Summary
Um Caenorhabditis elegans (C. elegans) in der Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große Populationen von Würmern zu generieren, bei denen eine einzelne Probe plattformübergreifend für vergleichende Analysen gemessen werden kann. Hier wird eine Methode vorgestellt, um C. elegans Populationen auf großräumigen Kulturplatten (LSCPs) zu kulturieren und das Bevölkerungswachstum zu dokumentieren.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) war und ist ein wertvoller Modellorganismus zur Untersuchung von Entwicklungsbiologie, Alterung, Neurobiologie und Genetik. Die umfangreiche Arbeit an C. elegans macht es zu einem idealen Kandidaten, um es in großpopulationige Ganztierstudien zu integrieren, um die komplexen biologischen Komponenten und ihre Beziehungen zu einem anderen Organismus zu sezieren. Um C. elegans in der kollaborativen -Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große Populationen von Tieren zu generieren, bei denen eine einzelne Probe auf verschiedene Plattformen für vergleichende Analysen aufgeteilt und analysiert werden kann.
Hier wird eine Methode zur Kultur und Sammlung einer reichlich vorhandenen C. elegans-Population im Mischstadium auf einer großräumigen Kulturplatte (LSCP) und anschließenden phänotypischen Daten vorgestellt. Diese Pipeline liefert eine ausreichende Anzahl von Tieren, um phänotypische und Populationsdaten zu sammeln, zusammen mit allen Daten, die für -Omics-Experimente benötigt werden (d. H. Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik). Darüber hinaus erfordert die LSCP-Methode eine minimale Manipulation der Tiere selbst, weniger Vorbereitungszeit für den Benutzer, bietet eine strenge Umweltkontrolle und stellt sicher, dass die Handhabung jeder Probe während der gesamten Studie konsistent ist, um die Reproduzierbarkeit insgesamt zu gewährleisten. Schließlich werden Methoden zur Dokumentation der Populationsgröße und Populationsverteilung von C. elegans Lebensstadien in einem gegebenen LSCP vorgestellt.
Introduction
C. elegans ist ein kleiner freilebender Fadenwurm, der auf der ganzen Welt in einer Vielzahl von natürlichen Lebensräumen vorkommt1. Seine relative Leichtigkeit des Wachstums, schnelle Generationszeit, Reproduktionssystem und transparenter Körper machen es zu einem leistungsstarken Modellorganismus, der in entwicklungsbiologischer, alternder, neurobiologischer und genetik weit verbreiteter2,3untersucht wurde. Die umfangreichen Arbeiten zu C. elegans machen es zu einem Hauptkandidaten für -omics-Studien, um Phänotypen umfassend mit komplexen biologischen Komponenten und ihren Beziehungen in einem bestimmten Organismus zu verknüpfen.
Um C. elegans in der kollaborativen -Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große gemischtstufige Populationen von Tieren zu generieren, bei denen eine einzelne Probe aufgeteilt und über verschiedene Plattformen und Instrumente für vergleichende Analysen verwendet werden kann. Die Erstellung einer Pipeline zur Generierung einer solchen Stichprobe erfordert ein ausgeprägtes Bewusstsein für Ernährung, Umwelt, Stress, Bevölkerungsstruktur sowie Probenhandhabung und -sammlung. Daher ist es entscheidend, standardisierte und reproduzierbare Kultivierungsbedingungen in große Rohrleitungen zu integrieren. In der Forschung von C. elegans werden zwei traditionelle Methoden verwendet, um Würmer zu züchten - Agar-Petrischalen und Flüssigenkultur4.
Historisch gesehen, wenn große Mengen von C. elegans benötigt werden, werden sie in flüssiger Kultur angebaut4. Die Schritte, die an der Erzeugung einer großen Population von Würmern in flüssiger Kultur beteiligt sind, erfordern mehrere Handhabungsschritte, die oft eine Bleichsynchronisation beinhalten, um gravidierte erwachsene Nagelhaut zu reißen und Embryonen freizusetzen, um die gewünschte Populationsgröße zu erreichen. Wenn jedoch Bleichsynchronisation verwendet wird, hängt das Bevölkerungswachstum von der Größe der Beginnenden Volkszählung ab und wirkt sich daher auf das nachfolgende Wachstum und die Bevölkerungszahlen aus. Darüber hinaus variieren C. elegans-Stämme in ihrer Nagelhautempfindlichkeit, Expositionszeit und Stressreaktion auf Bleichmittelsynchronisation, was es schwierigmacht,viele Stämme gleichzeitig zu bestimmen5,6,7,8,9.
Darüber hinaus erfordert das Wurmwachstum in flüssiger Kultur ein paar Transferschritte, da es oft empfohlen wird, vor der Ernte nur eine Generation von Würmern anzubauen, da eine Überfüllung leicht auftreten kann, wenn sie über mehrere Generationen angebaut wird und trotz der Anwesenheit von Nahrung zu einer dauerhaften Bildung führt10. Dauerbildung erfolgt durch kleine Signalmoleküle wie Ascaroside, oft als "Dauerpheromone" bezeichnet11,12,13,14, werden in flüssige Medien freigesetzt und beeinflussen das Wachstum der Bevölkerung. Darüber hinaus führt das Wachstum großer Wurmpopulationen in flüssiger Kultur zu einer übermäßigen Bakterienansammlung in der Kultur, was zu Schwierigkeiten führt, wenn eine saubere Probe für nachgeschaltete phänotypische Assays benötigt wird. Schließlich, wenn eine flüssige Kultur kontaminiert wird, ist es schwieriger zu erhalten, da Pilzsporen oder Bakterienzellen leicht in den Medien verteilt werden15.
Die andere traditionelle Methode des Anbaus von C. elegans ist auf Agar Petrischalen. Kommerziell erhältliche Petrischalen ermöglichen es, problemlos mehrere Generationen von Würmern im gemischten Stadium zu züchten, ohne die schnellen Auswirkungen von Überfüllung und hoher Dauerbildung, wie sie in flüssigen Kulturen beobachtet werden. Ein Nachteil des Wurmwachstums auf herkömmlichen Agar-Petrischalen ist jedoch, dass die größte kommerziell erhältliche Petrischale keine großen Wurmpopulationen für eine -omics-Studie liefert, ohne einen Bleichmittelsynchronisationsschritt hinzuzufügen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kultivierung von Populationen von C. elegans im gemischten Stadium auf Agar-Petrischalen besser geeignet ist, um -omics-Daten zu sammeln, aber wir benötigten eine Methode, um sehr große Populationsgrößen ohne flüssige Kultivierung zu erzeugen.
Hier stellen wir eine Methode vor, um große C. elegans-Populationen im gemischten Stadium auf großräumigen Kulturplatten (LSCP) zu kulturieren und zu sammeln. Das Sammeln von Proben durch diese Pipeline liefert genügend Proben, um phänotypische und Populationsdaten zu sammeln, zusammen mit allen Daten, die für -Omics-Experimente benötigt werden(z. B.Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik). Darüber hinaus erfordert die LSCP-Methode eine minimale Manipulation der Tiere, weniger Vorbereitungszeit für den Benutzer, bietet eine strenge Umweltkontrolle und stellt sicher, dass die Handhabung jeder Probe während der gesamten Studie konsistent ist, um die Reproduzierbarkeit insgesamt zu gewährleisten.
Protocol
1. LSCP und Ausrüstung sterilisieren
- Bereiten Sie Glas-LSCPs durch Händewaschen, gefolgt von Geschirrspülen und anschließendem Autoklavieren vor, um sicherzustellen, dass Glaswaren frei von Verunreinigungen sind, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Lagern Sie autoklavierte LSCPs an einem sauberen, trockenen Ort, bis sie verwendet werden.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass LSCPs spülmaschinen- und autoklavsicher sind. Stellen Sie sicher, dass die LSCP-Deckel spülmaschinenfest sind. - LSCP-Deckel durch Handwaschen mit anschließendem Geschirrspülen zubereiten. Lagern Sie LSCP-Deckel in einem sauberen Behälter, bis sie benötigt werden.
- An dem Tag, an dem Nematode Growth Media Agarose (NGMA) vorbereitet wird, wischen Sie die LSCP-Deckel zweimal mit 10% Bleichlösung ab, gefolgt von 70% Ethanol. Nach dem Abwischen mit 10% Bleichmittel und 70% Ethanol die LSCP-Deckel in einem sauberen Behälter in der Laminar-Flow-Haube aufbewahren, wo der NGMA vorbereitet wird.
2. Nematoden-Wachstumsmedien Agarose (NGMA) vorbereiten
- NGMA zubereiten, indem die folgenden Reagenzien zu einem autoklavierten 2 L Erlenmeyerkolben mit Rührstab auf einer Rührplatte kombiniert werden: 2,5 g Pepton, 3 g NaCl, 7 g Agarose, 10 g Agar und 975 ml steriles Wasser16. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 1 L entspricht. Kleben Sie eine Folienkappe auf den Kolben.
HINWEIS: Die hier beschriebenen Vorbereitungsschritte für die NGMA ergeben genügend Material für 2,5 LSCPs. Das Protokoll kann auf die benötigte LSCP-Losgröße in einem bestimmten Experiment zugeschnitten werden. - Autoklav im Flüssigkeitskreislauf bei 121 °C und 21 p.s.i. für 45 min.
- Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie es auf 50 °C ein. Bringen Sie das autoklavierte NGMA ins Wasserbad, um es auf 50 °C abzukühlen.
- 2 L Erlenmeyerkolben NGMA in die Haube oder den gereinigten Raum geben und auf eine Rührplatte stellen. Verwenden Sie ein Thermometer, um die NGMA-Temperatur zu verfolgen.
- Nachdem die NGMA 50 °C erreicht hat, fügen Sie Folgendes in der mit einer sterilen Einwegpipette in der Haube oder im gereinigten Raum aufgeführten Reihenfolge hinzu: 25 ml 1 M KH2PO4 (K-Phosphatpuffer), 1 ml Cholesterin (5 mg/ml ethanol), 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4,1 ml Nystatin (10 mg/ml) und 1 ml Streptomycin (100 mg/ml)16.
- Gießen Sie 400 ml NGMA in ein steriles Glas LSCP, etwa 1,3 cm tief, lassen Sie das LSCP auf einer ebenen Oberfläche in der Haube erarren und legen Sie den autoklavierten Foliendeckel wieder auf den LSCP.
- Sobald das Agar eingestellt ist, entfernen Sie die Folie, legen Sie einen sauberen, luftdichten Deckel auf LSCP und bewegen Sie sich zur Lagerung auf 4 ° C. Lagern Sie NGMA in LSCPs bei 4 °C bis zur Verwendung und Verwendung innerhalb von 5 Tagen.
3. Generieren Sie E. coli-Lebensmittel für NGMA auf LSCP
- Um eine stabile Nahrungsquelle zu erzeugen, erzeugen Sie Chargen von HT115 (DE3) E. coli unter Verwendung eines Kleinchargenmittelungskonzepts, das mit dem zentralenGrenzwertsatz 17übereinstimmt. Bei -80 °C lagern. Bei Bedarf E. coli Bakterienbestand(e) von -80 °C bis18auftauen.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden E. coli-Bakterienbestände in einem Bioreaktor gezüchtet. Am Ende des Kulturwachstums wurde die Kultur um 1:50 verdünnt und der gemessene OD600 betrug 0,4. Somit hatte die Kultur einen effektiven OD600 von 20. Bakterien wurden in einer Konzentration von 0,5 g/ml (Nassgewicht) in K-Medium pelletiert, gewogen und resuspendiert, in 2-ml-Aliquoten überführt und19eingefroren.
4. Bakterienwiese auf NGMA
- Bringen Sie NGMA LSCPs aus 4 °C für mehrere Stunden auf Raumtemperatur (RT), bevor Sie den Bakterien rasen verteilen, damit das gesamte LSCP RT erreichen kann.
- Ziehen Sie die benötigten E. coli-Bakterienbestände von -80 °C bis zum Auftauenvon 18° C heraus.
- Verdünnen Sie E. coli-Bakterienvorräte mit 2 ml sterilem K-Medium, um 0,5 g E. coli in 4 ml pro NGMA LSCP zu erreichen. 4 ml E. coli in der Mitte des NGMA LSCP vorsichtig pipetten.
- Verwenden Sie einen sterilen Streuer, um Bakterien in ein Rechteck zu verteilen, so dass etwa 3,8 cm Platz an den Rändern des NGMA E. coli frei bleiben.
- Lassen Sie den NGMA LSCP mit E. coli in der Motorhaube mit eingeschalteter Lüfter für 1 h, um sicherzustellen, dass die E. coli-Aufhängung vollständig trocknet.
- Sobald der Bakterien rasen trocken ist, drücken Sie den Deckel fest auf und lagern Sie ihn bei 4 °C, bis er verwendet ist.
5. Chunk Würmer, um Stress und Altersvariabilität zwischen den Proben zu reduzieren
- Streifen sie Würmer von einem gefrorenen Wurmstock zu einem neu ausgesäten 6 cm Teller4. Diese Platte dient als "Master Chunk" -Platte.
HINWEIS: Chunking ist eine optimale Methode, um Würmer aus einem homozygoten Stamm20zu übertragen. Wenn ein Stamm heterozygot ist oder durch Pflücken und Paarung aufrechterhalten werden muss, ist ein Chunking nicht ratsam. Die Chunking-Häufigkeit muss möglicherweise optimiert werden, abhängig von den verwendeten Wurmgenotypen, der für das Wachstum gewählten Temperatur und den nachgelagerten Schritten. - Nachdem die Master-Chunk-Platte voll von gesunden graviden Erwachsenen (ca. 3 Tage) ist und noch viel E. coli-Rasen vorhanden ist, befolgen Sie die Standard-C. elegans-Chunking-Richtlinien, wie in WormBook beschrieben, um vier Gesamt-Chunk-Platten zu produzieren4.
- Lagern Sie alle Stückplatten in einem Raum mit kontrollierter Temperatur (CT) bei 20 °C, sofern nicht anders für das Wachstum angegeben.
HINWEIS: Wenn Benutzer dieses Protokolls keinen Zugang zu einem CT-Raum haben, wie hier beschrieben, wird empfohlen, entweder einen kleinen Inkubator zu verwenden, in dem die Temperatur kontrolliert werden kann, oder einen dafür vorgesehenen Raum, in dem die Umgebungsbedingungen so weit wie möglich kontrolliert werden können. Wenn keine dieser alternativen Optionen verfügbar ist, beachten Sie, dass die Variation des Probenwachstums größer sein kann. - Sobald viele gravidierte Erwachsene in der4. Brockenplatte beobachtet wurden, fahren Sie mit Schritt 6 fort.
6. Spot Bleichen gravider Erwachsener auf LSCP
HINWEIS: Diese Bleichtechnik wird verwendet, um die meisten Verunreinigungen zu beseitigen und die Nagelhaut der Hermaphroditen aufzulösen, die Embryonen aus dem erwachsenen Wurm freisetzen. Die Bleichlösung wird vor dem Schlüpfen der Embryonen in das NGMA einweichen.
- Bringen Sie LSCPs für mehrere Stunden auf RT, bevor Sie Bleichwürmer entdecken.
- Bereiten Sie ein 7: 2: 1 Verhältnis von ddH2O : Bleichmittel : 5 M NaOH vor. Machen Sie diese alkalische Hypochloritlösung kurz vor dem Gebrauch frisch.
HINWEIS: Verwenden Sie während der gesamten Dauer eines bestimmten Experiments den gleichen Vorrat an Bleichmittel und NaOH, um Auswirkungen auf Bleichmittelchargen zu vermeiden. Bleichmittel, das in diesem Protokoll verwendet wurde, war 5-10% Natriumhypochlorit. - Zünden Sie einen Bunsenbrenner an und flammen Sie einen Wurmpickel an, bevor Sie fortfahren. Frische E. coli vom Rand des Bakterien rasens auf dem LSCP auf einen sterilen Pickel schöpfen.
- Wählen Sie einen einzelnen graviden Erwachsenen aus der4. Brockenplatte für spot bleaching.
- 5 μL der alkalischen Hypochloritlösung in eine Ecke des LSCP weg vom E. coli-Rasen pipetten.
- Den gepflückten gravidierten Erwachsenen in die 5 μL alkalische Hypochloritlösung geben. Tippen Sie auf den Fadenwurm, um die Nagelhaut zu stören und Eier freizusetzen.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.4 – 6.6 für insgesamt 4x und legen Sie 5 gravid Erwachsene gleichmäßig um den E. coli Rasen. Wählen Sie alle 5 graviden Erwachsenen aus derselben4. Brockenplatte, um sicherzustellen, dass fast genetisch isogene Individuen zu einer bestimmten Probe hinzugefügt werden.
- Setzen Sie den Deckel wieder auf den LSCP.
- Wiederholen Sie die Schritte für alle LSCPs.
7. Wurmwachstum im Raum mit kontrollierter Temperatur (CT)
- Nach dem Spotbleichen den Deckel fest auf das LSCP legen und in den auf 20 °C eingestellten CT-Raum mit konstantem Luftstrom und einer 12L:12D-Photoperiode (12 h Licht und 12 h Dunkelheit) legen.
- Notieren Sie sich die Zeit und Position, an der die Probe im CT-Raum platziert wurde.
HINWEIS: Die Position innerhalb des Raumes sollte immer dokumentiert werden, um alle Umweltunterschiede aufzuzeichnen, die Proben während des Wachstums möglicherweise feststellen könnten. Sobald sich die Probe im CT-Raum befindet, sollte sie ungestört an der zugewiesenen Stelle bleiben. Öffnen Sie den Deckel des LSCP nicht im CT-Raum, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu verringern. - Bringen Sie das LSCP zu einem Mikroskop außerhalb des CT-Raums, um das Bevölkerungswachstum und die Dichte zu beobachten.
HINWEIS: Jeder C. elegans Stamm und jede Probe variiert in seinem Wachstum, also überwachen Sie die Proben genau. Während es empfohlen wird, das Wachstum des LSCP im CT-Raum nicht zu stören, wurden LSCPs aus dem CT-Raum transportiert und die Deckel wurden alle 2 Tage geöffnet, um das Probenwachstum zu überwachen. Wenn die versiegelten Deckel alle 2 Tage von den LSCPs entfernt werden, kann auch O2 in das LSCP fließen. - Stellen Sie vor der Ernte sicher, dass das LSCP mit einer großen Population von Würmern gefüllt ist. Verwenden Sie die folgenden Kriterien, um zu entscheiden, ob der LSCP zur Erfassung bereit ist.
- Stellen Sie sicher, dass das LSCP voller gravider erwachsener Würmer ist.
- Stellen Sie sicher, dass die Platte eine große Populationsgröße enthält (d. H. Würmer bedecken die gesamte Oberfläche des Agars).
- Stellen Sie sicher, dass der Teller nicht viele Eier auf der Oberfläche des Agars hat(dhdie maximale Anzahl von Würmern sollte geschlüpft sein).
- Stellen Sie sicher, dass die Platte nur noch minimale bis keine E. coli mehr hat, was darauf hindeutet, dass die Würmer verhungern und dauer Larven erzeugen würden, wenn sie für weitere zwei Tage auf der Platte gelassen würden.
HINWEIS: Obwohl die meisten LSCPs je nach Stamm und Probe zwischen 10 und 20 Tagen erntebereit sind, sollten Sie jeden LSCP bei der Erstellung dieses Protokolls regelmäßig überprüfen, um die normalen Erntezeiten zu bestimmen.
- Reinigen Sie die Handschuhe und den Bereich mit 70% Ethanol zwischen den LSCPs, um Kreuzkontaminationen zwischen den Stämmen zu vermeiden.
8. Ernte der LSCP-Probe
- Schalten Sie die Zentrifuge ein und lassen Sie sie vor der Probenernte auf 4 °C abkühlen.
- Bereiten Sie drei konische 50-ml-Röhrchen mit 50 ml M9-Lösung pro LSCP vor, die geerntet werden sollen.
- Beschriften Sie ein 15 mL konisches Röhrchen pro LSCP.
HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte werden im konischen 15-ml-Rohr durchgeführt, da Würmer dazu neigen, in diesen Rohren gut zu pelletieren. - Gießen Sie 50 ml M9-Lösung (aus einem 50-ml-Konikrohr in Schritt 8.2) auf die LSCP-Oberfläche und wirbeln Sie herum, um sicherzustellen, dass M9 die gesamte NGMA-Oberfläche abdeckt.
- Während M9 auf der LSCP-Oberfläche sitzt, grundieren Sie eine sterile serologische Pipette mit M9.
HINWEIS: Durch die Grundierung der sterilen serologischen Pipette mit M9 wird sichergestellt, dass weniger Würmer an der Innenseite der Kunststoffpipette haften bleiben, wodurch Probenverlust verhindert wird. - Kippen Sie den LSCP so, dass sich M9 und die Wurmpopulation in einer Ecke des LSCP versammeln.
HINWEIS: Die Mischung aus M9-Lösung und Würmern aus dem LSCP wird in nachgeschalteten Schritten als "Schneckensuspension" bezeichnet. - Mit einer grundierten serologischen Pipette mit automatischem Pipttor, Pipettenschneckenaufhängung und in das ursprüngliche 50 mL konische Rohr legen. Sobald 50 ml Wurmsuspension gesammelt sind, legen Sie das konische Rohr auf eine Wippe, um Bakterienklumpen und Trümmer zu stören.
- Wiederholen Sie die Schritte 8,4 - 8,7 und sammeln Sie 150 ml Schneckensuspension pro LSCP.
- 15 mL Schneckensuspension aus einem der drei konischen 50-ml-Röhrchen werden durch Gießen in ein markiertes 15-ml-Konusrohr, das in Schritt 8.3 beiseite gelegt wurde, übertragen. Zentrifuge das 15 mL konische Rohr bei 884 x g für 1 min bei 4 °C. Die Mehrheit der Würmer wird am Boden des Rohres pelletieren.
- Saugen Sie den Überstand ab, um das Wurmpellet nicht zu stören.
- Fügen Sie weiterhin etwa 13 ml Schneckensuspension in dasselbe konische 15-ml-Rohr hinzu und wiederholen Sie die Schritte 8,9 und 8,10, bis alle 150 ml Wurmsuspension verbraucht sind. Kehren Sie das Rohr um und stören Sie das Pellet zwischen den Zentrifugationen, um so viele Bakterien und Ablagerungen wie möglich zu waschen und abzusaugen.
HINWEIS: In diesem Schritt wird der Inhalt aller drei konischen 50-ml-Rohre in einem einzigen 15-ml-Rohr kondensiert. - 10 ml sauberes M9 in das 15 ml konische Rohr geben und das Wurmpellet durch Invertieren rühren. Zentrifuge das 15 mL konische Rohr bei 884 x g für 1 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand ab, um das Wurmpellet nicht zu stören. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.
HINWEIS: Wenn sich in der Probe eine große Menge an Ablagerungen oder Bakterien befindet, wiederholen Sie Schritt 8.12, bis die Probe sauber ist. - Sobald die Probe sauber ist, geben Sie ddH2O zum Wurmpellet für insgesamt 10 ml ddH2O und Würmer. Rühren Sie das Wurmpellet durch Invertieren. Gehen Sie schnell in Schritt 9.1 über, da Würmer 5 Minuten oder weniger in ddH2O bleiben müssen, um osmotischen Stress zu vermeiden.
HINWEIS: Das Suspendieren von Wurmpellets inddH2O ist das bevorzugte Lösungsmittel für nachgeschaltete Omics-Schritte. Würmer können in anderen Lösungsmitteln oder Puffern suspendiert werden, wenn sie mit einem bestimmten experimentellen Workflow kompatibel sind.
9. Bevölkerungsgröße schätzen
HINWEIS: Gehen Sie schnell durch die Schritte 9.1 bis 9.7. Die Mischung ausddH2Ound Würmern aus Schritt 8.13 wird in nachfolgenden Schritten als "Wurmprobe" bezeichnet.
- Vor dem Pipettieren der Wurmprobe ist die Prime-Pipettenspitze mit M9 zu verwenden, um zu vermeiden, dass Würmer an der Innenseite der Kunststoffpipette haften bleiben, um Probenverlust zu verhindern und die Anzahlschwankungen zu reduzieren.
- Nehmen Sie eine 100 μL aliquote Wurmprobe und verdünnen Sie sie in 900 μL M9. Gut mischen und eine serielle Verdünnung vornehmen (1:10, 1:100, 1:1000). Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, um insgesamt drei Sätze aliquoter Replikate zu erreichen.
HINWEIS: Pipettierwürmer können zu einer hohen Variabilität der Probenpopulationen führen. Stellen Sie sicher, dass die Wurmprobe homogen ist, bevor Sie das gewünschte Aliquot pipettieren. - Stellen Sie das konische 15-ml-Rohr auf eine Wippe, um die bewegte Kultur fortzusetzen, während Aliquoten gezählt werden.
- Stellen Sie sicher, dass die Wurmprobe gut gemischt und homogen ist. Pipetten Sie 5 μL aus der 1:10-Wurmprobe, dosieren Sie sie auf einen Objektträger und zählen Sie die Anzahl der Würmer. Wenn diese Zahl kleiner als etwa 50 Würmer ist, dann zählen Sie auch die Verdünnungen 1:100 und 1:1000. Wenn es mehr als 50 ist, fahren Sie mit der nächsten seriellen Verdünnung um.
HINWEIS: Wenn zu viele Würmer nicht genau gezählt werden können, verwenden Sie stattdessen die nächste serielle Verdünnung zum Zählen. - Zählen Sie jedes aliquote Replikat jeder Verdünnung 3x. Am Ende der Zählung werden für die meisten Kulturen 9 Gesamtzählungen dokumentiert(d.h.3 Gesamtzählungen für jede aliquote Replikation).
- Mittelung der Verdünnungszahlen, um die geschätzte Populationsgröße der Wurmprobe zu bestimmen. Diese Verdünnungszahlen bestimmen das Volumen der Wurmprobe, das benötigt wird, um die gewünschte aliquote Größe für -omics-Schritte zu erzeugen.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden Aliquoten von etwa 200.000 Mischphasenwürmern erzeugt. Zusätzlich wurde ein Aliquot von ca. 50.000 Mischtischwürmern für die Sortierung in einem großen Partikel-Durchflusszytometer reserviert (beschrieben in Schritt 10). - Sobald die Wurmprobe in geeignete Aliquoten aufgeteilt wurde, gefrieren Sie in flüssigem Stickstoff und lagern Sie die Probe bei -80 °C.
HINWEIS: Frieren Sie das Aliquot, das für die Durchflusszytometrie großer Partikel bestimmt ist, nicht ein.
10. (Optional) Vorbereitungsprobe für die Großpartikel-Durchflusszytometrie
HINWEIS: Die Schritte 10, 11 und 12 sind die bevorzugte Methode der Autoren, um das Stichprobenwachstum(d. H.Populationsgröße und Populationsverteilung der Lebenszyklusphasen von C. elegans) aufzuzeichnen und den Erfolg einer Kultur zu bestimmen. Benutzer dieses Protokolls können die optionalen Schritte 10, 11 und 12 durch ihre eigenen Metriken für den Wachstumserfolg ersetzen. Die Schritte 10, 11 und 12 werden hier aus zwei Gründen beschrieben. Erstens können Benutzer, die geräteweise in den Schritten 10, 11 und 12 verwendet haben, diese Schritte replizieren und zweitens, um die Validierung dieser Wachstumsmethode zu zeigen. Schritt 9 oben bietet eine gute Schätzung der Gesamtzahl der Würmer, um aliquote Größen zu bestimmen, und Schritt 10 ist eine quantitativere Metrik, um die Anzahl und Populationsverteilung von Würmern in einer bestimmten Stichprobe zu schätzen.
- Bringen Sie das Aliquot von etwa 50.000 Mischphasenwürmern (in Schritt 9.6 beiseite gelegt) auf ein Gesamtvolumen von 10 ml in M9-Lösung.
- Es wird eine Lösung aus 1 mg/ml E. coli und einer 1:50-Verdünnung von 0,5 μM rot fluoreszierenden Mikrosphären19 herstellen.
- 200 μL dieser Lösung zu den 10 ml Mischphasenwürmern in M9 geben und während des Schaukelns 20 min inkubieren.
- Nach 20 min zentrifugiert man das 15 mL konische Röhrchen bei 884 x g für 1 min bei 4 °C.
- Saugen Sie den Überstand ab, um das Wurmpellet nicht zu stören.
- Waschen Sie das Wurmpellet zweimal mit M9-Lösung, um überschüssige Bakterien und rot fluoreszierende Mikrosphären zu beseitigen.
- Fügen Sie 5 ml M9 zum Wurmpellet hinzu und stellen Sie sicher, dass das Pellet sauber aussieht. Wenn das Pellet sauber ist, fügen Sie 5 ml M9 mit 50 mM Natriumazid hinzu, um die Würmer sowohl zu richten als auch abzutöten, um genau zu zählen und21zu dimensionieren.
- Dokumentieren Sie Uhrzeit und Datum, an dem Natriumazid zur Probe hinzugefügt wird.
- Legen Sie die Probe auf der Wippe beiseite, bis sie für die Großpartikel-Durchflusszytometrie benötigt wird.
HINWEIS: Es ist bekannt, dass Natriumazid die Physiologie der Nematoden beeinflusst(dhKörperlänge, Stoffwechsel und Thermotoleranz). Daher ist es wichtig zu beachten, wie lange Würmer Natriumazid ausgesetzt sind, da viele dieser physiologischen Auswirkungen innerhalb weniger Minutenauftreten 22. Aufgrund der bekannten physiologischen Wirkungen von Natriumazid auf Würmer wirkt sich diese Behandlung auf die nachgeschaltete Bildqualität aus und sollte in Betracht gezogen werden.
11. (Optional) Dokumentation der Populationsverteilung und Vorbereitung der 384-Well-Platte für die Bildgebung
HINWEIS: Schritt 11 verwendet ein großes Partikel-Durchflusszytometer (LPFC). Grundkenntnisse eines LPFC werden in diesem Protokoll vorausgesetzt. Andere Methoden können ersetzt werden, um das Wachstum und die Populationsverteilung von Stichproben zu dokumentieren. Die hier dokumentierten Schritte richten sich an Benutzer, die einen LPFC in ihrer Pipeline verwenden möchten23.
- Schalten Sie den LPFC ein, reinigen und grundieren Sie ihn und lassen Sie den Laser 1 h lang erwärmen, bevor Sie die Proben sortieren.
- Nachdem sich der Laser erwärmt hat, öffnen Sie das "Histogramm" -Profil und skalieren Sie auf eine Flugzeit (TOF) von 2050.
- Fügen Sie dem "Histogramm" einen Balkenbereich hinzu, der einen TOF-Bereich von 100 umfasst. Der erste Barbereich deckt einen TOF von 50-150 ab.
- Erstellen Sie weiterhin zwanzig Balkenbereiche, die jeweils einen TOF-Bereich von 100 umfassen. Diese Balkenbereiche werden den gesamten TOF-Bereich von 50 bis 2050 umfassen. In der ergänzenden Tabelle 1 finden Sie die genauen gated-Bereiche, die in der TOF-Verteilung verwendet werden sollen.
- Speichern Sie dieses Histogramm als "Experiment" für zukünftige LPFC-Läufe.
- Wählen Sie eine kalibrierte 384-Well-Platte oder kalibrieren Sie das Gerät auf eine 384-Well-Platte, in die Objekte dosiert werden sollen.
- Legen Sie die Vorlage nach der kalibrierten 384-Well-Plattenvorlage so fest, dass 20 gated Objekte in vier Wells (vier technische Replikate jeder Gated-Region) für jeden der 20 Balkenbereiche ausgegeben werden, die in den Schritten 11.3-4 erstellt wurden. In der ergänzenden Tabelle 2 finden Sie ein Beispiellayout für die Dosierung von Würmern in die 384-Well-Platte.
- Die Probe aus Schritt 10.9 wird in ein konisches Röhrchen mit 50 ml gegeben und zusätzliche M9-Lösung hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von etwa 40 ml zu erreichen.
- Beginnen Sie mit der automatischen Sortierung der Probe nach den in Schritt 11.7 festgelegten Parametern, während Sie die Probe kontinuierlich rühren, um zu verhindern, dass sich Objekte aus der Probe absetzen und gleichzeitig in die kalibrierte 384-Well-Platte dosieren.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Durchflussrate des LPFC zwischen 15 und 20 Objekten pro Sekunde arbeitet, und geben Sie keine Doppelungen an, die sortiert werden sollen. - Sobald die gesamte Probe sortiert und die maximale Anzahl der gated-Bereiche in die 384-Well-Platte abgegeben wurde, nehmen Sie die Probe von LPFC und reinigen Sie das Instrument.
HINWEIS: Wenn größere TOF-Regionen erreicht werden, kann es aufgrund der geringen Ereigniszahlen in diesem TOF-Bereich schwierig werden, die 384-Well-Platte weiterhin zu füllen. Füllen Sie so viele der gated-Regionen wie möglich aus, um die beste Vorstellung davon zu bekommen, wo die Lebensphasen von C. elegans in die LPFC-Verteilung fallen, bevor die Probe ausgeht. - Legen Sie eine Siegelfolie auf die 384-Well-Platte, bis sie abgebildet ist.
HINWEIS: Bildplatte so schnell wie möglich nach der Sortierung, da Proben mit Natriumazid22behandelt werden. Rot fluoreszierende Mikrosphären können in den gesammelten LPFC-Datendateien(d. H. PH-Rot-Daten in der Ausgabetextdatei) basierend auf dem Grad der roten Fluoreszenz gesehen werden, die in jedem sortierten Objekt emittiert wird, um zu identifizieren, welche Objekte lebende Würmer, tote Würmer, Dauers oder Junksind 24.
12. (Optional) Imaging 384-Well-Platte
HINWEIS: Schritt 12 verwendet ein mikrokonfokaleses Mikromikroskop zum Lesen der Platte. Grundkenntnisse eines konfokalen Mikromikroskops werden in diesem Protokoll vorausgesetzt. Andere Methoden können ersetzt werden, um das Wachstum und die Populationsverteilung von Stichproben zu dokumentieren.
- Verwendung eines plattenlesenden mikrokonfokalen Mikroskops mit einer 20-fachen Linse.
- Öffnen Sie die Registerkarte" Ziel und Kamera" und stellen Sie den Modus "10x Plan ApoLambda" ein.
- Öffnen Sie die Registerkarte "Camera Binning" und stellen Sie auf "2" ein.
- Öffnen Sie die Registerkarte "Sites to Visit on Plate" und setzen Sie auf "4" Sites pro Well und "Overlap Sites 10%", um später Bilder zusammenzusetzen.
- Öffnen Sie die Registerkarte "Wellenlänge" und stellen Sie sie auf "Hellfeld 1" ein.
- Öffnen Sie die Registerkarte "Beleuchtung" und stellen Sie sie auf "Durchlicht, helle Probe" ein.
- Legen Sie die 384-Well-Platte in das Mikroskop und stellen Sie den "Z Stack" auf "Calculate Offset" und finden Sie die richtige Fokusebene für die Proben in der 384-Well-Platte.
- Führen Sie die 384-Well-Platte auf dem konfokalen Mikromikroskop aus und sammeln Sie vier Bilder pro Vertiefung.
- Montage der vier Bilder zusammen, um ein Bild pro Vertiefung zu erstellen.
Representative Results
Das Wachstum von C. elegans mit der LSCP-Methode ergibt durchschnittlich etwa 2,4 Millionen Mischwurm pro Probe über 12,2 Tage. Das Wachstum von C. elegans mit der LSCP-Methode ermöglicht es Benutzern, große gemischtstufige Populationen von C. elegans mit wenig Handhabung und Manipulation der Tiere zu erzeugen, was ideal für groß angelegte Omics-Studien ist (Abbildung 1). Sobald ein LSCP voller erwachsener Würmer geworden ist, eine große Populationsgröße erreicht hat und nur noch minimale Bakterien übrig hat, können Benutzer die Populationsgröße ernten und schätzen. Dieser Punkt kann auch als Qualitätskontrolle dienen, indem bewertet wird, ob die Population ausreicht, um in einer -omics-Pipeline verwendet zu werden (Abbildung 2). Die Populationsdynamik hängt vom Stamm selbst, dem Verhalten des Stammes(d. H.Grabenstämme tendenziell eine geringere Wurmerholung) und dem Wachstumserfolg(d. H.Kontamination) ab. Die LSCP-Methode wurde an 15 Stämmen von C. elegans getestet, die eine Mischung aus Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Mutanten und Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) Wildstämmenenthalten 25. Stammgenotypen sind in der Ergänzenden Tabelle 3beschrieben.
Die LSCP-Methode ergab Populationsgrößen von etwa 94.500 bis 9.290.000. Die mittlere Populationsgröße innerhalb des Referenzstamms PD1074 und über Stämme hinweg betrug etwa 2,4 Millionen Würmer (Abbildung 3). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der geschätzten Populationsgröße zwischen C. elegans-Stämmen im Verlauf von durchschnittlich 12,2 LSCP-Wachstumstagen gefunden (Abbildung 4). PD1074 LSCPs brauchten zwischen 10 und 14 Tagen, um zu einer vollständigen Gemischtphasenpopulation zu wachsen. Die mittlere Wachstumszeit für PD1074 betrug 10 Tage. Die am langsamsten wachsende Sorte wuchs für maximal 20 Tage und die am schnellsten wachsende Sorte für mindestens 10 Tage (Abbildung 4).
Daher können Benutzer mit dieser LSCP-Methode neue Sorten von Interesse leicht in eine Studie integrieren, ohne über das Entwicklungszeitpunkt und die Hintergrundkenntnisse Bescheid zu wissen. Beachten Sie, dass Stämme und Phänotypen, die durch Pflücken aufrechterhalten werden müssen, Fruchtbarkeitsfehler aufweisen, heterozygot sind oder Wachstumsfehler aufweisen, in dieser Pipeline möglicherweise nicht gut funktionieren.
Die Großpartikel-Durchflusszytometrie und die Bildgebung von Proben ermöglicht es Benutzern, die Populationsverteilung zu dokumentieren. Eine Vielzahl von Plattformen kann verwendet werden, um ein erfolgreiches Bevölkerungswachstum zu messen.
Für reproduzierbare -omics-Messungen ist es wichtig, konsistente Kulturen zu züchten. Die Metriken der Kulturreproduzierbarkeit sind die Anzahl der Würmer und eine konsistente Größenverteilung für einen bestimmten Stamm. Wir zeigen die Probenverteilung für den Referenzstamm PD1074 – eine Variante des ursprünglichen N2 Bristol-Stammes – unter Verwendung der LPFC23,26 und mikrokonfokalen Mikroskopbilder als Proxys für den Wachstumserfolg. Da Würmer vom L1-Stadium bis zum graviden Erwachsenen auf der LPFC-Verteilung (Abbildung 5), der anschließenden Bildgebung (Abbildung 6) und der Variation der Populationsverteilung über Die Stichproben (Abbildung 7) gemessen wurden, können wir sehen, dass diese Pipeline eine Gemischtphasenpopulation von C. elegans erzeugte.
Um einen genaueren Blick auf die Populationsverteilung unserer gemischtstufigen Proben zu werfen, haben wir uns die Verteilung von 35 PD1074-LSCPs angesehen, indem wir den Prozentsatz der Würmer betrachtet haben, die innerhalb jeder Region über die gesamte Time of Flight (TOF)(d. H.Körperlänge) Verteilung fallen (Abbildung 7A, B).
Abbildung 1: Übersicht über die LSCP-Wurmwachstumspipeline. (A) Nach Erhalt im Labor wurden alle Stämme für die Langzeitlagerung bei -80 °C2vorbereitet und eingefroren. (B) Aus einem gefrorenen Wurmvorrat wurde ein "Master Chunk"-Teller hergestellt und bei 15 °C gelagert, um nicht länger als einen Monat verwendet zu werden. (C) Jede Probe durchlief vier aufeinanderfolgende Chunking-Schritte, um den Generationsstress zu reduzieren, bevor sie auf dem LSCP wuchs. (D) 5 einzelne gravidierte Erwachsene wurden aus der "Chunk 4" 6 cm Platte in Schritt (D) gepflückt und auf fünf bestimmten Bereichen des LSCP gebleicht. (E) Das LSCP wurde in einen Raum mit kontrollierter Temperatur gestellt und bei 20 °C gezüchtet, bis das LSCP voller erwachsener Würmer war, eine große Populationsgröße erreichte und nur noch minimale Bakterien übrig hatte. (F) Die Wurmpopulation wurde geerntet und für nachgelagerte Schritte gesammelt. (G) Aliquoten wurden aus dem LSCP erstellt und für nachgelagerte gewünschte Anwendungen eingefroren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Überblick über die LSCP-Ernte und Die Schätzung der Populationsgröße. (A) 50 ml M9 wurden verwendet, um Würmer von der NGMA-Oberfläche zu waschen. Die Schneckensuspension wurde in ein 50 mL konisches Rohr pipettiert. Schritt (A) wurde zweimal wiederholt. (B) 15 ml Schneckensuspension wurden in ein neues 15 mL konisches Rohr gegossen. Würmer wurden durch Zentrifugieren pelletiert. M9 + Trümmer wurden abgesaugt, ohne störende Wurmpellets zu stören. Schritt (B) wurde wiederholt, bis alle 150 ml Wurmsuspension gesammelt waren. (C) Das Wurmpellet wurde dreimal gewaschen und mit M9 zentrifugiert, um verbleibende Ablagerungen zu beseitigen. Sobald die Probe sauber war, wurde das Wurmpellet in 10 ml ddH2O resuspendiert. (D) Eine serielle Verdünnung der Probe wurde erstellt, um die Größe der Wurmpopulation zu schätzen. Die Verdünnungsfaktoren, die es ermöglichten, Würmer genau zu zählen, wurden verwendet. Die verwendeten Verdünnungsfaktoren änderten sich in Abhängigkeit von der Populationsgröße des LSCP. (E) Sobald der/die Verdünnungsfaktor(e) gewählt wurde(n), wurden alle Würmer aus allen drei aliquoten Replikaten dieser Verdünnung auf einen sauberen Objektträger pipettiert und Würmer unter einem Seziermikroskop gezählt. (F) Die Stichprobe wurde in Aliquoten geeigneter Größe aufgeteilt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die LSCP-Methode erzeugte im Durchschnitt eine Population von 2,4 Millionen Würmern im gemischten Stadium. Die LSCP ergibt Populationsgrößen bei den kleinsten Bevölkerungszuwucherungen bei rund 94.500 und bei den größten Bevölkerungszuwucherungen bei rund 9.290.000. Die mittlere Populationsgröße über alle Stämme hinweg betrug 2,4 Millionen Würmer. Balken unter den Stammnamen von C. elegans geben an, ob es sich bei einem Stamm um eine CGC-Mutante oder ein natürliches CeNDR-Isolat handelt. Die LSCP-Probengröße wird für jeden Stamm angezeigt. Es wurden Vergleiche für alle Paare mit Tukeys HSD-Test durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den geschätzten Populationsgrößen zwischen den C. elegans-Stämmen beobachtet (F(14.108) = 0,7, p = 0,77). Farbige Balken zeigen Standardfarbdisplays für die jeweilige C. elegans Dehnungsdarstellung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Die LSCP-Methode erzeugte in 10 – 20 Tagen große Würmerpopulationen im gemischten Stadium. Ein gegebener C. elegans LSCP wuchs, bis die Probe voller erwachsener Würmer war, eine große Populationsgröße erreichte und nur noch minimalen Bakterienwies übrig hatte. LSCPs brauchten je nach Sorte zwischen 10 und 20 Tagen, um zu einer vollständigen Mischphasenpopulation zu wachsen. Die mittlere Wachstumszeit über die Stämme hinweg betrug 12,2 Tage. Die LSCP-Probengröße wird für jeden Stamm angezeigt. Jeder Fehlerbalken wurde unter Verwendung von 1 Standardabweichung vom Mittelwert konstruiert. Ebenen, die nicht durch denselben Buchstaben verbunden sind, unterscheiden sich erheblich. Vergleiche für alle Paare mit Tukeys HSD-Test. Ein signifikanter Unterschied wurde in der Menge der Wachstumszeit auf LSCP gefunden, die über C. elegans-Stämme hinweg benötigt wurde (F(14.108) = 8,8, p < 0,0001*). Farbige Balken zeigen Standardfarbdisplays für die jeweilige C. elegans Dehnungsdarstellung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Gemischte Populations- und Wachstumsmessung des Wildtyp-Referenzstamms PD1074. Eine repräsentative LPFC-Verteilung eines LSCP-Wachstums des Wildtyp-Referenzstamms, einer Variante des ursprünglichen N2-Bristol-Stammes, (PD1074) dokumentiert die Größenverteilung und Ereigniszahlen einer Gemischtphasenpopulation. Die x-Achse zeigt die Länge (Time of Flight, TOF) der sortierten Würmer an. Die y-Achse zeigt die optische Dichte (optical extinction, EXT) der sortierten Würmer an. Jeder Datenpunkt ist ein Wurm, der im Beispiel dokumentiert wurde. Jeder TOF-Bereich, der für die Bildanalyse verwendet wurde, wird in einer anderen Farbe angezeigt. Es wurden zwanzig TOF-Regionen (R2 – R21) geschaffen, die von einem TOF von 50 bis 2050 reichen. Einzelheiten zu den einzelnen TOF-Regionen finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Bilder von Würmern, die aus TOF-Regionen von R2 bis R12 sortiert sind, zeigen die PD1074 LPFC-Verteilung. In der Region R2 können L1-Würmer identifiziert werden und in der Region R9 werden überwiegend gravidierte Erwachsene identifiziert, die die beiden Entwicklungslarvenextreme umfassen, was uns ungefähre Regionen innerhalb der Durchflusszytometerverteilung gibt, in denen Stadien in der Verteilung erwartet werden. Der Maßstabsbalken stellt 1 mm dar. Repräsentative Bilder wurden aus der in Abbildung 5dargestellten LPFC-Verteilung entnommen, und die farbigen Felder entsprechen den Bereichen aus Abbildung 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Populationsverteilung über Flugzeitregionen (TOF) im Wildtyp-Referenzstamm PD1074. Verteilung der Würmer über die gesamte TOF-Region, die die Regionen zeigt, in denen Würmer gefunden wurden. Jeder PD1074 LSCP wird als Einzelfarbe dargestellt. (A) Die x-Achse zeigt die zwanzig TOF-Bereiche (R2 – R21), die für den LSCP beobachtet und gezählt wurden, und zeigt die gesamte Größenverteilung an. Die y-Achse zeigt den Prozentsatz der Würmer aus einem bestimmten LSCP, die eine Körpergröße hatten, die in eine bestimmte TOF-Region fiel. (B) Da ein kleinerer Teil der Wurmpopulation zwischen den R7-R21-Regionen liegt, wurde das Protokoll des Prozentsatzes der Würmer, die in jede Region fielen, zur Anzeige der Populationsverteilung herangezogen. Die x-Achse zeigt die TOF-Bereiche R7-R21 an. Die y-Achse zeigt das Protokoll des Prozentsatzes der Würmer aus einem bestimmten LSCP an, der eine Körpergröße hatte, die in eine bestimmte TOF-Region fiel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Mittlere Tagestemperatur (°C) der Wachstumsbedingungen, unter denen das LSCP angebaut und gehandhabt wurde. Die berichteten Temperaturen des CT-Raums (Controlled Temperature) wurden dokumentiert und während des sechsmonatigen Zeitraums des Probenwachstums und der Probenentnahme gesammelt. Die durchschnittliche Tagestemperatur wird hier angegeben. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Temperatur beobachtet, bei der das LCSP während der Projektlaufzeit wuchs (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Die gesamte Temperaturdifferenz reichte über die sechsmonatige Dauer des Probenwachstums und der Probenerzeugung nicht größer als 0,003 °C. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: TOF-gated regions used to sort worms in 384-well plates for imaging. Binned-Regionen wurden erstellt, um einen TOF von 100 über die gesamte TOF-Verteilung von 50 bis 2050 zu umfassen. Gated Regions können an Ihre Bedürfnisse angepasst und optimiert werden. Jeder TOF-Bereich, der für die Bildanalyse verwendet wurde, wird in einer anderen Farbe angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: 384-Well-Plattenvorlage von TOF-Regionen und Replikationslayout. Jede Probe wurde zur Bildgebung in eine 384-Well-Platte sortiert. Für jede region, die für die Sortierung ausgewählt wurde, wurden vier Replikate erstellt. Gated Regions können an Ihre Bedürfnisse angepasst und optimiert werden. Siehe Ergänzende Tabelle 1 für bestimmte gated Regions, die in diesem Protokoll erstellt und verwendet werden. Jeder TOF-Bereich, der für die Bildanalyse verwendet wurde, wird in einer anderen Farbe angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 3: Die in diesem Protokoll verwendeten C. elegans-Stämme enthalten eine Mischung aus CGC- und CeNDR-Stämmen. Der Stamm, der Genotyp, die Stammquelle und die Details sind in dieser Tabelle beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
Eine Vielzahl von Gefäßen kann als LSCP verwendet werden. In diesem Protokoll wurde eine Standard-Glasbackform verwendet. Die verwendeten LSPCs hatten Außenmaße von 35,56 x 20,32 cm, Innenmaße von 27,94 x 17,78 cm und ca. 4,45 cm Tiefe und wurden mit einem eingebauten Deckel geliefert. Daher wurde die Menge der hier verwendeten Bakterien für ein LSCP mit den oben genannten Abmessungen optimiert, um eine große Population von Mischwurmen zu erhalten. Bakterienvolumen und -konzentration können an die experimentellen Bedürfnisse angepasst werden.
Eine Kontamination durch Schimmelpilze, Pilze oder andere Bakterienquellen kann bei jedem Schritt der LSCP-Methode auftreten, also behandeln Sie proben mit Vorsicht. Bevor Sie mit einem Schritt im Protokoll beginnen, stellen Sie sicher, dass der Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und 10% Bleichmittel gereinigt wird. Falls verfügbar, behandeln Sie gebrauchte Bereiche 30 Minuten lang mit UV-Licht und schalten Sie 30 Minuten vor Beginn jedes Schritts einen HEPA-Luftfilter ein.
Durch den Anbau des LSCP in einer kontrollierten Umgebung(d. h.in einem CT-Raum bei 20 °C) kann der Benutzer das Wachstum der Probe leichter verfolgen und eine mögliche Kontamination dokumentieren. Wenn die Oberfläche des LSCP kontaminiert wird, schneiden Sie entweder die Kontamination nach Möglichkeit aus und lassen Sie die Probe weiter wachsen oder entsorgen Sie die Probe, wenn die Kontamination nicht kontrolliert werden kann. Es ist unerlässlich, die Kontamination schnell anzugehen, um unerwünschtes Wachstum zu reduzieren und sicherzustellen, dass es nicht mit Würmern um Ressourcen übertrifft.
Diese Methode ist für diejenigen gedacht, die großflächige Mischkulturen von C. elegans anbauen möchten. Obwohl es möglich sein könnte, synchronisierte Populationen von Würmern auf dem LSCP zu züchten, wie es auf kommerziell erhältlichen Petrischalen und in flüssiger Kultur der Fall ist, haben die Autoren diese Option nicht getestet. Wenn Benutzer in einer bestimmten Stichprobe durchschnittlich mehr als etwa 2,4 Millionen Würmer züchten möchten, wird eine andere Methode empfohlen4. Der Wachstumserfolg hängt von der Sorte ab, die in der Pipeline verarbeitet wird. Die Autoren konnten erfolgreich Populationen von etwa 2,4 Millionen Würmern in mindestens fünf biologischen Replikaten von 15 C. elegans-Stämmen züchten, was darauf hindeutet, dass die Methode robust ist.
Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, beachten Sie, dass das Alter und die Gesundheit eines bestimmten Wurms die Fruchtbarkeit und die anschließende Populationswachstumszeit beeinflussen können. Stellen Sie sicher, dass Würmer unter gesunden Bedingungen mit minimalem Stress gehalten werden, bevor sie in dieser Pipeline verwendet werden. Es wird davon ausgegangen, dass Stammproben erstellt, eingefroren und bei -80 °C gehalten wurden, um die genetische Drift im Laufe der Zeit zu reduzieren.
Abhängig von den Bedürfnissen eines bestimmten Experiments kann die Anzahl der beginnenden graviden Erwachsenen auf einem LSCP geändert werden. Die Änderung der Anzahl der beginnenden graviden Erwachsenen auf dem LSCP wird die Wachstumsrate und damit die Zeit bis zur Ernte verändern. Fünf gravidierte Erwachsene werden verwendet, um jeden LSCP aus folgenden Gründen zu säen: (1) Eine einfache, schnelle und effiziente Möglichkeit, viele C. elegans-Stämme gleichzeitig auf LSCPs zu säen, war erforderlich und (2) um die Altersunterschiede zwischen den ausgewählten graviden Erwachsenen zu reduzieren, die zu der Wachstumsheterogenität führen könnten.
Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, große Populationen von Würmern mit allen Lebenszyklusstadien zu ernten. Mit den derzeit verfügbaren Methoden erfordert das Sammeln von großräumigen Proben von C. elegans eine Bleichsynchronisation, um die Anzahl der Würmer zu erhalten, die für nachgelagerte Arbeiten gewünscht werden. Mit diesem Ansatz kann man jetzt so viele Würmer wie bisher in Fermentern oder großen Flüssigkulturen züchten, ohne die Schwierigkeiten, die mit der Bleichmittelsynchronisation und mehreren Handhabungsschritten verbunden sind. Unser Protokoll ermöglicht es, Stämme von Interesse effizient anzusprechen, minimale Handhabungszeit für das Wachstum der Probe selbst zu verwenden und Stadien von Würmern oder der Population nach Bedarf in nachgelagerten Pipelines zu isolieren.
Ein LPFC wurde als Werkzeug verwendet, um die Populationsverteilung und -größe in einem bestimmten LSCP zu dokumentieren. Das verwendete LPFC ist ein kontinuierliches Durchflusssystem, das Würmer basierend auf ihrer Größe (TOF) und optischen Dichte analysiert, sortiert und dosiert. Wenn ein bestimmter Wurm die Durchflusszelle passiert, erfasst der axiale Lichtverlustdetektor die Menge an Signallicht, die von einem 488-nm-Festkörperlaser blockiert wird, für die Dauer, die ein Wurm benötigt, um durchzufahren, und gibt dem Benutzer die TOF und optische Dichte des Wurms. Fluoreszenzsammeloptiken und -detektoren können auch verwendet werden, um die Fluoreszenzempfindlichkeit und -sammlung an jeder Probe zu maximieren. LpFC-Sammlungsparameter variieren je nach Instrument. Benutzer können eine Vielzahl von Plattformen verwenden, um die Wurmgröße zu erfassen, und sind nicht auf die Verwendung dieses Protokolls beschränkt, wenn kein LPFC verfügbar ist.
Die Autoren verwenden Proben, die in der hier beschriebenen Methode gezüchtet wurden, um unbekannte Metaboliten in verschiedenen Stämmen von C. elegans mittels Flüssigkeitschromatographie – Massenspektrometrie, NMR-Spektroskopie und RNA-Sequenzierung – zu identifizieren. Die Autoren planen, diese Methode weiterhin für das Wachstum von Proben in dieser Pipeline mit einer Vielzahl von C. elegans-Stämmen zu verwenden, da neue Stämme von Interesse mit dieser Pipeline leicht verarbeitet werden können.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern des Edison Lab für hilfreiche Diskussionen und Rückmeldungen zu diesem Manuskript; insbesondere B.M. Garcia. Einige Stämme wurden vom CGC zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird, und ceNDR, das von NSF Living Collections CSBR 1930382 finanziert wird. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des NIH (U2CES030167) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Sterile Serological Pipettes | VWR | 89130-898 | |
| 10 ul pipette tips | VWR | 89079-438 | |
| 100 ul pipette tips | VWR | 89079-442 | |
| 1000 mL Graduated Cylinder | VWR | 10124-380 | |
| 1000 ul pipette tips | VWR | 89079-488 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-668 | |
| 190 Proof Ethanol | VWR | 89125-166 | |
| 2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask | VWR | 75804-654 | |
| 50 mL conical tubes | VWR | 75874-294 | |
| Agar | Sigma | 05040-100G | |
| Agarose | Sigma | A9539-500G | |
| BVC Control G Fluid Aspiration System | Vacuubrand | ||
| Calcium Chloride | Sigma | 449709-10G | |
| Cholesterol | Sigma | C3045-25G | |
| Clorox Bleach | VWR | 89414-502 | |
| Conviron Control Temperature Room | Conviron | https://www.conviron.com/environmental-rooms | |
| Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate | VWR | 89089-866 | |
| Fisher Scientific Accuspin 3R | Fisher | ||
| Flat-Bottom 24-Well Plate | VWR | 29443-952 | |
| Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. | Home Depot | 204390560 | |
| HT115 E. coli (DE3) | CGC | HT115(DE3) | https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3) |
| Kimwipes | VWR | 470224-038 | |
| Large Scale Culture Plate (LSCP) | Pyrex | 1090948 | Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid |
| Magnesium Sulfate | Sigma | C86677-25G | |
| MgSO4 | VWR | 97062-998 | |
| Microscope Plain Slides | VWR | 16004-422 | |
| Millipore Filter | Millipore | 1.11727.2500 | |
| Molecular Devices ImageXpress | Molecular Devices | Model Number:IXMConfocal | https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532 |
| Nystatin (10mg/mL) | Sigma | N6261-25MU | |
| Peptone | Sigma | P7750-100G | |
| Petri Dishes (6 cm) | VWR | 25384-092 | |
| Pipette Controller | VWR | 613-4180 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-3 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | 0781-500G | |
| Potasssium Hydroxide | Fisher | P250-500 | |
| Red Fluroscent Microspheres | Polysciences | 19507-5 | |
| Sodium Chloride | Sigma | 746398-500G | |
| Sodium Hydroxide | Fisher | 111357 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher | BP332-500 | |
| Standard Gilson Pipette Set | Gilson | FA10002M, FA10004M, FA10006M | |
| Streptomycin (100mg/mL) | Sigma | S6501-25G | |
| Union Biometrica COPAS BioSorter | Union Biometrica | https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3. |
References
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