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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Détection de l’ADN sans cellules dans les échantillons de plasma sanguin des patients atteints de cancer

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61449
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Cancer Genomics and BioComputing of Complex Diseases laboratory, The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2The Data Science Institute, Bar-Ilan University, 3The Dangoor Centre For Personalized Medicine, Bar-Ilan University

Summary

Dans cet article nous présentons un protocole détaillé pour la technique non invasive de biopsie liquide, y compris la collecte de sang, la séparation de manteau de plasma et de buffy, l’extraction de cfDNA et d’ADN de germline, la quantification de cfDNA ou d’ADN de germline, et l’analyse d’enrichissement de fragment de cfDNA.

Abstract

L’identification des mutations dans les tumeurs des patients cancéraux est une étape très importante dans la gestion de la maladie. Ces mutations servent de biomarqueurs pour le diagnostic tumoral ainsi que pour la sélection du traitement et sa réponse chez les patients atteints de cancer. La méthode actuelle d’étalon-or pour détecter des mutations de tumeur implique un essai génétique de l’ADN de tumeur au moyen des biopsies de tumeur. Cependant, cette méthode envahissante est difficile à effectuer à plusieurs reprises comme essai de suivi du répertoire mutationnel de tumeur. La biopsie liquide est une technique nouvelle et émergente pour détecter les mutations tumorales comme approche de biopsie facile à utiliser et non invasive.

Les cellules cancéreuses se multiplient rapidement. En parallèle, de nombreuses cellules cancéreuses subissent une apoptose. Les débris de ces cellules sont libérés dans le système circulatoire d’un patient, ainsi que des morceaux d’ADN finement fragmentés, appelés fragments d’ADN sans cellules (CFDNA), qui portent des mutations de l’ADN tumoral. Par conséquent, pour identifier les biomarqueurs basés sur cfDNA utilisant la technique liquide de biopsie, des échantillons de sang sont rassemblés des patients cancéraux, suivis de la séparation du plasma et du manteau buffy. Ensuite, le plasma est traité pour l’isolement de cfDNA, et la couche buffy respective est traitée pour l’isolement de l’ADN génomique d’un patient. Les deux échantillons d’acide nucléique sont ensuite vérifiés pour leur quantité et leur qualité; et analysé pour les mutations à l’aide de techniques de séquençage de prochaine génération (NGS).

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole détaillé pour la biopsie liquide, y compris la collecte de sang, le plasma, et la séparation buffy de manteau, l’extraction de cfDNA et d’ADN de germline, la quantification de cfDNA ou d’ADN de germline, et l’analyse d’enrichissement de fragment de cfDNA.

Introduction

Les progrès technologiques ont conduit au séquençage de centaines de génomes de cancer et transcriptomes1. Cela a contribué à comprendre les paysages des changements moléculaires entre les différents types de cancer2. D’autres études sur ces paysages ont contribué à caractériser les altérations somatiques séquentielles et les fusionsgène-gène 3 qui sont impliquées dans le cancer ou la progression tumorale, en perturbant périodiquement les voies d’apoptose4. Par conséquent, les mutations somatiques et les fusions gène-gène peuvent fournir l’information au sujet des tumeurs en servant de biomarqueurs dans les patients individuels pour un type particulier de tumeur5,identifiant le pronostic primaire existant de tumeurs6,catégorisant des tumeurs secondaires basées sur des changements moléculaires7,et identifiant des cibles de tumeur druggable8. Ces informations peuvent faciliter la sélection d’un traitement personnalisé pour les patients atteints de cancer et dans la détermination des réponses positives et négatives autraitement 9. Cependant, obtenir le matériel de tumeur pour identifier le profilage génomique du tissu de tumeur est une procédureenvahissante 10. En outre, une biopsie de tumeur comprend seulement une petite partie d’une tumeur hétérogène ; et peut, par conséquent, ne pas être représentatif pour le profil moléculaire de la tumeur entière11. La surveillance périodique et le génotypage de tumeur exigent une collection répétée des tissus de tumeur, qui, habituellement, n’est pas faisable en raison de l’invasivité de la procédure de biopsie de tumeur et des issues de sûreté qui découlent de telles procédures12.

La technique de biopsie liquide, d’autre part, a gagné l’attention énorme dans l’oncologie de précision au cours dela dernière décennie 13,14. Elle est principalement due à la non-invasiveness de cette technique, et à la possibilité qu’elle soit répétée à plusieurs moments, permettant ainsi une technique de surveillance facile à utiliser et sûre pour les coursde la maladie 15,16. La biopsie liquide est basée sur un phénomène que les cellules tumorales se multiplient rapidement, et simultanément beaucoup d’entre elles subissent l’apoptose et la nécrose. Ceci mène à la libération des débris apoptotiques de cellules dans le sang des patients, avec les fragments d’ADN qui sont coupés à des tailles précises pendant l’apoptose17. L’apoptose des cellules non cancéreuses conduit également à la libération de ses débris cellulaires dans le sang, cependant, le taux d’apoptose dans ces cellules est relativement beaucoup plus faible que les cellules tumorales18. Le rationnel de la technique de biopsie liquide est de capturer les molécules tumeur-associées telles que l’ADN, l’ARN, les protéines, et les cellules de tumeur14,19 qui circulent continuellement dans le sang. Diverses techniques20 peuvent être utilisées pour l’analyse de ces molécules, y compris le séquençage de prochaine génération (NGS), la réaction en chaîne de polymése de gouttelette numérique (DdPCR), le PCR en temps réel et l’essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA). La technique de biopsie liquide permet d’identifier les biomarqueurs qui sont des caractéristiques des cellules tumorales. Ces molécules de biomarqueur ne sont pas seulement libérées des parties spécifiques d’une tumeur, mais plutôt de toutes les parties de latumeur 21. Par conséquent, les marqueurs identifiés dans la biopsie liquide représente le profilage moléculaire d’une tumeur hétérogène entière, en plus d’autres tumeurs dans le corps, ayant ainsi des avantages au-dessus de la technique basée sur la biopsie de tissu22.

Le cfDNA a une courte demi-vie dans le sang circulant allant de quelques minutes à 1-2 heures23. Cependant, le temps court de demi-vie de cfDNA facilite des analyses en temps réel en évaluant la réponse de traitement et les évaluations dynamiques de tumeur. Les niveaux de cfDNA tumeur-dérivés indiquent le pronostic du stade/taille de tumeur démontré par plusieurs études, qui ont montré une relation entre des niveaux de cfDNA et les résultats de survie24. En outre, les études ont prouvé que le cfDNA a une meilleure capacité de prévision que les marqueurs de tumeur existants25. Le pronostic de cfDNA est encore plus prononcé après traitement de cancer, les niveaux plus élevés de cfDNA suivant le traitement corrélé bien avec un taux réduit de survie, et la résistance au traitement. Attendu que les niveaux inférieurs de cfDNA suivant la thérapie correspondent généralement à la réponse positive de traitement. En outre, l’ADNfc facilite la détection précoce de la réponse au traitement que les méthodes de détection traditionnelles.

Le cfDNA augmente la possibilité de détection précoce des mutations associées au cancer : pendant la maladie à un stadeprécoce 15,l’apparition des symptômes26 et avant le diagnostic du cancer jusqu’à 2ans 27. Comme cfDNA est libéré de plusieurs régions tumorales ou foyers, son analyse fournit une vue complète du génome tumoral qu’il représente28. Par conséquent, le cfDNA permet de détecter des mutations somatiques qui auraient pu être manquées dans les échantillons de tissu29. Comme l’hétérogénéité intra-tumorale et les mutations subclonales peuvent être détectées par séquençage profond des régions génomiques couvrant des milliers de bases, d’où l’analyse de la CFDNA permet de découvrir des sous-types moléculaires spécifiques avec des signatures génomiques distinctes13. Pour obtenir un niveau similaire d’information par l’échantillon de tissu beaucoup de biopsies pleines aurait été nécessaire.

En outre, les niveaux de cfDNA dans les patients présentant une maladie localisée telle que le cancer du côlon, de l’ovaire, et du poumon après un traitement chirurgical et/ou une chimiothérapie, ont démontré pour être un marqueur pronostique puissant pour la répétition de cancer et les résultats detraitement 20. En outre, dans les patients présentant le cancer du côlon, du sein, et du poumon, les analyses de cfDNA du sang pourraient avec succès détecter les changements tumeur-spécifiques, qui ont mené à la prévision précise de répétition plusieurs mois àl’avance 13. En outre, les marqueurs de résistance au traitement, tels que les mutations KRAS chez les patients atteints de CRC recevant une thérapie anti-EGFR30; VAFs pour des gènes tels que PIK3CA, MED1 ou EGFR chez les patients atteints de cancer du sein après le traitement avec diverses thérapies31; et la mutation de résistance d’EGFR T790M dans les patients de cancer du poumon traités avec EGFR-ciblés TKIs32 peut également être identifiée par l’analyse de cfDNA.

En résumé, l’analyse cfDNA peut être utilisée pour identifier des biomarqueurs précis dans le domaine de l’oncologie13,33. Dans ce protocole, des échantillons de sang de 3 patients de glioma et de 3 contrôles sains ont été traités pour obtenir l’ADN génomique des WBCs et cfDNA du plasma. Dans le cancer de gliome, les mutations dans IDH, TERT, ATRX, EGFR, et TP53 sert de marqueurs diagnostiques aussi bien que pronostiques qui peuvent aider dans le diagnostic tôt des tumeurs de glioma, classant différents types de tumeurs de glioma, guidant le traitement précis pour le patient individuel et comprenant la réponsede traitement 34,35. L’état mutationnel de ces gènes peut être identifié à l’aide de cfDNA dérivé du sang. Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole détaillé de cfDNA plasma-dérivé qui a été employé pour étudier des changements mutationnels dans le cancer de gliome12. Un tel protocole de biopsie liquide basé sur cfDNA expliqué dans cet article peut être employé pour étudier des changements mutationnels dans beaucoup d’autres types de cancers. En outre, une étude récente a montré que la biopsie liquide à base de cfDNA peut détecter 50 différents types de cancers36.

La collecte, l’entreposage et l’expédition d’échantillons de sang sont des étapes cruciales de ce protocole, car la température incontrôlée pendant ces étapes provoque la lyse desWBCs, conduisant à la libération de l’ADN génomique du WBC dans le plasma et causant la contamination de l’échantillon cfDNA, qui affecte le reste de laprocédure 37. L’hémolyse due à une température incontrôlée peut nuire aux processus de préparation de l’échantillon en aval de cfDNA, tels que les étapesPCR 38. Le sérum contient une proportion élevée de germline cfDNA plutôt que de plasma, bien qu’il présente un grand bruit de fond pour cfDNA39 tumeur-associé. Par conséquent, pour isoler cfDNA tumeur-associée, le plasma est un échantillon approprié39. Le sang prélevé dans un tube anticoagulant contenant du sang doit être centrifugé immédiatement ou dans un délai de deux heures, afin de séparer le plasma et d’éviter la contamination par l’ADNfc. Dans ce protocole, des tubes commerciaux dédiés de collecte de sang de conservation de cfDNA sont employés (voir tableau des matériaux),qui sont une alternative à l’anticoagulant contenant des tubes de collecte de sang. Ces tubes dédiés à la collecte de sang préservent l’ADNfc et l’ARNfc, et empêchent la lyse des CCB jusqu’à 30 jours à température ambiante, et jusqu’à 8 jours à 37 °C. Cela facilite le maintien de la température appropriée lors d’une expédition d’échantillons de sang et jusqu’à ce que le plasma et wbc sontséparés 40.

Il existe actuellement trois types de méthodologies d’extraction cfDNA : l’isolement de phase, la colonne de spin à base de membrane de silicium et l’isolement magnétique à basede perles 41. La méthode de colonne de spin à base de silicium-membrane a donné une grande quantité de cfDNA avec l’intégrité élevée comparée à d’autres méthodes d’extraction de cfDNA42.

L’évaluation quantitative de l’ADN est une exigence fondamentale dans la biopsie liquide, il est nécessaire de développer une procédure simple, abordable et standardisée pour leur mise en œuvre facile et leur utilisation à grande échelle. Trois méthodes couramment utilisées pour la quantification de cfDNA sont spectrophotométriques, fluorimétriques, et qPCR. La méthode fluorimétrique s’avère meilleure que les autres méthodes concernant l’exactitude, le coût et la facilité de conducttion43.

L’intégrité et la pureté de la cfDNA peuvent être estimées soit par électrophoresis agarose ou électrophoresis capillaire. L’électrophoresis d’Agarose ne montre ni sensibilité à la faible concentration de cfDNA ni à haute résolution pour montrer la taille précise de fragment de cfDNA. D’autre part, l’électrophorèse capillaire a un avantage sur l’électrophoresis agarose en surmontant les défis associés et, par conséquent, largement utilisé par les chercheurs pour l’analyse de la taille des fragments cfDNA. Dans ce protocole, la distribution de la taille des fragments de cfDNA isolé a été estimée à l’aide d’un instrument automatisé d’électrophoresis capillaire (voir tableau des matériaux).

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Protocol

Avant la collecte de sang, le consentement éclairé des sujets participant à la recherche est nécessaire et doit être obtenu. Les recherches décrites dans ce manuscrit ont été effectuées conformément au Rabin Medical Center, au Comité éthique d’Israël (code éthique: 0039-17-RMC) et à la Faculté de médecine Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Comité éthique allemand (code éthique: D 405/14).

1. Collecte et stockage d’échantillons de sang dans des tubes de conservation cfDNA ou cfRNA

  1. Étiqueter correctement les tubes de conservation
  2. Recueillir ~8 mL de sang dans le tube de préservation de l’ADN cf (voir tableau des matériaux),à l’aide d’un ensemble de collecte de sang et d’un support, selon le protocole institutionnel standard pour la venipuncture tel que décrit ci-dessous.
    REMARQUE : L’utilisation d’un ensemble de collecte de sang peut empêcher le retour possible du sang du tube.
    1. Alignez le patient avec le bras en position descendante.
    2. Tenez le tube droit, le bouchon étant orienté vers le haut, tout en veillant à ce que le contenu du tube ne touche pas le capuchon ou la pointe de l’aiguille.
    3. Comme le sang commence à couler dans le tube, relâchez le garrot lentement.
  3. Immédiatement après que le tube est rempli de sang (capacité maximale : 8,4 mL de sang entier), inversez doucement le tube (tournez le poignet du bras qui tient le tube par 180° vers le bas et vers l’arrière) 5 fois pour stabiliser l’échantillon.
    REMARQUE : L’inversion garantit que l’agent de conservation est mélangé uniformément avec l’échantillon. Cependant, ne secouez pas le contenu à nouveau, même avant la préparation du plasma. Un mélange insuffisant d’agents de conservation avec l’échantillon de sang entraîne une déstabilisation du contenu et la formation de micro caillots ou d’hémolyse. À ce stade, le protocole peut être poursuivi immédiatement pour la séparation plasmatique ou les tubes remplis de sang peuvent attendre jusqu’à 30 jours à température ambiante (15-25 °C), et jusqu’à 8 jours à 37 °C.

2. Séparation et stockage de manteau de plasma et de buffy

  1. Centrifugeuse le tube de conservation rempli de sang à 425 x g pendant 20 min à température ambiante pour séparer le plasma.
    REMARQUE : Les étapes 2.2 et 2.3 doivent être exécutées dans une armoire de biosécurité.
  2. Pipette soigneusement la couche supérieure de plasma à un tube frais en aliquots de 1 mL, sans déranger les couches inférieures.
  3. Transférez soigneusement la couche suivante de pelage bouffi dans un tube frais (la couche apparaît comme un anneau au-dessus des granulés RBC), tout en évitant les CRC dans la couche inférieure.
  4. Passez à l’étape 3 avec du plasma et l’étape 4 avec le manteau bouffi. Si nécessaire, stockez le contenu séparé à -80 °C.

3. Purification de la circulation cfDNA à partir de 1 mL de plasma

REMARQUE : Cette étape est effectuée avec un kit commercial (voir tableau des matériaux). Tous les tampons sont fournis avec le kit.

  1. Préparation des tampons et des réachagents
    ATTENTION : N’ajoutez pas de solutions acides ou d’eau de Javel directement aux déchets de préparation de l’échantillon. Les sels de guanidine présents dans le tampon de lyse, le tampon de liaison et le tampon de lavage-1 lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ou des acides peuvent produire des composés hautement réactifs.
    1. Tampon de liaison : Mélangez 300 mL de concentré tampon liant avec 200 mL d’isopropanol à 100 % pour faire 500 mL de tampon de liaison de travail. Conserver à température ambiante.
      REMARQUE : Le tampon de liaison permet la liaison optimale des acides nucléiques circulants à la membrane de silice. 500 mL du tampon de liaison est suffisant pour traiter respectivement 276, 138, 92, 69 ou 55 échantillons de 1, 2, 3, 4 ou 5 mL de plasma et est stable pendant 1 an à température ambiante.
    2. Laver buffer-1 : Mélanger 19 mL de concentré Wash Buffer-1 avec 25 mL d’éthanol à 96 à 100 % pour faire 44 mL de wash buffer-1. Conserver à température ambiante.
      REMARQUE : Wash Buffer-1 élimine les contaminants liés à la membrane de silice. 44 mL de wash buffer-1 de travail sont suffisants pour traiter 73 échantillons de plasma de 1/2/3/4/5 mL de plasma et sont stables pendant 1 an à température ambiante.
    3. Laver buffer-2: Bien mélanger 13 mL de concentré Wash Buffer-2 avec 30 mL de 96-100% d’éthanol pour faire 43 mL de lavage buffer-2 de travail. Conserver à température ambiante.
      REMARQUE : Wash Buffer-2 élimine les contaminants liés à la membrane de silice. 43 mL de wash buffer-2 de travail est suffisant pour traiter ~56 échantillons de 1/2/3/4/5 mL de plasma et est stable pendant 1 an à température ambiante.
    4. À un tube contenant 310 μg d’ARN porteur lyophilisé, ajouter 1 550 μL de tampon d’élitution, pour préparer une solution d’ARN porteur de 0,2 μg/μL. Après avoir complètement dissous l’ARN porteur, divisez la solution en aliquots appropriés et stockez à -30 °C à -15 °C. Ne pas congeler-décongeler ces aliquots plus de 3 fois. Au tampon Lysis, comme le montre le tableau S1,ajoutez l’ARN porteur reconstitué dissous dans le tampon Elution.
      REMARQUE : Étant donné que l’ARN porteur ne se dissout pas directement dans le tampon de lyse, il doit être dissous d’abord dans un tampon d’Elution, puis dans le tampon de lyse. Tout d’abord, la liaison des acides nucléiques membranaires de silice est améliorée lorsqu’il y a très peu de molécules cibles présentes dans l’échantillon. Deuxièmement, le risque de dégradation de l’ARN est réduit en raison de la présence de grandes quantités d’ARN porteur.
  2. Avant de commencer l’isolement, amener les colonnes et les échantillons à température ambiante et ajuster les volumes de l’échantillon à 1 mL avec stérile saline tamponnée de phosphate (PBS), si nécessaire. Préchauffer 2 bains d’eau ou blocs chauffants contenant respectivement 50 mL de tubes de centrifugeuse et 2 tubes de collecte mL à 60 °C et 56 °C.
  3. Dans un tube de centrifugeuse de 50 mL, ajouter 100 μL de Proteinase K, 1 mL de plasma et 0,8 mL de tampon de lyse contenant 1,0 μg d’ARN porteur (préparé à l’étape 3.1.4). Fermez le tube de centrifugeuse avec un bouchon et mélangez le contenu par vortex d’impulsion pendant 30 s, tout en assurant un vortex visible dans le tube. Un mélange complet du contenu est important pour une lyse efficace.
    REMARQUE : Immédiatement après le vortex, passez à l’étape 3.4, sans délai.
  4. Incuber la solution à 60 °C pendant 30 min.
  5. Retirer le bouchon, ajouter 1,8 mL du tampon de liaison au tube, et bien mélanger avec le vortex d’impulsion pendant 15-30 s après avoir placé le bouchon.
  6. Incuber le mélange résultant pendant 5 min sur la glace et insérer la colonne de la membrane de silice dans l’appareil à vide qui est connecté à la pompe à vide. Ensuite, insérez fermement un prolongeur de tube de 20 mL dans la colonne ouverte pour éviter les fuites d’échantillons.
  7. Verser délicatement le mélange incubé dans l’extenseur de tube de la colonne et allumer la pompe à vide. Après tout le mélange de lysate traverse complètement les colonnes, éteignez la pompe à vide, relâchez la pression à 0 mbar, et retirez et jetez l’extenseur de tube.
    REMARQUE : En évitant la contamination croisée, l’extenseur du tube doit être soigneusement jeté, afin d’éviter qu’il ne s’étende sur les colonnes adjacentes.
  8. Retirez la colonne de l’appareil à vide, insérez-la dans le tube de collecte et centrifugez à 11 000 x g pendant 30 s à température ambiante, afin d’éliminer tout lysate résiduel. Jetez le flux à travers.
  9. Ajouter 600 μL de Wash Buffer-1 dans la colonne, centrifugeuse à 11 000 x g pendant 1 min à température ambiante, jeter le débit.
  10. Ajouter 750 μL de Wash Buffer-2 à la colonne, centrifugeuse à 11 000 x g pendant 1 min à température ambiante et jeter le débit.
  11. Ajouter 750 μL d’éthanol (96-100%) à la colonne, centrifugeuse à 11 000 x g pendant 1 min à température ambiante et jeter le débit.
  12. Centrifugez la colonne à 20 000 x g pendant 3 min, en la plaçant dans un tube de collecte propre de 2 mL.
  13. Séchez complètement l’assemblage de la colonne membranaire en le plaçant dans un nouveau tube de collecte de 2 mL avec le couvercle ouvert et l’incubation à 56 °C pendant 10 min.
  14. Placez la colonne dans un tube d’élitution propre de 1,5 mL. Au centre de la membrane de la colonne, appliquer 20-150 μL de tampon Elution et incuber à température ambiante pendant 3 min avec le couvercle fermé.
    REMARQUE : Assurez-vous que le tampon Elution est égalé à la température ambiante. En cas d’utilisation d’un tampon d’élitution inférieur à 50 μL, assurez-vous qu’il est distribué avec soin au centre de la membrane. Cela aide à l’élitution complète de l’ADN lié. Toutefois, le volume d’élitution n’est pas fixe et peut être modifié selon les applications en aval. L’élitate récupéré peut être jusqu’à 5 μL et certainement inférieur au volume d’élitution appliqué à la colonne.
  15. Centrifugeuse l’électrification récupérée dans une microcentrifugeuse à 20.000 x g pendant 1 min pour élucider les acides nucléiques, et stocker à -20 °C.

4. Purification de l’ADN génomique à partir d’un pelage bouffi

REMARQUE : Le kit commercial utilisé dans ce protocole est mentionné dans le Tableau des matériaux. Les tampons et les reagents mentionnés dans le protocole ci-dessous, c’est-à-dire le tampon de lyse A, le tampon B de la lyse, le tampon de lavage X, le tampon wash Y, le tampon Proteinase, le tampon Elution et le proteinase K font partie de ce kit commercial.

  1. Préparation des tampons et des reagents
    ATTENTION : N’ajoutez pas de solutions acides ou d’eau de Javel directement aux déchets de préparation de l’échantillon. Les sels de guanidine présents dans le tampon B de la Lyse et le tampon X de lavage lorsqu’ils sont combinés avec de l’eau de Javel ou des acides, peuvent produire des composés hautement réactifs.
    1. Tampon de lavage Y : Bien mélanger 12 mL de concentré De tampon de lavage Y avec éthanol de 48 mL (96-100%) pour obtenir 60 mL de lavage tampon de travail Y. Magasin à température ambiante.
      REMARQUE : 60 mL de wash buffer Y de travail sont suffisants pour traiter 100 échantillons de couches chamois et sont stables pendant 1 an.
    2. Proteinase K: Préparer proteinase K solution en dissolvant 30 mg lyophilisé Proteinase K dans 1,35 mL de Proteinase Buffer.
      REMARQUE : La solution de travail totale de Proteinase K est suffisante pour traiter 52 échantillons de couches chamois. Proteinase K solution de travail peut être stocké pendant au moins 6 mois à -20 °C.
  2. Étapes avant le début de la procédure
    1. Equilibrer le pelage bouffi à température ambiante.
    2. Réglez le bloc thermique ou le bain d’eau à 56 °C.
  3. Suspendre le pelage bouffi dans le tampon A de la Lyse pour obtenir un volume final de 200 μL. Ajouter ensuite 25 μL de solution Proteinase K et 200 μL de tampon B. Mélanger par vortex et incuber à 70 °C pendant 10 à 15 min. Assurez-vous que les échantillons sont entièrement recouverts de la solution de lyse.
    REMARQUE : Pour le traitement d’une série d’échantillons, proteinase K et lysis tampon A peuvent être prémémixés 10-15 minutes avant la procédure, mais plus avant cela, comme Proteinase K auto-digère dans le tampon de Lysis A sans substrat.
  4. Ajouter 210 μL de 96 à 100 % d’éthanol au mélange et au vortex ci-dessus vigoureusement.
    REMARQUE : L’ajout d’éthanol peut former un précipité filandreux; toutefois, cela n’affectera pas l’isolement de l’ADN. Assurez-vous de charger le précipité également sur la colonne, comme indiqué dans les étapes suivantes.
  5. Chargez l’échantillon entier sur la colonne de silice placée dans un tube de collecte. Centrifugeuse pendant 1 min à 11 000 x g. Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte et jetez le tube précédent avec le flow-through.
    REMARQUE : Répétez l’étape de centrifugation si l’échantillon n’est pas complètement dessiné à travers la matrice.
  6. Ajouter 500 μL de wash buffer X, centrifugeuse pendant 1 min à 11 000 x g, et jeter le flow-through.
  7. Placez la colonne dans le tube de collecte, ajoutez 600 μL de Wash Buffer Y sur la colonne, centrifugez pendant 1 min à 11 000 x g et jetez le débit.
  8. Encore une fois, placez la colonne dans le tube de collecte et centrifugez la colonne pendant 1 min à 20 000 x g pour sécher la membrane de silice.
  9. Incuber la colonne à température ambiante pendant 1 min, placée dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL, puis ajouter 100 μL de tampon Elution. Ensuite, élitez l’ADN en centrifugant pendant 1 min à 11 000 x g et conservez-les à -20 °C.

5. Quantification de l’ADN cfDNA et génomique à l’aide d’un fluoromètre

  1. Avant de commencer le protocole, effectuez les étapes suivantes.
    1. Diluer 2 μL d’ADN génomique élucidé (à partir de l’étape 4.9) dans 1:10 proportions avec de l’eau ultrapure sans nucléase. En raison des faibles concentrations prévues, ne diluez pas les échantillons de cfDNA à partir de l’étape 3.15.
    2. Equilibrer l’analyse Standard #1 et l’analyse Standard #2 à température ambiante.
  2. Préparez un total de 6 tubes clairs à paroi mince de 0,5 mL de taille.
    REMARQUE : Le protocole présenté est pour la quantification de 2 échantillons d’ADN cfDNA et 2 échantillons d’ADN génomique, donc, 4 tubes pour 4 échantillons et cet essai exige 2 normes.
  3. Étiquetez les couvercles du tube.
    REMARQUE : L’étiquetage sur le côté du tube pourrait interférer avec la lecture. En outre, les tubes standard d’analyse sont étiquetés avec soin, puisque l’étalonnage du fluoromètre exige que les normes soient dans le bon ordre.
  4. Diluer le reagent d’essai en 1:200 avec le tampon Assay pour préparer la solution de travail. Pour 4 échantillons et 2 normes, utilisez 6 μL de reagent d’analyse plus 1 194 μL de tampon d’essai pour faire 1 200 μL (200 μL dans chaque tube) de solution de travail.
    REMARQUE : N’utilisez pas de contenant en verre, utilisez plutôt un tube en plastique propre. Chaque tube doit contenir environ 200 μL du volume final (un tube standard d’essai doit contenir 190 μL de la solution de travail, et le tube d’échantillon doit contenir 180-199 μL de la solution de travail). Une solution de travail suffisante doit être préparée pour répondre à toutes les normes et échantillons d’analyse.
  5. Dans les tubes standard d’analyse de travail, ajouter 190 μL de solution de travail et 10 μL de standard d’analyse et mélanger la solution par vortex pour 2-3 s. Évitez la formation de bulles dans la solution.
  6. Dans les tubes de l’échantillon, ajouter 198 μL de solution de travail et 2 μL d’ADN cfDNA ou génomique. Mélanger la solution en tourbillonnant pendant 2-3 s, et la garder incubée à température ambiante pendant 2 min.
  7. Dansl’écran « Accueil» de l’instrument fluoromètre, appuyez sur «ADN» et sélectionnez «dsDNA High Sensitivity Assay», pour afficher l’écran« Standards», puis appuyez sur« Oui» sur l’écran du fluoromètre «Standards» pour lire les normes.
  8. Dans la chambre de l’échantillon, insérez l’essai Standard #1 tube, fermez le couvercle et appuyez sur« Lire». Retirez le tube une fois la lecture terminée (environ 3 s) et répétez la même étape pour la norme #2.
  9. Un exemple d’écran est affiché après l’achèvement du processus d’étalonnage, puis insérez un tube d’échantillon et répétez l’étape '5.8'. L'«écran d’échantillon » affichera alors une valeur qui correspond à la concentration de l’échantillon après dilution dans le tube de l’échantillon.
  10. Pour chaque exemple, répétez l’étape « 5.9 », jusqu’à ce que tous les échantillons soient lus.
  11. Utilisez l’équation suivante pour calculer la concentration réelle de l’échantillon.
    Equation 1
    REMARQUE : Les valeurs d’analyse sont en ng/mL et correspondent à la concentration après dilution dans le tube d’essai. Équation mentionnée à l’étape supérieure 5.11, la valeur QF est la valeur donnée par l’instrument fluoromètre, et x est le nombre de microlitres d’échantillon ajoutés au tube d’essai. Les unités pour les valeurs QF générées par l’équation sont similaires à la valeur fournie par le fluoromètre. Par exemple, si la valeur du fluoromètre est en ng/mL, les unités pour la concentration calculée par l’équation sont ng/mL.

6. Répartition de la taille des fragments d’ADN de cfDNA par analyseur de fragments

  1. L’étape avant le début de la procédure: Equilibrate le concentré de colorant d’ADN et la matrice de gel d’ADN à température ambiante pendant 30 min.
  2. Préparation du mélange gel-colorant
    MISE EN GARDE : Manipulez les solutions avec prudence car le DMSO est connu pour faciliter l’entrée de molécules organiques dans les tissus.
    1. Décongeler complètement le DMSO en vortexant le flacon concentré de colorant d’ADN pendant 10 s. Pipette 15 μL de ce concentré dans un flacon de matrice de gel d’ADN et stocker à 4 °C dans l’obscurité.
    2. Encore une fois, vortex le flacon plafonné pendant 10 s jusqu’à ce que le mélange du gel et du colorant soit visualisé.
    3. Verser le mélange sur un filtre à spin jusqu’au réceptacle supérieur.
    4. Microcentrifugeuse le filtre de rotation à 2.240 x g ± 20% pendant 10 min à température ambiante.
    5. Étiquetez le gel-colorant préparé dans le tube et jetez le filtre, selon les bonnes pratiques de laboratoire. Étiquetez le tube et enregistrez la date de préparation.
      REMARQUE : Jetez le filtrate selon les bonnes pratiques de laboratoire. Le mélange gel-colorant peut être utilisé pour 5 puces d’ADN haute sensibilité (HS). S’il n’est pas utilisé pendant plus de 1 h, conserver à 4 °C. Le stockage dans l’obscurité est possible jusqu’à 6 semaines.
  3. Pour charger le mélange gel-colorant, assurez-vous de la position de la plaque de base de la station d’amorçage des copeaux et ajustez le clip à la position la plus basse.
    1. Equilibrer le mélange gel-colorant à température ambiante pendant 30 min, tout en surveillant l’exposition à la lumière.
    2. Prenez une nouvelle puce d’ADN HS d’un sac scellé et placez-la sur la station d’amorçage des copeaux, puis retirez 9,0 μL du mélange gel-colorant et distribuez-la au bas de la puce bien, marquée comme « G ».
      REMARQUE : Dessinez le mélange gel-colorant, en évitant les particules qui peuvent s’accumuler au fond du flacon. Tout en distribuant le mélange gel-colorant dans la puce d’ADN HS bien, insérer le bout de la pipette complètement, pour empêcher la formation de grandes bulles d’air. De plus, toucher la pipette sur les bords du puits produira de mauvais résultats.
    3. Placez le piston à 1 mL et fermez la station d’amorçage des copeaux. Assurez-vous que la serrure du loquet clique et réglez la mise à 60 s, puis appuyez sur le piston jusqu’à ce qu’il soit tenu par le clip, et exactement après 60 s, relâchez le piston avec le mécanisme de libération du clip.
    4. Lorsque le piston recule au moins à la marque de 0,3 mL, attendez 5 s, puis reculez lentement à la position de 1 mL, puis ouvrez la station d’amorçage des copeaux et retirez à nouveau 9,0 μL du mélange gel-colorant et distribuez-le au bas de la puce d’ADN HS bien, marquée comme « G ».
  4. Pour charger le marqueur d’ADN, distribuez 5 μL du marqueur d’ADN dans le puits, marqué du symbole de l’échelle. Répétez la procédure pour tous les 11 puits d’échantillon.
  5. Pour charger l’échelle et les échantillons, distribuez 1 μL de l’échelle d’ADN dans le puits, marqué du symbole de l’échelle, puis ajoutez 1 μL d’échantillon (puits usés) ou 1 μL de marqueur (puits inutilisés) dans les 11 puits d’échantillonnage.
  6. Vortex la puce D’ADN HS pour 60 s à 2400 rpm en plaçant la puce horizontalement dans l’adaptateur. Assurez-vous que le renflement qui fixe la puce d’ADN HS n’est pas endommagé pendant le vortex.
  7. Pour insérer la puce D’ADN HS dans l’instrument d’analyseur de fragments, ouvrez le couvercle et assurez-vous que la cartouche d’électrode est correctement insérée, et le sélecteur de puce est positionné pour « dsHigh Sensitivity DNA » dans l’instrument d’analyseur de fragments.
  8. Montez soigneusement la puce d’ADN HS dans le réceptacle, qui ne s’adapte qu’à une seule façon, puis perdez le couvercle en vous assurant que la cartouche d’électrode s’intègre exactement dans les puits de la puce d’ADN HS.
  9. L’affichage sur l’écran logiciel de l’analyseur de fragments indique la puce d’ADN HS insérée et le couvercle fermé, à travers l’icône de la puce en haut à gauche de l’écran.
  10. Pour lancer l’analyse des puces D’ADN HS, sélectionnez l’analyse de sensibilité élevée dsDNA à partir du menu« Assay» sur l’écran de l’instrument, puis remplissez correctement la table des noms d’échantillons en alimentant des informations telles que les noms d’échantillons et les commentaires et démarrez la puce en cliquant sur lebouton « Démarrer » en haut à droite de l’écran.
  11. Nettoyage de l’électrode après une série de puces d’ADN HS : Retirez immédiatement la puce d’ADN HS utilisée, dès que l’analyse est terminée et éliminez-la selon les bonnes pratiques de laboratoire. Effectuez la procédure suivante pour vous assurer que les électrodes sont propres, sans résidus de restes de l’analyse précédente.
    1. Remplissez lentement 350 μL d’eau déionisée de qualité analyse dans l’un des puits de nettoyage d’électrodes et placez le nettoyeur d’électrodes dans l’instrument d’analyseur de fragments en ouvrant le couvercle, puis fermez le couvercle et attendez environ 10 s.
    2. Retirer le nettoyeur d’électrodes en ouvrant le couvercle et attendre encore 10 s, pour que l’eau sur les électrodes s’évapore avant de fermer le couvercle.

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Representative Results

Séparation plasmatique
Le sang de 8,5-9 mL recueilli dans les tubes de conservation cfDNA ou cfRNA donne environ ~4 mL de plasma en volume. Le volume de plasma séparé du sang recueilli dans les tubes EDTA peut varier en fonction de la température. L’exposition de tubes EDTA contenant du sang à une température supérieure à 37 °C entraîne une diminution du volume plasmatiquede rendement 44.

Résultats de l’analyse fluoromètre
La concentration de cfDNA dans le plasma de 1 mL de chacun des patients de glioma #1 et #3 et les contrôles sains #H1, #H2, et #H3 étaient 137 ng, 12.6 ng, 6.52 ng, 2.26 ng, et 2.48 ng, respectivement. Cependant, dans le patient de glioma #2 la concentration de cfDNA était trop basse pour être détectée dans un fluoromètre. la concentration de cfDNA dans le plasma de 1 mL d’un patient cancér cancer varie de 0,5 à >1000 ng18, avec une valeur moyenne de 20 ng. Chez les personnes en bonne santé, la concentration de cfDNA varie d’une concentration indétectable à 16 ng, avec une valeur moyenne de 8 ng45. L’ADN génomique isolé d’une couche buffy de 200 μL (PBMCs) donne environ 25 à 50 μg d’ADN.

Résultats d’analyseur de fragment d’ADN
Selon une étude précédente, cfDNA est enrichi en fragments longs de 166 bp, qui représentent ~85% du cfDNA total dans le plasma d’un patient. En revanche, les fragments longs de 332 pb représentent 10 %, et les fragments longs de 498 pb représentent 5 % de cfDNA46. Deux facteurs principaux qui affectent les résultats d’analyseur de fragment cfDNA sont la contamination génomique d’ADN des PBMCs et la faible concentration de cfDNA. La figure 1 montre le graphique de bioanalyse prévu de cfDNA du patient de glioma #1, dans lequel des fragments de cfDNA sont enrichis à 166 bp et il n’y a aucune contamination génomique d’ADN dans l’échantillon21. La figure 2 montre le graphique d’enrichissement des fragments après que la préparation par la bibliothèque ngs de l’ADN du #1 patient du gliome et de l’enrichissement des fragments soit déplacée de 166 pb à 291 pb, en raison de l’attachement de 125 indices et adaptateurs bp à celui-ci. La figure 3 montre un très léger enrichissement des fragments cfDNA de patients atteints de gliome #2. Malgré la faible concentration de cfDNA dans les #2 des patients atteints de gliome, l’ajout d’adaptateurs NGS aux étapes d’amplification cfDNA et PCR mène au pic visible de la bibliothèque cfDNA sur le graphique d’enrichissement des fragments Figure 4. Par conséquent, la bibliothèque a été préparée avec succès à partir de cet échantillon cfDNA à faible concentration, comme le montre la figure 4. Dans la figure 5, les fragments cfDNA du #3 patient de gliome sont montrés pour culminer près de 166 bp mais la contamination génomique d’ADN est également apparente près du pic d’échelle de référence de 10380 bp.

Figure 1
Figure 1 : Graphique idéal de l’analyseur de fragments cfDNA de l’échantillon de glioma #1 cfDNA. Un pic majeur a été observé à 166 pb et un pic plus petit a été observé à 332 pb. Il n’y a pas eu de contamination génomique observée dans cet échantillon, qui se produit près du marqueur supérieur de 10 380 pb. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Graphique idéal de l’analyseur de fragments cfDNA de l’échantillon de glioma #1 bibliothèque cfDNA. Après avoir ligating 125 bp adaptateurs bibliothèque de séquençage de prochaine génération, 166 bp et 332 bp cfDNA fragments ont montré un pic majeur à 291 bp et un plus petit pic à 457 bp respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : graphique d’analyseur de fragments cfDNA de l’échantillon de gliome #2 cfDNA, montrant un très petit pic à 166 pb. En raison de la faible concentration de cfDNA, le pic à 166 bp était à peine visible. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : graphique d’analyseur de fragments cfDNA de la bibliothèque cfDNA de l’échantillon de glioma #2. Après avoir ligating 125 bp adaptateurs bibliothèque de séquençage de prochaine génération et l’exécution des cycles PCR pendant la préparation de la bibliothèque, le pic à peine visible cfDNA à 166 bp ou des pics complètement invisibles à 332 bp et 498 bp, étaient clairement visibles. Un pic majeur était présent près de 291 bp et un plus petit pic à 457 bp, 623 bp, 789 bp et près de 2.500 bp ont été observés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : analyseur de fragments cfDNA montrant une contamination génomique de l’ADN dans l’échantillon de gliome #3 cfDNA. Un petit pic à 166 pb indiquait que la présence de cfDNA et l’enrichissement près du marqueur supérieur (10 380 points de base) étaient des contaminations par l’ADN génomique. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau S1 : Volumes du tampon de lyse et de l’ARN porteur (dissous dans buffer AVE) requis pour le traitement de 1 mL d’échantillons de plasma. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette table.

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Discussion

La collecte du sang d’un patient dans un tube, l’expédition et le stockage sont des étapes initiales cruciales dans la biopsie liquide. Une mauvaise manipulation peut nuire à la qualité du plasma et, par conséquent, peut interférer avec les résultats de la biopsie liquide47. Si un échantillon de sang est prélevé dans un tube sanguin EDTA, le plasma doit être séparé dans les deux heures suivant la collecte de sang afin d’éviter la lyse des CWB et la libération de son ADN génomique dans le plasma48. Les WBCs peuvent également subir une apoptose dans un tube EDTA s’ils sont conservés plus longtemps, et les fragments cfDNA qui en résultent peuvent contaminer l’ADND d’origine dans le plasma48. Exposition d’un échantillon de sang à une température élevée (>37 °C) ou tremblement excessif du tube avant que la séparation du plasma ne provoque une hémolyse. L’hémoglobine qui reste par conséquent comme contaminant dans le plasma affecte les processus en aval de cfDNA tels que pendant la préparation de la bibliothèque49. La température élevée (>37 °C) affecte également le rendement du plasma dans un tube sanguin EDTA. Par conséquent, la séparation rapide du plasma après sa collecte dans un tube EDTA50 est une étape importante dans le contrôle de la qualité de la méthode. Si le sang est prélevé dans le tube commercial de conservation cfDNA ou cfRNA, le produit chimique conservateur doit être mélangé avec le sang immédiatement après la collecte de sang40. Le défaut de bien mélanger le produit chimique conservateur conduit à la formation de microclots dans le plasma. Ceux-ci obstruent les membranes de silice dans une colonne pendant le processus d’extraction de cfDNA et abaissent le rendement de cfDNA. Une secousse modérée du sang dans le tube ne cause pas d’hémolyse; bien que les secousses excessives puissent causer l’hémolyse même dans ces tubes40. Par conséquent, lors de l’expédition ou de la manipulation de ces tubes, des secousses excessives doivent être évitées. Les tubes sanguins sont recommandés pour être expédiés en position verticale.

La quantification et l’évaluation précises de la concentration de cfDNA par plasma unitaire est une étape importante dans la biopsie liquide, puisque la concentration de cfDNA de plasma est directement associée aux processus physiologiques etpathologiques 51. La concentration de cfDNA est plus élevée chez les patients atteints de cancer que chez les sujets enbonne santé 52. L’augmentation de la concentration de cfDNA dans le sang humain n’est pas spécifique au cancer; les femmes enceintes et les patients qui reçoivent des transplantations ont également tendance à avoir des concentrations élevées de cfDNA dans leursang 21. Des associations ont également été montrées pour l’inflammation, le trauma de tissu, le diabète, l’infarctus du myocarde, et le sepsis avec un niveau accru de concentration de cfDNA53. La concentration de cfDNA de plasma dans les patients tôt-étape de cancer tend à être inférieure à dans les patients présentant des tumeurs avancées ou métastatiques. Ceci soutient une association directe de cfDNA avec un fardeau de tumeur54. La concentration de cfDNA dans le sang varie sensiblement considérablement entre 0.5 et >1000 ng/mL dans les patients cancéraux et entre 0 et 100 ng/mL dans les sujets sains18. Pour la préparation de la bibliothèque, un minimum de 0,5 ng de cfDNA requis. Pour atteindre la quantité minimale de demande de cfDNA pour le séquençage, on peut commencer par un minimum de 2 mL d’un échantillon de sang ou d’un échantillon de plasma de 1 mL. En outre, les erreurs techniques pendant l’extraction de cfDNA de plasma réduisent également le rendement de cfDNA, et la concentration qui en résulte, s’écartant ainsi de la concentration réelle de cfDNA de plasma. La dégradation de cfDNA peut se produire en raison des anticoagulants dans les tubes d’EDTA ou en raison du processus de dégel et de congélation multiples des échantillons de plasma. Une mauvaise activité de proteinase K pendant le processus de lyse a également comme conséquence un faible rendement de cfDNA. Proteinase K activité diminue en raison de son exposition prolongée à des températures élevées. L’utilisation d’éthanol à faible concentration au lieu de 96 à 100 % pendant l’étape de lavage de l’extraction cfDNA entraîne également un faible rendement de cfDNA. Par conséquent, il est important d’éviter les erreurs techniques dans la technique de biopsie liquide pour obtenir des résultats précis et fiables.

L’analyse qualitative de cfDNA est une étape centrale, au cours de laquelle la distribution réelle des fragments d’ADN présents dans l’échantillon extrait de cfDNA est estimée. Les résultats quantitatifs de cfDNA ne sont fiables qu’après confirmation de sa pureté par analyse qualitative. Par conséquent, un graphique idéal de cfDNA généré dans l’analyseur de fragments d’ADN montre l’enrichissement du pic majeur de fragments cfDNA près de 166 bp, et un plus petit pic près de 332 bp longueur. Cela indique que l’échantillon extrait de cfDNA n’est pas contaminé par l’ADN génomique des CWB. Si un fragment est enrichi de 7 000 pb à l’échelle de référence (10 380 bp) et au-delà, cela indique la contamination d’un échantillon cfDNA par de l’ADN génomique WBC. Si la contamination génomique de l’ADN est observée dans un échantillon cfDNA après analyse d’estimation de la taille des fragments d’ADN, l’échantillon peut être exécuté sur du gel d’agarose de 2 % avec une échelle de 100 pb, et le gel peut être excisé entre la plage ~150-200 bp, suivi d’un essai d’extraction de gel. Une certaine quantité de cfDNA est perdue pendant le processus de sélection de taille de gel d’agarose. Toutefois, l’étape de préparation de la bibliothèque ngs nécessite un minimum de 0,5 ng et un maximum de 1000 ng de matériel d’ADN d’entrée pour préparer les bibliothèques pour le séquençage. Par conséquent, si la quantité totale de cfDNA est égale ou supérieure à 0,5 ng, elle est suffisante quantité pour l’étape de préparation de la bibliothèque. En outre, ces échantillons passent le processus de préparation de la bibliothèque avec succès, et la bibliothèque qui en résulte montre un pic majeur proche de 291 bp et un pic plus petit à 457 bp, en raison de l’ajout de 125 index et adaptateurs bp.

L’analyse des données NGS est la dernière étape de la technique de biopsie liquide basée sur ngs, et des listes de mutations et de fusionsgène-gène 3,55,56,57 sont générées à cette étape. Les mutations et les fusions gène-gène identifiées peuvent être évaluées selon des études antérieures sur les paysages de mutation du cancer58,59, mutations génétiques précédemmentcaractérisées 60 ou fusions gène-gène61,62,63. Ceux-ci peuvent servir de pronostique64 et de diagnostic7 biomarqueurs chez les patients atteints de cancer. Par exemple, la mutation R132H dans le gène de déshydrogénase d’isocitrate 1 (IDH1) est un signe décisif du cancer secondaire de glioblastoma, et le distingue également du glioblastome primaire dans lequel cette mutation est normalementabsente 65. De plus, la leucémie myéloïde chronique (LMC) se caractérise par une fusion génétique BCR/ABL1 résultant d’une translocation équilibrée entre le chromosome 9 et le 2261. Le gène BCR/ABL1 et son ARNm et sa protéine de fusion sont uniques aux progéniteurs de LAMC et constituent donc une bonne cible pour lathérapie 66.

Diagnostic avancé, la mise en scène correcte de la tumeur et la surveillance de traitement est une stratégie actuelle pour la gestion efficace du cancer. Jusqu’à récemment, la biopsie tissulaire a été l’étalon-or pour l’évaluation histologique des tissus tumoraux. Pourtant, à la suite de vastes recherches dans ce domaine et de l’avènement de la technologie, il a prouvé qu’une seule biopsie est incapable de fournir tout le paysage mutationnel d’une tumeur et que les biopsies en série ne sont généralement pas pratiques à effectuer en raison de leur invasivité, en particulier dans le glioblastome et le lymphome, où les biopsies sont très invasives. En outre, environ 16% des biopsies d’aiguille sont associées aux complicationsprocédurales 67. En outre, le profilage génomique de haute qualité exige une quantité suffisante de tissu, une demande qui n’est habituellement pas remplie par la biopsie d’aiguille68.

Les biopsies liquides, à partir d’un échantillon de sang de routine en analysant l’ADN dérivé de la tumeur se trouvent pour remplacer ou adjuvant les procédures courantes de biopsie de tissud’aiguille 12. L’analyse de l’ADN/cfDNA tumeur-dérivé par plasma par biopsie liquide est une procédure mini-invasive et efficace pour le profilage moléculaire des tumeurs. Il peut essentiellement permettre la surveillance de traitement par échantillonnage périodique au fil du temps sans les risques et complications potentiels habituellement associés à la biopsie traditionnelle de tissu de tumeur due à sa natureenvahissante 69. En outre, les études comparant la biopsie d’aiguille avec l’analyse de cfDNA par biopsie liquide d’une lésion simple de tumeur ont constaté que le profilage de cfDNA peut offrir une hétérogénéité moléculaire complète qu’une tumeur peut être hébergée par les populations clonales distinctes multiples70.

Cependant, bien que le diagnostic basé sur cfDNA de plasma ait beaucoup d’avantages au-dessus de biopsie de tissu de tumeur, il y a toujours quelques limitations cruciales qui entravent son applicabilité dans la pratique clinique générale. Les limitations du diagnostic de biopsie liquide basée sur cfDNA incluent le coût plus élevé de la procédure globale, le besoin d’ADN de haute qualité et un bioinformaticien consacré pour la nécessité d’une vaste analyse de données71. En raison du problème de gestion des données associé à l’analyse de l’ADNFC, ngs pose également des problèmes dans son application immédiate dans la clinique. Les défis de la gestion des données que pose ngs sont principalement dus à la difficulté de distinguer entre le bruit de fond intrinsèque du séquençage profond et les aberrations associées à la tumeur72. Enfin, en raison de l’indisponibilité de la validité clinique et des données d’utilité pour la majorité des essais de biopsie liquide, ils sont actuellement limités uniquement aux études cliniques et aux recherches fondamentales13.

Les développements futurs dans la technique de biopsie liquide, sont attendus par des efforts combinés par la recherche fondamentale dans le domaine de la biologie, de la physiologie, de la biologie moléculaire, des techniques d’analyse, de l’analyse statistique pour la gestion de données, et de la technologie machine-learn73,74. En outre, de nombreux essais cliniques basés sur l’évaluation des biomarqueurs cfDNA sont en cours, et leurs résultats aideront à établir la validité de la technique. Ces efforts combinés, espérons-le, établiront la plate-forme de biopsie liquide grâce à l’analyse cfDNA en tant qu’outil puissant de surveillance pronostique, diagnostique et thérapeutique dans le cadre clinique d’oncologie dans lescinq prochaines années 70,75.

Pour conclure, la biopsie liquide à base de cfDNA offre une approche sûre et non invasive pour identifier les biomarqueurs génomiques qui sont utiles dans la gestion des maladies cancéreuses. Toutefois, pour obtenir des résultats fiables et précis, des protocoles normalisés pour la collecte de sang, la séparation plasma/WBC, l’extraction de cfDNA et l’analyse quantitative et qualitative de cfDNAsont particulièrement nécessaires 74,75.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier les membres du Laboratoire de génomique du cancer et de bioincompétation des maladies complexes pour leurs contributions observationnelles et leur participation à de multiples discussions à différentes étapes de ce projet. Le soutien financier comprend l’Association israélienne contre le cancer (subvention de l’ICA pour M.F-M 2017-2019) et la subvention Kamin de l’Autorité israélienne de l’innovation (pour M.F-M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

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