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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61449
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Cancer Genomics and BioComputing of Complex Diseases laboratory, The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2The Data Science Institute, Bar-Ilan University, 3The Dangoor Centre For Personalized Medicine, Bar-Ilan University

Summary

Neste artigo apresentamos um protocolo detalhado para a técnica de biópsia líquida não invasiva, incluindo coleta de sangue, separação de plasma e casaco buffy, extração de DNA cfDNA e germinal, quantificação de DNA cfDNA ou germinal, e análise de enriquecimento de fragmentos cfDNA.

Abstract

Identificar mutações em tumores de pacientes com câncer é um passo muito importante no manejo da doença. Essas mutações servem como biomarcadores para o diagnóstico de tumor, bem como para a seleção do tratamento e sua resposta em pacientes com câncer. O método padrão-ouro atual para detectar mutações tumorais envolve um teste genético do DNA tumoral por meio de biópsias tumorais. No entanto, este método invasivo é difícil de ser realizado repetidamente como um teste de acompanhamento do repertório mutacional tumoral. A biópsia líquida é uma técnica nova e emergente para detectar mutações tumorais como uma abordagem de biópsia fácil de usar e não invasiva.

As células cancerígenas se multiplicam rapidamente. Paralelamente, inúmeras células cancerígenas sofrem apoptose. Detritos dessas células são liberados no sistema circulatório de um paciente, juntamente com pedaços de DNA finamente fragmentados, chamados fragmentos de DNA livre de células (CFDNA), que carregam mutações de DNA tumoral. Portanto, para identificar biomarcadores à base de CFDNA utilizando a técnica de biópsia líquida, amostras de sangue são coletadas dos pacientes com câncer, seguidas pela separação de plasma e casaco buffy. Em seguida, o plasma é processado para o isolamento do CFDNA, e o respectivo casaco buffy é processado para o isolamento do DNA genômico de um paciente. Ambas as amostras de ácido nucleico são então verificadas quanto à sua quantidade e qualidade; e analisado para mutações usando técnicas de sequenciamento de última geração (NGS).

Neste manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado para biópsia líquida, incluindo coleta de sangue, plasma e separação de casacos buffy, extração de DNA cfDNA e germinal, quantificação de DNA cfDNA ou germinal, e análise de enriquecimento de fragmentos cfDNA.

Introduction

Os avanços tecnológicos levaram ao sequenciamento de centenas de genomas cancerígenos e transcritos1. Isso contribuiu para a compreensão das paisagens das mudanças moleculares em diferentes tipos de câncer2. Outros estudos sobre essas paisagens ajudaram a caracterizar as alterações sommáticas sequenciais e as fusões gene-gene3 que estão envolvidas na progressão do câncer ou tumor, interrompendo seriamente as vias de apoptose4. Portanto, mutações somáticas e fusões gene-gene podem fornecer informações sobre tumores servindo como biomarcadores em pacientes individuais para um determinado tumor tipo5, identificando o prognóstico de tumores primários existentes6,categorizando tumores secundários baseados em alterações moleculares7e identificando alvos tumorais drogados8. Essas informações podem facilitar na seleção do tratamento personalizado para pacientes com câncer e na determinação de respostas positivas e negativas ao tratamento9. No entanto, a obtenção de material tumoral para identificação de perfil genômico do tecido tumoral é um procedimento invasivo10. Além disso, uma biópsia tumoral compreende apenas uma pequena parte de um tumor heterogêneo; e pode, portanto, não ser representativo para o perfil molecular de todo o tumor11. O monitoramento serial e a genotipagem tumoral requerem uma coleta repetida de tecidos tumorais, o que, geralmente, não é viável devido à invasão do procedimento de biópsia tumoral e às questões de segurança decorrentes desses procedimentos12.

A técnica de biópsia líquida, por outro lado, ganhou uma tremenda atenção na oncologia de precisão na última década13,14. Deve-se principalmente à não invasiva dessa técnica, e à possibilidade de ser repetida em vários momentos, possibilitando assim uma técnica de monitoramento fácil de usar e segura para os cursos da doença15,16. A biópsia líquida é baseada em um fenômeno que as células tumorais se multiplicam rapidamente, e simultaneamente muitas delas sofrem apoptose e necrose. Isso leva à liberação de detritos celulares apoptóticos no sangue dos pacientes, juntamente com os fragmentos de DNA que são cortados em tamanhos precisos durante a apoptose17. A apoptose de células não cancerosas também leva à liberação de seus detritos celulares no sangue, no entanto, a taxa de apoptose nessas células é relativamente muito menor do que as células tumorais18. O racional da técnica de biópsia líquida é capturar moléculas associadas ao tumor, como DNA, RNA, proteínas e células tumorais14,19 que circulam continuamente no sangue. Várias técnicas20 podem ser usadas para a análise dessas moléculas, incluindo Sequenciamento de Próxima Geração (NGS), reação em cadeia de polimerase de gotícula digital (ddPCR), PCR em tempo real e ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA). A técnica de biópsia líquida permite identificar biomarcadores que são características das células tumorais. Essas moléculas biomarcadores não são apenas liberadas de partes específicas de um tumor, mas sim de todas as partes do tumor21. Assim, os marcadores identificados na biópsia líquida representam o perfil molecular de todo um tumor heterogêneo, além de outros tumores no corpo, tendo vantagens sobre a técnica baseada em biópsiatecidual 22.

O cfDNA tem um curto tempo de meia-vida no sangue circulante que varia de alguns minutos a 1-2 horas23. No entanto, o curto tempo de meia-vida do CFDNA facilita análises em tempo real, avaliando a resposta ao tratamento e avaliações dinâmicas do tumor. Os níveis de CFDNA derivados do tumor indicam prognóstico do estágio/tamanho do tumor evidenciado por diversos estudos, que mostraram relação entre os níveis de CFDNA e os desfechos de sobrevivência24. Além disso, estudos comprovaram que o CFDNA tem uma melhor capacidade de previsão do que os marcadores tumorais existentes25. O prognóstico do CFDNA é ainda mais acentuado após o tratamento do câncer, níveis mais elevados de CFDNA após o tratamento correlaciona-se bem com uma taxa reduzida de sobrevivência e resistência ao tratamento. Considerando que os níveis mais baixos de CFDNA após a terapia geralmente correspondem à resposta positiva ao tratamento. Além disso, o CFDNA facilita a detecção precoce da resposta ao tratamento do que os métodos tradicionais de detecção.

O CFDNA aumenta a possibilidade de detecção precoce de mutações associadas ao câncer: durante a doença em estágio inicial15, o aparecimento dos sintomas26 e antes do diagnóstico de câncer até 2 anos27. Como o CFDNA é liberado de múltiplas regiões tumorais ou focos, sua análise fornece uma visão abrangente do genoma tumoral que representa28. Portanto, o CFDNA permite detectar mutações somáticas que podem ter sido perdidas nas amostras de tecido29. Como a heterogeneidade intra-tumoral e mutações subclonais podem ser detectadas pelo sequenciamento profundo de regiões genômicas que abrangem milhares de bases, daí a análise do CFDNA permite descobrir subtipos moleculares específicos com assinaturas genômicas distintas13. Para obter um nível semelhante de informação através da amostra de tecido muitas biópsias sólidas teriam sido necessárias.

Além disso, os níveis de CFDNA em pacientes com uma doença localizada, como câncer de cólon, ovário e pulmão após tratamento cirúrgico e/ou quimioterapia, demonstraram ser um poderoso marcador prognóstico para a recidiva do câncer e os resultados do tratamento20. Além disso, em pacientes com câncer de cólon, mama e pulmão, análises de CFNA do sangue puderam detectar com sucesso as alterações específicas do tumor, o que levou à previsão precisa de recidiva com vários meses de antecedência13. Além disso, os marcadores de resistência ao tratamento, como mutações kras em pacientes com CRC recebendo terapia anti-EGFR30; VAFs para genes como PIK3CA, MED1 ou EGFR em pacientes com câncer de mama após o tratamento com várias terapias31; e a mutação de resistência EGFR T790M em pacientes com câncer de pulmão tratada com TKIs32 direcionados ao EGFR também podem ser identificadas pela análise de CFDNA.

Em resumo, a análise cfDNA pode ser utilizada para identificar biomarcadores precisos no campo da oncologia13,33. Neste protocolo, amostras de sangue de 3 pacientes com glioma e 3 controles saudáveis foram processadas para obter DNA genômico de WBCs e CFDNA do plasma. No câncer de glioma, mutações em IDH, TERT, ATRX, EGFR e TP53 servem como diagnóstico, bem como marcadores prognósticos que podem ajudar no diagnóstico precoce de tumores glioma, classificando diferentes tipos de tumores de glioma, orientando o tratamento preciso para o paciente individual e entendendo a resposta ao tratamento34,35. O status mutacional desses genes pode ser identificado usando cfDNA derivado do sangue. Neste manuscrito, apresentamos um protocolo detalhado de CFDNA derivado do plasma que tem sido usado para estudar alterações mutacionais no câncer de glioma12. Esse protocolo de biópsia líquida baseado em CFDNA explicado neste artigo pode ser usado para estudar alterações mutacionais em muitos outros tipos de câncer. Além disso, um estudo recente mostrou que a biópsia líquida baseada em CFDNA pode detectar 50 tipos diferentes decânceres 36.

A coleta, o armazenamento e o envio de amostras de sangue são etapas cruciais neste protocolo, pois a temperatura descontrolada durante essas etapas causa lise dos WBCs, levando à liberação de DNA genômico do WBC no plasma e causando contaminação da amostra de CFDNA, que afeta o resto do procedimento37. A hemólise devido à temperatura descontrolada pode prejudicar os processos de preparação da amostra a jusante do CFDNA, como as etapas38do PCR . O soro contém uma alta proporção de cfDNA germinal em vez de plasma, embora apresente um grande ruído de fundo para cfDNA39associada ao tumor . Portanto, para isolar o CFDNA associado ao tumor, o plasma é uma amostra adequada39. O sangue extraído em um anticoagulante contendo tubo de coleta de sangue deve ser centrifutor imediatamente ou dentro de até duas horas, para separar o plasma e evitar a contaminação por CFDNA. Neste protocolo são utilizados tubos comerciais dedicados de coleta de sangue cfDNA (ver Tabela de Materiais),que são uma alternativa ao anticoagulante contendo tubos de coleta de sangue. Estes tubos dedicados de coleta de sangue preservam cfDNA e cfRNA, e previne a lise de WBCs por até 30 dias a temperatura ambiente, e até 8 dias a 37 °C. Isso facilita a manutenção da temperatura apropriada durante um carregamento de amostras de sangue e até que o plasma e o WBC sejam separados40.

Existem três tipos de metodologias de extração de CFDNA atualmente disponíveis: isolamento de fase, coluna de spin baseada em membrana de silício e isolamento à base de contasmagnéticas 41. O método da coluna spin baseada em membrana de silício rendeu uma alta quantidade de cfDNA com alta integridade em comparação com outros métodos de extração de CFDNA42.

A avaliação quantitativa do DNA é um requisito fundamental na biópsia líquida, há a necessidade de desenvolver um procedimento simples, acessível e padronizado para sua fácil implementação e amplo uso. Três métodos comumente utilizados para quantificação de CFDNA são espectrofotométrico, fluorimétrico e qPCR. O método fluorimétrico é comprovado melhor em relação aos outros métodos relativos à precisão, custo e facilidade de condução43.

A integridade e pureza do CFDNA podem ser estimadas por eletroforese agarose ou eletroforese capilar. A eletroforese agarose não mostra sensibilidade na baixa concentração de CFDNA nem tem alta resolução para mostrar o tamanho preciso do fragmento de cfDNA. Por outro lado, a eletroforese capilar tem uma vantagem sobre a eletroforese agarose, superando os desafios associados e, portanto, amplamente utilizada pelos pesquisadores para a análise do tamanho do fragmento de CFDNA. Neste protocolo, a distribuição do tamanho do fragmento do CFDNA isolado foi estimada utilizando um instrumento automatizado de eletroforese capilar (ver Tabela de Materiais).

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Protocol

Antes da coleta de sangue, é necessário o consentimento informado dos sujeitos participantes da pesquisa e deve ser obtido. A pesquisa descrita neste manuscrito foi realizada de acordo com o Rabin Medical Center, o Comitê de Ética de Israel (código de ética: 0039-17-RMC) e a Faculdade de Medicina Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, comitê de ética da Alemanha (código de ética: D 405/14).

1. Coleta e armazenamento de amostras de sangue em tubos de conservante cfDNA ou cfRNA

  1. Rotule corretamente os tubos de preservação
  2. Colete ~8 mL de sangue no tubo de preservação cf-DNA (ver Tabela de Materiais),utilizando um conjunto de coleta de sangue e um suporte, conforme o protocolo institucional padrão para venipuntura conforme descrito abaixo.
    NOTA: O uso de um conjunto de coleta de sangue pode impedir um possível refluxo do sangue do tubo.
    1. Alinhe o paciente com o braço em posição descendente.
    2. Segure o tubo ereto, com a tampa virada para cima, garantindo que o conteúdo do tubo não toque na tampa ou na ponta da agulha.
    3. À medida que o sangue começa a fluir para o tubo, solte o torniquete lentamente.
  3. Imediatamente após o tubo ser preenchido com sangue (capacidade máxima: 8,4 mL de sangue inteiro), inverta suavemente o tubo (gire o pulso do braço que está segurando o tubo em 180° para baixo e para trás) 5 vezes para estabilizar a amostra.
    NOTA: A inversão garante que o conservante seja misturado uniformemente com a amostra. No entanto, não agite o conteúdo novamente, mesmo antes da preparação do plasma. A mistura insuficiente de conservantes com a amostra de sangue leva à desestabilização do conteúdo e à formação de micro coágulos ou hemólise. Nesta fase, o protocolo pode ser continuado imediatamente para separação de plasma ou tubos cheios de sangue podem esperar até 30 dias à temperatura ambiente (15-25 °C), e até 8 dias a 37 °C.

2. Separação e armazenamento de casacos de plasma e buffy

  1. Centrifugar o tubo de preservação cheio de sangue a 425 x g por 20 minutos à temperatura ambiente para separar o plasma.
    NOTA: As etapas 2.2 e 2.3 devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança.
  2. Pipeta cuidadosamente a camada de plasma superior para um tubo fresco em alíquotas de 1 mL, sem perturbar as camadas inferiores.
  3. Transfira cuidadosamente a próxima camada de casaco buffy para um tubo fresco (a camada aparece como um anel acima das pelotas RBC), evitando RBCs na camada inferior.
  4. Vá para o passo 3 com plasma e passo 4 com o casaco buffy. Se necessário, armazene o conteúdo separado a -80 °C.

3. Purificação de cfDNA circulante de 1 mL de plasma

NOTA: Esta etapa é realizada com um kit comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os buffers são fornecidos com o kit.

  1. Preparação de tampões e reagentes
    ATENÇÃO: Não adicione soluções ácidas ou alvejante diretamente aos resíduos de preparação da amostra. Os sais de guanidina presentes no tampão de lysis, tampão de ligação e buffer de lavagem-1 quando combinados com alvejante ou ácidos podem produzir compostos altamente reativos.
    1. Tampão de ligação: Misture 300 mL de concentrado tampão de ligação com 200 mL de isopropanol de 100% para fazer 500 mL de buffer de ligação de funcionamento. Armazene à temperatura ambiente.
      NOTA: O tampão de ligação permite a ligação ideal dos ácidos nucleicos circulantes à membrana de sílica. 500 mL do tampão de ligação é suficiente para o processamento de 276, 138, 92, 69 ou 55 amostras de 1, 2, 3, 4 ou 5 mL de plasma, respectivamente, e é estável por 1 ano à temperatura ambiente.
    2. Wash Buffer-1: Misture 19 mL de concentrado Wash Buffer-1 com 25 mL de 96-100% de etanol para fazer 44 mL de wash buffer-1. Armazene à temperatura ambiente.
      NOTA: O Buffer-1 elimina os contaminantes ligados à membrana de sílica. 44 mL de wash buffer-1 de trabalho é suficiente para processar 73 amostras de 1/2/3/4/5 mL de plasma e está estável por 1 ano à temperatura ambiente.
    3. Wash Buffer-2: Misture bem 13 mL De concentrado tampão-2 com 30 mL de 96-100% de etanol para fazer 43 mL de wash buffer-2. Armazene à temperatura ambiente.
      NOTA: O Buffer-2 elimina os contaminantes ligados à membrana de sílica. 43 mL de wash buffer-2 de trabalho é suficiente para processar ~56 amostras de 1/2/3/4/5 mL de plasma e está estável por 1 ano à temperatura ambiente.
    4. A um tubo contendo RNA portador liofilizado de 310 μg, adicione 1.550 μL de tampão de Elução, para preparar uma solução de RNA portadora de 0,2 μg/μL. Depois de dissolver completamente o RNA da transportadora, divida a solução para alíquotas adequadas e armazene a -30 °C a -15 °C. Não congele essas alíquotas mais de 3 vezes. Ao buffer de Lise, como mostrado na Tabela S1,adicione o RNA da transportadora reconstituída dissolvido no buffer de Elução.
      NOTA: Como o RNA da operadora não se dissolve diretamente no buffer Lysis, ele precisa ser dissolvido primeiro em um buffer de elução e, em seguida, no Lysis Buffer. Em primeiro lugar, a ligação de ácidos nucleicos de membrana sílica é aprimorada quando há muito poucas moléculas-alvo presentes na amostra. Em segundo lugar, o risco de degradação do RNA é reduzido devido à presença de grandes quantidades de RNA portadora.
  2. Antes de iniciar o isolamento, leve as colunas e amostras à temperatura ambiente e ajuste os volumes amostrais para 1 mL com soro fisiológico estéril tamponado (PBS), se necessário. Pré aqueça 2 banhos de água ou blocos de aquecimento que contenham tubos de centrífugas de 50 mL e tubos de coleta de 2 mL a 60 °C e 56 °C, respectivamente.
  3. A um tubo centrífuga de 50 mL, adicione 100 μL de Proteinase K, plasma de 1 mL e 0,8 mL de tampão de Lysis contendo 1,0 μg de RNA portador (preparado na etapa 3.1.4). Feche o tubo de centrífuga com uma tampa e misture o conteúdo por vórtice de pulso por 30 s, ao mesmo tempo em que garante um vórtice visível no tubo. A mistura completa do conteúdo é importante para uma lise eficiente.
    NOTA: Imediatamente após o vórtice, proceda à etapa 3.4, sem demora.
  4. Incubar a solução a 60 °C por 30 min.
  5. Remova a tampa, adicione 1,8 mL do tampão de ligação ao tubo e misture completamente com vórtice de pulso para 15-30 s depois de colocar a tampa.
  6. Incubar a mistura resultante por 5 minutos no gelo e inserir a coluna da membrana de sílica no aparelho de vácuo que está conectado à bomba de vácuo. Em seguida, insira firmemente um extensor de tubo de 20 mL na coluna aberta para evitar vazamento de amostras.
  7. Despeje cuidadosamente a mistura incubada no extensor do tubo da coluna e ligue a bomba de vácuo. Depois de toda a mistura de lisato completamente correr através das colunas, desligue a bomba de vácuo, solte a pressão para 0 mbar e remova e descarte o extensor do tubo.
    NOTA: Evitando contaminação cruzada, o extensor do tubo deve ser descartado cuidadosamente, para evitar que se espalhe sobre colunas adjacentes.
  8. Remova a coluna do aparelho de vácuo, insira no tubo de coleta e centrífugas a 11.000 x g por 30 s à temperatura ambiente, para remover qualquer lise residual. Descarte o fluxo.
  9. Adicione 600 μL de Wash Buffer-1 na coluna, centrífuga a 11.000 x g por 1 min a temperatura ambiente, descarte o fluxo.through.
  10. Adicione 750 μL de Wash Buffer-2 à coluna, centrífuga a 11.000 x g por 1 min a temperatura ambiente e descarte o fluxo.through.
  11. Adicione 750 μL de etanol (96-100%) à coluna, centrífuga a 11.000 x g por 1 min a temperatura ambiente e descarte o fluxo..
  12. Centrifugar a coluna a 20.000 x g por 3 min, colocando-a em um tubo de coleta de 2 mL limpo.
  13. Seque completamente o conjunto da coluna de membrana colocando-a em um novo tubo de coleta de 2 mL com a tampa aberta e incubando a 56 °C por 10 minutos.
  14. Coloque a coluna em um tubo de eluição limpo de 1,5 mL. No centro da membrana da coluna, aplique 20-150 μL de tampão de elução e incubar à temperatura ambiente por 3 minutos com a tampa fechada.
    NOTA: Certifique-se de que o buffer de elução está equilibrado à temperatura ambiente. Em caso de uso do tampão de elução inferior a 50 μL, certifique-se de que ele seja dispensado cuidadosamente no centro da membrana. Isso ajuda com a elução completa do DNA vinculado. No entanto, o volume de elução não é fixo e pode ser alterado de acordo com as aplicações a jusante. O eluato recuperado pode ser de até 5 μL e certamente menor do que o volume de elução aplicado à coluna.
  15. Centrifugar o eluato recuperado em uma microcentrifuuge a 20.000 x g por 1 min para eluto os ácidos nucleicos, e armazenar a -20 °C.

4. Purificação de DNA genômico do casaco buffy

NOTA: O kit comercial utilizado neste protocolo é mencionado na Tabela de Materiais. Buffers e reagentes mencionados no protocolo abaixo, ou seja, tampão de Lysis A, tampão de Lysis B, buffer de lavagem X, Wash Buffer Y, Proteinase Buffer, Buffer de Elução e Proteinase K fazem parte deste kit comercial.

  1. Preparação dos buffers e reagentes
    ATENÇÃO: Não adicione soluções ácidas ou alvejante diretamente aos resíduos de preparação da amostra. Os sais de guanidina presentes no tampão de lysis B e wash buffer X quando combinados com alvejante ou ácidos, podem produzir compostos altamente reativos.
    1. Wash Buffer Y: Misture bem 12 mL de concentrado Wash Buffer Y com 48 mL de etanol (96-100%) para obter 60 mL de lavagem de lavagem de trabalho Y. Armazenar à temperatura ambiente.
      NOTA: 60 mL de wash buffer Y de trabalho é suficiente para processar 100 amostras de casaco buffy e está estável por 1 ano.
    2. Proteinase K: Prepare a solução Proteinase K dissolvendo 30 mg de Proteinase K liofilizada em 1,35 mL de Proteinase Buffer.
      NOTA: A solução de trabalho total da Proteinase K é suficiente para processar 52 amostras de casacos buffy. A solução de trabalho Proteinase K pode ser armazenada por pelo menos 6 meses a -20 °C.
  2. Etapas antes do início do procedimento
    1. Equilibre o casaco de buffy à temperatura ambiente.
    2. Coloque o bloco de calor ou banho de água a 56 °C.
  3. Suspenda o casaco buffy no tampão de Lysis A para obter um volume final de 200 μL. Em seguida, adicione 25 μL de solução Proteinase K e 200 μL de tampão de lysis B. Misture por vórtice e incubar a 70 °C por 10-15 min. Certifique-se de que as amostras estão completamente cobertas com a solução de lise.
    NOTA: Para a série de processamento de amostras, proteinase K e tampão de lise A podem ser pré-misturadas 10-15 minutos antes do procedimento, mas não mais antes disso, como Proteinase K auto-digerir em Lysis buffer A sem substrato.
  4. Adicione 210 μL de 96-100% de etanol à mistura acima e vórtice vigorosamente.
    NOTA: A adição de etanol pode formar um precipitado; no entanto, isso não afetará o isolamento do DNA. Certifique-se de carregar o precipitado também na coluna, como mostrado nas etapas seguintes.
  5. Coloque toda a amostra na coluna de sílica colocada em um tubo de coleta. Centrífuga por 1 min a 11.000 x g. Coloque a coluna em um novo tubo de coleta e descarte o tubo anterior junto com o fluxo.
    NOTA: Repita a etapa de centrifugação se a amostra não for completamente desenhada através da matriz.
  6. Adicione 500 μL de wash buffer X, centrífuga por 1 min a 11.000 x g, e descarte o fluxo-through.
  7. Coloque a coluna no tubo de coleta, adicione 600 μL de Wash Buffer Y na coluna, centrífuga por 1 min a 11.000 x g e descarte o fluxo-through.
  8. Novamente, coloque a coluna no tubo de coleta e centrífugue a coluna por 1 min a 20.000 x g para secar a membrana de sílica.
  9. Incubar a coluna em temperatura ambiente por 1 min, colocada em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e, em seguida, adicionar 100 μL de tampão de eluição. Em seguida, elute o DNA por centrifugação por 1 min a 11.000 x g e armazenar a -20 °C.

5. Quantificação do DNA cfDNA e genômico usando fluorômetro

  1. Antes de iniciar o protocolo, execute as seguintes etapas.
    1. Diluir 2 μL de DNA genômico elucido (a partir da etapa 4.9) em proporções de 1:10 com água ultrapura sem nuclease. Devido às baixas concentrações esperadas, não diluir amostras de CFDNA a partir da etapa 3.15.
    2. Equilibre o ensaio Padrão #1 e teste Padrão #2 à temperatura ambiente.
  2. Prepare um total de 6 tubos claros de paredes finas de tamanho de 0,5 mL.
    NOTA: O protocolo apresentado é para quantificação de 2 amostras de DNA cfDNA e 2 genômicas, portanto, 4 tubos para 4 amostras e este ensaio requer 2 normas.
  3. Rotule as tampas do tubo.
    NOTA: A rotulagem na lateral do tubo pode interferir na leitura. Além disso, os tubos padrão de ensaio são rotulados cuidadosamente, uma vez que a calibração do fluorômetro exige que as normas estejam na ordem correta.
  4. Diluir o reagente de ensaio em 1:200 com o buffer Assay para preparar a solução de trabalho. Para 4 amostras e 2 padrões, use 6 μL de reagente de ensaio mais 1.194 μL de tampão de ensaio para fazer 1.200 μL (200 μL em cada tubo) de solução de trabalho.
    NOTA: Não use um recipiente de vidro, em vez disso, use um tubo plástico limpo. Cada tubo deve conter aproximadamente 200 μL do volume final (um tubo padrão de ensaio deve conter 190 μL da solução de trabalho, e o tubo de amostra deve conter 180-199 μL da solução de trabalho). A solução de trabalho suficiente deve ser preparada para acomodar todos os padrões e amostras de ensaio.
  5. Nos tubos padrão de ensaio de funcionamento, adicione 190 μL de solução de trabalho e 10 μL padrão de ensaio e misture a solução com vórtice para 2-3 s. Evite a formação de bolhas dentro da solução.
  6. Nos tubos de amostra, adicione 198 μL de solução de trabalho e 2 μL de CFDNA ou DNA genômico. Misture a solução por vórtice para 2-3 s, e mantenha-a incubada à temperatura ambiente por 2 minutos.
  7. Na tela 'Home' do instrumento fluorômetro, pressione 'DNA' e selecione 'dsDNA High Sensitivity Assay', para exibir a tela 'Standards' e, em seguida, pressione 'Sim' na tela 'Standards 'fluorometer' para ler os padrões.
  8. Na câmara de amostra, insira o tubo de #1 padrão de ensaio, feche a tampa epressione' Leia '. Remova o tubo assim que a leitura estiver concluída (aproximadamente 3 s) e repita o mesmo passo para #2 Padrão.
  9. Uma tela de amostra é exibida após a conclusão do processo de calibração e, em seguida, insira um tubo de amostra e repita a etapa '5.8'. A "tela de amostra" exibirá então um valor que corresponde à concentração da amostra após a diluição no tubo de amostra.
  10. Para cada amostra repetir a etapa '5.9', até que todas as amostras sejam lidas.
  11. Use a seguinte equação para calcular a concentração real da amostra.
    Equation 1
    NOTA: Os valores do ensaio estão em ng/mL e correspondem à concentração após a diluição no tubo de ensaio. Equação mencionada na etapa acima 5.11, o valor QF é o valor dado pelo instrumento fluorômetro, e x é o número de microliters de amostra adicionado ao tubo de ensaio. As unidades para valores de QF gerados pela equação são semelhantes ao valor fornecido pelo fluorômetro. Por exemplo, se o valor do fluorômetro estiver em ng/mL, as unidades para a concentração calculada pela equação são ng/mL.

6. Distribuição do tamanho do tamanho do fragmento de DNA do CFDNA por analisador de fragmentos

  1. O passo antes de iniciar o procedimento: Equilibre o concentrado de corante de DNA e a matriz de gel de DNA à temperatura ambiente por 30 minutos.
  2. Preparação da mistura gel-corante
    ATENÇÃO: Manuseie soluções com cautela, pois o DMSO é conhecido por facilitar a entrada de moléculas orgânicas nos tecidos.
    1. Descongele completamente o DMSO vórtice do frasco de concentrado de corante de DNA para 10 s. Pipeta fora 15 μL deste concentrado em um frasco de matriz de gel de DNA e armazenar a 4 °C no escuro.
    2. Novamente, o vórtice do frasco tampado por 10 s até a mistura do gel e corante é visualizado.
    3. Despeje a mistura em um filtro de giro até o recipiente superior.
    4. Microcentrifugar o filtro de giro a 2.240 x g ± 20% por 10 min a temperatura ambiente.
    5. Rotule o gel-corante preparado no tubo e descarte o filtro, conforme boas práticas laboratoriais. Rotule o tubo e grave a data da preparação.
      NOTA: Descarte o filtrado de acordo com boas práticas laboratoriais. A mistura de gel-corante pode ser usada para 5 chips de DNA de alta sensibilidade (HS). Se não foriado por mais de 1h, armazene a 4 °C. O armazenamento no escuro é possível por até 6 semanas.
  3. Para carregar a mistura gel-corante, certifique-se da posição da placa base da estação de escoramento do chip e ajuste o clipe na posição mais baixa.
    1. Equilibre a mistura de gel-corante à temperatura ambiente por 30 minutos, enquanto monitora a exposição à luz.
    2. Pegue um novo chip de DNA HS de um saco selado e coloque-o na estação de escoramento de chips, em seguida, remova 9,0 μL da mistura de gel-corante e dispense-o na parte inferior do chip bem, marcado como 'G'.
      NOTA: Desenhe a mistura gel-corante, evitando partículas que possam se acumular na parte inferior do frasco. Ao dispensar bem a mistura de gel-corante no chip de DNA HS, insira a ponta da pipeta completamente, para evitar a formação de grandes bolhas de ar. Além disso, tocar a pipeta nas bordas do poço produzirá resultados ruins.
    3. Posicione o êmbolo a 1 mL e feche a estação de escoramento de chips. Certifique-se de que a trava clique e defina o temporizador para 60 s, em seguida, pressione o êmbolo para baixo até que ele seja mantido pelo clipe, e exatamente depois dos anos 60, solte o êmbolo com o mecanismo de liberação do clipe.
    4. Quando o êmbolo recuar pelo menos para a marca de 0,3 mL, espere por 5 s e, em seguida, puxe lentamente de volta para a posição de 1 mL, em seguida, abra a estação de escoramento do chip e remova novamente 9,0 μL da mistura de corante de gel e dispense bem na parte inferior do chip de DNA HS, marcado como 'G'.
  4. Para carregar o marcador de DNA, dispense 5 μL do marcador de DNA no poço, marcado com o símbolo da escada. Repita o procedimento para todos os 11 poços amostrais.
  5. Para carregar a escada e as amostras, dispense 1 μL da escada de DNA no poço, marcado com o símbolo da escada e, em seguida, adicione 1 μL de amostra (poços usados) ou 1 μL de marcador (poços não utilizados) em todos os 11 poços amostrais.
  6. Vórtice o chip de DNA HS para 60 s a 2.400 rpm colocando o chip horizontalmente no adaptador. Certifique-se de que a protuberância que corrige o chip de DNA HS não esteja danificada durante o vórtice.
  7. Para inserir o chip de DNA HS no instrumento analisador de fragmentos, abra a tampa e certifique-se de que o cartucho de eletrodo esteja devidamente inserido, e o seletor de chip esteja posicionado para 'dsHigh Sensitivity DNA' no instrumento analisador de fragmentos.
  8. Monte cuidadosamente o chip de DNA HS no recipiente, que se encaixa apenas de uma maneira, em seguida, perca a tampa, garantindo que o cartucho de eletrodo se encaixe exatamente nos poços do chip de DNA HS.
  9. O display na tela de software do analisador de fragmentos indica o chip de DNA HS inserido e a tampa fechada, através do ícone do chip no canto superior esquerdo da tela.
  10. Para iniciar a execução do chip de DNA HS, selecione o ensaio dsDNA high sensitivity do menu 'Assay' na tela do instrumento e, em seguida, preencha adequadamente a tabela de nomes de amostra, alimentando informações como nomes de amostras e comentários e inicie a execução do chip clicando no botão'Iniciar' no canto superior direito da tela.
  11. Limpeza de eletrodo após uma execução de um chip de DNA HS: Remova imediatamente o chip de DNA HS usado, assim que o ensaio for concluído e elimine-o de acordo com boas práticas laboratoriais. Realize o seguinte procedimento para garantir que os eletrodos estejam limpos, sem sobras de resíduos do ensaio anterior.
    1. Encha lentamente 350 μL de água de nível de análise deionizada em um dos poços de limpeza de eletrodos e coloque o limpador de eletrodos no instrumento analisador de fragmentos abrindo a tampa e, em seguida, feche a tampa e espere cerca de 10 s.
    2. Retire o limpador de eletrodos abrindo a tampa e espere por mais 10 s, para que a água dos eletrodos evapore antes de fechar a tampa.

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Representative Results

Separação plasmática
O sangue de 8,5-9 mL coletado em tubos de conservação cfDNA ou cfRNA produz cerca de ~4 mL de plasma em volume. O volume de plasma separado do sangue coletado nos tubos EDTA pode variar dependendo da temperatura. A exposição de tubos EDTA contendo sangue a uma temperatura superior a 37 °C leva à diminuição do volume de plasma44.

Resultados do ensaio do ensaio do fluorômetro
a concentração de CFDNA em plasma de 1 mL de cada um dos pacientes com glioma #1 e #3 e controles saudáveis #H1, #H2 e #H3 foram 137 ng, 12,6 ng, 6,52 ng, 2,26 ng e 2,48 ng, respectivamente. No entanto, no paciente glioma #2 concentração de CFDNA era muito baixa para ser detectada em um fluorômetro. a concentração de cfDNA no plasma de 1 mL de um paciente com câncer varia de 0,5 a >1000 ng18, com um valor médio de 20 ng. Em pessoas saudáveis, a concentração de CFDNA varia de uma concentração indetectável a 16 ng, com um valor médio de 8 ng45. O DNA genômico isolado de 200 μL buffy coat (PBMCs) rende cerca de 25-50 μg de DNA.

Resultados do ensaio do analisador de fragmentos de DNA
De acordo com um estudo anterior, o CFDNA é enriquecido em fragmentos longos de 166 bp, que representam ~85% do total de CFDNA no plasma de um paciente. Em contrapartida, os fragmentos longos de 332 bp representam 10%, e os fragmentos longos de 498 bp representam 5% do CFDNA46. Dois fatores principais que afetam os resultados do ensaio do analisador de fragmentos de CFDNA são a contaminação genômica do DNA dos PBMCs e a baixa concentração de CFDNA. A Figura 1 mostra o gráfico bioanalídoce de glioma #1, no qual os fragmentos de CFDNA são enriquecidos a 166 bp e não há contaminação genômica de DNA na amostra21. A Figura 2 mostra o gráfico de enriquecimento de fragmentos após a elaboração da biblioteca NGS do cfDNA do paciente glioma #1 e o enriquecimento de fragmentos é deslocado de 166 bp para 291 bp, devido à fixação de 125 índices e adaptadores de 125 bps a ele. A Figura 3 mostra um leve enriquecimento dos fragmentos de CFDNA do paciente glioma #2. Apesar da baixa concentração de CFDNA no paciente glioma #2, a adição de adaptadores NGS às etapas de amplificação de CFDNA e PCR levam ao pico visível da biblioteca cfDNA no gráfico de enriquecimento de fragmentos Figura 4. Portanto, a biblioteca foi preparada com sucesso a partir desta amostra de CFDNA de baixa concentração, conforme mostrado na Figura 4. Na Figura 5,os fragmentos de CFDNA do paciente glioma #3 são mostrados para atingir o pico perto de 166 bp, mas a contaminação genômica de DNA também é aparente perto do pico da escada de referência de 10380 bp.

Figure 1
Figura 1: Um gráfico ideal de ensaio do analisador de fragmentos cfDNA da amostra de glioma #1 cfDNA. Um pico maior foi observado em 166 bp e um pico menor foi observado em 332 bp. Não foi observada contaminação genômica nesta amostra, que ocorre perto do marcador superior de 10.380 bp. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Um gráfico ideal de ensaio do analisador de fragmentos cfDNA da amostra de glioma #1 biblioteca cfDNA. Depois de ligar 125 bp de última geração de adaptadores de biblioteca de sequenciamento, fragmentos de CFDNA de 166 bp e 332 bp mostraram um pico maior de 291 bp e um pico menor de 457 bp, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: gráfico de ensaio do analisador de fragmentos cfDNA da amostra de glioma #2 cfDNA, mostrando um pico muito pequeno de 166 bp. Devido à baixa concentração de CFDNA, o pico de 166 bp mal era visível. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: gráfico de ensaio do analisador de fragmentos cfDNA da biblioteca cfDNA da amostra de glioma #2. Depois de ligar os adaptadores de biblioteca de sequenciamento de 125 bp de última geração e realizar ciclos de PCR durante a preparação da biblioteca, o pico cfDNA pouco visível em 166 bp ou picos completamente invisíveis a 332 bp e 498 bp, eram claramente visíveis. Um pico maior foi presente perto de 291 bp e um pico menor de 457 bp, 623 bp, 789 bp e perto de 2.500 bp foram observados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: ensaio analisador de fragmentos de CFDNA mostrando contaminação genômica de DNA na amostra de glioma #3 cfDNA. Um pequeno pico de 166 bp indicou que a presença de CFDNA e enriquecimento próximo ao marcador superior (10.380 bp) foi contaminação genômica de DNA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela S1: Volumes do tampão de lise e do RNA portador (dissolvido em Buffer AVE) necessários para o processamento de 1 mL de amostras de plasma. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

A coleta de sangue de um paciente em um tubo, embarque e armazenamento são etapas iniciais cruciais na biópsia líquida. O manuseio inadequado pode prejudicar a qualidade do plasma e, portanto, pode interferir nos resultados da biópsia líquida47. Se uma amostra de sangue for coletada em um tubo sanguíneo EDTA, o plasma deve ser separado dentro de duas horas de coleta de sangue para evitar a lise dos WBCs e liberar seu DNA genômico no plasma48. Os WBCs também podem sofrer apoptose em um tubo EDTA se mantidos por mais tempo, e os fragmentos de CFDNA resultantes podem contaminar o CFDNA original no plasma48. Exposição de uma amostra de sangue a uma alta temperatura (>37 °C) ou tremor excessivo do tubo antes que a separação plasmática cause hemólise. A hemoglobina que consequentemente permanece como contaminante no plasma afeta os processos a jusante do CFDNA, como durante a preparação da biblioteca49. A alta temperatura (>37 °C) também afeta o rendimento do plasma em um tubo sanguíneo EDTA. Portanto, a rápida separação do plasma após sua coleta em um tuboEDTA 50 é um passo significativo no controle de qualidade do método. Se o sangue for coletado no tubo comercial cfDNA ou cfRNA Preservation, o produto químico conservante deve ser misturado com o sangue imediatamente após a coleta de sangue40. A não mistura adequada do produto químico conservante leva à formação de microclotas no plasma. Estes entupem as membranas de sílica em uma coluna durante o processo de extração de CFDNA e reduzem o rendimento do CFDNA. Tremor moderado de sangue no tubo não causa hemólise; embora o tremor excessivo possa causar hemólise mesmo nestes tubos40. Portanto, durante o embarque ou manuseio desses tubos, deve-se evitar o tremor excessivo. Recomenda-se que os tubos sanguíneos sejam enviados em sua posição vertical.

A quantificação e avaliação precisas da concentração de CFDNA por unidade de plasma é um passo importante na biópsia líquida, uma vez que a concentração de CFDNA plasmática está diretamente associada aos processos fisiológicos e patológicos51. A concentração de CFDNA é maior em pacientes com câncer do que em indivíduos saudáveis52. O aumento da concentração de CFDNA no sangue humano não é específico para o câncer; gestantes e pacientes que recebem transplantes também tendem a ter concentrações elevadas de CFDNA no sangue21. Associações também têm sido apresentadas para inflamação, trauma tecidual, diabetes, infarto do miocárdio e sepse com aumento do nível de concentração de CFDNA53. A concentração de cfDNA plasmática em pacientes com câncer em estágio inicial tende a ser menor do que em pacientes com tumores avançados ou metastáticos. Isso suporta uma associação direta de CFDNA com uma carga tumoral54. A concentração de CFDNA no sangue varia significativamente entre 0,5 e >1000 ng/mL em pacientes com câncer e entre 0 e 100 ng/mL em indivíduos saudáveis18. Para a preparação da biblioteca, é necessário um mínimo de 0,5 ng de CFDNA. Para alcançar a quantidade mínima de demanda de CFDNA para sequenciamento, pode-se começar com um mínimo de 2 mL de uma amostra de sangue ou 1 mL de amostra de plasma. Além disso, erros técnicos durante a extração de cfDNA de plasma também reduzem o rendimento do CFDNA, e a concentração resultante, desviando-se assim da concentração atual de cfDNA plasmática. a degradação do CFDNA pode ocorrer devido a anticoagulantes em tubos EDTA ou devido ao processo de degelo múltiplo e congelamento de amostras de plasma. Uma má atividade de proteinase K durante o processo de lise também resulta em um baixo rendimento de CFDNA. A atividade proteinase K diminui devido à sua exposição prolongada a altas temperaturas. O uso de etanol de baixa concentração em vez de 96-100% durante a etapa de lavagem da extração de CFDNA também causa um baixo rendimento de CFDNA. Portanto, evitar erros técnicos na técnica de biópsia líquida é importante para alcançar resultados precisos e confiáveis.

A análise qualitativa do CFDNA é um passo central, durante o qual se estima a distribuição real dos fragmentos de DNA presentes na amostra de CFDNA extraída. Os resultados quantitativos do CFDNA só são confiáveis após a confirmação de sua pureza por análise qualitativa. Portanto, um gráfico ideal de CFDNA gerado no ensaio analisador de fragmentos de DNA mostra o enriquecimento do pico principal de fragmentos de CFDNA perto de 166 bp, e um pico menor perto de 332 bp de comprimento. Isso indica que a amostra de CFDNA extraída não está contaminada com DNA genômico de WBCs. Se um fragmento for enriquecido de 7.000 bp para a escada de referência (10.380bp) e além, isso indica contaminação de uma amostra de CFDNA com DNA genômico WBC. Se a contaminação genômica de DNA for vista em uma amostra de CFNA após o ensaio de estimativa do tamanho do fragmento de DNA, a amostra pode ser executada em gel de 2% de agarose com uma escada de 100 bp, e o gel pode ser extirpado entre a faixa ~150-200 bp, seguido de um ensaio de extração de gel. Alguma quantidade de CFDNA é perdida durante o processo de seleção do tamanho do gel agarose. No entanto, a etapa de preparação da biblioteca NGS requer um mínimo de 0,5 ng e um máximo de 1.000 ng de material de DNA de entrada para preparar bibliotecas para sequenciamento. Portanto, se a quantidade total de CFDNA for igual ou superior a 0,5 ng, é quantidade suficiente para a etapa de preparação da biblioteca. Além disso, tais amostras passam com sucesso no processo de preparação da biblioteca, e a biblioteca resultante mostra um pico maior perto de 291 bp e um pico menor de 457 bp, devido à adição de índices e adaptadores de 125 bp.

A análise de dados do NGS é o último passo na técnica de biópsia líquida baseada em NGS, e listas de mutações e fusões gene-gene3,55,56,57 são geradas nesta etapa. Mutações e fusões gene-gene que são identificadas podem ser avaliadas de acordo com estudos anteriores sobre paisagens de mutação de câncer58,59, mutações genéticas anteriormente caracterizadas60 ou fusões gene-gene61,62,63. Estes podem servir como prognóstico64 e diagnóstico7 biomarcadores em pacientes com câncer. Por exemplo, a mutação R132H no gene isocitrate desidrogenase 1 (IDH1) é um sinal decisivo do câncer de glioblastoma secundário, e também a distingue do glioblastoma primário no qual essa mutação normalmente está ausente65. Além disso, a leucemia mielogenous crônica (LMC) é caracterizada por uma fusão genética BCR/ABL1 resultante de uma translocação equilibrada entre o cromossomo 9 e 2261. O gene BCR/ABL1 e sua proteína mRNA e de fusão são exclusivos dos progenitores cml e, portanto, constituem um bom alvo para a terapia66.

Diagnóstico avançado, o estadiamento correto do tumor e monitoramento do tratamento é uma estratégia atual para o manejo eficiente do câncer. Até recentemente, a biópsia tecidual tem sido o padrão-ouro para a avaliação histológica dos tecidos tumorais. No entanto, após vastas pesquisas nesta área e o advento da tecnologia, provou que uma única biópsia é incapaz de fornecer toda a paisagem mutacional de um tumor e que biópsias seriais são geralmente impraticáveis para serem realizadas devido à sua invasão, particularmente no glioblastoma e no linfoma, onde biópsias são altamente invasivas. Além disso, aproximadamente 16% das biópsias de agulha estão associadas a complicações processuais67. Além disso, o perfil genômico de alta qualidade requer uma quantidade suficiente de tecido, uma demanda que geralmente não é cumprida pela biópsia da agulha68.

As biópsias líquidas, a partir de uma amostra de sangue de rotina, analisando o DNA derivado do tumor, são encontradas para substituir ou adjuntar os procedimentos de biópsia de tecido de agulha de rotina12. A análise do DNA/cfDNA derivado do tumor através do plasma por biópsia líquida é um procedimento minimamente invasivo e eficaz para o perfil molecular dos tumores. Pode essencialmente permitir o monitoramento do tratamento por amostragem serial ao longo do tempo sem os potenciais riscos e complicações geralmente associados à biópsia tradicional do tecido tumoral devido à sua natureza invasiva69. Além disso, estudos comparando a biópsia da agulha com a análise de CFDNA por biópsia líquida de uma única lesão tumoral descobriram que o perfil do CFDNA pode oferecer uma heterogeneidade molecular completa de que um tumor pode ser abrigado por múltiplas populações clonais distintas70.

No entanto, embora o diagnóstico baseado em CFDNA plasmática tenha muitas vantagens sobre a biópsia do tecido tumoral, ainda existem algumas limitações cruciais que dificultam sua aplicabilidade na prática clínica geral. As limitações do diagnóstico de biópsia líquida baseada em CFDNA incluem o maior custo do procedimento global, a necessidade de DNA de alta qualidade e um bioinformático dedicado para a necessidade de uma vasta análise de dados71. Devido ao problema de gestão de dados associado à análise do CFDNA, o NGS também apresenta problemas em sua aplicação imediata na clínica. Os desafios do gerenciamento de dados que o NGS apresenta se devem principalmente à dificuldade em distinguir entre o ruído de fundo intrínseco do sequenciamento profundo e as aberrações associadas ao tumor72. Por fim, devido à indisponibilidade dos dados de validade clínica e utilidade para a maioria dos ensaios de biópsia líquida, eles estão atualmente confinados apenas aos estudos clínicos e pesquisas básicas13.

Os desenvolvimentos futuros da técnica de biópsia líquida são esperados através de esforços combinados por pesquisas básicas no campo da biologia, fisiologia, biologia molecular, técnicas de ensaio, análise estatística para gerenciamento de dados e tecnologia de aprendizagem demáquinas 73,74. Além disso, inúmeros ensaios clínicos baseados na avaliação do biomarcador cfDNA estão em andamento, e seus resultados ajudarão a estabelecer a validade da técnica. Esses esforços combinados, esperançosamente, estabelecerão a plataforma de biópsia líquida através da análise cfDNA como uma poderosa ferramenta de monitoramento de prognóstico, diagnóstico e tratamento no cenário clínico oncológico nos próximos cinco anos70,75.

Para concluir, a biópsia líquida baseada em CFDNA oferece uma abordagem segura e não invasiva para identificar biomarcadores genômicos que são úteis no manejo de doenças cancerígenas. No entanto, para obter resultados confiáveis e precisos, são particularmente necessários protocolos padronizados para coleta de sangue, separação plasma/WBC, extração de CFDNA e análise quantitativa e qualitativa cfDNA são particularmente necessários74,75.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer aos membros do Laboratório de Genômica do Câncer e Biocomumia de Doenças Complexas por seus agudos insumos observacionais e sua participação em múltiplas discussões em diferentes etapas deste projeto. O apoio ao financiamento inclui a Israel Cancer Association (bolsa ICA para m.F-M 2017-2019) e a bolsa Kamin da Israel Innovation Authority (para m.F-M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

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Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

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