Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Påvisande av cellfritt DNA i blodplasmaprover från cancerpatienter

Published: September 9, 2020 doi: 10.3791/61449
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Cancer Genomics and BioComputing of Complex Diseases laboratory, The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2The Data Science Institute, Bar-Ilan University, 3The Dangoor Centre For Personalized Medicine, Bar-Ilan University

Summary

I detta dokument presenterar vi ett detaljerat protokoll för icke-invasiv flytande biopsi teknik, inklusive blod insamling, plasma och buffy coat separation, cfDNA och sett DNA extraktion, kvantifiering av cfDNA eller könsceller DNA och cfDNA fragment anrikning analys.

Abstract

Att identifiera mutationer i tumörer hos cancerpatienter är ett mycket viktigt steg i sjukdomshanteringen. Dessa mutationer fungerar som biomarkörer för tumördiagnos samt för behandlingsvalet och dess svar hos cancerpatienter. Den nuvarande guldstandardmetoden för att upptäcka tumörmutationer innebär ett genetiskt test av tumör-DNA med hjälp av tumörbiopsier. Denna invasiva metod är dock svårt att utföras upprepade gånger som ett uppföljningstest av tumör mutational repertoaren. Flytande biopsi är en ny och framväxande teknik för att upptäcka tumörmutationer som en lättanvänd och icke-invasiv biopsi strategi.

Cancerceller förökar sig snabbt. Parallellt genomgår många cancerceller apoptos. Skräp från dessa celler släpps ut i patientens cirkulationssystem, tillsammans med fint fragmenterade DNA-bitar, så kallade cellfria DNA-fragment (cfDNA), som bär tumör-DNA-mutationer. För att identifiera cfDNA-baserade biomarkörer med hjälp av flytande biopsiteknik samlas därför blodprover in från cancerpatienterna, följt av separation av plasma och buffy coat. Därefter bearbetas plasma för isolering av cfDNA, och respektive buffy coat bearbetas för isolering av en patients genomiska DNA. Båda nukleinsyraproverna kontrolleras sedan för sin kvantitet och kvalitet. och analyseras för mutationer med hjälp av nästa generations sekvenseringstekniker (NGS).

I detta manuskript presenterar vi ett detaljerat protokoll för flytande biopsi, inklusive blodsamling, plasma och buffy coat separation, cfDNA och könsceller DNA extraktion, kvantifiering av cfDNA eller könsceller DNA och cfDNA fragment anrikning analys.

Introduction

Tekniska framsteg har lett till sekvensering av hundratals cancergenom och transkriptomer1. Detta har bidragit till att förstå landskap av molekylära förändringar över olika cancertyper2. Ytterligare studier på dessa landskap har hjälpt till att karakterisera sekventiella somatiska förändringar och gen-genfusioner3 som är involverade i cancer eller tumörprogression, genom att seriellt störa apoptosvägar4. Därför kan somatiska mutationer och gen-genfusioner ge information om tumörer genom att fungera som biomarkörer hos enskilda patienter för en viss tumörtyp 5, identifiera befintliga primära tumörer prognos6, kategorisera sekundära tumörer baserat på molekyläraförändringar 7, och identifiera druggable tumör mål8. Sådan information kan underlätta vid val av personlig behandling för cancerpatienter och vid bestämning av positiva och negativa behandlingssvar9. Emellertid, erhålla tumör material för att identifiera genomisk profilering av tumörvävnad är ett invasivt förfarande10. Dessutom omfattar en tumör biopsi endast en liten del av en heterogen tumör. och kan därför inte vara representativ för den molekylära profilen för helatumören 11. Seriell övervakning och tumör genotypning kräver en upprepad samling av tumör vävnader, vilket vanligtvis inte är genomförbart på grund av invasiviteten i tumör biopsi förfarande och de säkerhetsproblem som uppstår från sådanaförfaranden 12.

Den flytande biopsitekniken, å andra sidan, har fått enorm uppmärksamhet i precision onkologi under det senaste decenniet13,14. Det beror främst på den icke-invasiva tekniken, och möjligheten att den upprepas vid flera tidpunkter, vilket möjliggör en lättanvänd och säker övervakningsteknik för sjukdomskurserna15,16. Flytande biopsi är baserad på ett fenomen som tumörceller multiplicerar snabbt, och samtidigt genomgår många av dem apoptos och nekros. Detta leder till frisättning av apoptotiskt cellskräp i patienternas blod, tillsammans med DNA-fragmenten som skärs i exakta storlekar under apoptos17. Apoptosen hos icke-cancerceller leder också till att dess cellulära skräp släpps ut i blodet, men apoptoshastigheten i dessa celler är relativt mycket lägre än tumörceller18. Den rationella av den flytande biopsitekniken är att fånga tumörrelaterade molekyler som DNA, RNA, proteiner och tumörceller14,19 som cirkulerar kontinuerligt i blodet. Olika tekniker20 kan användas för analys av dessa molekyler inklusive nästa generations sekvensering (NGS), digital dropppolymeraskedjereaktion (ddPCR), PCR i realtid och enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA). Flytande biopsiteknik gör det möjligt att identifiera biomarkörer som är egenskaper hos tumörceller. Dessa biomarkörmolekyler frigörs inte bara från specifika delar av en tumör, utan snarare från alla delar avtumören 21. Därför representerar markörer som identifierats i flytande biopsi molekylär profilering av en hel heterogen tumör, förutom andra tumörer i kroppen, vilket har fördelar jämfört med vävnad biopsi-baserade tekniken22.

CfDNA har en kort halveringstid i det cirkulerande blodet som sträcker sig från några minuter till 1-2 timmar23. Den korta halveringstiden för cfDNA underlättar dock realtidsanalyser genom att utvärdera behandlingssvar och dynamiska tumörbedömningar. Tumör-härledda cfDNA nivåer indikerar prognostication av tumör stadium/storlek framgår av flera studier, som visade ett samband mellan cfDNA nivåer och överlevnad resultaten24. Dessutom har studier visat att cfDNA har en bättre prediktionskapacitet än befintliga tumörmarkörer25. Prognosen för cfDNA är ännu mer uttalad efter cancerbehandling, högre nivåer av cfDNA efter behandling korrelerar väl med en minskad överlevnadsgrad och resistens mot behandling. Medan lägre nivåer av cfDNA efter behandling i allmänhet motsvarar positivt behandlingssvar. Dessutom underlättar cfDNA tidig upptäckt av behandlingssvar än de traditionella detektionsmetoderna.

CfDNA ökar möjligheten till tidig upptäckt av cancerrelaterade mutationer: under tidig sjukdom15, uppkomsten av symtom26 och före cancerdiagnos upp till 2 år27. Eftersom cfDNA frigörs från flera tumörregioner eller högborgar ger analysen en omfattande bild av tumörgenomet det representerar28. Därför gör cfDNA det möjligt att upptäcka somatiska mutationer som kan ha missats i vävnadsproverna29. Som intra-tumor heterogenitet och subklonala mutationer kan detekteras genom djup sekvensering av genomiska regioner som spänner över tusentals baser, gör analysen av cfDNA det möjligt att avslöja specifika molekylära subtyper med distinkta genomiska signaturer13. För att få en liknande informationsnivå genom vävnadsprov skulle många fasta tarmbiopsier ha behövts.

Dessutom visade cfDNA nivåer hos patienter med en lokaliserad sjukdom såsom kolon, äggstockscancer och lungcancer efter en kirurgisk behandling och/eller kemoterapi, vara en kraftfull prognostiska markör för cancer återkommande och behandling resultat20. Dessutom, hos patienter med tjocktarms-, bröst- och lungcancer, kunde analyser av cfDNA från blodet framgångsrikt upptäcka de tumörspecifika förändringarna, vilket ledde till den exakta förutsägelsen av återkommande flera månader i förväg13. Dessutom markörer för behandlingsresistens, såsom KRAS-mutationer hos patienter med CRC som får anti-EGFR-behandling30; VAFs för gener som PIK3CA, MED1 eller EGFR hos patienter med bröstcancer efter behandlingen med olika terapier31; och EGFR T790M resistensmutation hos lungcancerpatienter som behandlats med EGFR-riktade TKIs32 kan också identifieras genom cfDNA-analys.

Sammanfattningsvis kan cfDNA-analysen användas för att identifiera exakta biomarkörer inom onkologi13,33. I detta protokoll behandlades blodprover från 3 gliompatienter och 3 friska kontroller för att erhålla genomiskt DNA från WBC och cfDNA från plasman. Vid gliomcancer fungerar mutationer i IDH, TERT, ATRX, EGFR och TP53 som en diagnostisk samt prognostiska markörer som kan hjälpa till vid tidig diagnos av gliomtumörer, klassificera olika typer av gliomtumörer, vägleda den exakta behandlingen för den enskilda patienten och förstå behandlingssvaret34,35. Mutationsstatus för dessa gener kan identifieras med hjälp av blod-härledda cfDNA. I detta manuskript presenterar vi ett detaljerat protokoll av plasma-härledda cfDNA som har använts för att studera mutationella förändringar i gliom cancer12. Sådana cfDNA-baserade flytande biopsi protokoll förklaras i denna artikel kan användas för att studera mutationella förändringar i många andra typer av cancer. Dessutom har en ny studie visat att cfDNA-baserad flytande biopsi kan upptäcka 50 olika typer av cancer36.

Insamling, lagring och sändning av blodprover är avgörande steg i detta protokoll, eftersom okontrollerad temperatur under dessa steg orsakar lys av WBC, vilket leder till att genomiskt DNA frigörs från WBC i plasman och orsakar förorening av cfDNA-provet, vilket påverkar resten avproceduren 37. Hemolys på grund av okontrollerad temperatur kan försämra nedströms provberedningsprocesser av cfDNA, såsom PCR steg38. Serumet innehåller en hög andel sett till cfDNA snarare än plasma, även om det presenterar ett stort bakgrundsljud för tumör-associerade cfDNA39. Därför, för att isolera tumör-associerade cfDNA, plasma är ett lämpligt prov39. Blod som dras i ett antikoagulantia som innehåller bloduppsamlingsrör ska centrifugeras omedelbart eller inom upp till två timmar, för att separera plasman och för att undvika cfDNA-kontaminering. I detta protokoll används dedikerade kommersiella cfDNA konserveringsrör för blodsamling (se Materialförteckning),som är ett alternativ till antikoagulantia som innehåller bloduppsamlingsrör. Dessa dedikerade bloduppsamlingsrör bevarar cfDNA och cfRNA och förhindrar lys av WBC i upp till 30 dagar vid omgivningstemperatur och upp till 8 dagar vid 37 °C. Detta underlättar bibehållandet av lämplig temperatur under en blodprovstransport och tills plasma och WBC separeras40.

Det finns för närvarande tre typer av cfDNA-extraktionsmetoder: fasisolering, kiselmembranbaserad spinnkolonn och magnetisk pärlbaserad isolering41. Den kiselmembranbaserade spinnkolonnmetoden gav en hög mängd cfDNA med hög integritet jämfört med andra cfDNA-extraktionsmetoder42.

Den kvantitativa utvärderingen av DNA är ett grundläggande krav inom flytande biopsi, det finns ett behov av att utveckla ett enkelt, överkomligt och standardiserat förfarande för deras enkla implementering och breda användning. Tre vanliga metoder för cfDNA kvantifiering är spektrofotometriska, fluorimetriska och qPCR. Den fluorimetriska metoden har visat sig vara bättre än de andra metoderna för noggrannhet, kostnad och enkel ledning43.

CfDNA: s integritet och renhet kan uppskattas av antingen agarose elektrofores eller kapillär elektrofores. Agarose elektrofores visar varken känslighet vid låg koncentration av cfDNA eller har hög upplösning för att visa exakt fragmentstorlek av cfDNA. Å andra sidan har kapillärelektrofores en fördel jämfört med agaroseelektroforesen genom att övervinna de tillhörande utmaningarna och därför allmänt använda av forskarna för cfDNA fragmentstorleksanalys. I detta protokoll uppskattades fragmentstorleksfördelningen av isolerade cfDNA med hjälp av ett automatiserat kapillärelektroforesinstrument (se Materialförteckning ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Före blodinsamling krävs informerat samtycke från försökspersoner som deltar i forskningen och måste erhållas. Forskningen som beskrivs i detta manuskript utfördes i enlighet med och överensstämmelse med Rabin Medical Center, Israels etikkommitté (etikkod: 0039-17-RMC) och medicinska fakulteten Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Tysklands etikkommitté (etikkod: D 405/14).

1. Insamling och lagring av blodprover i cfDNA- eller cfRNA-konserveringsrör

  1. Märk konserveringsrören korrekt
  2. Samla ~8 ml blod i cf-DNA-konserveringsröret (se Materialförteckningen),med hjälp av en blodsamlingsset och en hållare, enligt det institutionella standardprotokollet för venipuncture enligt beskrivningen nedan.
    OBS: Användning av en bloduppsamlingsset kan förhindra eventuellt återflöde av blodet från röret.
    1. Rikta in patienten mot armen i ett nedåtriktat läge.
    2. Håll röret upprätt, med locket vänt uppåt, samtidigt som du ser till att rörinnehållet inte vidrör locket eller nålspetsen.
    3. När blod börjar strömma in i röret, släpp stassen långsamt.
  3. Omedelbart efter att röret har fyllts med blod (maximal kapacitet: 8,4 ml helblod), vänd försiktigt röret (vrid handleden på armen som håller röret med 180° nedåt och bakåt) 5 gånger för att stabilisera provet.
    OBS: Inversion säkerställer att konserveringsmedlet blandas jämnt med provet. Skaka dock inte innehållet igen, inte ens före plasmaberedningen. Otillräcklig blandning av konserveringsmedel med blodprovet leder till destabilisering av innehållet och bildandet av mikropropp eller hemolys. I detta skede kan protokollet fortsättas omedelbart för plasmaseparation eller blodfyllda rör kan vänta i upp till 30 dagar vid omgivningstemperatur (15-25 °C) och upp till 8 dagar vid 37 °C.

2. Separation och förvaring av plasma och buffy coat

  1. Centrifugera det blodfyllda konserveringsröret vid 425 x g i 20 minuter vid rumstemperatur för att separera plasma.
    OBS: Steg 2.2 och 2.3 ska utföras i ett biosäkerhetsskåp.
  2. Pipettera försiktigt ut det övre plasmaskiktet till ett nytt rör i 1 ml alikvoter, utan att störa de nedre lagren.
  3. Överför försiktigt nästa lager av buffy coat till ett nytt rör (skiktet visas som en ring ovanför RBC-pelletsen), samtidigt som RBC undviks i det nedre lagret.
  4. Fortsätt till steg 3 med plasma och steg 4 med den buffy kappan. Förvara vid behov det separerade innehållet vid -80 °C.

3. Rening av cirkulerande cfDNA från 1 ml plasma

OBS: Detta steg utförs med ett kommersiellt kit (se Materialförteckning ). Alla buffertar är försedda med satsen.

  1. Beredning av buffertar och reagenser
    VARNING: Tillsätt inte sura lösningar eller blekmedel direkt i provberedningsavfallet. Guanidinsalter som finns i Lysis buffert, Bindningsbuffert och Tvättbuffert-1 i kombination med blekmedel eller syror kan producera mycket reaktiva föreningar.
    1. Bindningsbuffert: Blanda 300 ml Bindningsbuffertkoncentrat med 200 ml 100 % isopropanol för att göra 500 ml fungerande bindningsbuffert. Förvara i rumstemperatur.
      OBS: Bindningsbufferten möjliggör optimal bindning av de cirkulerande nukleinsyrorna till kiseldioxidmembranet. 500 ml av bindningsbufferten är tillräcklig för bearbetning av 276, 138, 92, 69 eller 55 prover av 1, 2, 3, 4 respektive 5 ml plasma och är stabil i 1 år vid rumstemperatur.
    2. Tvättbuffert-1: Blanda 19 ml tvättbuffert-1 koncentrat med 25 ml 96–100% etanol för att göra 44 ml fungerande tvättbuffert-1. Förvara i rumstemperatur.
      OBS: Tvättbuffert-1 eliminerar de föroreningar som är bundna till kiseldioxidmembranet. 44 ml fungerande tvättbuffert-1 är tillräckligt för bearbetning av 73 prover av 1/2/3/4/5 ml plasma och är stabil i 1 år vid rumstemperatur.
    3. Tvättbuffert-2: Blanda väl 13 ml tvättbuffert-2 koncentrat med 30 ml 96–100% etanol för att göra 43 ml fungerande tvättbuffert-2. Förvara i rumstemperatur.
      OBS: Tvättbuffert-2 eliminerar de föroreningar som är bundna till kiseldioxidmembranet. 43 ml fungerande tvättbuffert-2 är tillräckligt för bearbetning av ~56 prover av 1/2/3/4/5 ml plasma och är stabil i 1 år vid rumstemperatur.
    4. Tillsätt 1 550 μL elueringsbuffert till ett rör som innehåller 310 μg litofiliiserat bärar-RNA för att förbereda en bärar-RNA-lösning på 0,2 μg/μL. Efter att ha löst upp bärar-RNA noggrant, dela lösningen till lämpliga alikvoter och förvara vid –30 °C till –15 °C. Frys inte upp dessa alikvoter mer än 3 gånger. Till Lysis-bufferten, som visas i tabell S1,tillsätt den rekonstituerade bäraren RNA upplöst i elueringsbufferten.
      OBS: Eftersom bärar-RNA inte löses upp direkt i Lysis buffert måste det lösas upp först i en elueringsbuffert och sedan i Lysis Buffer. För det första förstärks bindningen av kiseldioxidmembrankärnor när det finns mycket få målmolekyler i provet. För det andra minskar risken för RNA-nedbrytning på grund av närvaron av stora mängder bärar-RNA.
  2. Innan isoleringen påbörjas, för kolonnerna och proverna till rumstemperatur och justera provvolymerna till 1 ml med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), om det behövs. Förvärm 2 vattenbad eller värmeblock som innehåller 50 ml centrifugeringsrör och 2 ml uppsamlingsrör till 60 °C respektive 56 °C.
  3. Tillsätt 100 μL proteinas K, 1 ml plasma och 0,8 ml Lysis-buffert som innehåller 1,0 μg bärar-RNA (framställd i steg 3.1.4) till ett centrifugerör på 50 ml centrifug. Stäng centrifugröret med ett lock och blanda innehållet genom pulsvirvel i 30 s, samtidigt som du säkerställer en synlig virvel i röret. Noggrann blandning av innehållet är viktigt för effektiv lys.
    OBS: Omedelbart efter virvelvind, fortsätt till steg 3.4, utan dröjsmål.
  4. Inkubera lösningen vid 60 °C i 30 min.
  5. Ta bort locket, tillsätt 1,8 ml av bindningsbufferten i röret och blanda noggrant med pulsvirvel i 15–30 s efter att locket har placerats.
  6. Inkubera den resulterande blandningen i 5 minuter på is och för in kiseldioxidmembrankolonnen i vakuumapparaten som är ansluten till vakuumpumpen. Sätt sedan in en 20 ml rörförlängare i den öppna kolonnen för att förhindra provläckage.
  7. Häll försiktigt den inkuberade blandningen i kolonnens rörförlängare och slå på vakuumpumpen. När all lysatblandning helt rinner genom kolonnerna, stäng av vakuumpumpen, släpp trycket till 0 mbar och ta bort och kassera rörförlängaren.
    OBS: För att undvika korskontaminering bör rörförlängaren kasseras noggrant för att förhindra att den sprids över intilliggande kolonner.
  8. Ta bort kolonnen från vakuumapparaten, sätt in den i uppsamlingsröret och centrifugen vid 11 000 x g i 30 s vid rumstemperatur för att avlägsna eventuellt restlysrör. Kassera genomflödet.
  9. Tillsätt 600 μL tvättbuffert-1 i kolonnen, centrifugera vid 11 000 x g i 1 minut vid rumstemperatur, kassera genomflödet.
  10. Tillsätt 750 μL tvättbuffert-2 till kolonnen, centrifug vid 11 000 x g i 1 minut vid rumstemperatur och kassera genomflödet.
  11. Tillsätt 750 μL etanol (96–100 %) till kolonnen, centrifug vid 11 000 x g i 1 min vid rumstemperatur och kassera genomflödet.
  12. Centrifugera kolonnen vid 20 000 x g i 3 min genom att placera den i ett rent uppsamlingsrör på 2 ml.
  13. Torka membrankolonnenheten helt genom att placera den i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör med locket öppet och inkubera vid 56 °C i 10 min.
  14. Placera kolonnen i ett rent 1,5 ml elueringsrör. Applicera 20–150 μL elueringsbuffert i mitten av kolonnmembranet och inkubera i rumstemperatur i 3 minuter med locket stängt.
    OBS: Se till att elueringsbufferten är jämvikt till rumstemperatur. Vid användning av elueringsbuffert mindre än 50 μL, se till att den fördelas försiktigt på membranets mitt. Detta hjälper till med fullständig eluering av det bundna DNA: t. Elueringsvolymen är dock inte fast och kan ändras enligt nedströmsapplikationerna. Det återvunna eluatet kan vara upp till 5 μL och säkert mindre än elueringsvolymen som appliceras på kolonnen.
  15. Centrifugera det återvunna eluatet i en mikrocentrifug vid 20 000 x g i 1 minut för att eluera nukleinsyrorna och lagra vid -20 °C.

4. Rening av genomiskt DNA från buffy coat

OBS: Kommersiellt kit som används i detta protokoll nämns i materialförteckningen. Buffertar och reagenser som nämns i nedanstående protokoll, dvs Lysis buffert A, Lysis buffert B, Tvättbuffert X, Tvättbuffert Y, Proteinasbuffert, Elutionbuffert och Proteinas K ingår i detta kommersiella kit.

  1. Beredning av buffertar och reagenser
    VARNING: Tillsätt inte sura lösningar eller blekmedel direkt i provberedningsavfallet. Guanidinsalter som finns i Lysis buffert B och Tvättbuffert X i kombination med blekmedel eller syror kan ge mycket reaktiva föreningar.
    1. Tvättbuffert Y: Blanda väl 12 ml tvättbuffert Y-koncentrat med 48 ml etanol (96–100 %) för att erhålla 60 ml fungerande tvättbuffert Y. Förvaras i rumstemperatur.
      OBS: 60 ml fungerande tvättbuffert Y är tillräckligt för bearbetning av 100 buffy coat prover och är stabil i 1 år.
    2. Proteinas K: Förbered Proteinas K-lösningen genom att lösa upp 30 mg lyofiliserat proteinas K till 1,35 ml proteinasbuffert.
      OBS: Total arbetslösning av Proteinase K är tillräcklig för bearbetning av 52 buffy coat prover. Proteinas K arbetslösning kan lagras i minst 6 månader vid -20 °C.
  2. Steg innan förfarandet inleds
    1. Balansera den buffiga kappan till rumstemperatur.
    2. Ställ in värmeblocket eller vattenbadet på 56 °C.
  3. Suspendera buffy coat i Lysis buffert A för att få en slutlig volym på 200 μL. Tillsätt sedan 25 μL Proteinase K-lösning och 200 μL Lysis buffert B. Blanda genom att virvla och inkubera vid 70 °C i 10–15 min. Se till att proverna är helt täckta med lyslösningen.
    OBS: För bearbetningsserier av prover kan Proteinase K och Lysis buffert A förblandas 10–15 minuter före ingreppet, men inte längre innan dess, eftersom Proteinase K självsmältning i Lysis buffert A utan substrat.
  4. Tillsätt 210 μL 96–100 % etanol till ovanstående blandning och virvel kraftigt.
    OBS: Tillsats av etanol kan bilda en sträng fällning; Detta kommer dock inte att påverka DNA-isoleringen. Var noga med att ladda fällningen även på kolumnen, som visas i följande steg.
  5. Ladda hela provet på kiseldioxidkolonnen som placeras i ett uppsamlingsrör. Centrifugera i 1 min vid 11 000 x g. Placera kolonnen i ett nytt uppsamlingsrör och kassera föregående rör tillsammans med genomflöde.
    OBS: Upprepa centrifugeringssteget om provet inte dras helt genom matrisen.
  6. Tillsätt 500 μL tvättbuffert X, centrifugera i 1 min vid 11 000 x g och kassera genomflödet.
  7. Placera kolonnen i uppsamlingsröret, tillsätt 600 μL tvättbuffert Y på kolonnen, centrifug i 1 min vid 11 000 x g och kassera genomflödet.
  8. Placera återigen kolonnen i uppsamlingsröret och centrifugera kolonnen i 1 min vid 20 000 x g för att torka kiseldioxidmembranet.
  9. Inkubera kolonnen vid rumstemperatur i 1 min, placerad i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt sedan 100 μL elueringsbuffert. Eluera sedan DNA genom att centrifugera i 1 min vid 11 000 x g och lagra vid -20 °C.

5. Kvantifiering av cfDNA och genomiskt DNA med hjälp av fluorometer

  1. Innan du startar protokollet utför du följande steg.
    1. Späd 2 μL eluterat genomiskt DNA (från steg 4.9) i proportionerna 1:10 med ultrapure nukleasfritt vatten. På grund av förväntade låga koncentrationer, späd inte cfDNA-prover från steg 3.15.
    2. Jämvikta analysen Standard #1 och analys Standard #2 rumstemperatur.
  2. Förbered totalt 6 tunnväggiga klara rör med en storlek på 0,5 ml.
    OBS: Det protokoll som presenteras är för kvantifiering av 2 cfDNA och 2 genomiska DNA-prover, därför 4 rör för 4 prover och denna analys kräver 2 standarder.
  3. Märk rörets lock.
    OBS: Märkning på sidan av röret kan störa avläsningen. Dessutom är standardrören märkta noggrant, eftersom kalibreringen av fluorometern kräver att standarderna är i rätt ordning.
  4. Späd ut analysreagenset i 1:200 med analysbufferten för att förbereda arbetslösningen. För 4 prover och 2 standarder, använd 6 μL analysreagens plus 1 194 μL assaybuffert för att göra 1 200 μL (200 μL i varje rör) arbetslösning.
    OBS: Använd inte en glasbehållare, använd istället ett rent plaströr. Varje rör måste innehålla cirka 200 μL av den slutliga volymen (ett standardrör för analys måste innehålla 190 μL av arbetslösningen, och provröret måste innehålla 180–199 μL av arbetslösningen). Tillräcklig arbetslösning måste beredas för att uppfylla alla analysstandarder och prover.
  5. I standardrören för arbetsanalys, tillsätt 190 μL arbetslösning och 10 μL-analysstandard och blanda lösningen genom att virvla i 2–3 s. Undvik bildandet av bubblor i lösningen.
  6. Tillsätt 198 μL arbetslösning och 2 μL cfDNA eller genomiskt DNA i provrören. Blanda lösningen genom att virvla i 2–3 s och håll den inkuberad i rumstemperatur i 2 min.
  7. På fluorometerinstrumentets " hemskärm " trycker du på" DNA" och väljer "dsDNA High Sensitivity Assay", för att visa skärmen "Standards" och tryck sedan på "Ja" på fluorometerns "Standards" skärm för att läsa standarderna.
  8. I provkammaren sätter du in #1, stänger locket och trycker på 'Läs'. Ta bort röret när avläsningen är klar (cirka 3 s) och upprepa samma steg för Standard #2.
  9. En provskärm visas efter kalibreringsprocessens slutförande, sätt sedan in ett provrör och upprepa steg "5.8". "Provskärmen" visar sedan ett värde som motsvarar provets koncentration efter utspädning i provröret.
  10. För varje prov upprepas steg "5.9", tills alla prover har lästs.
  11. Använd följande ekvation för att beräkna den faktiska koncentrationen av provet.
    Equation 1
    OBS: Analysvärdena är i ng/ml och motsvarar koncentrationen efter utspädning i analysröret. Ekvation som nämns i ovanstående steg 5.11, QF-värde är värdet som ges av fluorometerinstrumentet, och x är antalet mikroliter av prov som tillsätts till analysröret. Enheterna för QF-värden som genereras av ekvationen liknar det värde som fluorometern ger. Om till exempel fluorometerns värde är i ng/ml är enheterna för koncentrationen som beräknas med ekvationen ng/ml.

6. DNA-fragmentstorleksfördelning av cfDNA av fragmentanalysator

  1. Steget innan proceduren påbörjas: Balansera DNA-färgkoncentratet och DNA-gelmatrisen till rumstemperatur i 30 min.
  2. Beredning av gelfärgblandningen
    VARNING: Hantera lösningar med försiktighet eftersom DMSO är känt för att underlätta inträdet av organiska molekyler i vävnader.
    1. Tina DMSO noggrant genom att vibrerande DNA-färgämneskoncentratflaskan i 10 s. Pipett ut 15 μL av detta koncentrat till en DNA-gelmatrisflaska och förvaras vid 4 °C i mörker.
    2. Återigen virvel den kapade injektionsflaskan i 10 s tills blandning av gel och färgämne visualiseras.
    3. Häll blandningen på ett spinnfilter till det övre kärlet.
    4. Mikrocentrifug spinnfiltret vid 2 240 x g ± 20% i 10 min vid rumstemperatur.
    5. Märk det beredda gelfärgämnet i röret och kassera filtret enligt god laboratoriepraxis. Märk röret och registrera förberedelsedatumet.
      OBS: Kassera filtratet enligt god laboratoriepraxis. Gelfärgblandningen kan användas för 5 HS-DNA-chips (High Sensitivity). Förvara vid 4 °C om den inte används i mer än 1 timme. Förvaring i mörker är möjlig i upp till 6 veckor.
  3. För att ladda gelfärgblandningen, se till att spånprimingstationens bottenplatta är placerad och justera klämman i lägsta läge.
    1. Jämvikt gelfärgblandningen till rumstemperatur i 30 minuter, samtidigt som ljusexponeringen övervakas.
    2. Ta ett nytt HS DNA-chip från en förseglad påse och placera det på chipprimingstationen, ta sedan bort 9,0 μL av gelfärgblandningen och dispensera den längst ner på spånbrunnen, märkt som "G".
      OBS: Dra upp gelfärgblandningen och undvik partiklar som kan ackumuleras i botten av injektionsflaskan. Medan du doserar gelfärgblandningen i HS DNA-chipbrunnen, sätt in pipettens spets helt för att förhindra bildandet av stora luftbubblor. Dessutom kommer beröring av pipetten vid brunnens kanter att ge dåliga resultat.
    3. Placera kolven på 1 ml och stäng spånprimingstationen. Se till att låset på spärren klickar och ställ in timern på 60 s, tryck sedan ner kolven tills den hålls av klämman, och exakt efter 60 s släpper du kolven med clip-release-mekanismen.
    4. När kolven drar sig tillbaka åtminstone till 0,3 ml-märket, vänta i 5 s och dra sedan långsamt tillbaka till 1 ml-positionen, öppna sedan chipprimingstationen och ta bort 9,0 μL gelfärgblandningen och dispensera längst ner på HS DNA-chipbrunnen, märkt som "G".
  4. För att ladda DNA-markören, dispensera 5 μL av DNA-markören i brunnen, markerad med stegsymbolen. Upprepa proceduren för alla 11 provbrunnar.
  5. För att ladda stegen och proverna, dela ut 1 μL av DNA-stegen i brunnen, markerad med stegsymbolen och tillsätt sedan 1 μL prov (använda brunnar) eller 1 μL markör (oanvända brunnar) i alla 11 provbrunnar.
  6. Virvel HS DNA-chip för 60 s vid 2 400 varv/min genom att placera chipet horisontellt i adaptern. Se till att utbuktningen som fixar HS DNA-chipet inte skadas under virvel.
  7. För att sätta in HS DNA-chippet i fragmentanalysatorinstrumentet, öppna locket och se till att elektrodpatronen är korrekt insatt, och spånväljaren är placerad till "dsHög känslighets-DNA" i fragmentanalysatorinstrumentet.
  8. Montera försiktigt HS DNA-chippet i behållaren, som endast passar enkel väg, och tappa sedan locket genom att se till att elektrodpatronen passar exakt in i HS DNA-chipens brunnar.
  9. Displayen på fragmentanalysatorns programvaruskärm indikerar det insatta HS DNA-chipet och det slutna locket, genom chipikonen längst upp till vänster på skärmen.
  10. Om du vill initiera HS DNA-chipkörningen väljer du dsDNA High Sensitivity Assay på menyn "Assay" på instrumentskärmen och fyller sedan i tabellen med provnamn genom att mata information som provnamn och kommentarer och starta chipkörningen genom att klicka påknappen "Start" längst upp till höger på skärmen.
  11. Elektrodrengöring efter en HS DNA-chipkörning: Ta omedelbart bort det använda HS DNA-chipet så snart analysen är klar och kassera den enligt god laboratoriepraxis. Utför följande procedur för att säkerställa att elektroderna är rena, utan rester från den tidigare analysen.
    1. Fyll långsamt 350 μL avjoniserat analysvatten i en av elektrodrengöringsbrunnarna och placera elektrodrengöringsmedel i fragmentanalysatorinstrumentet genom att öppna locket och sedan stänga locket och vänta i ca 10 s.
    2. Ta bort elektrodrengöringsmedel genom att öppna locket och vänta till ytterligare 10 s, så att vattnet på elektroderna avdunstar innan locket stängs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Plasmaseparation
8,5-9 ml blod som samlats in i cfDNA- eller cfRNA-konserveringsrör ger cirka ~4 ml plasma i volym. Mängden plasma som separeras från blod som samlats in i EDTA-rör kan variera beroende på temperaturen. Exponering av EDTA-rör som innehåller blod vid en temperatur över 37 °C leder till minskadplasmavolymutbyte 44.

Resultat av fluorometeranalys
cfDNA koncentration i 1 ml plasma av var och en av glioma patienter #1 och #3 och friska kontroller #H1, #H2 och #H3 var 137 ng, 12,6 ng, 6,52 ng, 2,26 ng och 2,48 ng, respektive. I glioma patienten var #2 cfDNA koncentrationen för låg för att detekteras i en fluorometer. cfDNA-koncentrationen i en cancerpatients 1 ml plasma varierar från 0, 5 till >1000 ng18, med ett medelvärde på 20 ng. Hos friska personer varierar cfDNA-koncentrationen från en oidentifierbar koncentration till 16 ng, med ett medelvärde på 8 ng45. Genomiskt DNA isolerat från 200 μL buffy coat (PBMCs) ger cirka 25- 50 μg DNA.

DNA-fragmentanalysanalysresultat
Enligt en tidigare studie berikas cfDNA i 166-bp långa fragment, som står för ~ 85% av den totala cfDNA i en patients plasma. Däremot står 332 bp långa fragment för 10%, och 498 bp långa fragment står för 5% av cfDNA46. Två huvudfaktorer som påverkar cfDNA fragment analys analys resultat är genomisk DNA förorening från PBMCs och låg koncentration av cfDNA. Figur 1 visar den förväntade cfDNA bioanalyzer grafen av gliom patient #1, där cfDNA fragment berikas vid 166 bp och det finns ingen genomisk DNA-förorening i provet21. Figur 2 visar fragmentanrikningsdiagrammet efter NGS-biblioteksberedningen av cfDNA av gliompatienten #1 och fragmentberikningen flyttas från 166 bp till 291 bp, på grund av fastsättning av 125 bp index och adaptrar till den. Figur 3 visar mycket liten berikning av cfDNA fragment av glioma patienten #2. Trots den låga cfDNA-koncentrationen hos gliompatienten #2 leder tillsats av NGS-adaptrar till cfDNA- och PCR-förstärkningsstegen till den synliga cfDNA-bibliotekstoppen på fragmentanrikningsdiagrammet figur 4. Därför utarbetades biblioteket framgångsrikt från detta cfDNA-prov med låg koncentration, vilket visas i figur 4. I figur 5visas cfDNA-fragmenten av gliompatienten #3 nå en topp nära 166 bp, men genomisk DNA-kontaminering är också uppenbar nära referensstegens topp på 10380 bp.

Figure 1
Figur 1: Ett idealiskt cfDNA fragment analysator analys diagram över glioma prov #1 cfDNA. En större topp observerades vid 166 bp och en mindre topp observerades vid 332 bp. Det fanns ingen genomisk förorening sett i detta prov, som uppstår nära den 10,380 bp övre markören. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Bild 2: Ett idealiskt cfDNA fragment analysator analys diagram över glioma prov #1 cfDNA bibliotek. Efter att ha ligaterat 125 bp nästa generations sekvenseringsbiblioteksadaptrar visade 166 bp och 332 bp cfDNA-fragment en stor topp på 291 bp respektive en mindre topp på 457 bp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: cfDNA fragment analysator analys diagram över gliom prov #2 cfDNA, visar en mycket liten topp på 166 bp. På grund av den låga koncentrationen av cfDNA var toppen på 166 bp knappt synlig. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: cfDNA fragment analysator analys diagram för cfDNA bibliotek av glioma prov #2. Efter att ha ligaterat 125 bp nästa generations sekvenseringsbiblioteksadaptrar och utfört PCR-cykler under biblioteksförberedelser, var den knappt synliga cfDNA-toppen på 166 bp eller helt osynliga toppar på 332 bp och 498 bp, tydligt synliga. En stor topp var närvarande nära 291 bp och en mindre topp på 457 bp, 623 bp, 789 bp och nära 2.500 bp observerades. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: cfDNA fragment analysator analys som visar genomisk DNA-förorening i gliom prov #3 cfDNA. En liten topp på 166 bp anges förekomsten av cfDNA och anrikning nära övre markör (10,380 bp) var genomisk DNA-förorening. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Tabell S1: Volymer av lysbufferten och bärar-RNA (upplösta i buffert AVE) som krävs för bearbetning av 1 ml plasmaprover. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Insamling av en patients blod i ett rör, transport och lagring är avgörande inledande steg i flytande biopsi. Felaktig hantering kan försämra plasmans kvalitet och kan därför störa resultaten av den flytande biopsin47. Om ett blodprov samlas in i ett EDTA-blodrör måste plasman separeras inom två timmar efter blodinsamlingen för att undvika lys av WBC och frisättning av dess genomiska DNA i plasma48. WBC kan också genomgå apoptos i ett EDTA-rör om det förvaras under en längre tid, och de resulterande cfDNA-fragmenten kan förorena original cfDNA i plasma48. Exponering av ett blodprov vid hög temperatur (>37 °C) eller överdriven skakning av röret innan plasmaseparation orsakar hemolys. Hemoglobin som följaktligen förblir som en förorening i plasma påverkar cfDNA: s nedströmsprocesser, till exempel under biblioteksberedning49. Hög temperatur (>37 °C) påverkar också utbytet av plasma i ett EDTA-blodrör. Därför är snabb separation av plasma efter insamlingen i ettEDTA-rör 50 ett viktigt steg i kvalitetskontrollen av metoden. Om blod samlas i kommersiellt cfDNA- eller cfRNA-konserveringsrör ska konserveringskemikalien blandas med blodet omedelbart efter blodinsamlingen40. Underlåtenhet att korrekt blanda den konserverande kemikalien leder till bildandet av mikroklor i plasman. Dessa täpper till kiseldioxidmembranen i en kolumn under cfDNA-extraktionsprocessen och sänker utbytet av cfDNA. Måttlig skakning av blod i röret orsakar inte hemolys; även om överdriven skakning kan orsaka hemolys även i dessa rör40. Därför bör överdriven skakning undvikas under transporten eller hanteringen av dessa rör. Blodrör rekommenderas att skickas i upprätt läge.

Korrekt kvantifiering och bedömning av cfDNA koncentration per enhet plasma är ett viktigt steg i flytande biopsi, eftersom plasma cfDNA koncentration är direkt associerad med fysiologiska och patologiska processer51. CfDNA- koncentrationen är högre hos patienter med cancer än hos friska försökspersoner52. Ökad cfDNA-koncentration i humant blod är inte specifik för cancer; gravida kvinnor och patienter som får transplantationer tenderar också att ha förhöjda cfDNA koncentrationer i blodet21. Föreningar har också visats för inflammation, vävnad trauma, diabetes, hjärtinfarkt och sepsis med en ökad nivå av cfDNA koncentration53. Koncentrationen av plasma cfDNA i tidiga cancerpatienter tenderar att vara lägre än hos patienter med avancerade eller ögonbevarande tumörer. Detta stöder en direkt associering av cfDNA med en tumör börda54. CfDNA-koncentrationen i blodet varierar signifikant mellan 0, 5 och >1000 ng/ml hos cancerpatienter och mellan 0 och 100 ng/ml hos friska försökspersoner18. För biblioteksförberedelserna krävs minst 0,5 ng cfDNA. För att uppnå minsta möjliga efterfrågan på cfDNA för sekvensering kan man börja med minst 2 ml blodprov eller 1 ml plasmaprov. Dessutom minskar tekniska fel under plasma cfDNA extraktion också cfDNA avkastning, och den resulterande koncentrationen, därmed avviker från den faktiska plasma cfDNA koncentrationen. cfDNA nedbrytning kan uppstå på grund av antikoagulantia i EDTA-rör eller på grund av processen med flera upptining och frysning av plasmaprover. En dålig aktivitet av proteinas K under lysisprocessen resulterar också i ett lågt utbyte av cfDNA. Proteinas K-aktiviteten minskar på grund av dess långvariga exponering för höga temperaturer. Användningen av lågkoncentration etanol istället för 96-100% under cfDNA extraktionstvättsteget orsakar också ett lågt utbyte av cfDNA. Därför är det viktigt att undvika tekniska fel i vätskebiopsitekniken för att uppnå exakta och tillförlitliga resultat.

Kvalitativ analys av cfDNA är ett centralt steg, under vilket den faktiska fördelningen av DNA-fragment som finns i det extraherade cfDNA-provet uppskattas. Kvantitativa resultat av cfDNA är tillförlitliga först efter att ha bekräftat dess renhet genom kvalitativ analys. Därför visar en idealisk graf av cfDNA som genereras i DNA-fragmentanalysatoranalysen berikning av den största toppen av cfDNA-fragment nära 166 bp och en mindre topp nära 332 bp längd. Detta indikerar att det extraherade cfDNA-provet inte är förorenat med genomiskt DNA från WBC. Om ett fragment berikas från 7 000 bp till referensstegen (10,380bp) och därefter, indikerar detta förorening av ett cfDNA-prov med WBC-genomiskt DNA. Om genomisk DNA-kontaminering ses i ett cfDNA-prov efter DNA-fragmentstorleksuppskattningsanalys kan provet köras på 2% agarosgel med en stege på 100 bp, och gel kan strukas mellan intervallet ~ 150-200 bp, följt av en gelextraktionsanalys. En del av cfDNA går förlorad under agarose gel storlek urvalsprocessen. NGS biblioteksförberedelsesteg kräver dock minst 0,5 ng och högst 1 000 ng indata-DNA-material för att förbereda bibliotek för sekvensering. Därför, om den totala kvantiteten cfDNA är lika med eller mer än 0,5 ng, är det tillräckligt med kvantitet för biblioteksförberedelsesteg. Dessutom passerar sådana prover biblioteksberedningsprocessen framgångsrikt, och det resulterande biblioteket visar en stor topp nära 291 bp och en mindre topp på 457 bp, på grund av tillägg av 125 bp index och adaptrar.

NGS-dataanalysen är det sista steget i den NGS-baserade flytande biopsitekniken, och listor över mutationer och gen-genfusioner3,55,56,57 genereras i detta steg. Mutationer och gen-genfusioner som identifieras kan bedömas enligt tidigare studier på cancermutationslandskap58,59, tidigare karakteriserade genmutationer60 eller gengenfusioner61,62,63. Dessa kan fungera som prognostiska64 och diagnostiska 7 biomarkörer hos cancerpatienter. Till exempel är R132H mutationen i isocitrate dehydrogenas 1 (IDH1) genen en avgörande teckenpost för sekundär glioblastom cancer, och skiljer den också från primära glioblastom där denna mutation normalt är frånvarande65. Dessutom kännetecknas kronisk myeloisk leukemi (CML) av en BCR/ ABL1 genfusion som härrör från en balanserad flyttning mellan kromosom 9 och 2261. BCR/ABL1 genen och dess mRNA och fusion protein är unika för CML föregångare och utgör därför ett bra mål för terapi66.

Avancerad diagnos, korrekt iscensättning av tumör och behandling övervakning är en aktuell strategi för effektiv hantering av cancer. Fram till nyligen har vävnad biopsi varit guld standard för histologiska utvärdering av tumör vävnader. Men efter omfattande forskning på detta område och teknikens tillkomst har det visat sig att en enda biopsi inte kan ge hela mutationslandskapet i en tumör och att seriella tarmbiopsier vanligtvis är opraktiska att utföra på grund av deras invasivitet, särskilt i glioblastom och lymfom, där tarmbiopsier är mycket invasiva. Dessutom är cirka 16% av nål tarmbiopsier associerade med procedurmässiga komplikationer67. Dessutom kräver högkvalitativ genomisk profilering en tillräcklig mängd vävnad, ett krav som vanligtvis inte uppfylls av nålbiopsin68.

De flytande tarmbiopsierna, från ett rutinmässigt blodprov genom att analysera tumör-härlett DNA, befinns ersätta eller adjungera de rutinmässiga nålvävnad biopsiförfarandena 12. Analys av tumör-härledda DNA/ cfDNA genom plasma genom flytande biopsi är ett minimalt invasivt och effektivt förfarande för molekylär profilering av tumörer. Det kan i huvudsak tillåta behandling övervakning genom seriell provtagning över tid utan de potentiella risker och komplikationer som vanligtvis förknippas med traditionell tumör vävnad biopsi på grund av dess invasiva natur69. Dessutom fann studier som jämförde nålbiopsin med cfDNA-analys genom flytande biopsi av en enda tumör lesion att cfDNA profilering kan erbjuda en fullständig molekylär heterogenitet att en tumör kan hysas av flera distinkta klonurumpopulationer70.

Men även om plasma cfDNA-baserad diagnos har många fördelar jämfört med tumörvävnad biopsi, Det finns fortfarande några avgörande begränsningar som hämmar dess tillämplighet i den allmänna kliniska praxis. Begränsningar av cfDNA-baserad vätskebiopsidiagnos inkluderar den högre kostnaden för det övergripande förfarandet, behovet av högkvalitativt DNA och en dedikerad bioinformatiker för behovet av en omfattande dataanalys71. På grund av datahanteringsproblem i samband med cfDNA-analys utgör NGS också problem i sin omedelbara tillämpning på kliniken. Utmaningarna med den datahantering som NGS utgör beror främst på svårigheten att skilja mellan det inneboende bakgrundsljudet från djup sekvensering och de avvikelser som är förknippade medtumören 72. Slutligen, på grund av att de kliniska validitets- och nyttodata inte är tillgängliga för de flesta flytande biopsianalyser, är de för närvarande begränsade endast till de kliniska studierna och grundforskningarna13.

Den framtida utvecklingen inom den flytande biopsitekniken förväntas genom kombinerade ansträngningar av grundforskning inom biologi, fysiologi, molekylärbiologi, analystekniker, statistisk analys för datahantering och maskininlärningsteknik73,74. Dessutom pågår många kliniska prövningar baserade på cfDNA biomarkör utvärdering, och deras resultat kommer att bidra till att fastställa teknikens giltighet. Dessa kombinerade ansträngningar kommer förhoppningsvis att etablera den flytande biopsiplattformen genom cfDNA-analys som ett kraftfullt prognostiskt, diagnostiskt och behandlingsövervakningsverktyg i onkologins kliniska miljö inom de närmaste fem åren70,75.

Sammanfattningsvis erbjuder den cfDNA-baserade flytande biopsin ett säkert och icke-invasivt tillvägagångssätt för att identifiera genomiska biomarkörer som är användbara vid hantering av cancersjukdomar. För att uppnå tillförlitliga och exakta resultat krävs dock standardiserade protokoll för blodinsamling, plasma/ WBC-separation, cfDNA-extraktion och cfDNA kvantitativ och kvalitativanalys särskilt 74,75.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna vill tacka medlemmarna i Laboratoriet för cancergenomik och biodatorer av komplexa sjukdomar för deras skarpa observationsinsatser och deras deltagande i flera diskussioner i olika skeden av detta projekt. I finansieringsstödet ingår Israel Cancer Association (ICA-bidrag för M.F-M 2017-2019) och Kamin-bidrag från Israel Innovation Authority (för M.F-M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent Technologies, Inc. G2939BA The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5042-1398 Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies, Inc. 5067-4626 The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes Norgen Biotek Corp. 63950 Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station Agilent Technologies, Inc. 5065-4401 Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit Agilent Technologies, Inc. 5065-9951 Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix Agilent Technologies, Inc. 185-5990 Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex IKA-Werke GmbH & Co. KG MS-3-S36 Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit MACHEREY-NAGEL 740952.5 With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells
(e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit Qiagen 55114 The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold Qiagen 19413 The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System Qiagen 19419 In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32851 The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump Qiagen 84010 used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campbell, P. J., et al. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).
  2. Liotta, L., Petricoin, E. Molecular profiling of human cancer. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 48-56 (2000).
  3. Balamurali, D., et al. ChiTaRS 5.0: the comprehensive database of chimeric transcripts matched with druggable fusions and 3D chromatin maps. Nucleic Acids Research. 48 (1), 825-834 (2019).
  4. Trédan, O., et al. Molecular screening program to select molecular-based recommended therapies for metastatic cancer patients: Analysis from the ProfiLER trial. Annals of Oncology. 30 (5), 757-765 (2019).
  5. Oliveira, K. C. S., et al. Current perspectives on circulating tumor DNA, precision medicine, and personalized clinical management of cancer. Molecular Cancer Research. 18 (4), 517-528 (2020).
  6. Siegal, T. Clinical impact of molecular biomarkers in gliomas. Journal of Clinical Neuroscience. 22 (3), 437-444 (2015).
  7. Komori, T. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System: The Major Points of Revision. Neurologia medico-chirurgica. 57 (7), 301-311 (2017).
  8. Duffy, M. J., O'Donovan, N., Crown, J. Use of molecular markers for predicting therapy response in cancer patients. Cancer Treatment Reviews. 37 (2), 151-159 (2011).
  9. Saenz-Antoñanzas, A., et al. Liquid Biopsy in Glioblastoma: Opportunities, Applications and Challenges. Cancers. 11 (7), 950 (2019).
  10. Marrugo-Ramírez, J., Mir, M., Samitier, J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopsy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2877 (2018).
  11. Pantel, K., Alix-Panabières, C. Liquid biopsy in 2016: Circulating tumour cells and cell-free DNA in gastrointestinal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 73-74 (2017).
  12. Bronkhorst, A. J., et al. The emerging role of cell-free DNA as a molecular marker for cancer management. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100087 (2019).
  13. Cescon, D. W., Bratman, S. V., Chan, S. M., Siu, L. L. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer. 1 (3), 276-290 (2020).
  14. Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, 175883591879463 (2018).
  15. Cohen, J. D. J., et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 926-930 (2018).
  16. Wan, J. C. M., et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 223-238 (2017).
  17. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nature Reviews Genetics. 20 (2), 71-88 (2018).
  18. Thierry, A. R., et al. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (3), 347-376 (2016).
  19. Buscail, E., et al. High Clinical Value of Liquid Biopsy to Detect Circulating Tumor Cells and Tumor Exosomes in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients Eligible for Up-Front Surgery. Cancers. 11 (11), 1656 (2019).
  20. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry. 61 (1), 112-123 (2015).
  21. Kustanovich, A., Schwartz, R., Peretz, T., Grinshpun, A. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biology and Therapy. 20 (8), 1057-1067 (2019).
  22. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
  23. Celec, P., et al. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, (2018).
  24. Gautschi, O., et al. Origin and prognostic value of circulating KRAS mutations in lung cancer patients. Cancer Letters. 254 (2), 265-273 (2007).
  25. Bidard, F., et al. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. International Journal of Cancer. 134 (5), 1207-1213 (2013).
  26. Chan, K. C. A., et al. Analysis of Plasma Epstein–Barr Virus DNA to Screen for Nasopharyngeal Cancer. New England Journal of Medicine. 377 (6), 513-522 (2017).
  27. Mao, L., et al. Detection of Oncogene Mutations in Sputum Precedes Diagnosis of Lung Cancer. Cancer Research. 54 (7), 1634-1637 (1994).
  28. De Mattos-Arruda, L., et al. Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nature communications. 6 (1), 8839 (2015).
  29. Khier, S., Lohan, L. Kinetics of circulating cell-free DNA for biomedical applications: critical appraisal of the literature. Future science OA. 4 (4), 295 (2018).
  30. Misale, S., et al. Resistance to Anti-EGFR therapy in colorectal cancer: From heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discovery. 4 (11), 1269-1280 (2014).
  31. Beddowes, E., Sammut, S. J., Gao, M., Caldas, C. Predicting treatment resistance and relapse through circulating DNA. Breast. 34, 31-35 (2017).
  32. Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA oncology. 2 (8), 1014-1022 (2016).
  33. Vaidyanathan, R., et al. Cancer diagnosis: from tumor to liquid biopsy and beyond. Lab on a Chip. 19 (1), 11-34 (2019).
  34. Kelly, P. Gliomas: Survival, origin and early detection. Surgical Neurology International. 1 (1), 96 (2010).
  35. Faria, G., Silva, E., Da Fonseca, C., Quirico-Santos, T. Circulating Cell-Free DNA as a Prognostic and Molecular Marker for Patients with Brain Tumors under Perillyl Alcohol-Based Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1610 (2018).
  36. Liu, M. C., et al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Annals of Oncology. 31 (6), 745-759 (2020).
  37. Enko, D., Halwachs-Baumann, G., Kriegshäuser, G. Plasma free DNA: Evaluation of temperature-associated storage effects observed for roche cell-free DNA collection tubes. Biochemia Medica. 29 (1), 153-156 (2019).
  38. Streleckiene, G., et al. Effects of Quantification Methods Isolation Kits, Plasma Biobanking, and Hemolysis on Cell-Free DNA Analysis in Plasma. Biopreservation and Biobanking. 17 (6), 553-561 (2019).
  39. Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
  40. Ward Gahlawat, A., et al. Evaluation of Storage Tubes for Combined Analysis of Circulating Nucleic Acids in Liquid Biopsies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 704 (2019).
  41. Lu, J. L., Liang, Z. Y. Circulating free DNA in the era of precision oncology: Pre- and post-analytical concerns. Chronic Diseases and Translational Medicine. 2 (4), 223-230 (2016).
  42. Iyapparaj, P., et al. Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus sp. MSU3IR against shrimp bacterial pathogens. Aquatic Biosystems. 9 (1), 12 (2013).
  43. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clinica Chimica Acta. 479, 14-19 (2018).
  44. Medina Diaz, I., et al. Performance of Streck cfDNA blood collection tubes for liquid biopsy testing. PLoS One. 11 (11), 0166354 (2016).
  45. Perkins, G., et al. Multi-Purpose Utility of Circulating Plasma DNA Testing in Patients with Advanced Cancers. PLoS One. 7 (11), 47020 (2012).
  46. Mouliere, F., et al. Multi-marker analysis of circulating cell-free DNA toward personalized medicine for colorectal cancer. Molecular Oncology. 8 (5), 927-941 (2014).
  47. Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
  48. Risberg, B., et al. Effects of Collection and Processing Procedures on Plasma Circulating Cell-Free DNA from Cancer Patients. Journal of Molecular Diagnostics. 20 (6), 883-892 (2018).
  49. Markus, H., et al. Evaluation of pre-analytical factors affecting plasma DNA analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7375 (2018).
  50. Chen, Z., et al. Comprehensive Evaluation of the Factors Affecting Plasma Circulating Cell-Free DNA Levels and Their Application in Diagnosing Nonsmall Cell Lung Cancer. Genetic Testing and Molecular Biomarkers. 23 (4), 270-276 (2019).
  51. Schwarzenbach, H., Hoon, D. S. B., Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11 (6), 426-437 (2011).
  52. Malyuchenko, N. V., et al. PARP1 Inhibitors: antitumor drug design. Acta Naturae. 7 (3), 27-37 (2015).
  53. Fleischhacker, M., Schmidt, B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-A survey. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1775 (1), 181-232 (2007).
  54. Jung, K., Fleischhacker, M., Rabien, A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker—A critical appraisal of the literature. Clinica Chimica Acta. 411 (21-22), 1611-1624 (2010).
  55. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS: a database of human, mouse and fruit fly chimeric transcripts and RNA-sequencing data. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 142-151 (2013).
  56. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS 2.1--an improved database of the chimeric transcripts and RNA-seq data with novel sense-antisense chimeric RNA transcripts. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 68-75 (2015).
  57. Gorohovski, A., et al. ChiTaRS-3.1-the enhanced chimeric transcripts and RNA-seq database matched with protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 45 (1), 790-795 (2017).
  58. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Research. 47 (1), 941-947 (2019).
  59. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  60. Szopa, W., Burley, T. A., Kramer-Marek, G., Kaspera, W. Diagnostic and Therapeutic Biomarkers in Glioblastoma: Current Status and Future Perspectives. BioMed Research International. 2017, 1-13 (2017).
  61. Salesse, S., Verfaillie, C. M. BCR/ABL: from molecular mechanisms of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia. Oncogene. 21 (56), 8547-8559 (2002).
  62. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28 (12), 67-74 (2012).
  63. Frenkel-Morgenstern, M., et al. Chimeras taking shape: Potential functions of proteins encoded by chimeric RNA transcripts. Genome Research. 22 (7), 1231-1242 (2012).
  64. Simon, M., et al. TERT promoter mutations: a novel independent prognostic factor in primary glioblastomas. Neuro-Oncology. 17 (1), 45-52 (2015).
  65. Waitkus, M. S., Diplas, B. H., Yan, H. Isocitrate dehydrogenase mutations in gliomas. Neuro-Oncology. 18 (1), 16-26 (2016).
  66. Kindler, T., Meyer, R. G., Fischer, T. BCR-ABL as a target for novel therapeutic interventions. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 6 (1), 85-101 (2002).
  67. Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2013).
  68. Vanderlaan, P. A., et al. Success and failure rates of tumor genotyping techniques in routine pathological samples with non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 84 (1), Amsterdam, Netherlands. 39-44 (2014).
  69. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. 228-229, 169-179 (2018).
  70. Normanno, N., et al. The liquid biopsy in the management of colorectal cancer patients: Current applications and future scenarios. Cancer Treatment Reviews. 70, 1-8 (2018).
  71. Hufnagl, C., et al. Evaluation of circulating cell-free DNA as a molecular monitoring tool in patients with metastatic cancer. Oncology Letters. 19 (2), 1551-1558 (2020).
  72. Petit, J., et al. Cell-Free DNA as a Diagnostic Blood-Based Biomarker for Colorectal Cancer: A Systematic Review. The Journal of Surgical Research. 236, 184-197 (2019).
  73. Poulet, G., Massias, J., Taly, V. Liquid Biopsy: General Concepts. Acta Cytologica. 63 (6), 449-455 (2019).
  74. Alix-Panabières, C. The future of liquid biopsy. Nature. 579 (7800), 9 (2020).
  75. Eisenstein, M. Could liquid biopsies help deliver better treatment. Nature. 579 (7800), 6-8 (2020).

Tags

Cancerforskning utgåva 163 flytande biopsi cellfritt DNA precisionsmedicin gliom cancerdiagnos blodplasma
Påvisande av cellfritt DNA i blodplasmaprover från cancerpatienter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palande, V., Raviv Shay, D.,… More

Palande, V., Raviv Shay, D., Frenkel-Morgenstern, M. Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients. J. Vis. Exp. (163), e61449, doi:10.3791/61449 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter