Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Påvisning av cellefritt DNA i blodplasmaprøver av kreftpasienter

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61449
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Cancer Genomics and BioComputing of Complex Diseases laboratory, The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2The Data Science Institute, Bar-Ilan University, 3The Dangoor Centre For Personalized Medicine, Bar-Ilan University

Summary

I dette papiret presenterer vi en detaljert protokoll for ikke-invasiv flytende biopsiteknikk, inkludert blodinnsamling, plasma- og buffycoatseparasjon, cfDNA og germline DNA-ekstraksjon, kvantifisering av cfDNA eller germline DNA, og cfDNA fragmentberikelsesanalyse.

Abstract

Identifisering av mutasjoner i svulster hos kreftpasienter er et svært viktig skritt i sykdomsbehandling. Disse mutasjonene tjener som biomarkører for tumordiagnose, så vel som for behandlingsvalget og dens respons hos kreftpasienter. Den nåværende gullstandardmetoden for å oppdage tumormutasjoner innebærer en genetisk test av tumor-DNA ved hjelp av tumorbiopsier. Imidlertid er denne invasive metoden vanskelig å bli utført gjentatte ganger som en oppfølgingstest av tumormutasjonsrepertoaret. Flytende biopsi er en ny og fremvoksende teknikk for å oppdage tumormutasjoner som en brukervennlig og ikke-invasiv biopsitilnærming.

Kreftceller multipliserer raskt. Parallelt gjennomgår mange kreftceller apoptose. Rusk fra disse cellene slippes ut i pasientens sirkulasjonssystem, sammen med fint fragmenterte DNA-stykker, kalt cellefrie DNA -fragmenter (cfDNA), som bærer tumor-DNA-mutasjoner. Derfor, for å identifisere cfDNA-baserte biomarkører ved hjelp av flytende biopsiteknikk, samles blodprøver fra kreftpasientene, etterfulgt av separasjon av plasma og buffy pels. Deretter behandles plasma for isolering av cfDNA, og den respektive buffy pelsen behandles for isolering av pasientens genomiske DNA. Begge nukleinsyreprøvene kontrolleres deretter for deres kvantitet og kvalitet; og analysert for mutasjoner ved hjelp av neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS).

I dette manuskriptet presenterer vi en detaljert protokoll for flytende biopsi, inkludert blodinnsamling, plasma og buffy coat separasjon, cfDNA og germline DNA ekstraksjon, kvantifisering av cfDNA eller germline DNA, og cfDNA fragment berikelse analyse.

Introduction

Teknologiske fremskritt har ført til sekvensering av hundrevis av kreftgenomer og transkripsjoner1. Dette har bidratt til å forstå landskap av molekylære endringer på tvers av ulike krefttyper2. Videre studier på disse landskapene har bidratt til å karakterisere sekvensielle somatiske endringer og gengenfusjoner3 som er involvert i kreft eller tumorprogresjon, ved å forstyrre apoptoseveier4. Derfor kan somatiske mutasjoner og gengenfusjoner gi informasjon om svulster ved å tjene som biomarkører hos individuelle pasienter for en bestemt tumortype5, identifisere eksisterende primære svulster prognose6, kategorisere sekundære svulster basert påmolekylære endringer 7, og identifisere druggable tumor mål8. Slik informasjon kan legge til rette for å velge personlig behandling for kreftpasienter og ved fastsettelse av positive og negative behandlingsresponser9. Imidlertid er det å skaffe tumormateriale for å identifisere genomisk profilering av tumorvev en invasiv prosedyre10. Videre består en tumorbiopsi bare en liten del av en heterogen svulst; og kan derfor ikke være representativ for den molekylære profilen til hele svulsten11. Seriell overvåking og tumorgenomtyping krever en gjentatt samling av tumorvev, som vanligvis ikke er mulig på grunn av invasiviteten av tumorbiopsiprosedyre og sikkerhetsproblemene som oppstår fra slike prosedyrer12.

Den flytende biopsiteknikken, derimot, har fått enorm oppmerksomhet i presisjononkologi det siste tiåret13,14. Det skyldes hovedsakelig ikke-invasivitet av denne teknikken, og muligheten for at den gjentas på flere tidspunkter, og dermed muliggjør en brukervennlig og sikker overvåkingsteknikk for sykdomskursene15,16. Flytende biopsi er basert på et fenomen som tumorceller multipliserer raskt, og samtidig gjennomgår mange av dem apoptose og nekrose. Dette fører til frigjøring av apoptotisk celleavfall i pasientens blod, sammen med DNA-fragmentene som kuttes i nøyaktige størrelser under apoptose17. Apoptose av ikke-kreftceller fører også til frigjøring av cellulære rusk i blodet, men apoptosehastigheten i disse cellene er relativt mye lavere enn tumorceller18. Rasjonaliteten av den flytende biopsiteknikken er å fange tumorrelaterte molekyler som DNA, RNA, proteiner og tumorceller14,19 som sirkulerer kontinuerlig i blodet. Uliketeknikker 20 kan brukes til analyse av disse molekylene, inkludert neste generasjons sekvensering (NGS), digital dråpepolymerasekjedereaksjon (ddPCR), sanntids PCR og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Flytende biopsi teknikk gjør det mulig å identifisere biomarkører som er kjennetegn på tumorceller. Disse biomarkørmolekylene frigjøres ikke bare fra bestemte deler av en svulst, men heller fra alle deler av svulsten21. Derfor representerer markører identifisert i flytende biopsi molekylær profilering av en hel heterogen svulst, i tillegg til andre svulster i kroppen, og dermed har fordeler over vevbiopsibasert teknikk22.

CfDNA har en kort halveringstid i det sirkulerende blodet fra noen få minutter til 1-2 timer23. Den korte halveringstiden til cfDNA forenkler imidlertid sanntidsanalyser ved å evaluere behandlingsrespons og dynamiske tumorvurderinger. Tumoravledede cfDNA-nivåer indikerer prognostisering av tumorstadium/størrelse som fremgår av flere studier, som viste en sammenheng mellom cfDNA-nivåer og overlevelsesresultatene24. Videre har studier vist at cfDNA har en bedre prediksjonskapasitet enn eksisterende tumormarkører25. Prognosen for cfDNA er enda mer uttalt etter kreftbehandling, høyere nivåer av cfDNA etter behandling korrelerer godt med redusert overlevelsesrate og motstand mot behandling. Mens lavere nivåer av cfDNA etter behandling generelt tilsvarer positiv behandlingsrespons. I tillegg forenkler cfDNA tidlig påvisning av behandlingsrespons enn de tradisjonelle deteksjonsmetodene.

CfDNA øker muligheten for tidlig påvisning av kreftrelaterte mutasjoner: under tidlig stadium sykdom15, utbruddet av symptomer26 og før kreftdiagnose opptil 2 år27. Som cfDNA frigjøres fra flere tumorregioner eller foci, gir analysen et omfattende syn på tumorgenomet det representerer28. Derfor gjør cfDNA det mulig å oppdage somatiske mutasjoner som kan ha blitt savnet i vevsprøvene29. Som intra-tumor heterogenitet og subklonale mutasjoner kan oppdages ved dyp sekvensering av genomiske regioner som strekker seg over tusenvis av baser, derav analysen av cfDNA gjør det mulig å avdekke spesifikke molekylære undertyper med distinkte genomiskesignaturer 13. For å få et lignende nivå av informasjon gjennom vevsprøve mange faste biopsier ville ha vært nødvendig.

Videre viste cfDNA-nivåene hos pasienter med en lokalisert sykdom som tykktarm, eggstokk og lungekreft etter kirurgisk behandling og/ eller kjemoterapi, å være en kraftig prognostisk markør for tilbakefall av kreft og behandlingsutfall20. Videre, hos pasienter med tykktarms-, bryst- og lungekreft, kan analyser av cfDNA fra blodet med hell oppdage de tumorspesifikke endringene, noe som førte til den nøyaktige forutsigelsen av tilbakefall flere måneder i forveien13. Videre, behandlingsresistensmarkører, slik som KRAS mutasjoner hos pasienter med CRC mottar anti-EGFR terapi30; VAFs for gener som PIK3CA, MED1 eller EGFR hos pasienter med brystkreft etter behandling med ulike behandlinger31; og EGFR T790M resistensmutasjon hos lungekreftpasienter behandlet med EGFR-målrettede TKIer32 kan også identifiseres ved cfDNA-analyse.

Oppsummert kan cfDNA-analysen brukes til å identifisere nøyaktige biomarkører innen onkologi13,33. I denne protokollen ble blodprøver av 3 gliompasienter og 3 friske kontroller behandlet for å oppnå genomisk DNA fra WBCer og cfDNA fra plasmaet. I gliomakreft fungerer mutasjoner i IDH, TERT, ATRX, EGFR og TP53 som en diagnostisk samt prognostiske markører som kan hjelpe til med tidlig diagnose av gliomasvulster, klassifisere ulike typer gliomasvulster, veilede nøyaktig behandling for den enkelte pasient og forstå behandlingsresponsen34,35. Mutasjonsstatus for disse genene kan identifiseres ved hjelp av blodavledet cfDNA. I dette manuskriptet presenterer vi en detaljert protokoll av plasma-avledet cfDNA som har blitt brukt til å studere mutasjonsendringer i gliomakreft12. Slike cfDNA-baserte flytende biopsiprotokoll forklart i denne artikkelen kan brukes til å studere mutasjonsendringer i mange andre typer kreftformer. Videre har en nylig studie vist at cfDNA-basert flytende biopsi kan oppdage 50 forskjellige typer kreft36.

Blodprøveinnsamling, lagring og forsendelse er avgjørende trinn i denne protokollen, da ukontrollert temperatur under disse trinnene forårsaker lysis av WBCer, noe som fører til frigjøring av genomisk DNA fra WBC inn i plasmaet og forårsaker forurensning av cfDNA-prøven, noe som påvirker resten av prosedyren37. Hemolyse på grunn av ukontrollert temperatur kan svekke nedstrøms prøveforberedelsesprosesser av cfDNA, for eksempel PCR trinn38. Serumet inneholder en høy andel av germline cfDNA i stedet for plasma, selv om det presenterer en stor bakgrunnsstøy for tumor-assosiert cfDNA39. Derfor, for å isolere tumor-assosiert cfDNA, plasma er en passende prøve39. Blod som trekkes i et antikoagulant som inneholder blodoppsamlingsrør, bør sentrifugeres umiddelbart eller innen opptil to timer, for å skille plasmaet og for å unngå cfDNA-kontaminering. I denne protokollen brukes dedikerte kommersielle cfDNA bevaring blodinnsamlingsrør (se Materialse tabell), som er et alternativ til antikoagulant som inneholder blodinnsamlingsrør. Disse dedikerte blodinnsamlingsrørene bevarer cfDNA og cfRNA, og forhindrer lysis av WBCer i opptil 30 dager ved omgivelsestemperatur, og opptil 8 dager ved 37 °C. Dette forenkler opprettholdelse av riktig temperatur under en blodprøve forsendelse og til plasma og WBC er skilt40.

Det finnes tre typer cfDNA utvinning metoder tilgjengelig: faseisolasjon, silisium-membran basert spin kolonne, og magnetisk perle-basert isolasjon41. Den silisiummembranbaserte spin-kolonnemetoden ga en høy mengde cfDNA med høy integritet sammenlignet med andre cfDNA-ekstraksjonsmetoder42.

Den kvantitative evalueringen av DNA er et grunnleggende krav i flytende biopsi, det er behov for å utvikle en enkel, rimelig og standardisert prosedyre for enkel implementering og bred bruk. Tre vanlige metoder for cfDNA-kvantifisering er spektrofotometriske, fluoriske og qPCR. Den fluorometriske metoden er bevist bedre over de andre metodene om nøyaktighet, kostnad og enkel ledning43.

Integriteten og renheten til cfDNA kan estimeres ved enten agarose elektroforese eller kapillær elektroforese. Agarose elektroforese viser verken følsomhet ved lav konsentrasjon av cfDNA eller har høy oppløsning for å vise nøyaktig fragmentstørrelse av cfDNA. På den annen side har kapillær elektroforese en fordel over agarose elektroforesen ved å overvinne de tilknyttede utfordringene og derfor mye brukt av forskerne for cfDNA fragmentstørrelsesanalyse. I denne protokollen ble fragmentstørrelsesfordelingen av isolert cfDNA estimert ved hjelp av et automatisert kapillærelektroforeseinstrument (se Materials tabell).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Før blodinnsamling er det nødvendig med informert samtykke fra personer som deltar i forskningen og må innhentes. Forskningen beskrevet i dette manuskriptet ble utført i samsvar med Rabin Medical Center, Israel etikk komité (etikk kode: 0039-17-RMC) og Det medisinske fakultet Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Tyskland etikk komité (etikk kode: D 405/14).

1. Blodprøveinnsamling og lagring i cfDNA eller cfRNA konserveringsmiddelrør

  1. Merk bevaringsrørene riktig
  2. Samle ~ 8 ml blod inn i cf-DNA bevaring tube (se Table of Materials), ved hjelp av en blodinnsamling sett og en holder, i henhold til standard institusjonelle protokollen for venipuncture som beskrevet nedenfor.
    MERK: Bruk av et blodprøvesett kan forhindre mulig tilbakestrømning av blodet fra røret.
    1. Juster pasienten etter armen i en nedadgående stilling.
    2. Hold røret oppreist, med hetten vendt oppover, samtidig som rørinnholdet ikke berører hetten eller nålespissen.
    3. Når blodet begynner å strømme inn i røret, slipp turniqueten sakte.
  3. Umiddelbart etter at røret er fylt med blod (maksimal kapasitet: 8,4 ml fullblod), forsiktig inverter røret (vri håndleddet på armen som holder røret med 180° nedover og tilbake) 5 ganger for å stabilisere prøven.
    MERK: Inversjon sikrer at konserveringsmiddelet blandes jevnt med prøven. Men ikke rist innholdet igjen, selv før plasmapreparat. Utilstrekkelig blanding av konserveringsmidler med blodprøven fører til destabilisering av innholdet og dannelsen av mikrokløver eller hemolyse. På dette stadiet kan protokollen fortsette umiddelbart for plasmaseparasjon eller blodfylte rør kan vente i opptil 30 dager ved omgivelsestemperatur (15-25 °C), og opptil 8 dager ved 37 °C.

2. Plasma og buffy pels separasjon og lagring

  1. Sentrifuger det blodfylte konserveringsrøret ved 425 x g i 20 min ved romtemperatur for å skille plasma.
    MERK: Trinn 2.2 og 2.3 skal utføres i et biosikkerhetsskap.
  2. Pipette forsiktig ut det øvre plasmalaget til et friskt rør i 1 ml aliquots, uten å forstyrre de nedre lagene.
  3. Overfør forsiktig neste lag med buffy pels til et friskt rør (laget vises som en ring over RBC pellets), samtidig som du unngår RBC-er i det nedre laget.
  4. Fortsett til trinn 3 med plasma og trinn 4 med buffy pels. Oppbevar om nødvendig det separerte innholdet ved -80 °C.

3. Rensing av sirkulerende cfDNA fra 1 ml plasma

MERK: Dette trinnet utføres med et kommersielt sett (se Materialse tabell). Alle buffere er utstyrt med settet.

  1. Utarbeidelse av buffere og reagenser
    FORSIKTIG: Ikke tilsett sure oppløsninger eller blekemiddel direkte i prøveavfallet. Guanidinsalter som finnes i Lysis buffer, Binding buffer og Wash Buffer-1 kombinert med blekemiddel eller syrer kan produsere svært reaktive forbindelser.
    1. Bindingsbuffer: Bland 300 ml bindingsbufferkonsentrat med 200 ml 100 % isopropanol for å lage 500 ml fungerende bindingsbuffer. Oppbevares ved romtemperatur.
      MERK: Bindingsbuffer gjør det mulig å optimal binding av de sirkulerende nukleinsyrene til silikamembranen. 500 ml bindingsbuffer er tilstrekkelig for behandling av henholdsvis 276, 138, 92, 69 eller 55 prøver av henholdsvis 1, 2, 3, 4 eller 5 ml plasma og er stabil i 1 år ved romtemperatur.
    2. Vask buffer-1: Bland 19 ml vaskebuffer-1 konsentrat med 25 ml 96–100 % etanol for å lage 44 ml arbeidsvaskbuffer-1. Oppbevares ved romtemperatur.
      MERK: Vask Buffer-1 eliminerer kontaminantene som er bundet til silikamembranen. 44 ml arbeidsvaskbuffer-1 er tilstrekkelig til behandling av 73 prøver av 1/2/3/4/5 ml plasma og er stabil i 1 år ved romtemperatur.
    3. Vask Buffer-2: Bland godt 13 ml vaskebuffer-2 konsentrat med 30 ml 96–100 % etanol for å lage 43 ml arbeidsvaskbuffer-2. Oppbevares ved romtemperatur.
      MERK: Vask Buffer-2 eliminerer kontaminantene som er bundet til silikamembranen. 43 ml arbeidsvaskbuffer-2 er tilstrekkelig for behandling av ~56 prøver av 1/2/3/4/5 ml plasma og er stabil i 1 år ved romtemperatur.
    4. Til et rør som inneholder 310 μg lyofilisert bærer RNA, tilsett 1550 μL Elution buffer, for å forberede en bærer RNA løsning på 0,2 μg / μL. Etter grundig oppløsning av bæreren RNA, dele oppløsningen til egnede aliquots, og lagre på -30 °C til -15 °C. Ikke frys-tine disse aliquots mer enn 3 ganger. Legg til den rekonstituerte transportøren RNA oppløst i Elution-bufferen, som vist i tabell S1.
      MERK: Fordi transportøren RNA ikke oppløses direkte i Lysis-bufferen, må den oppløses først i en Elution-buffer og deretter i Lysis Buffer. For det første forbedres silikamembran-nukleinsyrer som binders når det er svært få målmolekyler tilstede i prøven. For det andre reduseres risikoen for RNA-nedbrytning på grunn av tilstedeværelsen av store mengder transportør RNA.
  2. Før du starter isolasjonen, ta kolonnene og prøvene til romtemperatur og juster prøvevolumene til 1 ml med steril fosfatbufret saltvann (PBS), om nødvendig. Forvarm 2 vannbad eller varmeblokker som inneholder henholdsvis 50 ml sentrifugerør og 2 ml oppsamlingsrør til henholdsvis 60 °C og 56 °C.
  3. Til et 50 ml sentrifugerør legger du til 100 μL proteinase K, 1 ml plasma og 0,8 ml Lysis-buffer som inneholder 1,0 μg RNA (tilberedt i trinn 3.1.4). Lukk sentrifugerøret med en hette og bland innholdet ved pulsvirvel i 30 s, samtidig som du sikrer en synlig virvel i røret. Grundig blanding av innholdet er viktig for effektiv lysis.
    MERK: Umiddelbart etter vortexing, fortsett til trinn 3.4, uten forsinkelse.
  4. Inkuber oppløsningen ved 60 °C i 30 min.
  5. Fjern hetten, tilsett 1,8 ml av bindingsbufferen på røret, og bland godt med pulsvirvel i 15–30 s etter at hetten er plassert.
  6. Inkuber den resulterende blandingen i 5 min på is og sett silikamembrankolonnen inn i vakuumapparatet som er koblet til vakuumpumpen. Sett deretter en 20 ml rørforlenger fast i den åpne kolonnen for å hindre prøvelekkasje.
  7. Hell den inkuberte blandingen forsiktig inn i rørforlengeren av kolonnen og slå på vakuumpumpen. Etter at all lysateblandingen er helt ferdig gjennom kolonnene, slår du av vakuumpumpen, slipper trykket til 0 mbar, og fjerner og kast rørforlengeren.
    MERK: Unngå krysskontaminering, rørforlengeren skal kastes forsiktig, for å hindre spredning over tilstøtende kolonner.
  8. Fjern kolonnen fra vakuumapparatet, sett inn i oppsamlingsrøret og sentrifuge på 11.000 x g i 30 s ved romtemperatur, for å fjerne eventuelle rester. Kast gjennomstrømningen.
  9. Tilsett 600 μL vaskebuffer-1 i kolonnen, sentrifuge ved 11 000 x g i 1 min ved romtemperatur, kast gjennomstrømningen.
  10. Tilsett 750 μL vaskebuffer-2 i kolonnen, sentrifuge ved 11 000 x g i 1 min ved romtemperatur, og kast gjennomstrømningen.
  11. Tilsett 750 μL etanol (96–100 %) til kolonnen, sentrifuge på 11.000 x g i 1 min ved romtemperatur og kast gjennomstrømningen.
  12. Sentrifuger kolonnen på 20.000 x g i 3 min, ved å plassere den i et rent 2 ml oppsamlingsrør.
  13. Tørk membrankolonneenheten helt ved å plassere den i et nytt 2 ml oppsamlingsrør med lokket åpent og inkubering ved 56 °C i 10 min.
  14. Plasser kolonnen i et rent 1,5 ml elutionrør. Til midten av kolonnemembranen, påfør 20-150 μL elutionbuffer og inkuber ved romtemperatur i 3 minutter med lokket lukket.
    MERK: Kontroller at Elution-bufferen er likevektet til romtemperatur. Ved bruk av elutionbuffer mindre enn 50 μL, sørg for at den dispenseres forsiktig på midten av membranen. Dette hjelper med fullstendig eliminasjon av det bundne DNA- Elution-volumet er imidlertid ikke løst og kan endres i henhold til nedstrøms programmene. Den gjenopprettede eluate kan være opp til 5 μL og absolutt mindre enn elution volum som brukes på kolonnen.
  15. Sentrifuger den gjenvunnede eluatet i en mikrocentrifuge ved 20.000 x g i 1 min for å elute nukleinsyrene, og oppbevares ved -20 °C.

4. Rensing av genomisk DNA fra buffy pels

MERK: Kommersielt sett som brukes i denne protokollen, er nevnt i Materials tabell. Buffere og reagenser nevnt i protokollen nedenfor, det vil vil at Lysis buffer A, Lysis buffer B, Vaskebuffer X, Vaskebuffer Y, Proteinase Buffer, Elution buffer og Proteinase K er en del av dette kommersielle settet.

  1. Utarbeidelse av buffere og reagenser
    FORSIKTIG: Ikke tilsett sure oppløsninger eller blekemiddel direkte i prøveavfallet. Guanidinsalter som finnes i Lysis buffer B og Vaskebuffer X kombinert med blekemiddel eller syrer, kan produsere svært reaktive forbindelser.
    1. Vaskebuffer Y: Bland godt 12 ml vaskebuffer Y konsentrat med 48 ml etanol (96–100 %) for å få 60 ml arbeidsvaskbuffer Y. Oppbevares ved romtemperatur.
      MERK: 60 ml arbeidsvaskbuffer Y er tilstrekkelig til behandling av 100 buffy coat-prøver og er stabil i 1 år.
    2. Proteinase K: Klargjør Proteinase K-oppløsning ved å oppløse 30 mg lyofilisert proteinase K i 1,35 ml proteinalbuffer.
      MERK: Total arbeidsløsning av Proteinase K er tilstrekkelig for behandling av 52 buffy coat prøver. Proteinase K arbeidsløsning kan oppbevares i minst 6 måneder ved -20 °C.
  2. Trinn før initiering av prosedyren
    1. Likevekt buffy pels til romtemperatur.
    2. Sett varmeblokken eller vannbadet ved 56 °C.
  3. Suspender buffy pels i Lysis buffer A for å få et endelig volum på 200 μL. Tilsett deretter 25 μL proteinase K-oppløsning, og 200 μL Lysis-buffer B. Bland ved vortexing og inkuber ved 70 °C i 10–15 min. Sørg for at prøvene er helt dekket med lysisløsningen.
    MERK: For behandling av utvalg av prøver kan Proteinase K og Lysis buffer A være forhåndsinnsagt 10–15 minutter før prosedyren, men ikke lenger før det, da Proteinase K selvfordøyer i Lysis buffer A uten substrat.
  4. Tilsett 210 μL 96–100 % etanol i blandingen over og virvelen kraftig.
    MERK: Tilsetning av etanol kan danne et stringy bunnsplitt; Dette vil imidlertid ikke påvirke DNA-isolasjonen. Pass på at du laster inn utfellingsmengden også i kolonnen, som vist i følgende trinn.
  5. Legg hele prøven på silikakolonnen som er plassert i et oppsamlingsrør. Sentrifuge i 1 min ved 11 000 x g. Plasser kolonnen i et nytt oppsamlingsrør og kast det forrige røret sammen med gjennomstrømning.
    MERK: Gjenta sentrifugeringstrinnet hvis prøven ikke tegnes helt gjennom matrisen.
  6. Tilsett 500 μL vaskebuffer X, sentrifuge i 1 min ved 11 000 x g, og kast gjennomstrømningen.
  7. Plasser kolonnen i oppsamlingsrøret, tilsett 600 μL vaskebuffer Y på kolonnen, sentrifuge i 1 min ved 11 000 x g, og kast gjennomstrømningen.
  8. Igjen, plasser kolonnen i oppsamlingsrøret, og sentrifuger kolonnen i 1 min ved 20.000 x g for å tørke silikamembranen.
  9. Inkuber kolonnen ved romtemperatur i 1 min, plassert i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, og legg deretter til 100 μL Elution-buffer. Deretter elute DNA ved sentrifuging i 1 min ved 11.000 x g og lagre ved -20 °C.

5. Kvantifisering av cfDNA og genomisk DNA ved bruk av fluorometer

  1. Før du starter protokollen, må du utføre følgende trinn.
    1. Fortynn 2 μL av eluted genomisk DNA (fra trinn 4.9) i 1:10 proporsjoner med ultrapure kjernefritt vann. På grunn av forventede lave konsentrasjoner må du ikke fortynne cfDNA-prøver fra trinn 3.15.
    2. Likevekt av analysen Standard #1 analyse Standard #2 til romtemperatur.
  2. Forbered totalt 6 tynne veggede klare rør med 0,5 ml størrelse.
    MERK: Protokollen som presenteres er for kvantifisering av 2 cfDNA og 2 genomiske DNA-prøver, derfor krever 4 rør for 4 prøver, og denne analysen krever 2 standarder.
  3. Merk lokkene på røret.
    MERK: Merking på siden av røret kan forstyrre avlesningen. I tillegg er analysestandardrørene merket nøye, siden kalibrering av fluorometeret krever at standardene er i riktig rekkefølge.
  4. Fortynn analysereagensen i 1:200 med Analysebufferen for å klargjøre arbeidsløsningen. For 4 prøver og 2 standarder, bruk 6 μL analysereagens pluss 1194 μL analysebuffer for å lage 1200 μL (200 μL i hvert rør) arbeidsløsning.
    MERK: Ikke bruk en glassbeholder, bruk i stedet et rent plastrør. Hvert rør må inneholde ca. 200 μL av det endelige volumet (et analysestandardrør må inneholde 190 μL av arbeidsløsningen, og prøverøret må inneholde 180–199 μL av arbeidsløsningen). Tilstrekkelig arbeidsløsning må være forberedt på å imøtekomme alle analysestandarder og prøver.
  5. I arbeidsanalysestandardrørene legger du til 190 μL arbeidsløsning og 10 μL-analysestandard og blander oppløsningen ved å virvle i 2–3 s. Unngå dannelse av bobler i løsningen.
  6. I prøverørene, tilsett 198 μL arbeidsløsning og 2 μL cfDNA eller genomisk DNA. Bland oppløsningen ved å vortexing i 2-3 s, og hold den inkubert ved romtemperatur i 2 min.
  7. I'Hjem' skjermen på fluorometeret instrument, trykk 'DNA' og velg 'dsDNA Høy følsomhet Analyse', for å vise 'Standarder' skjermen, og trykk deretter 'Ja' på fluorometer 'Standarder' skjermen for å lese standardene.
  8. I prøvekammeret setter du inn analysen Standard #1, lukker lokket og trykker 'Les'. Fjern røret når avlesningen er fullført (ca. 3 s) og gjenta det samme trinnet for Standard #2.
  9. Et eksempelskjermbilde vises etter at kalibreringsprosessen er fullført, og setter deretter inn et prøverør og gjentar trinn '5.8'. "Prøveskjermen" vil da vise en verdi som tilsvarer konsentrasjonen av prøven etter fortynning i prøverøret.
  10. For hvert eksempel gjenta trinn '5.9', til alle eksemplene leses.
  11. Bruk følgende formel til å beregne den faktiske konsentrasjonen av prøven.
    Equation 1
    MERK: Analyseverdiene er i ng/ml og tilsvarer konsentrasjonen etter fortynning i analyserøret. Ligning nevnt i over trinn 5.11, QF verdi er verdien gitt av fluorometerinstrumentet, og x er antall mikroliter av prøve lagt til analyserøret. Enhetene for QF-verdier som genereres av ligningen, ligner på verdien som tilbys av fluorometeret. For eksempel, hvis verdien av fluorometeret er i ng / ml, er enhetene for konsentrasjonen beregnet av ligningen ng / ml.

6. DNA fragment størrelse fordeling av cfDNA av fragment analysator

  1. Trinnet før du starter prosedyren: Likevekt DNA fargestoff konsentrat og DNA gel matrise til romtemperatur i 30 min.
  2. Fremstilling av gelfargeblandingen
    FORSIKTIG: Håndter løsninger med forsiktighet da DMSO er kjent for å lette inntreden av organiske molekyler i vev.
    1. Tine DMSO grundig ved å vortexing DNA fargestoff konsentrat hetteglasset i 10 s. Pipette ut 15 μL av dette konsentratet i et DNA gel matrise hetteglass og oppbevares ved 4 ° C i mørket.
    2. Igjen, vortex det avgrensede hetteglasset i 10 s til blanding av gel og fargestoff visualiseres.
    3. Hell blandingen på et spinnfilter til toppbeholderen.
    4. Microcentrifuge spin filteret på 2240 x g ± 20% i 10 min ved romtemperatur.
    5. Merk den tilberedte gelfargen i røret og kast filteret, i henhold til god laboratoriepraksis. Merk røret og ta opp forberedelsesdatoen.
      MERK: Kast filtratet i henhold til god laboratoriepraksis. Gelfargeblandingen kan brukes til 5 HIGH Sensitivity (HS) DNA-chips. Hvis den ikke brukes i mer enn 1 time, oppbevares ved 4 °C. Lagring i mørket er mulig i opptil 6 uker.
  3. For å laste gelfargeblandingen må du sørge for plasseringen av bunnplaten på chipprimingstasjonen og justere klemmen i laveste posisjon.
    1. Likevekt gelfargeblandingen til romtemperatur i 30 min, mens du overvåker lyseksponeringen.
    2. Ta en ny HS DNA-chip fra en forseglet pose og plasser den på chip priming stasjon, fjern deretter 9,0 μL av gel-fargestoff blanding og dispensere den på bunnen av brikken godt, merket som "G".
      MERK: Trekk opp gelfargeblandingen, unngå partikler som kan samle seg på bunnen av hetteglasset. Mens du dispenserer gelfargeblandingen godt inn i HS DNA-chipen, setter du tuppen av pipetten helt, for å forhindre dannelse av store luftbobler. Videre vil berøring av pipetten på kantene av brønnen gi dårlige resultater.
    3. Plasser stempelet ved 1 ml og lukk chip-grunningsstasjonen. Kontroller låsen på låsen klikk og sett timeren til 60 s, trykk deretter stempelet ned til det holdes av klemmen, og nøyaktig etter 60 s, slipp stempelet med clip-release mekanismen.
    4. Når stempelet trekker seg tilbake minst til 0,3 ml-merket, vent på 5 s, og trekk deretter sakte tilbake til 1 ml-stilling, åpne deretter chipprimingstasjonen og fjern igjen 9,0 μL av gelfargeblandingen og dispenser på bunnen av HS DNA-chipen godt, merket som "G".
  4. For å laste DNA-markøren, dispenser 5 μL av DNA-markøren inn i brønnen, merket med stigesymbolet. Gjenta prosedyren for alle de 11 prøvebrønnene.
  5. For å laste stigen og prøvene, dispenser 1 μL av DNA-stigen i brønnen, merket med stigesymbolet og tilsett deretter 1 μL prøve (brukte brønner) eller 1 μL markør (ubrukte brønner) i alle de 11 prøvebrønnene.
  6. Vortex HS DNA-brikken i 60 s ved 2400 o/min ved å plassere brikken horisontalt i adapteren. Sørg for at bulen som fikser HS DNA-brikken ikke er skadet under vortexing.
  7. For å sette inn HS DNA-brikken i fragmentanalysatorinstrumentet, åpne lokket og kontroller at elektrodekassetten er riktig satt inn, og chipvelgeren er plassert til "dsHigh Sensitivity DNA" i fragmentanalysatorinstrumentet.
  8. Monter HS DNA-chipen forsiktig i beholderen, som bare passer én vei, og mist deretter lokket ved å sørge for at elektrodekassetten passer nøyaktig inn i brønnene til HS DNA-chipen.
  9. Skjermen på skjermbildet for fragmentanalysatorprogramvare indikerer den innsatte HS DNA-brikken og det lukkede lokket, gjennom chipikonet øverst til venstre på skjermen.
  10. For å starte HS DNA-chip run, velg dsDNA High Sensitivity Assay fra 'Assay' -menyen på instrumentskjermen, fyll deretter ut tabellen med eksempelnavn på riktig måte ved å mate informasjon som eksempelnavn og kommentarer og starte brikken som kjøres ved å klikke på 'Start' -knappen øverst til høyre på skjermen.
  11. Elektroderengjøring etter en HS DNA-brikkekjøring: Fjern umiddelbart den brukte HS DNA-brikken, så snart analysen er fullført og kast den i henhold til god laboratoriepraksis. Utfør følgende prosedyre for å sikre at elektrodene er rene, uten rester av rester fra forrige analyse.
    1. Fyll sakte 350 μL av deionisert analyse-grade vann i en av elektrode renere brønner og plasser elektroderenseren i fragmentanalysatorinstrumentet ved å åpne lokket og lukk lokket og vent på ca 10 s.
    2. Fjern elektroderenseren ved å åpne lokket og vent til ytterligere 10 s, til at vannet på elektrodene fordamper før lokket lukkes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Separasjon av plasma
8,5-9 ml blod samlet i cfDNA eller cfRNA konserveringsmiddelrør gir rundt ~ 4 ml plasma i volum. Volumet av plasma atskilt fra blod samlet i EDTA-rør kan variere avhengig av temperaturen. Eksponering av EDTA-rør som inneholder blod ved en temperatur høyere enn 37 °C fører til redusert plasmavolumutbytte44.

Fluoranalyse Resultater
cfDNA konsentrasjon i 1 ml plasma av hver av glioma pasienter #1 og #3 og friske kontroller #H1, #H2, og #H3 var 137 ng, 12,6 ng, 6,52 ng, 2,26 ng, og 2,48 ng, henholdsvis. Hos glioma-pasienten var #2 cfDNA-konsentrasjonen for lav til å bli påvist i et fluorometer. cfDNA konsentrasjon i en kreftpasients 1 ml plasma varierer fra 0,5 til > 1000 ng18, med en gjennomsnittlig verdi på 20 ng. Hos friske personer varierer cfDNA-konsentrasjonen fra en umulig konsentrasjon til 16 ng, med en gjennomsnittlig verdi på 8 ng45. Genomisk DNA isolert fra 200 μL buffy coat (PBMCs) gir rundt 25- 50 μg DNA.

DNA fragment analysator analyse resultater
Ifølge en tidligere studie er cfDNA beriket i 166-bp lange fragmenter, som står for ~ 85% av den totale cfDNA i pasientens plasma. Til sammenligning står 332 bp lange fragmenter for 10%, og 498 bp lange fragmenter står for 5% av cfDNA46. To hovedfaktorer som påvirker cfDNA fragment analysator analyseresultater er genomisk DNA-forurensning fra PBMCer og lav konsentrasjon av cfDNA. Figur 1 viser den forventede cfDNA bioanalyzer grafen av glioma pasient #1, der cfDNA fragmenter er beriket på 166 bp og det er ingen genomisk DNA-forurensning iprøven 21. Figur 2 viser fragmentberikelsesgrafen etter NGS-bibliotekets fremstilling av cfDNA av gliomapasient #1 og fragmentberikelse flyttes fra 166 bp til 291 bp, på grunn av vedlegg av 125 bp indekser og adaptere til den. Figur 3 viser svært liten berikelse av cfDNA fragmenter av glioma pasient #2. Til tross for den lave cfDNA-konsentrasjonen i gliomapasient #2, fører tillegg av NGS-adaptere til cfDNA- og PCR-forsterkningstrinnene til den synlige cfDNA-bibliotektoppen på fragmentberikelsesgrafen Figur 4. Derfor ble biblioteket utarbeidet med hell fra denne lave konsentrasjonen cfDNA-prøven, som vist i figur 4. I figur 5er cfDNA-fragmentene av gliomapasienten #3 vist å toppe nær 166 bp, men genomisk DNA-kontaminering er også tydelig nær 10380 bp referansestigetoppen.

Figure 1
Figur 1: En ideell cfDNA fragment analysator analyse graf av glioma prøve #1 cfDNA. En stor topp ble observert på 166 bp og en mindre topp ble observert på 332 bp. Det var ingen genomisk kontaminering sett i denne prøven, som forekommer nær 10 380 bp øvre markør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: En ideell cfDNA fragment analysator analyse graf av glioma prøve #1 cfDNA bibliotek. Etter ligating 125 bp neste generasjon sekvensering bibliotek adaptere, 166 bp og 332 bp cfDNA fragmenter viste en stor topp på 291 bp og en mindre topp på 457 bp hjalp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: cfDNA fragment analysator analyse graf av glioma prøve #2 cfDNA, viser en svært liten topp på 166 bp. På grunn av den lave konsentrasjonen av cfDNA var topp på 166 bp knapt synlig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: cfDNA fragment analysator analyse graf av cfDNA bibliotek av glioma prøve #2. Etter ligating 125 bp neste generasjon sekvensering bibliotek adaptere og utføre PCR sykluser under biblioteket forberedelse, knapt synlig cfDNA topp på 166 bp eller helt usynlige topper på 332 bp og 498 bp, var tydelig synlig. En stor topp var til stede nær 291 bp og en mindre topp på 457 bp, 623 bp, 789 bp og nær 2500 bp ble observert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: cfDNA fragmentanalysatoranalyse som viser genomisk DNA-kontaminering i gliomprøven #3 cfDNA. En liten topp på 166 bp indikerte tilstedeværelsen av cfDNA og berikelse nær øvre markør (10 380 bp) var genomisk DNA-forurensning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell S1: Volumer av lysisbufferen og transportøren RNA (oppløst i Buffer AVE) som kreves for behandling av 1 ml plasmaprøver. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Innsamlingen av pasientens blod i et rør, forsendelse og lagring er avgjørende første skritt i flytende biopsi. Feil håndtering kan svekke kvaliteten på plasmaet og derfor kan forstyrre resultatene av den flytende biopsien47. Hvis en blodprøve samles inn i et EDTA-blodrør, må plasmaet separeres innen to timer etter blodinnsamling for å unngå lysis av WBCer og frigjøring av genomisk DNA i plasma48. WbCs kan også gjennomgå apoptose i et EDTA-rør hvis det holdes i lengre tid, og de resulterende cfDNA-fragmentene kan forurense originale cfDNA i plasma48. Eksponering av en blodprøve for høy temperatur (> 37 °C) eller overdreven risting av røret før plasmaseparasjon forårsaker hemolyse. Hemoglobinet som følgelig forblir som en kontaminant i plasma påvirker nedstrøms prosessene til cfDNA som under bibliotekpreparat49. Høy temperatur (> 37 °C) påvirker også plasmautbyttet i et EDTA-blodrør. Derfor er rask separasjon av plasma etter innsamlingen i et EDTA-rør50 et betydelig skritt i kvaliteten på metoden. Hvis blod samles inn i kommersiell cfDNA eller cfRNA Preservation Tube, bør konserveringsmiddelkjemikaturet blandes med blodet umiddelbart etter blodoppsamlingen40. Unnlatelse av å blande konserveringsmiddelkjemikamet fører til dannelse av mikroklut i plasmaet. Disse tetter silikamembranene i en kolonne under cfDNA-ekstraksjonsprosessen og senker utbyttet av cfDNA. Moderat risting av blod i røret forårsaker ikke hemolyse; selv om overdreven risting kan forårsake hemolyse selv i disserørene 40. Derfor, under forsendelse eller håndtering av disse rørene, bør overdreven risting unngås. Blodrør anbefales å bli sendt i oppreist stilling.

Nøyaktig kvantifisering og vurdering av cfDNA konsentrasjon per enhet plasma er et viktig skritt i flytende biopsi, siden plasma cfDNA konsentrasjon er direkte forbundet med fysiologiske og patologiske prosesser51. CfDNA-konsentrasjonen er høyere hos pasienter med kreft enn hos friske forsøkspersoner52. Økt cfDNA konsentrasjon i humant blod er ikke spesifikk for kreft; gravide kvinner og pasienter som får transplantasjoner har også en tendens til å ha forhøyede cfDNA konsentrasjoner iblodet 21. Assosiasjoner har også vist seg for betennelse, vevstraumer, diabetes, hjerteinfarkt og sepsis med økt nivå av cfDNA konsentrasjon53. Konsentrasjonen av plasma cfDNA hos tidlige kreftpasienter har en tendens til å være lavere enn hos pasienter med avanserte eller metastatiske svulster. Dette støtter en direkte sammenslutning av cfDNA med ensvulstbyrde 54. CfDNA-konsentrasjonen i blodet varierer betydelig mellom 0,5 og >1000 ng/ml hos kreftpasienter og mellom 0 og 100 ng/ml hos friske forsøkspersoner18. For bibliotekforberedelsen kreves det minst 0,5 ng cfDNA. For å oppnå minimum etterspørselsmengden cfDNA for sekvensering, kan man starte med minst 2 ml av en blodprøve eller 1 ml plasmaprøve. Videre reduserer tekniske feil under plasma-cfDNA-ekstraksjonen også cfDNA-utbyttet, og den resulterende konsentrasjonen, og dermed avviker fra den faktiske plasma-cfDNA-konsentrasjonen. cfDNA nedbrytning kan oppstå på grunn av antikoagulantia i EDTA-rør eller på grunn av prosessen med flere tiing og frysing av plasmaprøver. En dårlig aktivitet av proteinase K under lysisprosessen resulterer også i et lavt utbytte av cfDNA. Proteinase K-aktiviteten minker på grunn av langvarig eksponering for høye temperaturer. Bruken av lavt konsentrasjonsetanol i stedet for 96-100% under cfDNA ekstraksjon vasketrinn forårsaker også et lavt utbytte av cfDNA. Derfor er det viktig å unngå tekniske feil i den flytende biopsiteknikken for å oppnå nøyaktige og pålitelige resultater.

Kvalitativ analyse av cfDNA er et sentralt skritt, der den faktiske fordelingen av DNA-fragmenter som finnes i den ekstraherte cfDNA-prøven er estimert. Kvantitative resultater av cfDNA er pålitelige først etter å ha bekreftet renheten ved kvalitativ analyse. Derfor viser en ideell graf av cfDNA generert i DNA fragment analysator analyse berikelse av den store toppen av cfDNA fragmenter nær 166 bp, og en mindre topp nær 332 bp lengde. Dette indikerer at den ekstraherte cfDNA-prøven ikke er forurenset med genomisk DNA fra WBCer. Hvis et fragment er beriket fra 7000 bp til referansestigen (10,380bp) og utover, indikerer dette forurensning av en cfDNA-prøve med WBC genomisk DNA. Hvis genomisk DNA-kontaminering ses i en cfDNA-prøve etter DNA-fragmentstørrelsesestimeringsanalyse, kan prøven kjøres på 2% agarose gel med en 100 bp stige, og gel kan skåret mellom området ~ 150-200 bp, etterfulgt av en gelekstraksjonsanalyse. En viss mengde cfDNA går tapt under agarose gel størrelse utvelgelsesprosessen. Ngs bibliotek forberedelse trinn krever imidlertid minst 0,5 ng og maksimalt 1000 ng av input DNA materiale for å forberede biblioteker for sekvensering. Derfor, hvis det totale antallet cfDNA er lik eller mer enn 0,5 ng, er det nok mengde for bibliotek forberedelse trinn. Videre passerer slike eksempler bibliotekforberedelsesprosessen vellykket, og det resulterende biblioteket viser en stor topp nær 291 bp og en mindre topp på 457 bp, på grunn av tillegg av 125 bp indekser og adaptere.

NGS-dataanalysen er det siste trinnet i den NGS-baserte flytende biopsiteknikken, og lister over mutasjoner og gengenfusjoner3,55,56,57 genereres i dette trinnet. Mutasjoner og gengenfusjoner som identifiseres kan vurderes i henhold til tidligere studier på kreftmutasjonslandskap58,59, tidligere preget genmutasjoner60 eller gengenfusjoner61,62,63. Disse kan tjene som prognostiske64 ogdiagnostiske 7 biomarkører hos kreftpasienter. For eksempel er R132H-mutasjonen i isocitratedehydrogenase 1 (IDH1) genet et avgjørende tegn på sekundær glioblastomkreft, og skiller det også fra primær glioblastom der denne mutasjonen normalt er fraværende65. Videre er kronisk myelogen leukemi (KML) preget av en BCR / ABL1 genfusjon som følge av en balansert translokasjon mellom kromosom 9 og 2261. BCR/ABL1-genet og dets mRNA- og fusjonsprotein er unike for KML-stamfarer og utgjør derfor et godt mål for terapi66.

Avansert diagnose, riktig iscenesettelse av svulsten og behandlingsovervåking er en gjeldende strategi for effektiv styring av kreft. Inntil nylig har vevbiopsi vært gullstandarden for den histologiske evalueringen av tumorvev. Likevel, etter stor forskning på dette området og bruk av teknologi, har det vist seg at en enkelt biopsi ikke er i stand til å gi hele mutasjonslandskapet til en svulst, og at seriebiopsier vanligvis er upraktiske som skal utføres på grunn av deres invasivitet, spesielt i glioblastom og lymfom, hvor biopsier er svært invasive. I tillegg er ca 16% av nålebiopsier forbundet med prosessuelle komplikasjoner67. Videre krever genomisk profilering av høy kvalitet en tilstrekkelig mengde vev, et krav som vanligvis ikke oppfylles av nålebiopsien68.

De flytende biopsiene, fra en rutinemessig blodprøve ved å analysere tumoravledet DNA, er funnet å erstatte eller supplement til rutinemessige nålevevbiopsiprosedyrer12. Analyse av tumoravledet DNA / cfDNA gjennom plasma ved flytende biopsi er en minimal invasiv og effektiv prosedyre for molekylær profilering av svulster. Det kan i hovedsak tillate behandling overvåking ved seriell prøvetaking over tid uten potensielle risikoer og komplikasjoner vanligvis forbundet med tradisjonelle tumorvev biopsi på grunn av sin invasive natur69. Videre fant studier som sammenligner nålebiopsien med cfDNA-analyse ved flytende biopsi av en enkelt tumorlesjon at cfDNA-profilering kan tilby en full molekylær heterogenitet som en svulst kan skjules av flere forskjellige klonalepopulasjoner 70.

Men selv om plasma cfDNA basert diagnose har mange fordeler over tumorvev biopsi, det er fortsatt noen avgjørende begrensninger som hindrer sin anvendelse i den generelle kliniske praksis. Begrensninger av cfDNA-basert flytende biopsidiagnose inkluderer de høyere kostnadene ved den generelle prosedyren, behov for DNA av høy kvalitet og en dedikert bioinformatiker for nødvendigheten av en stor dataanalyse71. På grunn av datahåndteringsproblem knyttet til cfDNA-analyse, utgjør NGS også problemer i sin umiddelbare anvendelse i klinikken. Utfordringene ved databehandlingen som NGS utgjør skyldes først og fremst vanskeligheten med å skille mellom den indre bakgrunnsstøyen av dyp sekvensering og avvikene som er forbundet medsvulsten 72. Til slutt, på grunn av utilgjengeligheten av de kliniske gyldighets- og nyttedataene for de fleste av væskebiopsianalysene, er de for tiden begrenset bare til kliniske studier og grunnleggende undersøkelser13.

Den fremtidige utviklingen i den flytende biopsiteknikken forventes gjennom kombinert innsats fra grunnleggende forskning innen biologi, fysiologi, molekylærbiologi, analyseteknikker, statistisk analyse for databehandling og maskinlæringsteknologi73,74. I tillegg pågår mange kliniske studier basert på cfDNA biomarkørevaluering, og resultatene vil bidra til å etablere teknikkens gyldighet. Disse kombinerte tiltakene vil forhåpentligvis etablere den flytende biopsiplattformen gjennom cfDNA-analyse som et kraftig prognostisk, diagnostisk og behandlingsovervåkingsverktøy i onkologi klinisk innstilling i løpet av de nestefem årene 70,75.

For å konkludere tilbyr den cfDNA-baserte flytende biopsien en trygg og ikke-invasiv tilnærming for å identifisere genomiske biomarkører som er nyttige i kreftsykdomsbehandling. Men for å oppnå pålitelige og nøyaktige resultater, er standardiserte protokoller for blodinnsamling, plasma / WBC separasjon, cfDNA ekstraksjon og cfDNA kvantitativ og kvalitativ analyse spesielt nødvendig74,75.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke medlemmene av Laboratory of Cancer Genomics and Biocomputing of Complex Diseases for deres ivrige observasjonsinnspill og deres deltakelse i flere diskusjoner på ulike stadier av dette prosjektet. Finansieringsstøtten inkluderer Israel Cancer Association (ICA-stipend for M.F-M 2017-2019) og Kamin-stipend fra Israel Innovation Authority (for M.F-M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, P. J., et al. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).
  2. Liotta, L., Petricoin, E. Molecular profiling of human cancer. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 48-56 (2000).
  3. Balamurali, D., et al. ChiTaRS 5.0: the comprehensive database of chimeric transcripts matched with druggable fusions and 3D chromatin maps. Nucleic Acids Research. 48 (1), 825-834 (2019).
  4. Trédan, O., et al. Molecular screening program to select molecular-based recommended therapies for metastatic cancer patients: Analysis from the ProfiLER trial. Annals of Oncology. 30 (5), 757-765 (2019).
  5. Oliveira, K. C. S., et al. Current perspectives on circulating tumor DNA, precision medicine, and personalized clinical management of cancer. Molecular Cancer Research. 18 (4), 517-528 (2020).
  6. Siegal, T. Clinical impact of molecular biomarkers in gliomas. Journal of Clinical Neuroscience. 22 (3), 437-444 (2015).
  7. Komori, T. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System: The Major Points of Revision. Neurologia medico-chirurgica. 57 (7), 301-311 (2017).
  8. Duffy, M. J., O'Donovan, N., Crown, J. Use of molecular markers for predicting therapy response in cancer patients. Cancer Treatment Reviews. 37 (2), 151-159 (2011).
  9. Saenz-Antoñanzas, A., et al. Liquid Biopsy in Glioblastoma: Opportunities, Applications and Challenges. Cancers. 11 (7), 950 (2019).
  10. Marrugo-Ramírez, J., Mir, M., Samitier, J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopsy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2877 (2018).
  11. Pantel, K., Alix-Panabières, C. Liquid biopsy in 2016: Circulating tumour cells and cell-free DNA in gastrointestinal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 73-74 (2017).
  12. Bronkhorst, A. J., et al. The emerging role of cell-free DNA as a molecular marker for cancer management. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100087 (2019).
  13. Cescon, D. W., Bratman, S. V., Chan, S. M., Siu, L. L. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer. 1 (3), 276-290 (2020).
  14. Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, 175883591879463 (2018).
  15. Cohen, J. D. J., et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 926-930 (2018).
  16. Wan, J. C. M., et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 223-238 (2017).
  17. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nature Reviews Genetics. 20 (2), 71-88 (2018).
  18. Thierry, A. R., et al. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (3), 347-376 (2016).
  19. Buscail, E., et al. High Clinical Value of Liquid Biopsy to Detect Circulating Tumor Cells and Tumor Exosomes in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients Eligible for Up-Front Surgery. Cancers. 11 (11), 1656 (2019).
  20. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry. 61 (1), 112-123 (2015).
  21. Kustanovich, A., Schwartz, R., Peretz, T., Grinshpun, A. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biology and Therapy. 20 (8), 1057-1067 (2019).
  22. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
  23. Celec, P., et al. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, (2018).
  24. Gautschi, O., et al. Origin and prognostic value of circulating KRAS mutations in lung cancer patients. Cancer Letters. 254 (2), 265-273 (2007).
  25. Bidard, F., et al. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. International Journal of Cancer. 134 (5), 1207-1213 (2013).
  26. Chan, K. C. A., et al. Analysis of Plasma Epstein–Barr Virus DNA to Screen for Nasopharyngeal Cancer. New England Journal of Medicine. 377 (6), 513-522 (2017).
  27. Mao, L., et al. Detection of Oncogene Mutations in Sputum Precedes Diagnosis of Lung Cancer. Cancer Research. 54 (7), 1634-1637 (1994).
  28. De Mattos-Arruda, L., et al. Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nature communications. 6 (1), 8839 (2015).
  29. Khier, S., Lohan, L. Kinetics of circulating cell-free DNA for biomedical applications: critical appraisal of the literature. Future science OA. 4 (4), 295 (2018).
  30. Misale, S., et al. Resistance to Anti-EGFR therapy in colorectal cancer: From heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discovery. 4 (11), 1269-1280 (2014).
  31. Beddowes, E., Sammut, S. J., Gao, M., Caldas, C. Predicting treatment resistance and relapse through circulating DNA. Breast. 34, 31-35 (2017).
  32. Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA oncology. 2 (8), 1014-1022 (2016).
  33. Vaidyanathan, R., et al. Cancer diagnosis: from tumor to liquid biopsy and beyond. Lab on a Chip. 19 (1), 11-34 (2019).
  34. Kelly, P. Gliomas: Survival, origin and early detection. Surgical Neurology International. 1 (1), 96 (2010).
  35. Faria, G., Silva, E., Da Fonseca, C., Quirico-Santos, T. Circulating Cell-Free DNA as a Prognostic and Molecular Marker for Patients with Brain Tumors under Perillyl Alcohol-Based Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1610 (2018).
  36. Liu, M. C., et al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Annals of Oncology. 31 (6), 745-759 (2020).
  37. Enko, D., Halwachs-Baumann, G., Kriegshäuser, G. Plasma free DNA: Evaluation of temperature-associated storage effects observed for roche cell-free DNA collection tubes. Biochemia Medica. 29 (1), 153-156 (2019).
  38. Streleckiene, G., et al. Effects of Quantification Methods Isolation Kits, Plasma Biobanking, and Hemolysis on Cell-Free DNA Analysis in Plasma. Biopreservation and Biobanking. 17 (6), 553-561 (2019).
  39. Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
  40. Ward Gahlawat, A., et al. Evaluation of Storage Tubes for Combined Analysis of Circulating Nucleic Acids in Liquid Biopsies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 704 (2019).
  41. Lu, J. L., Liang, Z. Y. Circulating free DNA in the era of precision oncology: Pre- and post-analytical concerns. Chronic Diseases and Translational Medicine. 2 (4), 223-230 (2016).
  42. Iyapparaj, P., et al. Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus sp. MSU3IR against shrimp bacterial pathogens. Aquatic Biosystems. 9 (1), 12 (2013).
  43. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clinica Chimica Acta. 479, 14-19 (2018).
  44. Medina Diaz, I., et al. Performance of Streck cfDNA blood collection tubes for liquid biopsy testing. PLoS One. 11 (11), 0166354 (2016).
  45. Perkins, G., et al. Multi-Purpose Utility of Circulating Plasma DNA Testing in Patients with Advanced Cancers. PLoS One. 7 (11), 47020 (2012).
  46. Mouliere, F., et al. Multi-marker analysis of circulating cell-free DNA toward personalized medicine for colorectal cancer. Molecular Oncology. 8 (5), 927-941 (2014).
  47. Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
  48. Risberg, B., et al. Effects of Collection and Processing Procedures on Plasma Circulating Cell-Free DNA from Cancer Patients. Journal of Molecular Diagnostics. 20 (6), 883-892 (2018).
  49. Markus, H., et al. Evaluation of pre-analytical factors affecting plasma DNA analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7375 (2018).
  50. Chen, Z., et al. Comprehensive Evaluation of the Factors Affecting Plasma Circulating Cell-Free DNA Levels and Their Application in Diagnosing Nonsmall Cell Lung Cancer. Genetic Testing and Molecular Biomarkers. 23 (4), 270-276 (2019).
  51. Schwarzenbach, H., Hoon, D. S. B., Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11 (6), 426-437 (2011).
  52. Malyuchenko, N. V., et al. PARP1 Inhibitors: antitumor drug design. Acta Naturae. 7 (3), 27-37 (2015).
  53. Fleischhacker, M., Schmidt, B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-A survey. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1775 (1), 181-232 (2007).
  54. Jung, K., Fleischhacker, M., Rabien, A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker—A critical appraisal of the literature. Clinica Chimica Acta. 411 (21-22), 1611-1624 (2010).
  55. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS: a database of human, mouse and fruit fly chimeric transcripts and RNA-sequencing data. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 142-151 (2013).
  56. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS 2.1--an improved database of the chimeric transcripts and RNA-seq data with novel sense-antisense chimeric RNA transcripts. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 68-75 (2015).
  57. Gorohovski, A., et al. ChiTaRS-3.1-the enhanced chimeric transcripts and RNA-seq database matched with protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 45 (1), 790-795 (2017).
  58. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Research. 47 (1), 941-947 (2019).
  59. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  60. Szopa, W., Burley, T. A., Kramer-Marek, G., Kaspera, W. Diagnostic and Therapeutic Biomarkers in Glioblastoma: Current Status and Future Perspectives. BioMed Research International. 2017, 1-13 (2017).
  61. Salesse, S., Verfaillie, C. M. BCR/ABL: from molecular mechanisms of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia. Oncogene. 21 (56), 8547-8559 (2002).
  62. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28 (12), 67-74 (2012).
  63. Frenkel-Morgenstern, M., et al. Chimeras taking shape: Potential functions of proteins encoded by chimeric RNA transcripts. Genome Research. 22 (7), 1231-1242 (2012).
  64. Simon, M., et al. TERT promoter mutations: a novel independent prognostic factor in primary glioblastomas. Neuro-Oncology. 17 (1), 45-52 (2015).
  65. Waitkus, M. S., Diplas, B. H., Yan, H. Isocitrate dehydrogenase mutations in gliomas. Neuro-Oncology. 18 (1), 16-26 (2016).
  66. Kindler, T., Meyer, R. G., Fischer, T. BCR-ABL as a target for novel therapeutic interventions. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 6 (1), 85-101 (2002).
  67. Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2013).
  68. Vanderlaan, P. A., et al. Success and failure rates of tumor genotyping techniques in routine pathological samples with non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 84 (1), Amsterdam, Netherlands. 39-44 (2014).
  69. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. 228-229, 169-179 (2018).
  70. Normanno, N., et al. The liquid biopsy in the management of colorectal cancer patients: Current applications and future scenarios. Cancer Treatment Reviews. 70, 1-8 (2018).
  71. Hufnagl, C., et al. Evaluation of circulating cell-free DNA as a molecular monitoring tool in patients with metastatic cancer. Oncology Letters. 19 (2), 1551-1558 (2020).
  72. Petit, J., et al. Cell-Free DNA as a Diagnostic Blood-Based Biomarker for Colorectal Cancer: A Systematic Review. The Journal of Surgical Research. 236, 184-197 (2019).
  73. Poulet, G., Massias, J., Taly, V. Liquid Biopsy: General Concepts. Acta Cytologica. 63 (6), 449-455 (2019).
  74. Alix-Panabières, C. The future of liquid biopsy. Nature. 579 (7800), 9 (2020).
  75. Eisenstein, M. Could liquid biopsies help deliver better treatment. Nature. 579 (7800), 6-8 (2020).

Tags

Kreftforskning utgave 163 flytende biopsi cellefritt DNA presisjonsmedisin gliom kreftdiagnose blodplasma
Påvisning av cellefritt DNA i blodplasmaprøver av kreftpasienter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palande, V., Raviv Shay, D.,… More

Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter