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Cancer Research

癌症患者血浆样本中无细胞DNA检测

doi: 10.3791/61449 Published: September 9, 2020

Summary

本文提出了非侵入性液体活检技术的详细方案,包括采血、血浆和缓冲涂层分离、cfDNA和生殖系DNA提取、cfDNA或生殖系DNA的量化以及cfDNA片段富集分析。

Abstract

识别癌症患者肿瘤突变是疾病管理中非常重要的一步。这些突变是肿瘤诊断以及癌症患者治疗选择及其反应的生物标志物。目前检测肿瘤突变的黄金标准方法是通过肿瘤活检对肿瘤DNA进行基因检测。然而,这种侵入性方法很难反复执行,作为肿瘤突变的后续测试。液体活检是一种新的和新兴的技术,用于检测肿瘤突变,作为一种易于使用和非侵入性的活检方法。

癌细胞迅速繁殖。同时,许多癌细胞也发生凋亡。这些细胞的碎片被释放到患者的循环系统中,以及细碎的DNA片段,称为无细胞DNA(cfDNA)片段,携带肿瘤DNA突变。因此,为了使用液体活检技术识别基于 cfDNA 的生物标志物,从癌症患者身上采集血液样本,然后分离血浆和布菲涂层。接下来,血浆被处理用于cfDNA的分离,并处理相应的缓冲涂层,以隔离患者的基因组DNA。然后对两个核酸样品进行数量和质量检查:并使用下一代测序 (NGS) 技术分析突变。

在这份手稿中,我们提出了液体活检的详细方案,包括血液采集、血浆和缓冲涂层分离、cfDNA和生殖系DNA提取、cfDNA或生殖系DNA的量化以及cfDNA片段富集分析。

Introduction

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技术进步导致数百个癌症基因组和转录体1的测序。这有助于了解不同癌症类型2的分子变化。对这些景观的进一步研究有助于描述与癌症或肿瘤进展有关的顺序体变和基因融合3, 通过连续破坏凋亡路径4。因此,体细胞突变和基因融合可以通过在特定肿瘤5型患者中作为生物标志物,识别现有原发性肿瘤预后6,根据分子变化7对继发肿瘤进行分类,确定可药性肿瘤靶点8,提供肿瘤信息。这些资料可方便选择癌症病人的个性化治疗,以及确定正面及负面的治疗反应然而,获取肿瘤材料来识别肿瘤组织的基因组分析是一个侵入性的过程10。此外,肿瘤活检只包括异质肿瘤的一小部分:因此,可能不代表整个肿瘤11的分子特征。连续监测和肿瘤基因成型需要反复收集肿瘤组织,由于肿瘤活检程序的侵入性和此类程序产生的安全问题,通常不可行。

另一方面,液体活检技术在过去十年中在精密肿瘤学方面获得了极大的关注。这主要是由于这种技术的非侵入性,以及它在多个时间点重复的可能性,从而使疾病课程15,16易于使用和安全的监测技术。液体活检基于肿瘤细胞迅速繁殖的现象,同时许多肿瘤细胞发生凋亡和坏死。这导致凋亡细胞碎片释放到患者的血液中,以及DNA片段,在凋亡17期间被切成精确大小。非癌细胞的凋亡也导致其细胞碎片释放到血液中,然而,这些细胞的凋亡率相对低于肿瘤细胞18。液体活检技术的合理性是捕捉与肿瘤相关的分子,如DNA、RNA、蛋白质和肿瘤细胞14、19,这些分子在血液中持续循环。各种技术20可用于分析这些分子,包括下一代测序 (NGS)、数字液滴聚合酶链反应 (ddPCR)、实时 PCR 和酶相关免疫糖体检测 (ELISA)。液体活检技术能够识别肿瘤细胞特性的生物标志物。这些生物标志分子不仅从肿瘤的特定部位释放出来,而且从肿瘤21的所有部位释放出来。因此,在液体活检中发现的标记物代表整个异质肿瘤的分子分析,以及体内其他肿瘤,因此,与基于组织活检的技术22相比具有优势。

cfDNA在循环血液中有很短的半生时间,从几分钟到1-2小时23不等。然而,cfDNA的短半寿命通过评估治疗反应和动态肿瘤评估促进实时分析。肿瘤衍生的 cfDNA 水平表示肿瘤阶段/大小的预后,通过多项研究证明,这表明 cfDNA 水平与生存结果24之间的关系。此外,研究已经证明,cfDNA具有更好的预测能力比现有的肿瘤标记25。cfDNA的预测在癌症治疗后更加明显,治疗后cfDNA水平较高,与存活率降低和对治疗的抵抗力密切相关。然而,治疗后 cfDNA 水平较低通常与积极的治疗反应相对应。此外,与传统的检测方法相比,cfDNA 有助于早期检测治疗反应。

cfDNA增加了癌症相关突变的早期发现的可能性:在早期疾病15,症状26 的出现和癌症诊断之前长达2年27。由于 cfDNA 是从多个肿瘤区域或肿瘤区域释放出来的,其分析提供了它所代表的28个肿瘤基因组的全面视图。因此,cfDNA能够检测组织样本29中可能遗漏的体细胞突变。由于肿瘤内异质性和亚克隆突变可以通过对跨越数千个碱基的基因组区域进行深度测序来检测,因此对 cfDNA 的分析能够发现具有不同基因组特征的特定分子亚型13。为了通过组织样本获得类似水平的信息,需要进行许多固体活检。

此外,在手术治疗和/或化疗后,局部疾病(如结肠癌、卵巢癌和肺癌)患者的 cfDNA 水平证明是癌症复发和治疗结果20的强大预后标记。此外,在结肠癌、乳腺癌和肺癌患者中,从血液中分析cfDNA可以成功检测出肿瘤特异性变化,从而提前几个月准确预测复发。此外,治疗耐药性标志物,如KRAS突变的CRC患者接受抗EGFR治疗30:各种疗法治疗后乳腺癌患者的PIK3CA、MED1EGFR等基因的VAF:EGFR T790M耐药性突变的肺癌患者治疗EGFR靶向TKIs32也可以通过cfDNA分析识别。

总之,cfDNA分析可用于识别肿瘤学领域13,33的精确生物标志物。在此协议中,对3名胶质瘤患者的血液样本和3个健康对照进行了处理,以从血浆中获取WBCs和cfDNA的基因组DNA。在胶质瘤癌症中,IDH、TERT、ATRX、EGFRTP53的突变作为诊断和预后标记,可能有助于胶质瘤肿瘤的早期诊断,分类不同类型的胶质瘤肿瘤,指导对个别患者的准确治疗,并了解治疗反应34,35。 这些基因的突变状态可以使用血液衍生的 cfDNA 来识别。在这份手稿中,我们提出了一个血浆衍生的cfDNA的详细协议,用于研究胶质瘤癌12的突变变化。本文中解释的基于 cfDNA 的液体活检方案可用于研究许多其他类型的癌症的突变变化。此外,最近的一项研究表明,cfDNA为基础的液体活检可以检测出50种不同类型的癌症36。

血液样本收集、储存和装运是本协议中的关键步骤,因为这些步骤期间不受控制的温度会导致 WBC 的裂解,导致基因组 DNA 从 WBC 释放到血浆中,并导致 cfDNA 样本的污染,从而影响其余过程37。由于不受控制的温度溶解会损害 cfDNA 的下游样品制备过程,例如 PCR 步骤38。血清含有高比例的细菌素cfDNA,而不是血浆,虽然它提出了肿瘤相关的cfDNA39的大背景噪音。因此,对于分离肿瘤相关的cfDNA,血浆是一个合适的样本39。在含有血液收集管的抗凝血剂中提取的血液应立即或在长达两个小时内离心,以分离血浆并避免 cfDNA 污染。在此协议中,使用专用的商业 cfDNA 保存采血管(见材料表),这是含有采血管的抗凝血剂的替代品。这些专用的血液收集管保存 cfDNA 和 cfRNA,并在环境温度下防止 WBCs 的裂解长达 30 天,在 37 °C 下最多 8 天。 这有助于在血液样本运输期间保持适当的温度,直到血浆和WBC分离40。

目前有三种类型的cfDNA提取方法:相隔离、基于硅膜的自旋柱和基于磁珠的分离41。与其他 cfDNA 提取方法42相比,基于硅膜的自旋柱法具有较高的完整性。

DNA定量评价是液体活检的一项基本要求,需要制定一个简单、经济、规范的程序,使之易于实施和广泛使用。cfDNA 量化的三种常用方法是光谱测量、氟化和 qPCR。氟化方法在传导的准确性、成本和易用性方面比其他方法更好。

cfDNA的完整性和纯度可以通过藻杉电泳或毛细纤维电泳来估计。阿加罗斯电泳既没有显示低浓度 cfDNA 的灵敏度,也没有高分辨率显示 cfDNA 的精确片段大小。另一方面,毛细细电泳通过克服相关挑战,比藻状电泳具有优势,因此,研究人员广泛用于 cfDNA 片段大小分析。在此协议中,使用自动毛细细电泳仪器估计了孤立的 cfDNA 的碎片大小分布(见 材料表)。

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Protocol

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在采血之前,需要并必须获得参与研究的受试者的知情同意。本手稿中描述的研究是按照拉宾医疗中心、以色列伦理委员会(伦理代码:0039-17-RMC)和德国伦理委员会(伦理代码:D 405/14)进行的。

1. 在 cfDNA 或 cfRNA 防腐剂管中采集和储存血液样本

  1. 正确标记保存管
  2. 收集约8 mL的血液到cf-DNA保存管(见 材料表),使用采血集和持有人,根据标准机构协议的静脉曲张如下所述。
    注意:使用采血套件可以防止血液从管子中回流。
    1. 将患者与手臂向下的位置对齐。
    2. 直立握住管子,盖子朝上,同时确保管内物品不接触盖或针尖。
    3. 当血液开始流入管子时,慢慢释放。
  3. 在管子充满血液(最大容量:8.4 mL 的全血)后,轻轻倒置管(将持有管子的臂手腕向下和向后转动 5 次),以稳定样本。
    注:反转确保防腐剂与样品均匀混合。但是,即使在等离子体准备之前,也不要再次摇动内容。防腐剂与血液样本的混合不足导致成分不稳定和微血块或溶血的形成。在这个阶段,协议可以立即继续,血浆分离或充满血液的管子可以在环境温度(15-25°C)等待长达30天,在37°C长达8天。

2. 等离子体和浅黄色外套分离和存储

  1. 在室温下将充满血液的保鲜管在425 x g 下分离20分钟,以分离血浆。
    注:步骤 2.2 和 2.3 应在生物安全柜中执行。
  2. 小心地将上等离子层移出到 1 mL 的插图中的新鲜管子中,而不会干扰下层。
  3. 小心地将下一层自助涂层转移到新鲜管子上(该层显示为 RBC 颗粒上方的环),同时避免下层的 RBC。
  4. 继续用等离子体进行第 3 步,第 4 步与布菲外套。如果需要,请将分离的内容存储在-80°C。

3. 从1mL等离子体中净化循环cfDNA

注:此步骤是用商业套件执行的(见 材料表)。所有缓冲区都配有套件。

  1. 制备缓冲区和试剂
    注意:不要将酸性溶液或漂白剂直接添加到样品制备废物中。在裂解缓冲区、绑定缓冲区和洗涤缓冲区-1中存在的瓜尼丁盐与漂白剂或酸混合时,可产生高度反应的化合物。
    1. 绑定缓冲区:将 300 mL 的绑定缓冲浓缩物与 200 mL 的 100% 异丙酚混合,使 500 mL 的工作绑定缓冲区。在室温下存放。
      注:绑定缓冲区允许循环核酸与二氧化硅膜的最佳结合。500 mL 的绑定缓冲区足以分别处理 276、138、92、69 或 55 个 1、2、3、4 或 5 mL 等离子体样品,在室温下稳定 1 年。
    2. 洗涤缓冲区-1:混合19 mL的洗涤缓冲区-1浓缩物与25 mL的96-100%乙醇,使44 mL的工作洗缓冲区-1。在室温下存放。
      注:洗涤缓冲区-1消除与二氧化硅膜结合的污染物。44 mL 的工作洗涤缓冲区-1 足以处理 73 个 1/2/3/4/5 mL 等离子体样品,并在室温下稳定 1 年。
    3. 洗涤缓冲区-2:混合好13 mL洗缓冲区-2浓缩物与30 mL的96-100%乙醇,使43 mL的工作洗缓冲区-2。在室温下存放。
      注:洗涤缓冲区-2消除与二氧化硅膜结合的污染物。43 mL 的工作洗涤缓冲区-2 足以处理 +56 样品的 1/2/3/4/5 mL 等离子体,并在室温下稳定 1 年。
    4. 在包含 310μg 亲血杆菌载体 RNA 的管子上,添加 1,550 μL 的 Elution 缓冲液,以制备 0.2 μg/μL 的载体 RNA 解决方案。彻底溶解载体RNA后,将溶液划分为合适的方位,并存储在-30°C至-15°C。 不要冻结这些方位引用超过3次。在 Lysis 缓冲器中,如 表 S1所示,添加在 Elution 缓冲区中溶解的重组载体 RNA。
      注:由于载体RNA不会直接溶解在裂解缓冲区,因此需要先在Elution缓冲区溶解,然后溶解在裂解缓冲区。首先,当样品中存在的目标分子很少时,硅膜核酸结合就会增强。其次,由于存在大量载体RNA,RNA退化的风险降低。
  2. 在开始隔离之前,将柱子和样品带到室温下,并在需要时将样品体积调整为 1 mL,并配以无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。预热 2 个水浴或加热块,分别包含 50 mL 离心管和 2 mL 收集管至 60 °C 和 56 °C。
  3. 在 50 mL 离心管中,加入 100 μL 蛋白酶 K、1 mL 等离子体和 0.8 mL 的 Lysis 缓冲液,其中含有 1.0μg 的载体 RNA(在步骤 3.1.4 中准备)。用盖子关闭离心管,通过脉冲涡流混合内容30s,同时确保管内有一个可见的涡流。内容的彻底混合对于高效裂解非常重要。
    注:在漩涡后立即继续第3.4步,毫不拖延。
  4. 在 60 °C 下孵化溶液 30 分钟。
  5. 取下盖子,将 1.8 mL 的绑定缓冲器添加到管中,并在放置盖子后与脉冲涡流彻底混合 15-30 s。
  6. 在冰上孵化产生的混合物5分钟,并将二氧化硅膜柱插入连接到真空泵的真空装置中。然后,将 20 mL 管扩展器牢固地插入开柱中,以防止样品泄漏。
  7. 小心地将孵化的混合物倒入柱子的管扩展器中,然后打开真空泵。在所有的利酸盐混合物完全穿过柱子后,关闭真空泵,将压力释放到 0 mbar,并拆卸和丢弃管延长器。
    注意:避免交叉污染,应小心丢弃管扩展器,以防止其扩散到相邻的柱子上。
  8. 从真空装置中取出柱子,插入收集管,在室温下以 11,000 x g 的 离心机进行 30 s,以去除任何残留的解液。丢弃流经。
  9. 在柱子中加入 600 μL 的 Wash Buffer-1,在室温下以 11,000 x g 的 离心机进行 1 分钟,丢弃流经。
  10. 将 750 μL 的 Wash Buffer-2 添加到柱子中,在室温下以 11,000 x g 的速度 离心,持续 1 分钟,然后丢弃流经。
  11. 加入 750μL 乙醇 (96-100%)到柱子,离心机在11,000 x g 在室温下1分钟,并丢弃流经。
  12. 将柱子放在一个干净的 2 mL 收集管中,以 20,000 x g 的速度离心 3 分钟。
  13. 将膜柱组件放入新的 2 mL 收集管中,盖子打开并在 56 °C 下孵育 10 分钟,从而完全干燥膜柱组件。
  14. 将柱子放在一个干净的 1.5 mL 洗发管中。在柱膜的中心,应用 20-150μL 的 Elution 缓冲液,并在室温下孵育 3 分钟,盖子关闭。
    注意:确保Elution缓冲区平衡到室温。如果使用小于 50 μL 的 elution 缓冲区,请确保小心地将其分配到膜的中心。这有助于完全摆脱束缚的DNA。但是,选修量不是固定的,可以根据下游应用进行更改。回收的 eluate 可高达 5 μL,当然低于适用于柱子的流出体积。
  15. 在20,000 x g 的微中心中将回收的埃卢特离心,1分钟以排出核酸,并储存在-20°C。

4. 从布菲外套中净化基因组DNA

注:本协议中使用的商用套件在 材料表中提及。下文协议中提及的缓冲区和试剂,即裂解缓冲器 A、裂解缓冲液 B、洗涤缓冲器 X、洗涤缓冲液 Y、蛋白酶缓冲区、Elution 缓冲区和蛋白酶 K 是此商用套件的一部分。

  1. 制备缓冲区和试剂
    注意:不要将酸性溶液或漂白剂直接添加到样品制备废物中。乳液缓冲液B和洗涤缓冲液X中存在的瓜尼丁盐与漂白剂或酸混合时,可产生高度反应的化合物。
    1. 洗涤缓冲区 Y: 混合好 12 mL 的洗涤缓冲区 Y 浓缩物与 48 mL 乙醇 (96-100%)获得60 mL的工作洗涤缓冲区Y.存储在室温下。
      注: 60 mL 的工作洗涤缓冲区 Y 足以处理 100 个布谷涂层样品,并且稳定 1 年。
    2. 蛋白酶 K: 通过将 30 毫克亲血蛋白酶 K 溶解到 1.35 mL 蛋白酶缓冲液中来准备蛋白酶 K 溶液。
      注:蛋白酶K的总工作解决方案足以处理52个浅黄色外套样品。蛋白酶 K 工作解决方案可在 -20 °C 下存储至少 6 个月。
  2. 启动程序之前的步骤
    1. 将薄薄的外套平衡到室温。
    2. 将热块或水浴设置为 56 °C。
  3. 在 Lysis 缓冲器 A 中悬挂浅黄色外套,以获得 200 μL 的最终体积。然后加入 25 μL 的蛋白酶 K 溶液和 200μL 的裂解缓冲液 B. 通过涡流混合,在 70 °C 下孵育 10-15 分钟。确保样品完全覆盖在裂解溶液中。
    注:对于一系列样品的处理,蛋白酶K和裂解缓冲区A可以在手术前10-15分钟预混合,但在此之前不再,因为蛋白酶K自我消化在裂解缓冲区A没有基质。
  4. 在上述混合物中加入 210 μL 的 96-100% 乙醇,并大力搅拌涡流。
    注:乙醇的添加可能形成细腻的沉淀:然而,这不会影响DNA分离。请务必在列上加载沉淀物,如以下步骤所示。
  5. 将整个样品加载到放置在收集管中的二氧化硅柱上。离心机1分钟,11,000 x g。将柱子放在一个新的收集管中,并丢弃前一根管子以及流经。
    注:如果样本未完全通过矩阵绘制,请重复离心步骤。
  6. 加入 500 μL 的 Wash 缓冲区 X,在 11,000 x g 下离心机 1 分钟,然后丢弃流经。
  7. 将柱子放入收集管中,在柱子上添加 600 μL 的洗涤缓冲区 Y,在 11,000 x g 下离心 1 分钟,然后丢弃流经。
  8. 再次,将柱子放入收集管中,在 20,000 x g 下将柱子离心 1 分钟,以干燥硅膜。
  9. 在室温下孵化柱子1分钟,放入1.5 mL微中心管中,然后加入100μL的Elution缓冲液。然后,在 11,000 x g 下离心 1 分钟,并在 -20 °C 下储存,从而排泄 DNA。

5. 使用荧光计量化 cfDNA 和基因组 DNA

  1. 在启动协议之前,执行以下步骤。
    1. 用超纯无核素水以 1:10 的比例稀释 2 μL 的精英基因组 DNA(从步骤 4.9)。由于预期浓度较低,不要稀释步骤 3.15 的 cfDNA 样品。
    2. 将检测标准#1和检测标准#2平衡到室温。
  2. 准备总共 6 个薄壁透明管 0.5 mL 大小。
    注:提交的协议是量化2 cfDNA和2基因组DNA样本,因此,4管4个样本,这个检测需要2个标准。
  3. 给管子的盖子贴上标签。
    注意:在管子侧面贴上标签可能会干扰读数。此外,检测标准管经过仔细标记,因为氟计校准要求标准处于正确的顺序。
  4. 用检测缓冲器在 1:200 稀释检测试剂,以准备工作解决方案。对于 4 个样本和 2 个标准,请使用 6 μL 的检测试剂加 1,194 μL 的检测缓冲液,使工作解决方案达到 1,200 μL(每管 200μL)。
    注意:不要使用玻璃容器,而应使用干净的塑料管。每个管子必须包含约 200μL 的最终体积(检测标准管必须包含 190μL 的工作解决方案,样本管必须包含 180-199 μL 的工作解决方案)。必须准备足够的工作解决方案,以适应所有检测标准和样品。
  5. 在工作检测标准管中,添加 190μL 的工作解决方案和 10 μL 检测标准,并通过涡流混合溶液 2-3 s。避免在解决方案内形成气泡。
  6. 在样品管中,添加 198μL 工作解决方案和 2 μL 的 cfDNA 或基因组 DNA。将溶液通过涡流混合2-3秒,并在室温下孵育2分钟。
  7. 在荧光计仪器的"主屏幕"中,按下"DNA"并选择"dsDNA高灵敏度检测",以显示"标准"屏幕,然后按""在荧光计"标准"屏幕上读取标准。
  8. 在样品室中,插入检测标准#1管,合上盖子,按"读取"。读数完成后(约 3 s)取出管子,并重复标准#2的相同步骤。
  9. 标定过程完成后显示示例屏幕,然后插入样本管并重复步骤"5.8"。然后,"样本屏幕"将显示与样品管稀释后样品浓度相对应的值。
  10. 对于每个示例重复步骤"5.9",直到读取所有示例。
  11. 使用以下方程来计算样品的实际浓度。
    Equation 1
    注:测定值为 ng/mL,对应于检测管稀释后的浓度。上述步骤 5.11 中提到的方程,QF 值是荧光计仪器给出的值 ,x 是添加到测定管中的微升样品数量。方程生成的 QF 值单位与荧光计提供的值相似。例如,如果荧光计的值为 ng/mL,则方程计算的浓度单位为 ng/mL。

6. dna 片段大小通过片段分析仪分配 cfDNA

  1. 启动手术前的步骤:将DNA染料浓缩物和DNA凝胶基质平衡到室温30分钟。
  2. 凝胶染料混合物的准备
    注意:谨慎处理溶液,因为DMSO已知有助于有机分子进入组织。
    1. 通过将脱氧核糖核酸染料浓缩瓶旋涡10s彻底解冻DMSO。将15μL的这种浓缩物放入DNA凝胶基质小瓶中,并在黑暗中储存在4°C。
    2. 再次,涡流盖瓶10s,直到凝胶和染料的混合被可视化。
    3. 将混合物倒在自旋滤镜上,倒入顶部容器。
    4. 在室温下,微中心将自旋滤光片在 2,240 x g ± 20%, 10 分钟。
    5. 根据良好的实验室做法,在管子中标记已制备的凝胶染料并丢弃过滤器。给管子贴上标签并记录准备日期。
      注意:根据良好的实验室实践丢弃过滤。凝胶染料混合物可用于5高灵敏度(HS)DNA芯片。如果未使用超过1小时,请在4°C存储。 在黑暗中存储最多 6 周。
  3. 要加载凝胶染料混合物,请确保芯片启动站基板的位置,并在最低位置调整夹子。
    1. 将凝胶染料混合物平衡到室温30分钟,同时监测光线照射。
    2. 从密封袋中取出一个新的HS DNA芯片,并将其放置在芯片启动站上,然后取出凝胶染料混合物的9.0μL,并在芯片底部分配,标记为"G"。
      注意:绘制凝胶染料混合物,避免可能积聚在小瓶底部的颗粒。同时将凝胶染料混合物很好地分配到HS DNA芯片中,完全插入移液器的尖端,以防止形成大气泡。此外,触摸油井边缘的移液器会产生不良效果。
    3. 将柱塞放置在 1 mL,并关闭芯片启动站。确保闩锁的锁单击并将定时器设置为 60 s,然后按下柱塞,直到它被剪辑按住,并且正好在 60 s 之后,用剪辑释放机制释放柱塞。
    4. 当柱塞至少退到 0.3 mL 标记时,等待 5 s,然后慢慢拉回 1 mL 位置,然后打开芯片启动站,再次取出凝胶染料混合物的 9.0 μL,并在 HS DNA 芯片底部分配,标记为"G"。
  4. 要加载 DNA 标记,将 5 μL 的 DNA 标记分配到井中,并标有梯子符号。重复所有 11 口样本井的程序。
  5. 要装载梯子和样品,在井中分配 1 μL 的 DNA 梯子,标记为梯子符号,然后在所有 11 口样品井中添加 1 μL 的样品(用过的油井)或 1 μL 的标记(未使用的井)。
  6. 通过将芯片水平放置在适配器中,以 2,400 rpm 的速度将 HS DNA 芯片调至 60 s。确保修复 HS DNA 芯片的凸起不会在涡流过程中损坏。
  7. 要将 HS DNA 芯片插入片段分析仪仪器中,请打开盖子并确保正确插入电极墨盒,并将芯片选择器定位为碎片分析仪仪中的"高灵敏度DNA"。
  8. 小心地将 HS DNA 芯片安装到容器中,该插座仅适合单向,然后通过确保电极墨盒完全适合 HS DNA 芯片的井而失去盖子。
  9. 片段分析器软件屏幕上的显示显示通过屏幕左上半部分的芯片图标表示插入的 HS DNA 芯片和关闭的盖子。
  10. 要启动 HS DNA 芯片运行,请从仪器屏幕上的"检测"菜单中选择 dsDNA 高灵敏度检测,然后通过馈送样本名称和注释等信息正确填充样本名称表,然后通过单击屏幕右上角的"开始" 按钮启动芯片运行。
  11. HS DNA 芯片运行后的电极清洁:一旦检测完成,立即取出用过的 HS DNA 芯片,并按照良好的实验室实践进行处置。执行以下程序,确保电极清洁,不会从以前的检测留下残留物。
    1. 将 350μL 的去离子化分析级水慢慢填充到其中一口电极清洁井中,然后打开盖子,然后关闭盖子,等待大约 10 s。
    2. 打开盖子,取出电极清洁剂,再等10下,电极上的水蒸发后再合盖。

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Representative Results

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等离子体分离
在 cfDNA 或 cfRNA 防腐剂管中收集的 8.5-9 mL 血液的体积约为 4 mL 血浆。从 EDTA 管中收集的血液中分离的血浆体积可能因温度而异。在高于37°C的温度下接触含有血液的EDTA管会导致血浆体积减少44。

荧光计检测结果
胶质瘤患者#1和#3各1 mL血浆中的 cfDNA 浓度和健康对照#H1、#H2和#H3分别为 137 ng、12.6 ng、6.52 ng、2.26 ng 和 2.48 ng。然而,在胶质瘤患者#2 cfDNA浓度过低,无法在荧光计中检测到。cfDNA浓度在癌症患者的1 mL血浆范围从0.5到+1000 ng18,平均值20 ng。在健康人中,cfDNA浓度从检测不到的浓度到16 ng不等,平均值为8 ng45。从 200μL 布菲涂层 (PBMC) 中分离出的基因组 DNA 产生大约 25-50μg 的 DNA。

DNA片段分析仪检测结果
根据先前的研究,cfDNA富含166-bp长的片段,占患者血浆中cfDNA总量的85%。相比之下,332 bp长片段占10%,498 bp长碎片占cfDNA46的5%。影响 cfDNA 片段分析仪检测结果的两个主要因素是来自 PBMC 的基因组 DNA 污染和 cfDNA 浓度低。 图1 显示了胶质瘤患者#1的预期cfDNA生物分析仪图,其中cfDNA片段在166 bp时富集,样本21中没有基因组DNA污染。 图 2 显示了 NGS 库编制胶质瘤患者 cfDNA 后碎片浓缩图 #1,由于附件 125 bp 索引和适配器,碎片浓缩从 166 bp 转移到 291 bp。 图3 显示胶质瘤患者#2的cfDNA片段非常轻微的丰富。尽管胶质瘤患者#2 cfDNA浓度较低,但将NGS适配器添加到 cfDNA 和 PCR 放大步骤中会导致片段浓缩图 图 4上的可见 cfDNA 库峰值。因此,图书馆从这个低浓度的 cfDNA 样本中成功制备,如 图 4所示。在 图5中,胶质瘤患者#3的cfDNA片段显示在166 bp附近达到峰值,但基因组DNA污染在10380 bp参考梯峰附近也很明显。

Figure 1
图1:胶质瘤样本的理想cfDNA片段分析仪测定图#1 cfDNA。观测到的主要峰值为166个基点,较小的峰值为332 bp。此样本中未发现基因组污染,该污染发生在接近 10,380 bp 上标记的地方。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 2
图2:#1 cfDNA库中胶质瘤样本的理想cfDNA片段分析仪分析图。在将 125 bp 下一代测序库适配器连在一起后,166 bp 和 332 bp cfDNA 片段分别显示了 291 bp 的主要峰值和 457 bp 的较小峰值。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 3
图3:cfDNA片段分析仪胶质瘤样本的测定图#2 cfDNA,显示166 bp的峰值非常小。由于 cfDNA 浓度低,166 bp 的峰值几乎看不到。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 4
图4:胶质瘤样本#2 cfDNA片段分析仪测定图。在将 125 bp 下一代测序库适配器连在一起并在库准备过程中执行 PCR 周期之后,在 166 bp 时几乎看不到的 cfDNA 峰值或在 332 bp 和 498 bp 时完全可见的峰值清晰可见。观测到的主要峰值接近291个基点,较小的峰值为457个基点、623个基点、789个基点和近2500个基点。 请点击这里查看此数字的较大版本。

Figure 5
图5:cfDNA片段分析仪检测显示胶质瘤样本中的基因组DNA污染#3 cfDNA。 166 bp的一个小峰值表明,在上部标记(10,380 bp)附近存在cfDNA和浓缩物是基因组DNA污染。 请点击这里查看此数字的较大版本。

表 S1:处理 1 mL 等离子体样品所需的裂解缓冲区和载体 RNA(溶解在缓冲区 AVE 中)的体积。请点击这里下载此表。

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Discussion

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在管子、装运和储存中收集患者的血液是液体活检的关键初始步骤。处理不当会损害血浆的质量,因此会干扰液体活检的结果。如果血液样本在EDTA血管中采集,血浆必须在采血后两小时内分离,以避免WBC裂解并将其基因组DNA释放到血浆48中。如果保存时间较长,WBCs 也可以在 EDTA 管中进行凋亡,由此产生的 cfDNA 片段可能会污染等离子体48中的原始 cfDNA。血液样本暴露在高温(+37°C)或血浆分离前管的过度摇晃会导致溶血。血红蛋白,因此仍然是等离子体中的污染物影响cfDNA的下游过程,如在库准备49。高温(+37°C)也影响EDTA血管中血浆的产量。因此,在 EDTA 管50 中收集血浆后及时分离等离子体是该方法质量控制的重要一步。如果血液收集在商业cfDNA或cfRNA保存管,防腐剂化学品应与血液立即混合后,血液收集40。未能正确混合防腐剂化学品会导致等离子体中微小块的形成。这些在 cfDNA 提取过程中将二氧化硅膜堵塞在柱子中,并降低了 cfDNA 的产量。管内血液的中度摇晃不会引起溶血:虽然过度摇晃会导致溶血,即使在这些管40。因此,在运送或处理这些管子时,应避免过度摇晃。建议将血管以直立位置运送。

精确量化和评估单位等离子体的 cfDNA 浓度是液体活检的重要步骤,因为等离子体 cfDNA 浓度与生理和病理过程51直接相关。在癌症患者中,cfDNA浓度高于健康受试者52。人类血液中 cfDNA 浓度的增加并非癌症特有的:孕妇和接受移植手术的病人血液中的 cfDNA 浓度也往往升高炎症、组织创伤、糖尿病、心肌梗塞和败血症的关联性也显示为 cfDNA 浓度增加53。早期癌症患者的血浆 cfDNA 浓度往往低于晚期或转移性肿瘤患者。这支持cfDNA与肿瘤负担54的直接关联。血液中的 cfDNA 浓度在癌症患者的 0.5 至 1000 ng/mL 之间显著变化,在健康受试者18中在 0 到 100 ng/mL 之间。对于库的准备,至少需要0.5 ng的cfDNA。为了实现 cfDNA 测序的最低需求量,可以从至少 2 mL 的血液样本或 1 mL 血浆样本开始。此外,等离子 cfDNA 提取过程中的技术错误也会降低 cfDNA 产量和由此产生的浓度,从而偏离实际等离子 cfDNA 浓度。cfDNA退化可能是由于EDTA管中的抗凝剂,或由于多次解冻和冻结等离子体样品的过程。蛋白酶 K 在裂解过程中的不良活性也会导致 cfDNA 的低产量。蛋白酶 K 活性因长期暴露在高温下而减少。在 cfDNA 提取洗涤步骤中,使用低浓度乙醇而不是 96-100% 也会导致 cfDNA 的低产。因此,避免液体活检技术的技术错误对于取得准确可靠的结果具有重要意义。

cfDNA的定性分析是一个中心步骤,在此期间,估计提取的cfDNA样本中DNA片段的实际分布。cfDNA的定量结果只有在通过定性分析确认其纯度后才可靠。因此,DNA 片段分析仪分析仪中生成的理想 cfDNA 图形显示 cfDNA 片段的主要峰值在 166 bp 附近丰富,小峰值接近 332 bp 长度。这表明提取的 cfDNA 样本没有受到来自 WBCs 的基因组 DNA 的污染。如果一个片段从 7,000 bp 浓缩到参考阶梯 (10,380bp) 及以后,则表示带有 WBC 基因组 DNA 的 cfDNA 样本受到污染。如果在 dna 片段大小估算后在 cfDNA 样本中看到基因组 DNA 污染,则样品可以在 2% 的阿加罗斯凝胶上运行,并具有 100 bp 阶梯,凝胶可以在 150-200 bp 范围内排出,然后是凝胶提取分析。在阿加罗斯凝胶大小选择过程中丢失了一定量的 cfDNA。但是,NGS 库准备步骤至少需要 0.5 ng 和最多 1,000 ng 的输入 DNA 材料来准备库的排序。因此,如果 cfDNA 的总数量等于或超过 0.5 ng,则足以用于库的准备步骤。此外,这些样本顺利通过库的准备过程,由此产生的库显示一个主要峰值接近291 bp和较小的峰值在457 bp,由于增加了125 bp索引和适配器。

NGS数据分析是NGS液体活检技术的最后一步,在此步骤中生成突变和基因融合列表3、55、56、57。根据先前对癌症突变景观58、59、以前特征为基因突变60或基因融合61、62、63的研究可以评估已识别的突变和基因融合。这些可能作为癌症患者的预后64和诊断7生物标志物。例如,同位素脱氢酶1(IDH1)基因中的R132H突变是继发性胶质母细胞瘤癌症的决定性标志,也区别于原发性胶质母细胞瘤,在原发性胶质母细胞瘤中,这种突变通常不存在65。此外,慢性骨髓性白血病(CML)的特点是BCR/ABL1基因融合,这是由9号染色体和22号61号染色体之间的平衡转移引起的。BCR/ABL1基因及其mRNA和融合蛋白是CML祖先所独有的,因此,它构成了治疗66的良好靶点。

先进的诊断、肿瘤的正确分期和治疗监测是目前有效管理癌症的策略。直到最近,组织活检一直是肿瘤组织组织组织学评价的黄金标准。然而,经过这一领域的大量研究和技术的出现,它已证明,单一活检无法提供肿瘤的整个突变景观,连续活检通常不切实际,由于其侵入性,特别是在胶质母细胞瘤和淋巴瘤,其中活检是高度侵入性的。此外,约16%的针头活检与程序并发症有关。此外,高质量的基因组分析需要足够的组织,这种需求通常不能满足针头活检68。

液体活检,从常规血液样本通过分析肿瘤衍生的DNA被发现取代或辅助常规针头组织活检程序12。通过液体活检通过血浆对肿瘤衍生的DNA/cfDNA进行分析,是肿瘤分子分析的微创和有效过程。它基本上可以允许治疗监测通过连续采样随着时间的推移,没有潜在的风险和并发症,通常与传统的肿瘤组织活检,因为它的侵入性69。此外,通过液体活检对单个肿瘤病变进行cfDNA分析比较针头活检的研究发现,cfDNA剖析可以提供一个完整的分子异质性,即肿瘤可以由多个不同的克隆种群70容纳。

然而,虽然基于血浆cfDNA的诊断比肿瘤组织活检有许多优点,但仍存在一些关键的局限性,阻碍其在一般临床实践中的适用性。cfDNA液体活检诊断的局限性包括整体手术成本较高、需要高质量的DNA和专门的生物信息学家,以进行大量数据分析。由于与 cfDNA 分析相关的数据管理问题,NGS 在临床上的即时应用也带来了问题。NGS所带来的数据管理挑战,主要是由于难以区分深度测序的内在背景噪音和与肿瘤72相关的畸变。最后,由于大部分液体活检检测缺乏临床有效性和实用性数据,目前仅限于临床研究和基础研究13。

液体活检技术的未来发展,是通过生物学、生理学、分子生物学、测定技术、数据管理统计分析、机器学习技术基础研究的共同努力,有望取得新的发展。此外,基于 cfDNA 生物标志物评估的众多临床试验正在进行中,其结果将有助于确定该技术的有效性。这些共同努力有望在未来五年内通过cfDNA 分析建立液体活检平台,成为肿瘤临床环境中强大的预后、诊断和治疗监测工具。

总之,基于 cfDNA 的液体活检提供了一种安全且非侵入性的方法,用于识别在癌症疾病管理中有用的基因组生物标志物。然而,为了达到可靠和准确的结果,特别需要74,75的血液采集、血浆/WBC分离、cfDNA提取和cfDNA定量和定性分析的标准化协议。

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Disclosures

作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

作者要感谢癌症基因组学和复杂疾病生物计算实验室的成员,感谢他们敏锐的观察投入,并参与了该项目不同阶段的多次讨论。资金支持包括以色列癌症协会(2017-2019年M.F-M的ICA赠款)和以色列创新局的卡明赠款(M.F-M.)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

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癌症患者血浆样本中无细胞DNA检测
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Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).More

Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

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