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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61449
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Cancer Genomics and BioComputing of Complex Diseases laboratory, The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2The Data Science Institute, Bar-Ilan University, 3The Dangoor Centre For Personalized Medicine, Bar-Ilan University

Summary

本論文では、非侵襲的な液体生検法の詳細なプロトコルを紹介し、血液採取、血漿およびバフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量、cfDNA断片濃縮分析を含む。

Abstract

がん患者の腫瘍の変異を特定することは、疾患管理において非常に重要なステップです。これらの突然変異は、腫瘍診断のためのバイオマーカーとしてだけでなく、癌患者における治療選択および応答のために役立つ。腫瘍の突然変異を検出するための現在の金標準法は、腫瘍生検による腫瘍DNAの遺伝子検査を伴う。しかし、この侵襲的な方法は、腫瘍突然変異レパートリーのフォローアップ試験として繰り返し行うことは困難である。液体生検は、使いやすく非侵襲的な生検アプローチとして腫瘍突然変異を検出するための新しい新しい技術です。

がん細胞は急速に増殖します。並行して、多数の癌細胞がアポトーシスを受ける。これらの細胞の破片は、腫瘍DNA突然変異を運ぶ無細胞DNA(cfDNA)断片と呼ばれる細かく断片化されたDNA片と共に、患者の循環系に放出される。そこで、液体生検法を用いてcfDNAベースのバイオマーカーを同定するため、血液サンプルを癌患者から採取し、続いて血漿およびバフィーコートを分離する。次に、血漿はcfDNAの単離のために処理され、それぞれのバフィーコートは患者のゲノムDNAの単離のために処理される。その後、両方の核酸サンプルの量と品質がチェックされます。次世代シーケンシング(NGS)技術を用いて変異を解析する。

本稿では、血液採取、血漿、バフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量化、cfDNA断片濃縮分析を含む液体生検の詳細なプロトコルを紹介する。

Introduction

技術の進歩は、何百もの癌ゲノムとトランスクリプトム1のシーケンシングにつながっています。これは、異なる癌タイプ間の分子変化の風景を理解するのに貢献しています 2.これらの景観に関するさらなる研究は、癌または腫瘍の進行に関与する逐次体細胞変化および遺伝子遺伝子融合3 を特徴付け、アポトーシス経路4を連続的に破壊することによって助けた。したがって、体細胞変異および遺伝子融合は、特定の腫瘍タイプ5の個々の患者においてバイオマーカーとして機能し、既存の原発性腫瘍予後6を同定し、分子変化に基づいて二次腫瘍を分類し、薬物性腫瘍標的を同定することにより、腫瘍に関する情報を提供することができる。このような情報は、がん患者に対する個別の治療を選択し、陽性および陰性の治療応答を決定する際に容易にすることができる9.しかし、腫瘍組織のゲノムプロファイリングを同定するための腫瘍物質を得ることは、侵襲的な手順10である。さらに、腫瘍生検は異種腫瘍のごく一部のみを含む。したがって、腫瘍11全体の分子プロファイルを代表するものではなくてもよい。連続モニタリングおよび腫瘍ジェノタイピングは、腫瘍組織の繰り返し収集を必要とするが、これは、通常、腫瘍生検処置の侵襲性およびそのような手順12から生じる安全性の問題のために実現不可能である。

一方、液体生検技術は、過去10年間で精密腫瘍学で大きな注目を集めています13,14.これは主にこの技術の非侵襲性によるものであり、複数の時点で繰り返される可能性があるため、疾患コース15,16に対する使いやすく安全なモニタリング技術が可能となる。液体生検は、腫瘍細胞が急速に増殖し、同時に多くの細胞がアポトーシスと壊死を起こる現象に基づいています。これは、アポトーシス17の間に正確なサイズで切断されるDNA断片と共に、患者の血液中にアポトーシス細胞の破片の放出をもたらす。非癌性細胞のアポトーシスは、その細胞の破片の血液への放出にもつながり、しかし、これらの細胞におけるアポトーシス率は腫瘍細胞18より比較的低い。液体生検技術の合理的な方法は、血液中を連続的に循環するDNA、RNA、タンパク質、および腫瘍細胞14、19などの腫瘍関連分子を捕捉することである。次世代シーケンシング(NGS)、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(ddPCR)、リアルタイムPCR、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)など、これらの分子の分析に種々の技術20を用いることができる。液体バイオプシー技術により、腫瘍細胞の特徴であるバイオマーカーを同定することができます。これらのバイオマーカー分子は、腫瘍の特定の部分から放出されるだけでなく、腫瘍21のすべての部分から放出される。したがって、液体生検で同定されたマーカーは、異種腫瘍全体の分子プロファイリングを表し、体内の他の腫瘍に加えて、組織生検ベースの技術22よりも優れたものを有する。

cfDNAは、数分から1〜2時間23に及ぶ循環血液中の短い半減期時間を有する。しかし、cfDNAの短い半減期は、治療応答と動的腫瘍評価を評価することによってリアルタイム分析を容易にする。腫瘍由来cfDNAレベルは、いくつかの研究によって証明された腫瘍段階/サイズの予後を示し、cfDNAレベルと生存結果24との関係を示した。さらに、cfDNAが既存の腫瘍マーカー25よりも優れた予測能力を有することが研究で証明されている。cfDNAの予後は癌治療後にさらに顕著であり、cfDNAの治療後の高いレベルは生存率の低下と良好に相関し、治療に対する耐性を有する。一方、cfDNA療法の低レベルは、一般的に陽性治療応答に対応する。さらに、cfDNAは従来の検出方法よりも治療応答の早期検出を促進する。

cfDNAは、癌関連突然変異の早期発見の可能性を高める:早期疾患15の間に、症状26 の発症および癌診断前2年27年まで。cfDNAは複数の腫瘍領域または病巣から放出されるので、その分析は、それが28を表す腫瘍ゲノムの包括的なビューを提供する。したがって、cfDNAは、組織サンプル29で見逃された可能性のある体細胞突然変異を検出することを可能にする。腫瘍内不均一性およびクローン下突然変異は、数千の塩基に及ぶゲノム領域の深いシーケンシングによって検出することができるので、cfDNAの分析は、明確なゲノムシグネチャ13を有する特定の分子サブタイプを発見することを可能にする。組織サンプルを通じて同様のレベルの情報を得るためには、多くの固体生検が必要であったであろう。

さらに、手術後の結腸、卵巣、肺癌などの局在性疾患を有する患者におけるcfDNAレベルおよび/または化学療法は、癌再発および治療結果20に対する強力な予後マーカーであることが実証された。さらに、結腸、乳癌、肺癌の患者では、血液からのcfDNAの分析は腫瘍特異的な変化を正常に検出することができ、これは数ヶ月前に再発の正確な予測につながった13。さらに、抗EGFR療法30を受けたCRC患者におけるKRAS突然変異などの治療抵抗マーカー様々な治療法による治療後の乳癌患者におけるPIK3CA、MED1またはEGFRなどの遺伝子のVAF31; EGFR標的TKU32で治療された肺癌患者におけるEGFR T790M耐性変異とEGFR T790M耐性変異もcfDNA分析によって同定することができる。

要約すると、cfDNA分析は、腫瘍学13、33の分野における正確なバイオマーカーを同定するために使用することができる。このプロトコルでは、3人のグリオーマ患者と3人の健康なコントロールの血液サンプルを処理し、血漿からWbCsおよびcfDNAからゲノムDNAを得た。グリオーマ癌において、IDH、TERT、ATRX、EGFR、およびTP53の突然変異は、グリオーマ腫瘍の早期診断に役立つ診断および予後マーカーとして機能し、異なるタイプのグリオーマ腫瘍を分類し、個々の患者に対する正確な治療を導き、治療応答34、35を理解する。 これらの遺伝子の変異状態は、血液由来cfDNAを用いて同定することができる。本稿では、神経膠腫癌12の変異変化を研究するために用いられてきた血漿由来cfDNAの詳細なプロトコルを提示する。この記事で説明されているこのようなcfDNAベースの液体生検プロトコルは、他の多くのタイプの癌の突然変異変化を研究するために使用することができる。さらに、最近の研究では、cfDNAベースの液体生検が50種類の癌36を検出できることを示している。

血液サンプル採取、保存、および出荷は、これらのステップ中の制御されていない温度がWBCのリシスを引き起こし、WBCから血漿中にゲノムDNAが放出され、cfDNAサンプルの汚染を引き起こし、手順37の残りの部分に影響を与えるため、このプロトコルにおいて重要なステップである。制御されていない温度による浸透圧は、PCRステップ38のようなcfDNAの下流サンプル調製プロセスを損なう可能性がある。血清は血漿ではなく生殖細胞系cfDNAの割合が高いが、腫瘍関連cfDNA39には大きなバックグラウンドノイズを示す。従って、腫瘍関連cfDNAを単離するためには、血漿は、適当な試料39である。採血管を含む抗凝固剤に採取された血液は、血漿を分離し、cfDNA汚染を避けるために、直ちにまたは最大2時間以内に遠心分離する必要があります。このプロトコルでは、専用の市販のcfDNA保存血液採取管(材料表を参照)が使用されており、これは採血管を含む抗凝固剤の代替である。これらの専用の採血管はcfDNAおよびcfRNAを維持し、周囲温度で30日まで、そして37°Cで8日間まで、Wbcのリシスを防ぐ。 これは、血液サンプルの出荷中および血漿とWBCが分離されるまで適切な温度を維持することを容易にする40.

現在利用可能なcfDNA抽出方法論には、位相分離、シリコン膜ベースのスピンカラム、磁気ビーズベースの絶縁41の3種類があります。シリコン膜ベースのスピンカラム法は、他のcfDNA抽出方法42と比較して、高い完全性を有する高い量のcfDNAを生み出した。

DNAの定量的評価は液体生検における基本的な要件であり、その容易な実施および広い使用のための簡単で、現実的で、標準化された手順を開発する必要性がある。cfDNA定量に一般的に使用される3つの方法は、分光光度測定、蛍光測定法、およびqPCRです。この蛍光測定法は、精度、コスト、および伝導の容易さ43に関する他の方法よりも優れている。

cfDNAの完全性および純度はアガロース電気泳動か毛細管電気泳動によって推定することができる。アガロース電気泳動は、cfDNAの低濃度で感度を示すことも、cfDNAの正確なフラグメントサイズを示す高分解能も示していません。一方、毛細管電気泳動は、関連する課題を克服することでアガロース電気泳動よりも優位性があり、したがってcfDNAフラグメントサイズ分析のために研究者によって広く使用されています。このプロトコルでは、分離されたcfDNAのフラグメントサイズ分布を、自動キャピラリー電気泳動器を用いて推定した( 材料表を参照)。

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Protocol

採血前に、研究に参加する被験者からのインフォームド・コンセントが必要であり、取得する必要があります。この原稿に記載されている研究は、ラビン医療センター、イスラエル倫理委員会(倫理規範:0039-17-RMC)、医学部Derクリスチャン・アルブレヒト・ズ・キール、ドイツ倫理委員会(倫理コード:D 405/14)に従って行われました。

1. cfDNAまたはcfRNA保存チューブ内の血液サンプルの採取と保存

  1. 保存チューブに適切なラベルを付ける
  2. 以下に記載される静脈穿刺の標準的な制度議定書に従って、採取セットとホルダーを用いて、cf-DNA保存チューブ( 材料表を参照)に約8mLの血液を採取する。
    注:採血セットを使用すると、チューブからの血液の逆流を防ぐことができます。
    1. 患者を下向きの位置に腕に合わせます。
    2. チューブの内容物がキャップや針先に触れないようにしながら、キャップを上向きにしてチューブを直立に保持します。
    3. 血液がチューブに流れ始めると、止血帯をゆっくりと放出します。
  3. チューブが血液で満たされた直後(最大容量:全血の8.4 mL)、チューブを穏やかに反転(チューブを180°下方と背中で保持している腕の手首を回す)を5回してサンプルを安定させます。
    注意: 反転は、防腐剤がサンプルと均一に混合されることを保証します。しかし、プラズマ調製前であっても内容物を振り返らないでください。血液サンプルと保存料の混合が不十分なため、内容物の不安定化や、マイクロ凝血や血分解の形成が行なわれ、この段階では、血漿分離または血液充填チューブのためにプロトコルを直ちに継続することができ、周囲温度(15〜25°C)で最大30日間、37°Cで最大8日間待つことができます。

2.プラズマとバフィーコートの分離と保管

  1. 血液充填保存チューブを425 x g で室温で20分間遠心分離し、血漿を分離する。
    注: ステップ 2.2 および 2.3 は、バイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。
  2. 下層を邪魔することなく、上のプラズマ層を1mLアリコートで新鮮なチューブに慎重にピペットアウトします。
  3. 下層のRBCsを避けながら、次のバフィーコートを新鮮なチューブ(その層はRBCペレットの上にリングとして表示されます)に慎重に移します。
  4. プラズマでステップ3に進み、バフィーコートでステップ4に進みます。必要に応じて、分離した内容物を-80°Cに保存してください。

3. 血漿1 mLからの循環cfDNAの精製

注: この手順は、商用キットで実行されます(「 一覧」を参照)。すべてのバッファーは、キットに付属しています。

  1. バッファーおよび試薬の調製
    注意: 酸性溶液や漂白剤を直接サンプル調製廃棄物に添加しないでください。ライシスバッファーに存在するグアニジン塩、結合バッファー、および洗浄バッファー-1漂白剤または酸と組み合わせると、反応性の高い化合物を生成できます。
    1. 結合バッファー: 300 mL の結合バッファー濃縮液を 200 mL の 100% イソプロパノールと混合し、500 mL の作業結合バッファーを作ります。室温で保管してください。
      注:結合バッファーは、シリカ膜への循環核酸の最適な結合を可能にします。結合緩衝液の500mLは、それぞれ1、2、3、4または5mLのプラズマの276、138、92、69または55サンプルを処理するのに十分であり、室温で1年間安定している。
    2. 洗浄バッファー-1:洗浄バッファー-1濃縮物の19 mLを96~100%エタノールの25 mLと混合し、44 mLの作業ウォッシュバッファ-1を作ります。室温で保管してください。
      注意:洗浄緩衝液-1はシリカ膜に結合された汚染物を除去する。44 mLの作業洗浄バッファー-1は、プラズマの1/2/3/4/5 mLの73サンプルを処理するのに十分であり、室温で1年間安定しています。
    3. 洗浄バッファー-2:96-100%エタノールの30 mLと13 mL洗浄バッファ-2濃縮をよく混ぜ、43 mLの作業ウォッシュバッファ-2を作ります。室温で保管してください。
      注:洗浄緩衝液-2は、シリカ膜に結合された汚染物質を除去する。43 mLの作業洗浄バッファー-2は、プラズマの1/2/3/4/5 mLの〜56サンプルを処理するのに十分であり、室温で1年間安定しています。
    4. 310 μgの凍結乾燥キャリアRNAを含むチューブに、1,550 μLの溶出バッファーを加え、0.2 μg/μLのキャリアRNA溶液を調製します。RNAを十分に溶解した後、溶液を適切なアリコートに分割し、–30°C~-15°Cで保存します。 これらのアリコートを3回以上凍結融解しないでください。Lysisバッファーに、 表S1に示すように、溶出バッファーに溶解した再構成されたキャリアRNAを加える。
      注: キャリアRNAはリシスバッファーに直接溶解しないため、最初に溶出バッファーに溶解し、次に溶解バッファーに溶解する必要があります。まず、試料中に存在する標的分子が非常に少ない場合にシリカ膜核酸結合が強化される。第二に、大量のキャリアRNAが存在するため、RNA分解のリスクが低減されます。
  2. 分離を開始する前に、カラムとサンプルを室温にし、必要に応じて無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でサンプル量を1mLに調整します。50 mL遠心分離管と2 mLの回収チューブを含む2つの水浴または加熱ブロックを60°Cおよび56°Cに予熱する。
  3. 50 mL遠心分離チューブに、100 μLのプロテイナーゼ K、1 mLプラズマ、および1.0 μgのキャリアRNAを含むリシスバッファーの0.8 mLを加えます(ステップ3.1.4で作成)。キャップで遠心管を閉じ、30 sのパルス渦によって内容物を混合し、チューブ内の可視渦を確保します。内容物を完全に混合することは、効率的なリシスにとって重要である。
    注: ボルテックスの直後に、遅滞なくステップ 3.4 に進みます。
  4. 60°Cで30分間インキュベートします。
  5. キャップを取り外し、1.8 mLの結合バッファーをチューブに加え、キャップを配置した後、15~30 sのパルス渦と十分に混ぜます。
  6. 得られた混合物を氷上で5分間インキュベートし、真空ポンプに接続された真空装置にシリカ膜カラムを挿入します。その後、20 mLチューブエクステンダーを開いたカラムにしっかりと挿入し、サンプル漏れを防ぎます。
  7. インキュベートした混合物をカラムのチューブエクステンダーに慎重に注ぎ、真空ポンプのスイッチを入れます。すべてのライセート混合物が完全に列を通って実行された後、真空ポンプをオフにし、0 mbarに圧力を解放し、チューブエクステンダーを取り外して廃棄します。
    注:クロスコンタミネーションを避けるために、チューブエクステンダーは、隣接する列に広がるのを防ぐために、慎重に廃棄する必要があります。
  8. 真空装置からカラムを取り出し、回収管に挿入し、室温で30sの11,000xgで遠心分離機を入れ、残留糖を除去する。 フロースルーを破棄します。
  9. 600 μL のウォッシュバッファ-1 をカラムに加え、遠心分離機を 11,000 x g で室温で 1 分間 1 分間、フロースルーを廃棄します。
  10. 750 μL のウォッシュバッファ-2をカラムに加え、遠心分離機を 11,000 x g で室温で 1 分間 1 分間加え、フロースルーを廃棄します。
  11. エタノールを750 μL加える(96~100%)列に、遠心分離機11,000 x g で室温で1分間、流量を捨てます。
  12. 20,000 x g で 3 分間遠心し、清潔な 2 mL の回収管に入れる。
  13. 膜柱アセンブリを蓋を開けた状態で新しい2 mLコレクションチューブに入れ、56°Cで10分間インキュベートして完全に乾燥させます。
  14. カラムを清潔な1.5 mL溶出管に入れる。柱膜の中央に溶出バッファーの 20 - 150 μL を塗布し、蓋を閉じた状態で 3 分間室温でインキュベートします。
    メモ:溶出バッファが室温に均衡していることを確認します。溶出バッファーを 50 μL 未満に使用する場合は、膜の中央に慎重に分配されるようにしてください。これは結合DNAの完全な溶出に役立つ。ただし、溶出量は固定されておらず、下流のアプリケーションに従って変更できます。回収された溶出物は5μLまでであり、確かにカラムに適用される溶出量より少ない。
  15. 20,000xgのマイクロ遠心分離機で回収された溶出物を1分間遠心分離し、核酸を溶出し、−20°Cで貯蔵する。

4. バフィーコートからのゲノムDNAの精製

注: このプロトコルで使用される商用キットは、 資料一覧に記載されています。下記のプロトコルに記載されている緩衝液および試薬すなわち、溶解緩衝液A、溶解緩衝液B、洗浄緩衝液X、洗浄緩衝液Y、プロテイナーゼバッファー、溶出バッファー、およびプロテイナーゼKは、この市販キットの一部である。

  1. バッファーおよび試薬の調製
    注意: 酸性溶液や漂白剤を直接サンプル調製廃棄物に添加しないでください。ライシス緩衝液BおよびウォッシュバッファーXに存在するグアニジン塩は、漂白剤または酸と組み合わせると、反応性の高い化合物を生成することができる。
    1. 洗浄バッファー Y: 洗浄バッファー Y 濃縮物 12 mL と 48 mL エタノール (96 -100%)60 mLの作業ウォッシュバッファYを室温で保存します。
      注:60 mLの作業ウォッシュバッファYは、100バフィーコートサンプルを処理するのに十分であり、1年間安定しています。
    2. プロテイナーゼ K: 30 mg の凍結乾燥プロテナーゼ K を 1.35 mL のプロテナーゼ バッファーに溶解することにより、プロテナーゼ K 溶液を調製します。
      注:プロテナーゼKのトータルワーキングソリューションは、52のバフィーコートサンプルを処理するのに十分です。プロテイナーゼK働く溶液は、−20°Cで少なくとも6ヶ月間保存することができる。
  2. 手順の開始前の手順
    1. バフィーコートを室温に平衡にします。
    2. ヒートブロックまたは水浴を56°Cに設定します。
  3. LysisバッファーAにバフィーコートをサスペンドして、最終容積200μLを得る。その後、25 μLのプロテイナーゼ K溶液を加え、200 μL のリシスバッファー B を混合してボルテックスを使用し、70 °Cでインキュベートして 10 ~ 15 分間インキュベートします。サンプルが溶解溶液で完全に覆われていることを確認します。
    注:一連のサンプルを処理するために、プロテイナーゼKおよびリシスバッファーAは、処置の10〜15分前に予め混合することができるが、それ以前には、基質のないリシスバッファーAのタンパク質酵素K自己消化として、もはやそれ以前ではない。
  4. 上記の混合物と渦に96~100%のエタノールを210μL加え、渦を激しく加えます。
    注:エタノールの添加は、糸状沈殿物を形成することができます。ただし、これは DNA の分離には影響しません。次の手順に示すように、必ずカラムにも沈殿物をロードしてください。
  5. サンプル全体をコレクションチューブに入れたシリカカラムに積み込みます。11,000 x gで1分間の遠心分離機。新しいコレクション チューブに列を配置し、フロースルーと共に前のチューブを破棄します。
    注: サンプルがマトリックスを通して完全に描画されない場合は、遠心分離手順を繰り返します。
  6. 500 μLのウォッシュバッファXを加え、遠心分離機を11,000 x g で1分間加え、流量を廃棄します。
  7. カラムを回収管に入れ、600 μL のウォッシュバッファ Y を柱に加え、遠心分離機を 11,000 x g で 1 分間追加し、フロースルーを破棄します。
  8. 再度、カラムを回収管に入れ、柱を20,000 x g で1分間遠心してシリカ膜を乾燥させます。
  9. カラムを室温で1分間インキュベートし、1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、100 μLの溶出バッファーを加えます。その後、11,000xgで1分間遠心してDNAを溶出し、-20°Cで保存します。

5. フルオロメーターを用いたcfDNAとゲノムDNAの定量化

  1. プロトコルを開始する前に、次の手順を実行します。
    1. 2 μLの溶出したゲノムDNA(ステップ4.9から)を、超純ヌクレアーゼを含まない水で1:10の割合で希釈します。期待される低濃度のため、ステップ3.15からcfDNAサンプルを希釈しないでください。
    2. アッセイスタンダード#1とアッセイスタンダード#2を室温に平衡化します。
  2. 0.5 mLサイズの6つの薄壁のクリアチューブを合計で準備してください。
    注:提示されるプロトコルは、2 cfDNAおよび2ゲノムDNAサンプルを定量化するため、したがって、4つのサンプルのための4つのチューブを、このアッセイは2つの標準を必要とします。
  3. チューブの蓋にラベルを付けます。
    注: チューブの側面にラベルを付け、読み取りが妨げられる可能性があります。さらに、測定標準管は、フルオロメーターのキャリブレーションは、標準が正しい順序であることを必要とするので、慎重に標識されています。
  4. アッセイバッファーでアッセイ試薬を1:200に希釈し、作動溶液を調製します。4サンプルと2規格では、6 μLのアッセイ試薬と1,194 μLのアッセイバッファーを使用して、1,200 μL(各チューブ内200 μL)の作動溶液を作ります。
    注:ガラス容器を使用せず、代わりにきれいなプラスチックチューブを使用してください。各チューブには、最終容積の約200 μLが含まれている必要があります(アッセイ標準チューブは、190 μLの作業用溶液を含み、サンプルチューブには180~199 μLの作業用溶液が含まれている必要があります)。すべてのアッセイの標準およびサンプルに対応するために十分な作業ソリューションを準備する必要があります。
  5. 動作アッセイ標準チューブでは、190 μLの作業ソリューションと10 μLアッセイ標準を追加し、2~3秒のボルテックスで溶液を混合します。溶液内の気泡の形成を避けてください。
  6. サンプルチューブに198 μLの働き溶液と2 μLのcfDNAまたはゲノムDNAを加えます。2~3 sのボルテックスで溶液を混合し、室温で2分間インキュベートします。
  7. フルオロメーター計の 'ホーム' 画面で'DNA' を押して 'dsDNA 高感度アッセイ' を選択して '標準' 画面を表示し、 蛍光計の '標準' 画面で 'はい' を押して標準を読みます。
  8. サンプルチャンバーに、アッセイ標準#1チューブを挿入し、蓋を閉じて'読み取り'を押します。読み取りが完了したらチューブを取り外し(約3 s)、標準#2でも同じ手順を繰り返します。
  9. キャリブレーションプロセスが完了した後にサンプル画面が表示され、サンプルチューブを挿入して、ステップ「5.8」を繰り返します。「サンプルスクリーン」は、次いで、サンプル管内の希釈後のサンプルの濃度に対応する値を表示する。
  10. 各サンプルについて、すべてのサンプルが読み取られるまで、ステップ '5.9' を繰り返します。
  11. 次の式を使用して、サンプルの実際の濃度を計算します。
    Equation 1
    注:アッセイ値はng/mLで、アッセイチューブ内の希釈後の濃度に対応しています。上記ステップ5.11で述べた式は、QF値は、フルオロメーター計によって与えられる値であり 、x はアッセイ管に添加されたサンプルのマイクロリットル数である。式によって生成される QF 値の単位は、フルオメーターによって提供される値と似ています。たとえば、フルオメーターの値が ng/mL の場合、式で計算される濃度の単位は ng/mL になります。

6. フラグメント分析装置によるcfDNAのDNAフラグメントサイズ分布

  1. 手順を開始する前のステップ:DNA色素濃縮物とDNAゲルマトリックスを室温に30分間平衡化します。
  2. ゲル色素混合の調製
    注意: DMSO は有機分子の組織への侵入を促進することが知られているため、慎重にソリューションを処理します。
    1. DNA染料濃縮バイアルを10sにボルテックスすることによりDMSOを徹底的に解凍する。この濃縮物の15μLをDNAゲルマトリックスバイアルに出し、暗闇の中で4°Cで保存します。
    2. 再度、ゲルと染料の混合が可視化されるまで、10sのキャップバイアルを渦を出す。
    3. スピンフィルターのミックスを上部レセプタクルに注ぎます。
    4. 2,240 x g のスピンフィルターを室温で 10 分間 20% ±マイクロ遠心分離します。
    5. 調製したゲル染料をチューブにラベル付けし、良好な実験室の慣行に従ってフィルターを廃棄します。チューブにラベルを付け、準備日を記録します。
      注:良い実験室の慣行に従って濾液を捨てます。ゲル色素混合は、5高感度(HS)DNAチップに使用できます。1時間以上使用しない場合は、4°Cで保存してください。 暗闇の中での貯蔵は6週間まで可能である。
  3. ゲル染めミックスをロードするには、チッププライミングステーションのベースプレートの位置を確認し、最も低い位置でクリップを調整します。
    1. 光の露出を監視しながら、ゲル染料ミックスを室温まで30分間平衡化します。
    2. 密封された袋から新しいHS DNAチップを取り出し、チッププライミングステーションに置き、ゲル染めミックスの9.0 μLを取り除き、チップの底部で「G」とマークして分配します。
      注:バイアルの底部に蓄積する可能性のある粒子を避け、ゲル染めミックスを描きます。ゲル色素をHS DNAチップによく分配しながら、ピペットの先端を完全に挿入し、大きな気泡の形成を防ぎます。また、ウェルの端にあるピペットに触れると、悪い結果が生じます。
    3. プランジャを1 mLに位置付け、チッププライミングステーションを閉じます。ラッチがクリックされ、タイマーが60sに設定されていることを確認し、その後、プランジャーをクリップが保持するまで押し下げ、60sの直後に、クリップリリース機構でプランジャーを解放します。
    4. プランジャーが少なくとも0.3 mLのマークまで後退したら、5秒待ってからゆっくりと1mL位置に引き戻し、チッププライミングステーションを開き、再び「G」とマークされたHS DNAチップの底にあるゲル染料ミックスとディスペンスの9.0 μLを取り除きます。
  4. DNAマーカーをロードするには、DNAマーカーの5μLを、はしごシンボルでマークしてウェルに分配します。11 個のサンプルウェルすべてに対して手順を繰り返します。
  5. はしごとサンプルをロードするには、DNAラダーの1μLをウェルに分配し、ラダーシンボルでマークし、11個のサンプルウェルすべてに1μLのサンプル(使用井戸)または1μLのマーカー(未使用の井戸)を加えます。
  6. アダプターにチップを水平に配置することにより、HS DNAチップを2,400rpmで60sにボルテックスする。HS DNAチップを固定するバルジがボルテックス中に損傷していないことを確認します。
  7. HS DNAチップをフラグメントアナライザ装置に挿入するには、蓋を開けて電極カートリッジが正しく挿入され、チップセレクタがフラグメントアナライザ機器の'dsHigh感度DNA'に配置されていることを確認します。
  8. 一方通行に収まるレセプタクルにHS DNAチップを慎重に取り付け、電極カートリッジがHS DNAチップの井戸に正確に収まることを確認して蓋を失います。
  9. フラグメントアナライザソフトウェア画面の表示は、挿入されたHS DNAチップと閉じた蓋を、画面左上のチップアイコンを通して示しています。
  10. HS DNAチップの実行を開始するには、計測器画面のアッセイメニューからdsDNA高感度アッセイを選択し、サンプル名やコメントなどの情報を供給してサンプル名のテーブルを適切に入力し、画面右上の「Start」 ボタンをクリックしてチップの実行を開始します。
  11. HS DNAチップの実行後の電極洗浄:すぐにアッセイが完了したら、使用されているHS DNAチップを取り外し、良好な実験室の慣行に従って処分します。前のアッセイの残渣を含まずに、電極がクリーンであることを確認するために、次の手順を実行します。
    1. 350 μLの脱イオン分析グレードの水を電極クリーナーウェルの1つにゆっくりと充填し、蓋を開けて蓋を閉めて約10秒待ちます。
    2. 蓋を開けて電極クリーナーを取り外し、蓋を閉じる前に電極上の水が蒸発するまで10s待ちます。

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Representative Results

プラズマ分離
cfDNAまたはcfRNA保存チューブで採取された8.5〜9 mLの血液は、体積の約〜4 mLの血漿を得る。EDTAチューブに採取された血液から分離された血漿の体積は、温度によって異なる場合があります。37°Cより高い温度で血液を含むEDTAチューブの暴露は、血漿体積収率44の低下をもたらす。

フルオロメーターアッセイ結果
各グリオーマ患者の1mL血漿中のcfDNA濃度は、#1および#3および健康なコントロール#H1、#H2、および#H3それぞれ137ng、12.6 ng、6.52 ng、2.26ng、および2.48ngであった。しかし、グリオーマ患者ではcfDNA濃度が低すぎてフルオロメーターで検出できない#2。癌患者の1mL血漿中のcfDNA濃度は、0.5から>1000 ng18の範囲で、平均値は20ngである。健康な人では、cfDNA濃度は検出不能濃度から16 ngまで及び、平均値は8 ng45である。200 μL のバフィーコート(PBMCs)から分離したゲノム DNA は、約 25 ~ 50 μg の DNA を得る。

DNAフラグメント分析アッセイ結果
以前の研究によると、cfDNAは166-bpの長い断片で濃縮され、患者の血漿中の全cfDNAの約85%を占める。対照的に、332-bpの長い断片は10%を占め、498 bpの長い断片はcfDNA46の5%を占める。cfDNAフラグメント分析アッセイの結果に影響を与える2つの主な要因は、PBMCsからのゲノムDNA汚染とcfDNAの低濃度である。 図1 は、166bpでcfDNA断片が濃縮され、試料21にゲノムDNA汚染がないグリオーマ #1患者の期待されるcfDNAバイオアナビナのグラフを示す。 図2 は、125bpのインデックスおよびアダプタの付着に起因して、グリオーマ患者#1およびフラグメント濃縮のcfDNA調製後のNGSライブラリー調製後のフラグメント濃縮グラフを示す。 図3 は、#2グリオーマ患者のcfDNA断片の非常にわずかな濃縮を示す。グリオーマ患者#2のcfDNA濃度が低いにもかかわらず、NGSアダプタをcfDNAおよびPCR増幅ステップに添加すると、フラグメント濃縮グラフ上の可視cfDNAライブラリピークがフラグメント濃縮グラフ 図4に生じる。したがって、 図4に示すように、ライブラリはこの低濃度cfDNAサンプルから正常に準備された。 図5では、#3のグリオーマ患者のcfDNA断片が166bp付近でピークに達することが示されているが、ゲノムDNA汚染も10380bp参照ラダーピーク付近で明らかになっている。

Figure 1
図1:グリオーマ試料#1 cfDNAの理想的なcfDNAフラグメント分析アッセイグラフ。主要なピークは166 bpで観察され、より小さいピークは332 bpで観察された。このサンプルにはゲノム汚染は見られなかったが、これは10,380 bp上部マーカーの近くで起こる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:グリオーマ試料#1 cfDNAライブラリーの理想的なcfDNAフラグメント分析アッセイグラフ。125 bp次世代シーケンシングライブラリアダプタを連結した後、166 bpおよび332 bp cfDNAフラグメントは、それぞれ291bpで主要なピークを示し、457 bpで小さいピークを示した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:cfDNAフラグメント分析装置のグリオーマ試料#2 cfDNAのアッセイグラフは、166bpで極めて小さなピークを示す。cfDNAの濃度が低いため、166bpのピークはほとんど見えませんでした。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:グリオーマ試料#2のcfDNAライブラリーのcfDNAフラグメント分析アッセイグラフ。125 bp次世代シーケンシングライブラリアダプタを連結し、ライブラリの準備中にPCRサイクルを実行した後、332 bpおよび498 bpで166bpまたは完全に見えないピークでほとんど目に見えないcfDNAピークがはっきりと見えました。主要なピークは291bp近く存在し、457bpで小さいピーク、623bp、789bpおよび2,500bp付近が観測された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:cfDNAサンプル#3のグリオーマ試料におけるゲノムDNA汚染を示すcfDNAフラグメント分析アッセイ。 166bpの小さなピークは、cfDNAの存在を示し、上部マーカー付近の濃縮(10,380 bp)はゲノムDNA汚染であった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表S1:1mLの血漿サンプルを処理するために必要な溶解バッファーおよびキャリアRNA(バッファAVEに溶解)の体積。こちらの表をダウンロードしてください。

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Discussion

チューブ内の患者の血液の収集、出荷および貯蔵は液体生検の重要な初期ステップである。不適切な取り扱いは、プラズマの品質を損なう可能性があり、したがって、液体生検47の結果を妨げる可能性がある。血液サンプルがEDTA血液管に採取された場合、血漿は、BPCのリシスおよび血漿48へのそのゲノムDNAの放出を避けるために、採血の2時間以内に分離されなければならない。BBCはまた、長期間保持すればEDTAチューブ内でアポトーシスを受けることができ、そして得られたcfDNA断片は、血漿48中の元のcfDNAを汚染する可能性がある。血漿分離前に、血液試料を高温(>37°C)に曝露したり、チューブが過度に揺れたりすると、血球の分離が起こって血化が起き、血中分解を引き起こす。結果として血漿中の汚染物質として残存するヘモグロビンは、ライブラリー調製49の間のようなcfDNAの下流プロセスに影響を及ぼす。高温(>37°C)はまた、EDTAの血液管の血漿の収量に影響を与える。従って、EDTAチューブ50 内でのその収集後のプラズマの迅速な分離は、この方法の品質管理における重要なステップである。市販のcfDNAまたはcfRNA保存チューブに血液が採取される場合、保存剤は採血40の直後に血液と混合されるべきである。保存剤を適切に混合しないと、プラズマ中にマイクロクロットが形成されます。これらは、cfDNA抽出プロセス中にカラム内のシリカ膜を詰まらせ、cfDNAの収率を低下させます。チューブ内の血液の適度な揺れは、血化を引き起こさない;過度の揺れは、これらのチューブ40でも、浸透を引き起こす可能性がある。したがって、これらのチューブの発送または取扱いの間に、過度の揺れを避けるべきである。血液管は直立した位置に出荷することをお勧めします。

血漿中の単位血漿あたりのcfDNA濃度の正確な定量および評価は、血漿cfDNA濃度が生理学的および病理学的プロセス51に直接関連しているので、液体生検において重要なステップである。cfDNA濃度は、健康な被験者52よりも癌患者において高い。ヒト血液中のcfDNA濃度の上昇は癌に特異的ではない。妊婦や移植を受けた患者も血液中のcfDNA濃度が上昇する傾向がある21.関連はまた、炎症、組織外傷、糖尿病、心筋梗塞、およびcfDNA濃度53の増加レベルを有する敗血症に関して示されている。初期の癌患者における血漿cfDNAの濃度は、進行した腫瘍または転移性腫瘍を有する患者よりも低くなる傾向がある。これは、cfDNAと腫瘍の負担54との直接の関連付けをサポートします。血液中のcfDNA濃度は、癌患者では0.5~1000ng/mL、健常者では0~100ng/mLの間で有意に範囲が大きく変化する18。ライブラリの準備のために、最低でも cfDNA の 0.5 ng が必要です。シーケンシングのためのcfDNAの最小需要量を達成するために、1つは血液サンプルまたは1 mL血漿サンプルの最低2 mLから始めることができる。さらに、血漿cfDNA抽出中の技術的な誤りはまた、cfDNA収率を低下させ、そして得られた濃度を、それによって実際の血漿cfDNA濃度から逸脱する。cfDNA分解は、EDTAチューブ内の抗凝固剤またはプラズマサンプルの複数の解凍および凍結のプロセスのために発生する可能性があります。リシスプロセス中にプロテナーゼKの活性が悪い場合も、cfDNAの低収率をもたらす。プロテイナーゼK活性は高温への長期暴露のために減少する。cfDNA抽出洗浄工程中に96-100%の代わりに低濃度エタノールを使用すると、cfDNAの低収率も生じる。したがって、液体生検技術における技術的な誤りを避けることは、正確で信頼性の高い結果を達成するために重要である。

cfDNAの定性的分析は、抽出されたcfDNAサンプル中に存在するDNA断片の実際の分布を推定する中心的なステップである。cfDNAの定量的結果は、定性分析によってその純度を確認した後にのみ信頼できる。したがって、DNAフラグメント分析アッセイで生成されたcfDNAの理想的なグラフは、166bp付近のcfDNA断片の主要ピークの濃縮と、332bpの長さに近い小さなピークを示す。これは、抽出されたcfDNAサンプルがWBCからのゲノムDNAで汚染されないことを示している。フラグメントが7,000 bpから参照ラダー(10,380bp)以降に濃縮された場合、これはWBCゲノムDNAによるcfDNAサンプルの汚染を示します。ゲノムDNA汚染が、DNA断片サイズ推定アッセイ後のcfDNAサンプルで見られる場合、サンプルは100bpの梯子を有する2%アガロースゲル上で実行することができ、そしてゲルは、〜150〜200bpの範囲間で切除することができ、続いてゲル抽出アッセイが続く。アガロースゲルサイズ選択プロセス中に、ある程度の量のcfDNAが失われる。しかし、NGSライブラリ調製工程では、シーケンス用のライブラリを準備するために、最小0.5 ngと最大1,000 ngの入力DNA材料が必要です。したがって、cfDNAの合計量が0.5ng以上の場合、ライブラリの準備ステップに十分な量です。さらに、このようなサンプルはライブラリ調製プロセスを正常に通過し、そして結果として得られたライブラリは、125 bpのインデックスおよびアダプタの追加により、291 bpに近い主要なピークと457 bpの小さいピークを示す。

NGSデータ解析は、NGSベースの液体生検技術の最後のステップであり、変異および遺伝子遺伝子融合のリスト3、55、56、57がこのステップで生成される。同定された変異および遺伝子遺伝子融合は、癌変異の景観に関する以前の研究に従って評価することができる58,59、 以前に特徴付け遺伝子変異60または遺伝子遺伝子融合61,62, 63.これらは、がん患者における予後64および診断7バイオマーカーとして役立つ可能性がある。例えば、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1(IDH1)遺伝子におけるR132H突然変異は、二次性神経膠芽腫癌の決定的な道標であり、また、この突然変異が通常存在しない原発性神経膠芽腫と区別する。また、慢性骨髄性白血病(CML)は、染色体9と2261の間でバランスのとれた転座に起因するBCR/ABL1遺伝子融合を特徴とする。BCR/ABL1遺伝子とそのmRNAおよび融合タンパク質は、CML前駆物質に特有であり、したがって、治療66のための良い標的を構成する。

高度な診断、腫瘍の正しいステージングおよび治療モニタリングは、癌の効率的な管理のための現在の戦略である。最近まで、組織生検は腫瘍組織の組織学的評価のゴールドスタンダードでした。しかし、この分野での膨大な研究と技術の出現に続いて、単一の生検が腫瘍の突然変異景観全体を提供することができず、特に生検が非常に侵襲性である神経膠芽腫およびリンパ腫において、連続生検は通常、侵襲性のために行われることが現実的でなく、であることが証明された。さらに、針の生検のおよそ16%は手続き的合併症67に関連している。また、高品質のゲノムプロファイリングは、十分な量の組織を必要とし、通常は針生検68によって満たされない要求である。

液体生検は、腫瘍由来DNAを分析することによって日常的な血液検体から、日常的な針組織生検手順12を置換または補助することが判明した。液体生検による血漿による腫瘍由来DNA/cfDNAの分析は、腫瘍の分子プロファイリングのための最小限の侵襲的かつ効果的な手順である。それは本質的に、その侵襲的な性質69のために通常伝統的な腫瘍組織生検に関連する潜在的なリスクおよび合併症なしに、時間の経過とともに連続的なサンプリングによる治療モニタリングを可能にすることができる。さらに、単一腫瘍病変の液体生検によるcfDNA分析と針生検を比較した研究では、cfDNAプロファイリングは、腫瘍が複数の明確なクローン集団70によって収容することができる完全な分子異質性を提供できることを発見した。

しかし、血漿cfDNAベースの診断は腫瘍組織生検に対して多くの利点を有するが、一般的な臨床現場でその適用性を妨げるいくつかの重要な制限がまだある。cfDNAベースの液体生検診断の限界は、全体の手順のより高いコスト、膨大なデータ分析71の必要性のための高品質DNAおよび専用のバイオインフォマティクスの必要性を含む。CFDNA分析に関連するデータ管理の問題により、NGSはクリニックでの即時のアプリケーションにも問題を提起します。NGSがもたらすデータ管理の課題は、主に深いシーケンシングの固有のバックグラウンドノイズと腫瘍72に関連する収差との区別が困難なためである。最後に、大部分の液体生検アッセイに対する臨床妥当性および有用性データの利用不能のために、それらは現在、臨床研究および基礎研究13のみに限定されている。

液体生検技術の今後の発展は、生物学、生理学、分子生物学、アッセイ技術、データ管理のための統計解析、および機械学習技術73,74の分野における基礎研究による組み合わせによる努力を通じて期待される。さらに、cfDNAバイオマーカー評価に基づく数多くの臨床試験が進行中であり、その結果は、技術の有効性を確立するのに役立ちます。これらの組み合わせの取り組みは、今後5年以内に腫瘍学の臨床現場で強力な予後、診断、および治療監視ツールとしてcfDNA分析を通じて液体生検プラットフォームを確立することを期待する70、75。

結論として、cfDNAベースの液体生検は、がん疾患管理に有用なゲノムバイオマーカーを同定するための安全で非侵襲的なアプローチを提供する。しかし、信頼性と正確な結果を達成するためには、血の収集のための標準化されたプロトコル、血漿/WBC分離、cfDNA抽出、およびcfDNA定量および定性的分析が特に74,75に必要である。

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Disclosures

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

Acknowledgments

著者らは、がんゲノミクス研究所と複雑疾患のバイオコンピューティングのメンバーに、鋭い観察的なインプットと、このプロジェクトのさまざまな段階での複数の議論への参加に感謝したいと考えています。資金援助には、イスラエル癌協会(M.F-M 2017-2019のICA助成金)とイスラエル革新機関のカミン助成金(M.F-M.)が含まれます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

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癌研究、問題163、液体生検、無細胞DNA、精密医療、神経膠腫、癌診断、血漿
がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出
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Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

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