिका झिल्ली से बंधे संदूषकों को समाप्त करता है। वर्किंग वॉश बफर-2 का 43 एमएल प्लाज्मा के 1/2/3/4/5 एमएल के ~ 56 नमूनों को प्रोसेस करने के लिए पर्याप्त है और कमरे के तापमान पर 1 साल के लिए स्थिर है।
    4. 310 माइक्रोन लियोफिलाइज्ड कैरियर आरएनए युक्त ट्यूब में, 0.2 माइक्रोग्राम/μL के वाहक आरएनए समाधान तैयार करने के लिए, एल्शन बफर के 1,550 माइक्रोन जोड़ें। वाहक आरएनए को अच्छी तरह से भंग करने के बाद, समाधान को उपयुक्त एलिकोट्स में विभाजित करें, और -30 डिग्री सेल्सियस पर -15 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। फ्रीज-गल न करें इन एलिमेंट्स को 3 बार से ज्यादा। लाइसिस बफर के लिए, जैसा कि टेबल एस 1में दिखाया गया है, संयुव बफर बफर में भंग पुनर्गठित वाहक आरएनए जोड़ें।
      नोट: क्योंकि वाहक आरएनए सीधे लाइसिस बफर में भंग नहीं होता है, इसे पहले एल्यूशन बफर में और फिर लाइसिस बफर में भंग करने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, सिलिका झिल्ली-न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी बढ़ाया जाता है जब नमूने में बहुत कम लक्षित अणु मौजूद होते हैं। दूसरे, बड़ी मात्रा में वाहक आरएनए की उपस्थिति के कारण आरएनए क्षरण का खतरा कम हो जाता है ।
  2. अलगाव शुरू करने से पहले, कॉलम और नमूनों को कमरे के तापमान में लाएं और जरूरत पड़ने पर बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ नमूना संस्करणों को 1 एमएल में समायोजित करें। प्री हीट 2 वॉटर बाथ या हीटिंग ब्लॉक्स जिनमें क्रमशः 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब और 2 एमएल कलेक्शन ट्यूब 60 डिग्री सेल्सियस और 56 डिग्री सेल्सियस होते हैं।
  3. 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में, 100 माइक्रोन प्रोटीनेज के, 1 एमएल प्लाज्मा, और 0.8 एमएल लाइसिस बफर में 1.0 माइक्रोग्राम वाहक आरएनए (चरण 3.1.4 में तैयार) जोड़ें। एक टोपी के साथ अपकेंद्रित्र ट्यूब बंद करें और ट्यूब में एक दृश्य भंवर सुनिश्चित करते हुए 30 एस के लिए पल्स-भंवर द्वारा सामग्री मिलाएं। कुशल लाइसिस के लिए सामग्री का पूरी तरह से मिश्रण महत्वपूर्ण है।
    नोट: भंवर के तुरंत बाद, बिना किसी देरी के 3.4 कदम पर आगे बढ़ें।
  4. 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर समाधान इनक्यूबेट करें।
  5. टोपी निकालें, ट्यूब में बाध्यकारी बफर के 1.8 एमएल जोड़ें, और टोपी रखने के बाद 15-30 एस के लिए पल्स भंवर के साथ अच्छी तरह से मिलाएं।
  6. बर्फ पर 5 मिनट के लिए परिणामी मिश्रण को इनक्यूबेट करें और वैक्यूम पंप से जुड़े वैक्यूम उपकरण में सिलिका झिल्ली स्तंभ डालें। फिर, सैंपल लीकेज को रोकने के लिए खुले कॉलम में 20 एमएल ट्यूब एक्सटेंडर को मजबूती से डालें।
  7. ध्यान से कॉलम के ट्यूब विस्तारक में इनक्यूबेटेड मिश्रण डालना और वैक्यूम पंप पर स्विच करें। सभी lysate मिश्रण पूरी तरह से कॉलम के माध्यम से चलाता है के बाद, वैक्यूम पंप बंद, 0 mbar करने के लिए दबाव जारी है, और हटाने और ट्यूब विस्तारक त्यागने।
    नोट: क्रॉस-संदूषण से बचने, ट्यूब एक्सटेंडर को सावधानी से छोड़ दिया जाना चाहिए, ताकि आसन्न स्तंभों पर इसके फैलने से रोका जा सके।
  8. वैक्यूम उपकरण से कॉलम निकालें, संग्रह ट्यूब में डालें, और कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 11,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, किसी भी अवशिष्ट lysate को दूर करने के लिए। प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  9. कॉलम में वॉश बफर-1 के 600 माइक्रोन जोड़ें, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 11,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  10. कॉलम में वॉश बफर-2 के 750 माइक्रोन जोड़ें, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 11,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  11. इथेनॉल के 750 माइक्रोन जोड़ें (96-100%) कॉलम में, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 11,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से त्यागना।
  12. 3 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर कॉलम को एक साफ 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखकर, सेंट्रलाइज करें।
  13. झिल्ली स्तंभ असेंबली को पूरी तरह से एक नए 2 मिलील संग्रह ट्यूब में रखकर ढक्कन खुला और 10 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके सुखा लें।
  14. कॉलम को साफ 1.5 एमएल एल्यूशन ट्यूब में रखें। कॉलम झिल्ली के केंद्र में, एलयूशन बफर के 20-150 माइक्रोन लागू करें और ढक्कन बंद के साथ 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि एल्यूशन बफर कमरे के तापमान पर बराबर है। 50 माइक्रोन से कम एल्यूशन बफर का उपयोग करने के मामले में, सुनिश्चित करें कि इसे झिल्ली के केंद्र पर सावधानीपूर्वक तिरस्कृत किया जाता है। यह बंधे डीएनए के पूर्ण योग के साथ मदद करता है। हालांकि, एलयूशन वॉल्यूम तय नहीं है और डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशंस के अनुसार इसे बदला जा सकता है। बरामद एल्यूएट 5 माइक्रोन तक हो सकता है और निश्चित रूप से कॉलम पर लागू एल्यूशन वॉल्यूम से कम हो सकता है।
  15. सेंटीफ्यूज बरामद 20,000 x ग्राम में एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 1 मिनट के लिए न्यूक्लिक एसिड को एल्यूयूट करने के लिए, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. बफी कोट से जीनोमिक डीएनए का शुद्धिकरण

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली वाणिज्यिक किट का उल्लेख सामग्री की तालिकामें किया गया है। नीचे प्रोटोकॉल यानी लिसिस बफर ए, लाइसिस बफर बी, वॉश बफर एक्स, वॉश बफर वाई, प्रोटीनेज बफर, एल्यूशन बफर और प्रोटीनेज के में बताए गए बफर और रिएजेंट्स इस कमर्शियल किट का हिस्सा हैं।

  1. बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी
    सावधानी: नमूना तैयार करने वाले कचरे में अम्लीय समाधान या ब्लीच न जोड़ें। लाइसिस बफर बी और वॉश बफर एक्स में मौजूद ग्वानिडीन लवण जब ब्लीच या एसिड के साथ संयुक्त होते हैं, तो अत्यधिक प्रतिक्रियाशील यौगिकों का उत्पादन कर सकते हैं।
    1. वॉश बफर वाई: 48 मिलीनॉल इथेनॉल (96-100%) कमरे के तापमान पर काम कर रहे वॉश बफर वाई स्टोर के 60 एमएल प्राप्त करने के लिए।
      नोट: वर्किंग वॉश बफर वाई का 60 एमएल 100 बफी कोट नमूनों को संसाधित करने के लिए पर्याप्त है और 1 वर्ष के लिए स्थिर है।
    2. प्रोटीनेज के: प्रोटीनेज के घोल को 30 मिलीग्राम ल्योफिलाइज्ड प्रोटीनेज के को 1.35 एमएल प्रोटीनेज बफर में घोलकर तैयार करें।
      नोट: प्रोटीनेज के कुल कार्य समाधान 52 बफी कोट नमूनों को संसाधित करने के लिए पर्याप्त है। प्रोटीनेज के वर्किंग सॉल्यूशन को -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 6 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. प्रक्रिया शुरू करने से पहले कदम
    1. बफी कोट को कमरे के तापमान पर बराबर रखें।
    2. हीट ब्लॉक या वाटर बाथ को 56 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  3. 200 माइक्रोल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए लाइसिस बफर ए में बफी कोट को निलंबित करें। इसके बाद 25 माइक्रोन प्रोटीनेज के सॉल्यूशन और लाइसिस बफर बी के 200 माइक्रोन मिक्स को 10-15 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर भंवर और इनक्यूबेट करके जोड़ें। सुनिश्चित करें कि नमूने पूरी तरह से लाइसिस समाधान के साथ कवर कर रहे हैं।
    नोट: नमूनों की प्रसंस्करण श्रृंखला के लिए, प्रोटीनेज कश्मीर और लाइसिस बफर ए को प्रक्रिया से 10-15 मिनट पहले प्रीमिक्स किया जा सकता है, लेकिन अब उससे पहले नहीं, क्योंकि प्रोटीनेज के स्वयं को बिना सब्सट्रेट के लाइसिस बफर ए में पचाता है।
  4. उपरोक्त मिश्रण और भंवर में 96-100% इथेनॉल के 210 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: इथेनॉल के अलावा एक स्ट्रीढ़ी तेज़ी से बन सकता है; हालांकि, यह डीएनए अलगाव को प्रभावित नहीं करेगा । कॉलम पर भी वर्षा लोड करना सुनिश्चित करें, जैसा कि निम्नलिखित चरणों में दिखाया गया है।
  5. पूरे नमूने को संग्रह ट्यूब में रखे सिलिका कॉलम पर लोड करें। 11,000 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए सेंट्रलाइज। कॉलम को एक नए संग्रह ट्यूब में रखें और प्रवाह के साथ-साथ पिछली ट्यूब को त्याग दें।
    नोट: यदि नमूना पूरी तरह से मैट्रिक्स के माध्यम से नहीं खींचा जाता है तो अपकेंद्रित्र चरण दोहराएं।
  6. वॉश बफर एक्स के 500 माइक्रोन जोड़ें, 11,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  7. कॉलम को संग्रह ट्यूब में रखें, कॉलम पर वॉश बफर वाई के 600 माइक्रोन जोड़ें, 11,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  8. फिर, कॉलम को संग्रह ट्यूब में रखें, और सिलिका झिल्ली को सुखाने के लिए 20,000 x ग्राम पर 1 मिनट के लिए कॉलम को अपकेंद्रित्र करें।
  9. 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कॉलम को इनक्यूबेट करें, 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखा गया, और फिर एल्यूशन बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें। फिर, 11,000 x g पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा डीएनए को एल्यूट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5. फ्लोरोमीटर का उपयोग कर cfDNA और जीनोमिक डीएनए का मात्राकरण

  1. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, निम्नलिखित चरणों को करें।
    1. अल्ट्रापुरे नाभिक मुक्त पानी के साथ 1:10 अनुपात में eluted जीनोमिक डीएनए (चरण 4.9 से) के 2 μL पतला। अपेक्षित कम सांद्रता के कारण, चरण 3.15 से सीएफडीएनए नमूनों को पतला न करें।
    2. परख मानक #1 और परख मानक कमरे के तापमान के लिए #2 बराबर ।
  2. 0.5 एमएल आकार की कुल 6 पतली दीवारों वाली साफ ट्यूब तैयार करें।
    नोट: प्रस्तुत प्रोटोकॉल 2 cfDNA और 2 जीनोमिक डीएनए नमूनों की मात्रा के लिए है, इसलिए, 4 नमूनों के लिए 4 ट्यूब और इस परख के लिए 2 मानकों की आवश्यकता है ।
  3. ट्यूब के ढक्कन लेबल।
    नोट: ट्यूब के किनारे पर लेबलिंग पढ़ने के साथ हस्तक्षेप कर सकता है । इसके अतिरिक्त, परख मानक ट्यूबों को ध्यान से लेबल किया जाता है, क्योंकि फ्लोरोमीटर के अंशांकन के लिए आवश्यक है कि मानक सही क्रम में हैं।
  4. काम समाधान तैयार करने के लिए परख बफर के साथ 1:200 में परख अभिकर् तार को पतला करें। 4 नमूनों और 2 मानकों के लिए, काम समाधान के 1,200 माइक्रोन (प्रत्येक ट्यूब में 200 माइक्रोन) बनाने के लिए परख रिएजेंट के 6 माइक्रोन प्लस 1,194 माइक्रोन का उपयोग करें।
    नोट: एक ग्लास कंटेनर का उपयोग न करें, इसके बजाय एक साफ प्लास्टिक ट्यूब का उपयोग करें। प्रत्येक ट्यूब में अंतिम मात्रा के लगभग 200 माइक्रोन होते हैं (एक परख मानक ट्यूब में काम करने वाले समाधान के 190 माइक्रोन होते हैं, और नमूना ट्यूब में काम करने वाले समाधान का 180-199 माइक्रोन होना चाहिए)। सभी परख मानकों और नमूनों को समायोजित करने के लिए पर्याप्त कार्य समाधान तैयार किया जाना चाहिए ।
  5. कामकाजी परख मानक ट्यूबों में, 190 माइक्रोन काम समाधान और 10 माइक्रोन परख मानक जोड़ें और 2-3 एस के लिए भंवर से समाधान मिलाएं। समाधान के भीतर बुलबुले के गठन से बचें।
  6. नमूना ट्यूबों में, 198 माइक्रोन वर्किंग सॉल्यूशन और सीएफडीएनए या जीनोमिक डीएनए के 2 माइक्रोन जोड़ें। 2-3 एस के लिए भंवर से समाधान मिलाएं, और इसे 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटेड रखें।
  7. फ्लोरोमीटर इंस्ट्रूमेंट की'होम'स्क्रीन में'डीएनए'दबाएं और'डीएसडीएनए हाई सेंसिटिविटी परख'का चयन करें,'मानकोंकी स्क्रीन' प्रदर्शित करें, फिर फ्लोरोमीटर'मानकोंकीस्क्रीन पर हां' दबाएं ताकि मानकों को पढ़ें।
  8. नमूना कक्ष में, परख मानक #1 ट्यूब डालें, ढक्कन बंद करें, और'पढ़ें' दबाएं। पढ़ने के पूरा होने के बाद ट्यूब निकालें (लगभग 3 एस) और मानक #2 के लिए एक ही कदम दोहराएं।
  9. अंशांकन प्रक्रिया पूरी होने के बाद एक नमूना स्क्रीन प्रदर्शित की जाती है, फिर एक नमूना ट्यूब डालें और दोहराने वाले चरण '5.8' डालें। "नमूना स्क्रीन" तो एक मूल्य है कि नमूना ट्यूब में कमजोर पड़ने के बाद नमूना की एकाग्रता के अनुरूप प्रदर्शित करेगा ।
  10. प्रत्येक नमूना दोहराने कदम '5.9' के लिए, जब तक सभी नमूनों को पढ़ा जाता है।
  11. नमूने की वास्तविक एकाग्रता की गणना करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें।
    Equation 1
    नोट: परख मूल्य एनजी/एमएल में हैं और परख ट्यूब में कमजोर पड़ने के बाद एकाग्रता से मेल खाती है । उपरोक्त चरण 5.11 में उल्लिखित समीकरण, क्यूएफ मूल्य फ्लोरोमीटर उपकरण द्वारा दिया गया मूल्य है, और एक्स परख ट्यूब में जोड़े गए नमूने के माइक्रोलीटर की संख्या है। समीकरण द्वारा उत्पन्न होने वाले क्यूएफ मूल्यों के लिए इकाइयां फ्लोरोमीटर द्वारा प्रदान किए गए मूल्य के समान हैं। उदाहरण के लिए, यदि फ्लोरोमीटर का मूल्य एनजी/एमएल में है, तो समीकरण द्वारा गणना की गई एकाग्रता के लिए इकाइयां एनजी/एमएल हैं ।

6. टुकड़ा विश्लेषक द्वारा cfDNA के डीएनए टुकड़ा आकार वितरण

  1. प्रक्रिया शुरू करने से पहले कदम: डीएनए डाई ध्यान केंद्रित और डीएनए जेल मैट्रिक्स को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बराबर करें।
  2. जेल-डाई मिश्रण की तैयारी
    सावधानी: सावधानी के साथ समाधान संभाल के रूप में DMSO ऊतकों में कार्बनिक अणुओं के प्रवेश की सुविधा के लिए जाना जाता है ।
    1. 10 एस के लिए डीएनए डाई ध्यान वाली शीशी को भंवर से जोड़कर डीएमएसओ को अच्छी तरह से पिघला दें। इस ध्यान के 15 माइक्रोन को डीएनए जेल मैट्रिक्स शीशी में बाहर निकालें और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. फिर, जेल और डाई के मिश्रण तक 10 एस के लिए कैप्ड शीशी भंवर की कल्पना की जाती है।
    3. शीर्ष पात्र के लिए एक स्पिन फिल्टर पर मिश्रण डालो।
    4. माइक्रोसेंट्रफ्यूज स्पिन फिल्टर 2,240 x ग्राम पर ± कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 20% है।
    5. तैयार जेल-डाई को ट्यूब में लेबल करें और अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं के अनुसार फिल्टर को त्याग दें। ट्यूब को लेबल करें और तैयारी की तारीख रिकॉर्ड करें।
      नोट: अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं के अनुसार फिल्ट्रेट को त्यागें। जेल-डाई मिक्स का इस्तेमाल 5 हाई सेंसिटिविटी (एचएस) डीएनए चिप्स के लिए किया जा सकता है । यदि 1 घंटे से अधिक समय तक अप्रयुक्त है, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अंधेरे में भंडारण 6 सप्ताह तक संभव है।
  3. जेल-डाई मिश्रण लोड करने के लिए, चिप प्राइमिंग स्टेशन की बेस प्लेट की स्थिति सुनिश्चित करें और क्लिप को सबसे कम स्थिति में समायोजित करें।
    1. प्रकाश जोखिम की निगरानी करते हुए, 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए जेल-डाई मिश्रण को बराबर करें।
    2. एक सीलबंद बैग से एक नया एचएस डीएनए चिप लें और इसे चिप प्राइमिंग स्टेशन पर रखें, फिर जेल-डाई मिश्रण के 9.0 माइक्रोन को हटा दें और इसे चिप के नीचे अच्छी तरह से वितरित करें, जो 'जी' के रूप में चिह्नित है।
      नोट: जेल-डाई मिश्रण को आकर्षित करें, उन कणों से बचें जो शीशी के तल पर जमा हो सकते हैं। एचएस डीएनए चिप में जेल-डाई मिश्रण को अच्छी तरह से वितरित करते समय, बड़े हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए, पिपेट की नोक को पूरी तरह से डालें। इसके अलावा, कुएं के किनारों पर पिपेट को छूने से खराब परिणाम पैदा होंगे।
    3. 1 एमएल पर प्लंजर की स्थिति और चिप प्राइमिंग स्टेशन बंद करें। कुंडी क्लिक का ताला सुनिश्चित करें और 60 s करने के लिए टाइमर सेट, तो प्लंजर नीचे प्रेस जब तक यह क्लिप द्वारा आयोजित किया जाता है, और ठीक 60 एस के बाद, क्लिप रिलीज तंत्र के साथ प्लंजर जारी।
    4. जब प्लंजर कम से कम 0.3 एमएल मार्क तक पीछे हटता है, तो 5 एस के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर धीरे-धीरे 1 एमएल स्थिति में वापस खींचें, फिर चिप प्राइमिंग स्टेशन खोलें और फिर से जेल-डाई मिश्रण के 9.0 माइक्रोन को हटा दें और एचएस डीएनए चिप के नीचे अच्छी तरह से वितरित करें, जो 'जी' के रूप में चिह्नित है।
  4. डीएनए मार्कर लोड करने के लिए, सीढ़ी प्रतीक के साथ चिह्नित कुएं में डीएनए मार्कर के 5 माइक्रोन बांटना। सभी 11 नमूना कुओं के लिए प्रक्रिया दोहराएं।
  5. सीढ़ी और नमूनों को लोड करने के लिए, कुएं में डीएनए सीढ़ी के 1 μL बांटना, सीढ़ी प्रतीक के साथ चिह्नित और फिर सभी 11 नमूना कुओं में नमूना (इस्तेमाल किया कुओं) या मार्कर के 1 μL (अप्रयुक्त कुओं) के 1 μL जोड़ें ।
  6. भंवर 2,400 आरपीएम पर 60 एस के लिए एचएस डीएनए चिप को चिप को क्षैतिज रूप से एडाप्टर में रखकर। सुनिश्चित करें कि एचएस डीएनए चिप को ठीक करने वाले उभार को भंवर के दौरान नुकसान न पहुंचे।
  7. टुकड़ा विश्लेषक उपकरण में एचएस डीएनए चिप डालने के लिए, ढक्कन खोलने के लिए और यह सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड कारतूस ठीक से डाला गया है, और चिप चयनकर्ता टुकड़ा विश्लेषक साधन में ' dsHigh संवेदनशीलता डीएनए ' के लिए तैनात है ।
  8. ध्यान से गोदाम में एचएस डीएनए चिप माउंट, जो केवल एक ही रास्ता फिट बैठता है, तो यह सुनिश्चित करना है कि इलेक्ट्रोड कारतूस एचएस डीएनए चिप के कुओं में बिल्कुल फिट बैठता है द्वारा ढक्कन खो देते हैं ।
  9. टुकड़ा विश्लेषक सॉफ्टवेयर स्क्रीन पर प्रदर्शन स्क्रीन के शीर्ष बाईं ओर चिप आइकन के माध्यम से डाला एचएस डीएनए चिप और बंद ढक्कन इंगित करता है ।
  10. एचएस डीएनए चिप रन शुरू करने के लिए इंस्ट्रूमेंट स्क्रीन पर'परख'मेन्यू से डीएसडीएनए हाई सेंसिटिविटी परख का चयन करें, फिर सैंपल नेम और कमेंट जैसी जानकारी फीड करके सैंपल नेम की टेबल को ठीक से भरें और स्क्रीन के ऊपरी दाईं ओर'स्टार्ट' बटन पर क्लिक कर चिप चलाना शुरू कर दें।
  11. एक एचएस डीएनए चिप चलाने के बाद इलेक्ट्रोड सफाई: तुरंत इस्तेमाल एचएस डीएनए चिप को हटा दें, जैसे ही परख पूरी हो जाती है और अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं के अनुसार इसका निपटान करें। यह सुनिश्चित करने के लिए निम्नलिखित प्रक्रिया करें कि पिछले परख से बचे हुए अवशेषों के बिना इलेक्ट्रोड साफ हैं।
    1. इलेक्ट्रोड क्लीनर कुओं में से एक में deionized विश्लेषण ग्रेड पानी के धीरे-धीरे 350 μL भरें और ढक्कन खोलकर टुकड़ा विश्लेषक उपकरण में इलेक्ट्रोड क्लीनर जगह है और फिर ढक्कन बंद करो और के बारे में 10 एस के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. ढक्कन खोलकर इलेक्ट्रोड क्लीनर निकालें और ढक्कन बंद करने से पहले वाष्पित होने के लिए इलेक्ट्रोड पर पानी के लिए, एक और 10 एस के लिए प्रतीक्षा करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

प्लाज्मा जुदाई
8.5-9 एमएल रक्त सीएफडीएनए या सीएफआरएनए परिरक्षक ट्यूबों में एकत्र मात्रा में ~ 4 एमएल प्लाज्मा के आसपास पैदावार। EDTA ट्यूबों में एकत्र रक्त से अलग प्लाज्मा की मात्रा तापमान के आधार पर भिन्न हो सकती है। 37 डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान पर रक्त युक्त ईडटा ट्यूबों के संपर्क में आने से प्लाज्मा की मात्रा44घट जाती है .

फ्लोरोमीटर परख परिणाम
ग्लियोमा रोगियों में से प्रत्येक के 1 मिलीएल प्लाज्मा में सीएफडीएनए एकाग्रता #1 क्रमशः #H1 #H1, #3 #H2 #H3 और स्वस्थ नियंत्रण #H1 137 एनजी, 12.6 एनजी, 6.52 एनजी, 2.26 एनजी और 2.48 एनजी थे। हालांकि, ग्लियोमा रोगी में #2 फ्लोरोमीटर में सीएफडीएनए एकाग्रता का पता लगाया जाना बहुत कम था। कैंसर रोगी के 1 मिलीएल प्लाज्मा में सीएफडीएनए एकाग्रता 0.5 से 1000 एनजी18तक होती है, जिसमें 20 एनजी का औसत मूल्य होता है। स्वस्थ व्यक्तियों में, सीएफडीएनए एकाग्रता एक अज्ञेय एकाग्रता से लेकर 16 एनजी तक होती है, जिसमें 8 एनजी45का औसत मूल्य होता है। जीनोमिक डीएनए २०० μL बफी कोट (PBMCs) से अलग डीएनए के लगभग 25-५० माइक्रोन पैदावार ।

डीएनए खंड विश्लेषक परख परिणाम
पिछले एक अध्ययन के अनुसार, cfDNA १६६-बीपी लंबे टुकड़ों में समृद्ध है, जो एक मरीज के प्लाज्मा में कुल cfDNA का ~ ८५% के लिए खाते । इसके विपरीत, 332-बीपी लंबे टुकड़े 10% के लिए खाते हैं, और 498 बीपी लंबे टुकड़े सीएफडीएनए46के 5% के लिए खाते हैं। दो मुख्य कारक जो सीएफडीएनए खंड विश्लेषक परख परिणामों को प्रभावित करते हैं, वे पीबीएमएमसी से जीनोमिक डीएनए संदूषण और सीएफडीएनए की कम एकाग्रता हैं। चित्रा 1 ग्लियोमा रोगी #1 के अपेक्षित cfDNA बायोएनालाइजर ग्राफ को दर्शाता है, जिसमें सीएफडीएनए के टुकड़े 166 बीपी पर समृद्ध होते हैं और नमूना21में कोई जीनोमिक डीएनए संदूषण नहीं है। चित्रा 2 ग्लियोमा रोगी #1 और खंड संवर्धन के cfDNA के NGS पुस्तकालय की तैयारी के बाद खंड संवर्धन ग्राफ से पता चलता है १६६ बीपी से २९१ बीपी के लिए स्थानांतरित कर दिया है, १२५ बीपी अनुक्रमित और यह करने के लिए एडाप्टर के लगाव के कारण । चित्रा 3 ग्लियोमा रोगी #2 के सीएफडीएनए टुकड़ों के बहुत मामूली संवर्धन को दर्शाता है। ग्लियोमा रोगी #2 में कम सीएफडीएनए एकाग्रता के बावजूद, सीएफडीएनए और पीसीआर प्रवर्धन चरणों में एनजीएस एडाप्टर के अलावा विखंडन ग्राफ चित्रा 4पर दृश्यमान सीएफडीएनए पुस्तकालय शिखर की ओर ले जाता है। इसलिए, पुस्तकालय को इस कम एकाग्रता सीएफडीएनए नमूने से सफलतापूर्वक तैयार किया गया था, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है। चित्रा 5में, ग्लियोमा रोगी #3 के सीएफडीएनए टुकड़े को १६६ बीपी के पास चोटी पर दिखाया गया है लेकिन जीनोमिक डीएनए संदूषण १०३८० बीपी संदर्भ सीढ़ी चोटी के पास भी स्पष्ट है ।

Figure 1
चित्रा 1: ग्लियोमा नमूना #1 सीएफडीएनए का एक आदर्श सीएफडीएनए टुकड़ा एनालाइजर परख ग्राफ। एक प्रमुख चोटी 166 बीपी पर देखी गई और 332 बीपी पर एक छोटी चोटी देखी गई। इस नमूने में कोई जीनोमिक संदूषण नहीं देखा गया था, जो १०,३८० बीपी अपर मार्कर के करीब होता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक आदर्श cfDNA टुकड़ा विश्लेषक सीएफडीएनए पुस्तकालय #1 ग्लियोमा नमूना का परख ग्राफ। १२५ बीपी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय एडाप्टर, १६६ बीपी और ३३२ बीपी सीएफडीएनए टुकड़ों में एक प्रमुख चोटी क्रमशः २९१ बीपी और ४५७ बीपी पर एक छोटी चोटी दिखाई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सीएफडीएनए खंड विश्लेषक परख ग्राफ ग्लियोमा नमूना #2 सीएफडीएनए, 166 बीपी पर एक बहुत छोटी चोटी दिखा रहा है। सीएफडीएनए की कम सांद्रता के कारण, 166 बीपी पर पीक मुश्किल से दिखाई दे रहा था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ग्लियोमा नमूना #2 के cfDNA पुस्तकालय के cfDNA खंड विश्लेषक परख ग्राफ। पुस्तकालय की तैयारी के दौरान 125 बीपी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय एडाप्टर और पीसीआर चक्र प्रदर्शन करने के बाद, 332 बीपी और 498 बीपी पर 166 बीपी या पूरी तरह से अदृश्य चोटियों पर बमुश्किल दिखाई देने वाली सीएफडीएनए चोटी स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही थी। एक प्रमुख चोटी २९१ बीपी के करीब मौजूद थी और ४५७ बीपी, ६२३ बीपी, ७८९ बीपी और करीब २,५०० बीपी पर छोटी चोटी देखी गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: cfDNA टुकड़ा विश्लेषक परख ग्लियोमा नमूना #3 cfDNA में जीनोमिक डीएनए संदूषण दिखा । १६६ बीपी पर एक छोटी सी चोटी cfDNA और ऊपरी मार्कर (१०,३८० बीपी) के पास संवर्धन की उपस्थिति का संकेत जीनोमिक डीएनए संदूषण था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका S1: प्लाज्मा नमूनों के 1 मिलीएल प्रसंस्करण के लिए आवश्यक लाइसिस बफर और कैरियर आरएनए (बफर AVE में भंग) की मात्रा। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एक ट्यूब, शिपमेंट और भंडारण में एक मरीज के रक्त का संग्रह तरल बायोप्सी में महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम हैं । अनुचित हैंडलिंग प्लाज्मा की गुणवत्ता को ख़राब कर सकती है और इसलिए, तरल बायोप्सी47के परिणामों में हस्तक्षेप कर सकती है। यदि एक रक्त नमूना एक EDTA रक्त ट्यूब में एकत्र किया जाता है, प्लाज्मा रक्त संग्रह के दो घंटे के भीतर अलग किया जाना चाहिए WBCs के lysis से बचने के लिए और प्लाज्मा४८में अपने जीनोमिक डीएनए की रिहाई । डब्ल्यूबीसी यदि लंबे समय तक रखा जाता है तो ईडीटीए ट्यूब में एपोप्टोसिस से भी गुजरना पड़ सकता है, और परिणामस्वरूप सीएफडीएनए के टुकड़े प्लाज्मा48में मूल सीएफडीएनए को दूषित कर सकते हैं। प्लाज्मा जुदाई से पहले ट्यूब के अत्यधिक झटकों से उच्च तापमान (>37 डिग्री सेल्सियस) या अत्यधिक झटकों के लिए रक्त के नमूने का संपर्क हीमोलिसिस का कारण बनता है। इसके फलस्वरूप प्लाज्मा में संदूषक के रूप में बना हुआ हीमोग्लोबिन सीएफडीएनए की डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं को प्रभावित करता है जैसे पुस्तकालय की तैयारीके दौरान 49. उच्च तापमान (>37 डिग्री सेल्सियस) भी एक EDTA रक्त ट्यूब में प्लाज्मा की उपज को प्रभावित करता है । इसलिए, एक EDTA ट्यूब50 में अपने संग्रह के बाद प्लाज्मा के शीघ्र जुदाई विधि की गुणवत्ता नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण कदम है। यदि वाणिज्यिक सीएफडीएनए या सीएफआरएनए संरक्षण ट्यूब में रक्त एकत्र किया जाता है, तो रक्त संग्रह40के तुरंत बाद रक्त के साथ परिरक्षक रसायन मिलाया जाना चाहिए। प्रिजर्वेटिव केमिकल को ठीक से मिक्स करने में नाकामी से प्लाज्मा में माइक्रोक्लोट्स का गठन होता है। ये सीएफडीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान एक कॉलम में सिलिका झिल्ली को रोकते हैं और सीएफडीएनए की उपज को कम करते हैं। ट्यूब में रक्त के मध्यम मिलाते हुए हीमोलिसिस का कारण नहीं बनता है; हालांकि अत्यधिक मिलाते हुए इन ट्यूब्स40में भी हीमोलिसिस पैदा कर सकता है . इसलिए, इन ट्यूबों के शिपमेंट या हैंडलिंग के दौरान, अत्यधिक झटकों से बचना चाहिए। रक्त ट्यूबों को उनकी ईमानदार स्थिति में भेजने की सिफारिश की जाती है।

प्रति यूनिट प्लाज्मा सीएफडीएनए एकाग्रता का सटीक मात्राकरण और मूल्यांकन तरल बायोप्सी में एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि प्लाज्मा सीएफडीएनए एकाग्रता सीधे शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं51से जुड़ी हुई है। सीएफडीएनए एकाग्रता स्वस्थ विषयों की तुलना में कैंसर के रोगियों में अधिक है52. मानव रक्त में बढ़ी हुई सीएफडीएनए एकाग्रता कैंसर के लिए विशिष्ट नहीं है; गर्भवती महिलाओं और रोगियों को जो प्रत्यारोपण प्राप्त भी उनके ब्लड21में ऊंचा cfDNA सांद्रता है करते हैं . सीएफडीएनए एकाग्रता53के बढ़े हुए स्तर के साथ सूजन, ऊतक आघात, मधुमेह, मायोकार्डियल इंफार्क्शन और सेप्सिस के लिए संघों को भी दिखाया गया है। प्रारंभिक चरण के कैंसर रोगियों में प्लाज्मा cfDNA की एकाग्रता उन्नत या मेटास्टैटिक ट्यूमर के साथ रोगियों की तुलना में कम हो जाता है । यह एक ट्यूमर बोझ54के साथ cfDNA के एक सीधे सहयोग का समर्थन करता है. रक्त में सीएफडीएनए एकाग्रता कैंसर रोगियों में 0.5 और 1000 एनजी/एमएल के बीच और स्वस्थविषयोंमें 0 से 100 एनजी/एमएल के बीच काफी भिन्न होती है। पुस्तकालय की तैयारी के लिए, सीएफडीएनए की न्यूनतम 0.5 एनजी की आवश्यकता होती है। अनुक्रमण के लिए सीएफडीएनए की न्यूनतम मांग मात्रा प्राप्त करने के लिए, कोई भी रक्त नमूने या 1 एमएल प्लाज्मा नमूने के न्यूनतम 2 एमएल के साथ शुरू कर सकता है। इसके अलावा, प्लाज्मा सीएफडीएनए निष्कर्षण के दौरान तकनीकी त्रुटियां भी सीएफडीएनए उपज और परिणामी एकाग्रता को कम करती हैं, जिससे वास्तविक प्लाज्मा सीएफडीएनए एकाग्रता से विचलित हो जाता है। सीएफडीएनए का क्षरण ईडीए ट्यूबों में एंटीकोगुलेंट्स के कारण या प्लाज्मा नमूनों की कई विगलन और ठंड की प्रक्रिया के कारण हो सकता है। लाइसिस प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन की खराब गतिविधि के परिणामस्वरूप सीएफडीएनए की उपज भी कम होती है। प्रोटीनेज कश्मीर गतिविधि उच्च तापमान के लिए अपने लंबे समय तक जोखिम के कारण कम हो जाती है । सीएफडीएनए निष्कर्षण वाशिंग स्टेप के दौरान 96-100% के बजाय कम एकाग्रता इथेनॉल का उपयोग भी सीएफडीएनए की कम उपज का कारण बनता है। इसलिए, सटीक और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए तरल बायोप्सी तकनीक में तकनीकी त्रुटियों से बचना महत्वपूर्ण है।

सीएफडीएनए का गुणात्मक विश्लेषण एक केंद्रीय कदम है, जिसके दौरान निकाले गए सीएफडीएनए नमूने में मौजूद डीएनए के टुकड़ों के वास्तविक वितरण का अनुमान लगाया गया है। गुणात्मक विश्लेषण द्वारा इसकी शुद्धता की पुष्टि करने के बाद ही सीएफडीएनए के मात्रात्मक परिणाम विश्वसनीय होते हैं। इसलिए, डीएनए खंड विश्लेषक परख में उत्पन्न सीएफडीएनए का एक आदर्श ग्राफ 166 बीपी के पास सीएफडीएनए टुकड़ों के प्रमुख शिखर और 332 बीपी लंबाई के पास एक छोटी चोटी के संवर्धन को दर्शाता है। यह इंगित करता है कि निकाले गए सीएफडीएनए नमूने को डब्ल्यूबीसी से जीनोमिक डीएनए से दूषित नहीं किया गया है। यदि एक टुकड़ा संदर्भ सीढ़ी (10,380bp) और उससे आगे के लिए ७,००० बीपी से समृद्ध है, यह WBC जीनोमिक डीएनए के साथ एक cfDNA नमूने के संदूषण इंगित करता है । यदि जीनोमिक डीएनए संदूषण डीएनए टुकड़ा आकार अनुमान परख के बाद एक cfDNA नमूने में देखा जाता है नमूना एक १०० बीपी सीढ़ी के साथ 2% agarose जेल पर चलाया जा सकता है, और जेल सीमा ~ 150-200 बीपी के बीच उत्पादित किया जा सकता है, एक जेल निष्कर्षण परख के बाद । एगर उठे जेल आकार चयन प्रक्रिया के दौरान सीएफडीएनए की कुछ मात्रा खो जाती है। हालांकि, एनजी लाइब्रेरी तैयार करने के कदम के लिए अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को तैयार करने के लिए न्यूनतम 0.5 एनजी और अधिकतम 1,000 एनजी इनपुट डीएनए सामग्री की आवश्यकता होती है। इसलिए, यदि सीएफडीएनए की कुल मात्रा 0.5 एनजी के बराबर या उससे अधिक है, तो यह पुस्तकालय तैयार करने के चरण के लिए पर्याप्त मात्रा है। इसके अलावा, इस तरह के नमूने पुस्तकालय तैयारी की प्रक्रिया को सफलतापूर्वक पारित करते हैं, और परिणामस्वरूप पुस्तकालय 125 बीपी इंडेक्स और एडाप्टर के अलावा 457 बीपी पर 291 बीपी और एक छोटी चोटी के करीब एक प्रमुख चोटी दिखाता है।

एनजीएस डेटा विश्लेषण एनजीएस आधारित तरल बायोप्सी तकनीक में अंतिम कदम है, और म्यूटेशन और जीन-जीन फ्यूजन की सूची3,55,56,57 इस चरण में उत्पन्न होती है। जिन उत्परिवर्तनों और जीन-जीन संलयन की पहचान की जाती है, उनका आकलन कैंसर उत्परिवर्तन परिदृश्य58,59पर पिछले अध्ययनों के अनुसार किया जा सकता है , पहले जीन उत्परिवर्तन60 या जीन-जीन संलयन61,62,63पर किया जा सकता है। ये कैंसर रोगियों में शकुन64 और डायग्नोस्टिक7 बायोमार्कर के रूप में काम कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, आइसोसेट डिहाइड्रोजनेज़ 1(आईडीएच 1)जीन में आर 132एच उत्परिवर्तन माध्यमिक ग्लियोब्लास्टोमा कैंसर का एक निर्णायक साइनपोस्ट है, और इसे प्राथमिक ग्लियोब्लास्टोमा से भी अलग करता है जिसमें यह उत्परिवर्तन सामान्य रूप सेअनुपस्थित है 65। इसके अलावा, क्रोनिक माइलोजेनस ल्यूकेमिया (सीएमएल) की विशेषता बीसीआर/एबीएल1 जीन फ्यूजन है जिसके परिणामस्वरूप गुणसूत्र 9 और 2261के बीच संतुलित स्थानांतरण होता है। बीसीआर/एबीएल1 जीन और इसके एमआरएनए और फ्यूजन प्रोटीन सीएमएल जनकों के लिए अद्वितीय हैं और इसलिए, चिकित्सा६६के लिए एक अच्छा लक्ष्य है ।

उन्नत निदान, ट्यूमर और उपचार निगरानी का सही मंचन कैंसर के कुशल प्रबंधन के लिए एक वर्तमान रणनीति है। हाल ही में जब तक, ऊतक बायोप्सी ट्यूमर ऊतकों के हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए सोने के मानक किया गया है । फिर भी, इस क्षेत्र में विशाल अनुसंधान और प्रौद्योगिकी के आगमन के बाद, यह साबित कर दिया है कि एक भी बायोप्सी एक ट्यूमर के पूरे उत्परिवर्तनीय परिदृश्य प्रदान करने में असमर्थ है और यह कि धारावाहिक बायोप्सी आमतौर पर उनके आक्रामकता के कारण प्रदर्शन करने के लिए अव्यावहारिक हैं, विशेष रूप से ग्लियोब्लास्टोमा और लिंफोमा में, जहां बायोप्सी अत्यधिक आक्रामक हैं । इसके अतिरिक्त, लगभग 16% सुई बायोप्सी प्रक्रियात्मक जटिलताओं67से जुड़ी हुई हैं। इसके अलावा, उच्च गुणवत्ता वाले जीनोमिक प्रोफाइलिंग के लिए पर्याप्त मात्रा में ऊतक की आवश्यकता होती है, एक मांग जो आमतौर पर सुई बायोप्सी68द्वारा पूरी नहीं होती है।

तरल बायोप्सी, ट्यूमर-व्युत्पन्न डीएनए का विश्लेषण करके एक नियमित रक्त नमूने से नियमित सुई ऊतक बायोप्सी प्रक्रियाओं को बदलने या सहायक पाया जाता है12। तरल बायोप्सी द्वारा प्लाज्मा के माध्यम से ट्यूमर-व्युत्पन्न डीएनए/सीएफडीएनए का विश्लेषण ट्यूमर की आणविक प्रोफाइलिंग के लिए एक न्यूनतम आक्रामक और प्रभावी प्रक्रिया है । यह अनिवार्य रूप से अपनी आक्रामक प्रकृति69के कारण पारंपरिक ट्यूमर ऊतक बायोप्सी के साथ जुड़े संभावित जोखिमों और जटिलताओं के बिना समय के साथ धारावाहिक नमूना द्वारा उपचार की निगरानी की अनुमति दे सकता है। इसके अलावा, एक ट्यूमर घाव के तरल बायोप्सी द्वारा सीएफडीएनए विश्लेषण के साथ सुई बायोप्सी की तुलना करने वाले अध्ययनों में पाया गया कि सीएफडीएनए प्रोफाइलिंग एक पूर्ण आणविक विषमता प्रदान कर सकती है जिसे ट्यूमर को कई अलग क्लोनल आबादी द्वारा आश्रय दिया जा सकता है70।

हालांकि, हालांकि प्लाज्मा cfDNA आधारित निदान ट्यूमर ऊतक बायोप्सी पर कई फायदे हैं, वहां अभी भी कुछ महत्वपूर्ण सीमाएं है कि सामांय नैदानिक अभ्यास में अपनी प्रयोज्यता में बाधा हैं । सीएफडीएनए आधारित तरल बायोप्सी निदान की सीमाओं में समग्र प्रक्रिया की उच्च लागत, उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए की आवश्यकता और एक विशाल डेटा विश्लेषण71की आवश्यकता के लिए एक समर्पित बायोइन्फॉर्मेटिक्स शामिल है। सीएफडीएनए विश्लेषण से जुड़े डेटा प्रबंधन के मुद्दे के कारण, एनजीस भी क्लिनिक में अपने तत्काल आवेदन में समस्या बन गया है । एनजीएस के डेटा प्रबंधन की चुनौतियां मुख्य रूप से गहरे अनुक्रमण के आंतरिक पृष्ठभूमि शोर और ट्यूमर72से जुड़े विपथनों के बीच भेद करने में कठिनाई के कारण होती हैं । अंत में, अधिकांश तरल बायोप्सी परख के लिए नैदानिक वैधता और उपयोगिता डेटा की अनुपलब्धता के कारण, वे वर्तमान में केवल नैदानिक अध्ययन औरबुनियादी शोधों तकही सीमित हैं।

तरल बायोप्सी तकनीक में भविष्य के विकास, जीव विज्ञान, शरीर विज्ञान, आणविक जीव विज्ञान, परख तकनीक, डेटा प्रबंधन के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण, और मशीन-लर्न प्रौद्योगिकी73,74के क्षेत्र में बुनियादी अनुसंधान द्वारा संयुक्त प्रयासों के माध्यम से उम्मीद की जाती है। इसके अतिरिक्त, सीएफडीएनए बायोमार्कर मूल्यांकन के आधार पर कई नैदानिक परीक्षण चल रहे हैं, और उनके परिणाम तकनीक की वैधता स्थापित करने में मदद करेंगे। उम्मीद है कि इन संयुक्त प्रयासों से अगले पांच वर्षों के भीतर ऑन्कोलॉजी नैदानिक सेटिंग में एक शक्तिशाली शकुन, नैदानिक और उपचार निगरानी उपकरण के रूप में सीएफडीएनए विश्लेषण के माध्यम से तरल बायोप्सी मंच स्थापित होगा70,75।

अपनी बात समाप्त करने के लिए, सीएफडीएनए आधारित तरल बायोप्सी कैंसर रोग प्रबंधन में उपयोगी जीनोमिक बायोमार्कर की पहचान करने के लिए एक सुरक्षित और गैर-आक्रामक दृष्टिकोण प्रदान करता है। हालांकि, विश्वसनीय और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए, रक्त संग्रह के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल, प्लाज्मा/डब्ल्यूबीसी सेपरेशन, सीएफडीएनए निष्कर्षण, और सीएफडीएनए मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण विशेष रूप से74,75की आवश्यकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक कैंसर जीनोमिक्स की प्रयोगशाला के सदस्यों को उनके उत्सुक अवलोकन आदानों और इस परियोजना के विभिन्न चरणों में कई चर्चाओं में उनकी भागीदारी के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। फंडिंग सपोर्ट में इज़राइल कैंसर एसोसिएशन (एमएफ-एम 2017-2019 के लिए आईसीए ग्रांट) और इज़राइल इनोवेशन अथॉरिटी (एमएफ-एम के लिए) काइन ग्रांट शामिल है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, P. J., et al. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).
  2. Liotta, L., Petricoin, E. Molecular profiling of human cancer. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 48-56 (2000).
  3. Balamurali, D., et al. ChiTaRS 5.0: the comprehensive database of chimeric transcripts matched with druggable fusions and 3D chromatin maps. Nucleic Acids Research. 48 (1), 825-834 (2019).
  4. Trédan, O., et al. Molecular screening program to select molecular-based recommended therapies for metastatic cancer patients: Analysis from the ProfiLER trial. Annals of Oncology. 30 (5), 757-765 (2019).
  5. Oliveira, K. C. S., et al. Current perspectives on circulating tumor DNA, precision medicine, and personalized clinical management of cancer. Molecular Cancer Research. 18 (4), 517-528 (2020).
  6. Siegal, T. Clinical impact of molecular biomarkers in gliomas. Journal of Clinical Neuroscience. 22 (3), 437-444 (2015).
  7. Komori, T. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System: The Major Points of Revision. Neurologia medico-chirurgica. 57 (7), 301-311 (2017).
  8. Duffy, M. J., O'Donovan, N., Crown, J. Use of molecular markers for predicting therapy response in cancer patients. Cancer Treatment Reviews. 37 (2), 151-159 (2011).
  9. Saenz-Antoñanzas, A., et al. Liquid Biopsy in Glioblastoma: Opportunities, Applications and Challenges. Cancers. 11 (7), 950 (2019).
  10. Marrugo-Ramírez, J., Mir, M., Samitier, J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopsy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2877 (2018).
  11. Pantel, K., Alix-Panabières, C. Liquid biopsy in 2016: Circulating tumour cells and cell-free DNA in gastrointestinal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 73-74 (2017).
  12. Bronkhorst, A. J., et al. The emerging role of cell-free DNA as a molecular marker for cancer management. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100087 (2019).
  13. Cescon, D. W., Bratman, S. V., Chan, S. M., Siu, L. L. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer. 1 (3), 276-290 (2020).
  14. Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, 175883591879463 (2018).
  15. Cohen, J. D. J., et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 926-930 (2018).
  16. Wan, J. C. M., et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 223-238 (2017).
  17. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nature Reviews Genetics. 20 (2), 71-88 (2018).
  18. Thierry, A. R., et al. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (3), 347-376 (2016).
  19. Buscail, E., et al. High Clinical Value of Liquid Biopsy to Detect Circulating Tumor Cells and Tumor Exosomes in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients Eligible for Up-Front Surgery. Cancers. 11 (11), 1656 (2019).
  20. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry. 61 (1), 112-123 (2015).
  21. Kustanovich, A., Schwartz, R., Peretz, T., Grinshpun, A. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biology and Therapy. 20 (8), 1057-1067 (2019).
  22. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
  23. Celec, P., et al. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, (2018).
  24. Gautschi, O., et al. Origin and prognostic value of circulating KRAS mutations in lung cancer patients. Cancer Letters. 254 (2), 265-273 (2007).
  25. Bidard, F., et al. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. International Journal of Cancer. 134 (5), 1207-1213 (2013).
  26. Chan, K. C. A., et al. Analysis of Plasma Epstein–Barr Virus DNA to Screen for Nasopharyngeal Cancer. New England Journal of Medicine. 377 (6), 513-522 (2017).
  27. Mao, L., et al. Detection of Oncogene Mutations in Sputum Precedes Diagnosis of Lung Cancer. Cancer Research. 54 (7), 1634-1637 (1994).
  28. De Mattos-Arruda, L., et al. Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nature communications. 6 (1), 8839 (2015).
  29. Khier, S., Lohan, L. Kinetics of circulating cell-free DNA for biomedical applications: critical appraisal of the literature. Future science OA. 4 (4), 295 (2018).
  30. Misale, S., et al. Resistance to Anti-EGFR therapy in colorectal cancer: From heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discovery. 4 (11), 1269-1280 (2014).
  31. Beddowes, E., Sammut, S. J., Gao, M., Caldas, C. Predicting treatment resistance and relapse through circulating DNA. Breast. 34, 31-35 (2017).
  32. Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA oncology. 2 (8), 1014-1022 (2016).
  33. Vaidyanathan, R., et al. Cancer diagnosis: from tumor to liquid biopsy and beyond. Lab on a Chip. 19 (1), 11-34 (2019).
  34. Kelly, P. Gliomas: Survival, origin and early detection. Surgical Neurology International. 1 (1), 96 (2010).
  35. Faria, G., Silva, E., Da Fonseca, C., Quirico-Santos, T. Circulating Cell-Free DNA as a Prognostic and Molecular Marker for Patients with Brain Tumors under Perillyl Alcohol-Based Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1610 (2018).
  36. Liu, M. C., et al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Annals of Oncology. 31 (6), 745-759 (2020).
  37. Enko, D., Halwachs-Baumann, G., Kriegshäuser, G. Plasma free DNA: Evaluation of temperature-associated storage effects observed for roche cell-free DNA collection tubes. Biochemia Medica. 29 (1), 153-156 (2019).
  38. Streleckiene, G., et al. Effects of Quantification Methods Isolation Kits, Plasma Biobanking, and Hemolysis on Cell-Free DNA Analysis in Plasma. Biopreservation and Biobanking. 17 (6), 553-561 (2019).
  39. Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
  40. Ward Gahlawat, A., et al. Evaluation of Storage Tubes for Combined Analysis of Circulating Nucleic Acids in Liquid Biopsies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 704 (2019).
  41. Lu, J. L., Liang, Z. Y. Circulating free DNA in the era of precision oncology: Pre- and post-analytical concerns. Chronic Diseases and Translational Medicine. 2 (4), 223-230 (2016).
  42. Iyapparaj, P., et al. Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus sp. MSU3IR against shrimp bacterial pathogens. Aquatic Biosystems. 9 (1), 12 (2013).
  43. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clinica Chimica Acta. 479, 14-19 (2018).
  44. Medina Diaz, I., et al. Performance of Streck cfDNA blood collection tubes for liquid biopsy testing. PLoS One. 11 (11), 0166354 (2016).
  45. Perkins, G., et al. Multi-Purpose Utility of Circulating Plasma DNA Testing in Patients with Advanced Cancers. PLoS One. 7 (11), 47020 (2012).
  46. Mouliere, F., et al. Multi-marker analysis of circulating cell-free DNA toward personalized medicine for colorectal cancer. Molecular Oncology. 8 (5), 927-941 (2014).
  47. Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
  48. Risberg, B., et al. Effects of Collection and Processing Procedures on Plasma Circulating Cell-Free DNA from Cancer Patients. Journal of Molecular Diagnostics. 20 (6), 883-892 (2018).
  49. Markus, H., et al. Evaluation of pre-analytical factors affecting plasma DNA analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7375 (2018).
  50. Chen, Z., et al. Comprehensive Evaluation of the Factors Affecting Plasma Circulating Cell-Free DNA Levels and Their Application in Diagnosing Nonsmall Cell Lung Cancer. Genetic Testing and Molecular Biomarkers. 23 (4), 270-276 (2019).
  51. Schwarzenbach, H., Hoon, D. S. B., Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11 (6), 426-437 (2011).
  52. Malyuchenko, N. V., et al. PARP1 Inhibitors: antitumor drug design. Acta Naturae. 7 (3), 27-37 (2015).
  53. Fleischhacker, M., Schmidt, B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-A survey. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1775 (1), 181-232 (2007).
  54. Jung, K., Fleischhacker, M., Rabien, A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker—A critical appraisal of the literature. Clinica Chimica Acta. 411 (21-22), 1611-1624 (2010).
  55. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS: a database of human, mouse and fruit fly chimeric transcripts and RNA-sequencing data. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 142-151 (2013).
  56. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS 2.1--an improved database of the chimeric transcripts and RNA-seq data with novel sense-antisense chimeric RNA transcripts. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 68-75 (2015).
  57. Gorohovski, A., et al. ChiTaRS-3.1-the enhanced chimeric transcripts and RNA-seq database matched with protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 45 (1), 790-795 (2017).
  58. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Research. 47 (1), 941-947 (2019).
  59. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  60. Szopa, W., Burley, T. A., Kramer-Marek, G., Kaspera, W. Diagnostic and Therapeutic Biomarkers in Glioblastoma: Current Status and Future Perspectives. BioMed Research International. 2017, 1-13 (2017).
  61. Salesse, S., Verfaillie, C. M. BCR/ABL: from molecular mechanisms of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia. Oncogene. 21 (56), 8547-8559 (2002).
  62. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28 (12), 67-74 (2012).
  63. Frenkel-Morgenstern, M., et al. Chimeras taking shape: Potential functions of proteins encoded by chimeric RNA transcripts. Genome Research. 22 (7), 1231-1242 (2012).
  64. Simon, M., et al. TERT promoter mutations: a novel independent prognostic factor in primary glioblastomas. Neuro-Oncology. 17 (1), 45-52 (2015).
  65. Waitkus, M. S., Diplas, B. H., Yan, H. Isocitrate dehydrogenase mutations in gliomas. Neuro-Oncology. 18 (1), 16-26 (2016).
  66. Kindler, T., Meyer, R. G., Fischer, T. BCR-ABL as a target for novel therapeutic interventions. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 6 (1), 85-101 (2002).
  67. Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2013).
  68. Vanderlaan, P. A., et al. Success and failure rates of tumor genotyping techniques in routine pathological samples with non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 84 (1), Amsterdam, Netherlands. 39-44 (2014).
  69. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. 228-229, 169-179 (2018).
  70. Normanno, N., et al. The liquid biopsy in the management of colorectal cancer patients: Current applications and future scenarios. Cancer Treatment Reviews. 70, 1-8 (2018).
  71. Hufnagl, C., et al. Evaluation of circulating cell-free DNA as a molecular monitoring tool in patients with metastatic cancer. Oncology Letters. 19 (2), 1551-1558 (2020).
  72. Petit, J., et al. Cell-Free DNA as a Diagnostic Blood-Based Biomarker for Colorectal Cancer: A Systematic Review. The Journal of Surgical Research. 236, 184-197 (2019).
  73. Poulet, G., Massias, J., Taly, V. Liquid Biopsy: General Concepts. Acta Cytologica. 63 (6), 449-455 (2019).
  74. Alix-Panabières, C. The future of liquid biopsy. Nature. 579 (7800), 9 (2020).
  75. Eisenstein, M. Could liquid biopsies help deliver better treatment. Nature. 579 (7800), 6-8 (2020).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक 163 तरल बायोप्सी सेल मुक्त डीएनए सटीक दवा ग्लियोमा कैंसर निदान रक्त प्लाज्मा
कैंसर रोगियों के रक्त प्लाज्मा नमूनों में सेल मुक्त डीएनए का पता लगाना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palande, V., Raviv Shay, D.,… More

Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter