Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Kultur og assay af storstilet blandet stadie Caenorhabditis elegans Populationer

doi: 10.3791/61453 Published: May 5, 2021

Summary

For at bruge Caenorhabditis elegans (C. elegans) i omics forskning, en metode er nødvendig for at generere store populationer af orme, hvor en enkelt prøve kan måles på tværs af platforme for sammenlignende analyser. Her præsenteres en metode til kultur C. elegans populationer på store kulturplader (LSCP'er) og til at dokumentere befolkningstilvæksten.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) har været og er fortsat en værdifuld model organisme til at studere udviklingsbiologi, aldring, neurobiologi og genetik. Den store mængde arbejde på C. elegans gør det til en ideel kandidat til at integrere sig i store, hele dyreforsøg for at dissekere de komplekse biologiske komponenter og deres forhold til en anden organisme. For at kunne anvende C. elegans i forskningssamarbejde er der behov for en metode til at generere store populationer af dyr, hvor en enkelt prøve kan opdeles og analyseres på tværs af forskellige platforme til sammenlignende analyser.

Her præsenteres en metode til kultur og indsamling af en rigelig blandet fase C. elegans befolkning på en storstilet kulturplade (LSCP) og efterfølgende fænotypiske data. Denne rørledning giver et tilstrækkeligt antal dyr til at indsamle fænotypiske data og befolkningsdata sammen med alle data, der er nødvendige for -omics-forsøg (dvs. genomik, transskriptionomics, proteomics og metabolomics). Desuden kræver LSCP-metoden minimal manipulation af dyrene selv, mindre brugerforberedelsestid, giver en stram miljøkontrol og sikrer, at håndteringen af hver prøve er konsistent under hele forsøget for generel reproducerbarhed. Endelig præsenteres metoder til at dokumentere befolkningsstørrelse og befolkningsfordeling af C. elegans livsstadier i et givet LSCP.

Introduction

C. elegans er en lille fritlevende nematode, der findes over hele verden i en række naturlige levesteder1. Dens relative lethed af vækst, hurtig generationstid, reproduktionssystem og gennemsigtig krop gør det til en stærk modelorganisme, der er blevet bredt undersøgt i udviklingsbiologi, aldring, neurobiologi og genetik2,3. Det rigelige arbejde med C. elegans gør det til en oplagt kandidat til at bruge i-omics undersøgelser til omfattende link fænotyper med komplekse biologiske komponenter og deres relationer i en given organisme.

For at kunne anvende C. elegans i forskningssamarbejde er der behov for en metode til at generere store populationer af dyr i blandede faser, hvor en enkelt prøve kan opdeles og anvendes på tværs af forskellige platforme og instrumenter til sammenlignende analyser. Oprettelse af en rørledning til at generere en sådan prøve kræver stor bevidsthed om kost, miljø, stress, befolkningsstruktur, og prøve håndtering og indsamling. Derfor er det afgørende at have standard- og reproducerbare dyrkningsforhold integreret i store rørledninger. I C. elegans forskning, to traditionelle metoder bruges til at dyrke orme - agar Petri retter og flydende kultur4.

Historisk set, når der er behov for store mængder C. elegans, dyrkes de i flydende kultur4. De skridt, der er involveret i at generere en stor population af orme i flydende kultur kræver flere håndtering trin, der ofte omfatter blegemiddel synkronisering til brud gravid voksne neglebånd, frigive embryoner for at opnå den ønskede befolkning størrelse. Men når blegemiddel synkronisering anvendes, befolkningstilvæksten er afhængig af start folketælling størrelse og dermed virkninger efterfølgende vækst og befolkningstal. Derudover varierer C. elegans-stammer i deres neglebåndsfølsomhed, eksponeringstid og stressrespons på blegemiddelsynkronisering, hvilket gør det vanskeligt at analysere mange stammer ad gangen5,6,7,8,9.

Derudover kræver ormvækst i flydende kultur et par overførselstrin, da det ofte anbefales at dyrke kun en generation af orme før høst, fordi overbelægning let kan forekomme, hvis den dyrkes i flere generationer og fører til dauerdannelse på trods af tilstedeværelsen af mad10. Dauer dannelse sker gennem små signalering molekyler såsom ascarosider, ofte benævnt "dauer feromoner"11,12,13,14, frigives i flydende medier og virkning væksten af befolkningen. Desuden fører voksende store ormpopulationer i flydende kultur til overskydende bakterieakkumulering i kulturen, hvilket skaber vanskeligheder, når der er behov for en ren prøve til downstream-fænotypiske assays. Endelig, når en flydende kultur bliver forurenet, er det vanskeligere at opretholde som svampesporer eller bakterieceller let spredes i hele medierne15.

Den anden traditionelle metode til dyrkning af C. elegans er på agar Petri retter. Kommercielt tilgængelige Petri retter giver en mulighed for nemt at dyrke flere generationer af blandet fase orme uden de hurtige virkninger af overbelægning og høj dauer dannelse som set i flydende kulturer. Men en ulempe ved orm vækst på traditionelle agar Petri retter er, at den største kommercielt tilgængelige Petri parabol ikke giver store orm befolkninger for en-omics undersøgelse uden at tilføje i en blegemiddel synkronisering trin. Sammenfattende er dyrkning af blandede stadier af C. elegans på agar Petri retter mere egnet til indsamling af -omics data, men vi krævede en metode til at generere meget store befolkningsstørrelser uden flydende dyrkning.

Her præsenterer vi en metode til kultur og samler store blandede C. elegans populationer på store kulturplader (LSCP). Indsamling af prøver gennem denne rørledning giver tilstrækkelig prøve til at indsamle fænotypiske data og befolkningsdata sammen med alle data, der er nødvendige for -omics-eksperimenter (dvs.genomik, transskriptionomics, proteomics og metabolomics). Desuden kræver LSCP-metoden minimal manipulation af dyrene, mindre brugerforberedelsestid, giver en stram miljøkontrol og sikrer, at håndteringen af hver prøve er konsistent under hele undersøgelsen for generel reproducerbarhed.

Protocol

1. Sterilisere LSCP og udstyr

  1. Forbered glas LSCPs ved håndvask, efterfulgt af opvask, og efterfølgende autoklavering for at sikre glasvarer er fri for forurenende stoffer, før du starter eksperimentet. Opbevar autoklaverede LSCP'er på et rent tørt sted, indtil de er i brug.
    BEMÆRK: Sørg for, at LSCP'er tåler opvaskemaskine og autoklaverer. Sørg for, at LSCP-lågene tåler opvaskemaskine.
  2. Forbered LSCP låg ved håndvask efterfulgt af opvask. Opbevar LSCP-låg i en ren beholder, indtil det er nødvendigt.
  3. På dagen nematode Vækst Media Agarose (NGMA) er prepped, tørre LSCP låg med 10% blegemiddel opløsning to gange, efterfulgt af 70% ethanol. Når tørret ned med 10% blegemiddel og 70% ethanol, holde LSCP låg i en ren bin i laminar flow hætte, hvor NGMA vil blive prepped.

2. Forbered nematode vækst medier agarose (NGMA)

  1. NGMA fremstilles ved at kombinere følgende reagenser i en autoklaveret 2 L Erlenmeyerkolbe med omrørsstang på en omrørsplade: 2,5 g pepton, 3 g NaCl, 7 g agarose, 10 g agar og 975 mL sterilt vand16. Sørg for, at det samlede volumen er lig med 1 L. Tape en folie hætte til kolben.
    BEMÆRK: Forberedelsestrinnene for NGMA som beskrevet her vil give nok materiale til 2,5 LSCPs. Protokollen kan skræddersys til den nødvendige LSCP batchstørrelse i et givet eksperiment.
  2. Autoklave på flydende cyklus ved 121 °C og 21 p.s.i. i 45 min.
  3. Tænd for vandbadet og sæt det til 50 °C. Bring den autoklaverede NGMA til vandbadet for at køle af til 50 °C.
  4. Bring 2 L Erlenmeyer kolbe af NGMA ind i emhætten eller renset plads og sæt på en omrøring plade. Brug et termometer til at spore NGMA-temperaturen.
  5. Når NGMA er nået op på 50 °C, der tilsættes følgende i den rækkefølge, der er angivet med en steril engangspipette inde i emhætten eller renset rum: 25 mL 1 M KH2PO4 (K fosfatbuffer), 1 mL kolesterol (5 mg/mL i ethanol), 1 mL af 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4,1 ml nystatin (10 mg/mL) og 1 ml streptomycin (100 mg/mL)16.
  6. Hæld 400 mL NGMA i et sterilt glas LSCP, ca. 1,3 cm dybt, lad LSCP størkne på flad overflade i emhætten og læg autoklaveret folielåg tilbage på LSCP.
  7. Når agaren er indstillet, skal folien fjernes, og der anbringes et rent lufttæt låg på LSCP, og der skal opbevares 4 °C. NGMA opbevares i LSCP'er ved 4 °C, indtil den er i brug og anvendes inden for 5 dage.

3. Generer E. coli mad til NGMA på LSCP

  1. For at generere en stabil fødekilde genereres partier af HT115 (DE3) E. coli ved hjælp af et lille batch gennemsnitskoncept, der er i overensstemmelse med den centrale grænse sætning17. Opbevares ved -80 °C. Når det er nødvendigt, trækkes E. coli bakteriebestande fra -80 °C til optøning18.
    BEMÆRK: I denne protokol blev E. coli bakteriebestande dyrket i en bioreaktor. I slutningen af kulturvæksten blev kulturen fortyndet 1:50, og den målte OD600 var 0,4. Således havde kulturen en effektiv OD600 af 20. Bakterier blev pelleted, vejet, og genbruges i K medium i en koncentration på 0,5 g / mL (våd vægt), overføres til 2 mL aliquots, og frosne19.

4. Bakteriel græsplæne på NGMA

  1. NGMA LSCPs bringes ud af 4 °C til stuetemperatur (RT) i flere timer, før bakterieplænen spredes, så hele LSCP kan nå RT.
  2. De nødvendige E. coli bakteriebestande trækkes ud fra -80 °C til optøning18.
  3. Fortyndet E. coli bakteriel bestand(er) med 2 mL sterilt K-medium for at opnå 0,5 g E. coli i 4 mL pr. NGMA LSCP. Rør forsigtigt 4 mL E. coli i midten af NGMA LSCP.
  4. Brug en steril spreder til at sprede bakterier i et rektangel, der efterlader ca. 3,8 cm plads omkring kanterne af NGMA E. coli-fri.
  5. Lad NGMA LSCP med E. coli i emhætten med ventilatoren på i 1 time for at sikre, at E. coli suspensionen tørrer helt.
  6. Når bakterieplæne er tør, skal låget skubbes tæt på og opbevares ved 4 °C, indtil det bruges.

5. Chunk orme til at reducere stress og aldersvariation på tværs af prøver

  1. Streak orme fra en frossen orm lager til en nyligt seedet 6 cm plade4. Denne plade vil tjene som "master chunk" plade.
    BEMÆRK: Chunking er en optimal metode til at overføre orme fra en homozygot stamme20. Hvis en stamme er heterozygogous eller skal opretholdes ved plukning og parring, chunking er ikke tilrådeligt. Chunking frekvens kan være nødvendigt at optimere afhængigt af orm anvendte genotyper, temperatur valgt til vækst, og downstream trin.
  2. Når master chunk plade er fuld af sunde gravid voksne (ca. 3 dage) med masser af E. coli græsplæne stadig til stede, følg standard C. elegans chunking retningslinjer som beskrevet i WormBook til at producere fire samlede luns plader4.
  3. Alle stykkerplader opbevares i et kontrolleret temperaturrum (CT) ved 20 °C, medmindre andet er angivet for vækst.
    BEMÆRK: Hvis brugere af denne protokol ikke har adgang til et CT-rum som beskrevet her, anbefales det at bruge enten en lille inkubator, hvor temperaturen kan styres, eller et udpeget rum, hvor miljøforholdene kan kontrolleres så meget som muligt. Hvis ingen af disse alternative indstillinger er tilgængelige, skal du være opmærksom på, at variationen i stikprøvevæksten kan være større.
  4. Når mange gravide voksne er observeret i 4th chunk plade, gå videre til Trin 6.

6. Spot blegning gravid voksne på LSCP

BEMÆRK: Denne blegningsteknik bruges til at udrydde de fleste forurenende stoffer og opløse neglebåndet på de hermafroditter, der frigiver embryoner fra den voksne orm. Blegemiddelopløsningen vil suge ind i NGMA før udklækningen af embryonerne.

  1. Bring LSCPs ud til RT i flere timer før stedet blegning orme.
  2. Forbered et 7:2:1-forhold på ddH2O: blegemiddel: 5 M NaOH. Gør denne alkaliske hypochloritopløsning frisk lige før brug.
    BEMÆRK: Brug det samme lager af blegemiddel og NaOH i løbet af et givet forsøg for at undgå blegemiddelpartipårører. Blegemiddel, der anvendes i denne protokol var 5-10% natrium hypochlorit.
  3. Tænd en Bunsen brænder og flamme en orm pick før du fortsætter. Scoop frisk E. coli på en steril pick fra kanten af bakteriel græsplæne på LSCP.
  4. Vælg en enkelt gravid voksen fra den4. chunk plade til spot blegning.
  5. Pipette 5 μL af alkalisk hypochloritopløsning i det ene hjørne af LSCP væk fra E. coli plænen.
  6. Placer den plukkede gravide voksne i 5 μL alkalisk hypochloritopløsning. Tryk på nematoden for at hjælpe med at forstyrre neglebåndet og frigive æg.
  7. Gentag trin 6.4 – 6.6 for i alt 4x og placer 5 gravide voksne jævnt rundt om E. coli græsplænen. Vælg alle 5 gravide voksne fra samme 4th chunk plade for at sikre næsten genetisk isogene individer tilsættes til en given prøve.
  8. Læg låget tilbage på LSCP'et.
  9. Gentag trin for alle LSCPs.

7. Orm vækst i kontrolleret temperatur (CT) værelse

  1. Efter spot blegning, placere låget tæt på LSCP og sted i CT-rummet indstillet til 20 °C med konstant luftstrøm og en 12L:12D fotoperiod (12 timer lys og 12 h mørke).
  2. Bemærk den tid og position, hvor prøven blev placeret i CT-rummet.
    BEMÆRK: Positionen i rummet skal altid dokumenteres for at registrere eventuelle miljøforskelle, som prøver, der potentielt kan støde på, mens de vokser. Når prøven er i CT-rummet, skal den forblive uopstyrtet på det tildelte sted. Åbn ikke låget på LSCP i CT-rummet for at mindske risikoen for kontaminering.
  3. Tag LSCP til et mikroskop, uden for CT-rummet, for at observere befolkningstilvæksten og tætheden.
    BEMÆRK: Hver C. elegans stamme og prøve vil variere i sin vækst, så overvåge prøver nøje. Selv om det anbefales ikke at forstyrre væksten i LSCP, mens der i CT-rummet, LSCPs blev transporteret ud af CT-rummet og låg blev åbnet hver 2 dage for at overvåge prøve vækst. Ved at fjerne de forseglede låg fra LSCP'erne hver anden dag kan O2 også strømme ind i LSCP' et.
  4. Før høst sikre, at LSCP er blevet fuld af en stor population af orme. Brug følgende kriterier til at afgøre, om LSCP'et er klar til at blive indsamlet.
    1. Sørg for, at LSCP er fuld af gravid voksen orme.
    2. Sørg for, at pladen indeholder en stor befolkningsstørrelse (dvs. orme dækker hele overfladen af agaren).
    3. Sørg for, at pladen ikke har mange æg på overfladen af agaren (dvs.det maksimale antal orme skal have klækket).
    4. Sørg for, at pladen har minimal til ingen E. coli tilbage, hvilket indikerer, at ormene ville sulte og generere dauer larver, hvis de blev efterladt på pladen i yderligere to dage.
      BEMÆRK: Selv om de fleste LSCP'er er klar til at høste mellem 10 og 20 dage, afhængigt af belastning og prøve, skal du kontrollere hvert LSCP ofte ved fastlæggelsen af denne protokol for at bestemme normale høsttider.
  5. Rengør handsker og område med 70% ethanol mellem håndtering af LSCP'er for at undgå krydskontaminering mellem stammer.

8. Høst af LSCP-prøven

  1. Tænd for og lad centrifugen køle af til 4 °C inden høstprøverne.
  2. Tre koniske rør på 50 ml fremstilles med 50 ml M9-opløsning pr. LSCP, der skal høstes.
  3. Etiket 15 mL konisk rør pr. LSCP.
    BEMÆRK: Alle centrifugeringstrin udføres i det 15 mL koniske rør, fordi orme har tendens til at pellet godt i disse rør.
  4. Hæld 50 ml M9-opløsning (fra et 50 ml konisk rør i trin 8.2) på LSCP-overfladen og svirr rundt for at sikre, at M9 dækker hele NGMA-overfladen.
  5. Mens M9 sidder på LSCP overflade, prime en steril serologisk pipette med M9.
    BEMÆRK: Ved at grunde den sterile serologiske pipette med M9 sikrer dette, at mindre orme klæber til indersiden af plastpipetten, hvilket forhindrer prøvetab.
  6. Vip LSCP så M9 og ormen befolkning samles i det ene hjørne af LSCP.
    BEMÆRK: Blandingen af M9-opløsning og orme fra LSCP omtales som "ormeaffjedringen" i downstream-trin.
  7. Ved hjælp af en primet serologisk pipette med en automatisk pipettor, pipette orm suspension og sted i den oprindelige 50 mL koniske rør. Når 50 mL orme suspension er indsamlet, placere koniske rør på en rocker til at forstyrre bakterier klumper og snavs.
  8. Gentag trin 8.4 - 8.7, der indsamler 150 mL ormeaffjedring pr. LSCP.
  9. 15 mL ormeaffjedring overføres fra et af de tre koniske rør på 50 mL ved at hælde i et mærket 15 mL konisk rør, der er afsat i trin 8.3. Centrifuge det 15 mL koniske rør ved 884 x g i 1 min ved 4 °C. De fleste orme vil pellet i bunden af røret.
  10. Aspirat ud supernatant sikre ikke at forstyrre ormen pellet.
  11. Fortsæt med at tilføje ca. 13 mL ormeaffjedring til det samme 15 mL koniske rør, der gentager trin 8.9 og 8.10, indtil alle 150 mL ormeaffjedring forbruges. Invertere røret og forstyrre pellet mellem centrifugationer til at vaske og indsugning off så mange bakterier og snavs som muligt.
    BEMÆRK: På dette trin kondenseres indholdet fra alle tre 50 mL koniske rør i et enkelt 15 mL rør.
  12. Tilsæt 10 mL ren M9 til det 15 mL koniske rør og omrør ormen pellet ved at vende. Centrifuge det 15 mL koniske rør ved 884 x g i 1 min ved 4 °C. Aspirat ud supernatant sikre ikke at forstyrre ormen pellet. Gentag to gange.
    BEMÆRK: Hvis der er en stor mængde snavs eller bakterier i prøven, skal du gentage trin 8.12, indtil prøven er ren.
  13. Når prøven er ren, tilsættes ddH2O til ormepillen for i alt 10 mL ddH2O og orme. Omrør ormen pellet ved at vende. Bevæg dig hurtigt ind i trin 9.1, da orme skal forblive i ddH2O i 5 minutter eller mindre for at undgå osmotisk stress.
    BEMÆRK: Suspendering af ormepiller i ddH2O er det foretrukne opløsningsmiddel til downstream-omics trin. Orme kan suspenderes i andre opløsningsmidler eller buffere, hvis de er kompatible med en given eksperimentel arbejdsproces.

9. Anslået befolkningsstørrelse

BEMÆRK: Gå hurtigt gennem trin 9.1 – 9.7. Blandingen af ddH2O og orme fra trin 8.13 kaldes "ormeprøven" i de efterfølgende trin.

  1. Før ormens prøvepipetterpipetter, der skal bruges sammen med M9, pipetter, skal du undgå, at ormene klæber fast på indersiden af plastpipetten, hvilket forhindrer prøvetab og reducerer tællevariationen.
  2. Der udtages en 100 μL aliquot ormeprøve, og den fortyndes til 900 μL M9. Bland godt og lav en seriel fortynding (1:10, 1:100, 1:1000). Gentag dette trin to gange for at opnå i alt tre sæt aliquot replikater.
    BEMÆRK: Pipetterorme kan forårsage høj variation i antallet af stikprøvepopulationer. Sørg for, at ormeprøven er homogen, inden den ønskede aliquotpipetterpipetteres.
  3. Sæt 15 mL koniske rør på en rocker til at fortsætte med at flytte kultur, mens aliquots tælles.
  4. Sørg for, at ormeprøven er godt blandet og homogen. Pipette 5 μL fra 1:10 orm prøve, dispensere det på en mikroskopi dias, og tælle antallet af orme. Hvis dette tal er mindre end ca. 50 orme, skal du også tælle fortyndingerne 1:100 og 1:1000. Hvis det er mere end 50, skal du gå til den næste serielle fortynding.
    BEMÆRK: Hvis for mange orme ikke kan tælles nøjagtigt, skal du bruge den næste serielle fortynding til optælling i stedet.
  5. Tæl hver aliquot replikat af hver fortynding 3x. Ved afslutningen af optællingen vil der for de fleste kulturer blive dokumenteret 9 samlede optællinger(dvs.3 samlede optællinger for hver aliquot replikat).
  6. Gennemsnittet af fortyndingstællingen for at bestemme ormeprøvens anslåede populationsstørrelse. Disse fortyndingsantal bestemmer mængden af ormeprøve, der er nødvendig for at skabe den ønskede aliquot-størrelse for -omics-trin.
    BEMÆRK: I dette eksperiment blev der genereret aliquots af ca. 200.000 orme i blandet fase. Derudover blev en aliquot på ca. 50.000 orme i blandet fase afsat til sortering i et stort partikelflowcytometer (beskrevet i trin 10).
  7. Når ormeprøven er blevet opdelt i passende aliquots, fryses flashen i flydende nitrogen, og prøven opbevares ved -80 °C.
    BEMÆRK: Tilsætning må ikke fryses, når det er beregnet til store partikelflowcytometri.

10. (Valgfri) Forbehandlingsprøve til stor partikelflowcytometri

BEMÆRK: Trin 10, 11 og 12 er forfatternes foretrukne metode til at registrere stikprøvevækst (dvs.befolkningsstørrelse og befolkningsfordeling af C. elegans livscyklusstadier) og bestemme succesen af en kultur. Brugere af denne protokol kan erstatte valgfri trin 10, 11 og 12 med deres egne målinger af vækstsucces. Trin 10, 11 og 12 beskrives her af to årsager. Først kan brugere, der har brugt udstyr i trin 10, 11 og 12, replikere disse trin og for det andet for at vise validering af denne vækstmetode. Trin 9 ovenfor giver et godt skøn over det samlede antal orme til at bestemme aliquot størrelser, og trin 10 er en mere kvantitativ metrikværdi til at estimere antallet og befolkningsfordelingen af orme i en given prøve.

  1. Bring aliquot af ca 50.000 blandet fase orme (afsat i trin 9,6) op til 10 ml samlede volumen i M9 opløsning.
  2. Der fremstilles en opløsning bestående af 1 mg/mL E. coli og en fortynding på 1:50 på 0,5 μM røde fluorescerende mikrosfærer19.
  3. Der tilsættes 200 μL af denne opløsning til 10 ml orme i blandet stadie i M9, og der inkuberes, mens de vugger i 20 minutter.
  4. Efter 20 min centrifuges det 15 mL koniske rør ved 884 x g i 1 min ved 4 °C.
  5. Aspirat ud supernatant sikre ikke at forstyrre ormen pellet.
  6. Vask ormen pellet to gange med M9 løsning for at fjerne overskydende bakterier og røde fluorescerende mikrosfærer.
  7. Tilsæt 5 mL M9 til ormen pellet og sikre, at pellet ser ren. Hvis pellet er ren, tilsæt 5 mL M9 med 50 mM natrium azide til både rette og dræbe orme for nøjagtig optælling og dimensionering21.
  8. Dokumenttidspunkt og -dato, hvor natriumanzid tilsættes til prøven.
  9. Sæt prøven til side på rocker, indtil det er nødvendigt for store partikel flow cytometry.
    BEMÆRK: Natriumazid er kendt for at påvirke nematodefysiologi (dvs.kropslængde, metabolisme og thermotolerance). Derfor er det vigtigt at bemærke, hvornår orme udsættes for natriumazid, da mange af disse fysiologiske virkninger sker inden for få minutter22. På grund af de kendte fysiologiske virkninger af natriumanzid på orme vil denne behandling påvirke downstream-billedkvaliteten og bør overvejes.

11. (Valgfrit) Dokumentation af befolkningsfordeling og klargødning af 384-brøndsplader til billeddannelse

BEMÆRK: Trin 11 bruger et stort partikelflowcytometer (LPFC). Grundlæggende kendskab til en LPFC antages i denne protokol. Andre metoder kan erstattes for at dokumentere væksten og befolkningsfordelingen af prøver. De trin, der er beskrevet her, er for brugere, der planlægger at bruge en LPFC i deres pipeline23.

  1. Tænd, rengør og prime LPFC, og lad laser (r) til at varme i 1 time før sortering prøver.
  2. Når laseren er varmet op, skal du åbne "Histogram" profilen og skalere til en Time of Flight (TOF) i 2050.
  3. Føj et søjleområde til "Histogram", der strækker sig over et TOF-område på 100. Den første bar region dækker en tof på 50-150.
  4. Fortsæt med at oprette tyve barområder, der hver strækker sig over et TOF-område på 100. Disse søjleområder spænder over hele tof-området fra 50 – 2050. Se supplerende tabel 1 for de nøjagtige lukkede områder, der skal anvendes på tværs af tof-fordelingen.
  5. Gem dette Histogram, der er konfigureret som et "eksperiment", der skal bruges i fremtidige LPFC-kørsler.
  6. Vælg kalibreret 384-brønds plade eller kalibrer instrument til en 384-brønds plade for at dispensere genstande ind.
  7. Når du er i den kalibrerede 384-brønds pladeskabelon, skal du indstille skabelonen til at dispensere 20 indhegnede objekter i fire brønde (fire tekniske replikater af hvert lukket område) for hvert af de 20 barområder, der blev oprettet under trin 11.3-4. Se supplerende tabel 2 for et eksempel på, hvordan orme dispenseres i 384-brøndspladen.
  8. Prøven overføres fra trin 10.9 til et 50 ml konisk rør, og der tilsættes yderligere M9-opløsning for at opnå et samlet volumen på ca. 40 mL.
  9. Prøven sorteres automatisk pr. parametre, der er angivet i trin 11.7, under konstant omrøring af prøven for at forhindre afregning og samtidig udlevering af genstande fra prøven til den kalibrerede 384-brøndsplade.
    BEMÆRK: Sørg for, at LPFC'ens strømningshastighed fungerer mellem 15-20 objekter i sekundet, og angiv ingen doubler, der skal sorteres.
  10. Når hele prøven er sorteret, og det maksimale antal indhegnede områder er blevet afleveret i 384-brøndspladen, skal prøven tages af LPFC og det rene instrument.
    BEMÆRK: Når større TOF-regioner nås, kan det blive udfordrende at fortsætte med at fylde 384-brøndspladen på grund af lave hændelsestællinger i det pågældende TOF-område. Fyld så mange af de indhegnede regioner som muligt for at få den bedste idé om, hvor C. elegans livsstadier falder inden for LPFC-distributionen, før de løber tør for prøve.
  11. Placer en tætningsfilm oven på 384-brøndspladen, indtil den er afbildet.
    BEMÆRK: Billedplade så hurtigt som muligt efter sortering, fordi prøver behandles med natriumazid22. Røde fluorescerende mikrosfærer kan ses i de indsamlede LPFC-datafiler(dvs. PH Red-data i outputtekstfilen) baseret på niveauet af rød fluorescens, der udsendes i hvert sorteret objekt for at hjælpe med at identificere, hvilke objekter der er levende orme, døde orme, dauers eller junk24.

12. (Valgfrit) Billedbehandling 384-brønds plade

BEMÆRK: Trin 12 bruger et mikrokonfokalt mikroskop. Grundlæggende kendskab til et mikrokonfokalt mikroskop antages i denne protokol. Andre metoder kan erstattes for at dokumentere væksten og befolkningsfordelingen af prøver.

  1. Ved hjælp af en plade-læsning mikro confocal mikroskop med en 20x linse.
  2. Åbn fanen "Mål og kamera", og angiv den til tilstanden "10x Plan ApoLambda".
  3. Åbn fanen "Kameraplacering", og angiv til "2".
  4. Åbn fanen "Sites to Visit on Plate" og angiv til "4" steder pr. brønd og "overlap sites 10%" for senere at sy billeder sammen.
  5. Åbn fanen "Bølgelængde" og angiv til "Brightfield 1".
  6. Åbn fanen "Belysning", og angiv den til "Transmitteret lys, lys prøve".
  7. Placer 384-brøndspladen i mikroskopet, og sæt "Z Stack" til "Calculate Offset" og find det rigtige brændplan til prøverne i 384-brøndspladen.
  8. Kør 384-brøndspladen på mikrokonfokalt mikroskop, der samler fire billeder pr. brønd.
  9. Montage de fire billeder sammen for at skabe et billede per brønd.

Representative Results

Væksten i C. elegans ved hjælp af LSCP-metoden giver i gennemsnit ca. 2,4 millioner orme i blandet fase pr. prøve over 12,2 dage. Væksten i C. elegans ved hjælp af LSCP-metoden giver brugerne mulighed for at generere store blandede populationer af C. elegans med ringe håndtering og manipulation af dyrene, hvilket er ideelt til store -omiske undersøgelser (Figur 1). Når en LSCP er blevet fuld af voksne orme, nåede en stor befolkning størrelse, og har minimal bakterier tilbage, kan brugerne høste og estimere befolkningens størrelse. Dette punkt kan også tjene som kvalitetskontrol ved at vurdere, om befolkningen er tilstrækkelig til at kunne bruges i en "omics pipeline" (figur 2). Populationsdynamikken er afhængig af selve stammen, belastningens opførsel (dvs.gravende stammer havde en tendens til at have lavere ormgendannelse) og vækstsucces(dvs.forurening). LSCP-metoden blev testet på 15 stammer af C. elegans, der indeholder en blanding af Caenorhabditis Genetics Center (CGC) mutanter og Caenorhabditis elegans Natural Diversity Resource (CeNDR) vilde stammer25. Stammegenotyper er beskrevet i supplerende tabel 3.

LSCP-metoden gav befolkningsstørrelser fra ca. 94.500 til 9.290.000. Den gennemsnitlige befolkningsstørrelse inden for referencestammen PD1074 og på tværs af stammer var ca. 2,4 millioner orme (figur 3). Der blev ikke konstateret signifikante forskelle i de anslåede befolkningsstørrelser mellem C. elegans-stammer i løbet af et gennemsnit på 12,2 LSCP-vækstdage (figur 4). PD1074 LSCPs tog mellem 10 - 14 dage at vokse til en fuld blandet fase befolkning. Den gennemsnitlige væksttid på tværs af PD1074 var 10 dage. Den langsomste voksende stamme voksede i højst 20 dage, og den hurtigst voksende stamme voksede i mindst 10 dage (Figur 4).

Derfor kan brugerne ved hjælp af denne LSCP-metode nemt integrere nye interessestammer i en undersøgelse med ringe viden om udviklingsmæssig timing og baggrundsekspertise. Bemærk, at stammer og fænotyper, der skal vedligeholdes ved plukning, har fecundity defekter, er heterozygoa, eller har vækstfejl kan ikke fungere godt i denne pipeline.

Store partikel flow cytometry og billeddannelse af prøver giver brugerne mulighed for at dokumentere befolkningsfordelingen. En bred vifte af platforme kan bruges til at måle vellykket befolkningstilvækst.

For reproducerbare -omics målinger, er det vigtigt at vokse konsekvent kulturer. Målingerne af kultur reproducerbarhed er antallet af orme og en ensartet størrelsesfordeling for en given stamme. Vi viser prøvefordelingen for referencestammen PD1074 – en variant af den oprindelige N2 Bristol-stamme ved hjælp af LPFC23-26 - og mikrokonfokale mikroskopbilleder som proxyer for vækstsucces. Da orme blev målt fra L1-fasen til gravid voksen på LPFC-fordelingen (Figur 5), efterfølgende billeddannelse (Figur 6) og variationen i befolkningsfordelingen på tværs af prøver (Figur 7), kan vi se, at denne rørledning genererede en blandet population af C. elegans.

For at se nærmere på befolkningsfordelingen af vores mixed stage prøver, vi kiggede på fordelingen af 35 PD1074 LSCPs ved at se på den procentdel af orme, der falder inden for hver region på tværs af hele Time of Flight (TOF)(dvs.kropslængde) distribution(Figur 7A, B).

Figure 1
Figur 1: Oversigt over LSCP-ormens vækstpipeline. (A) Når alle stammer er modtaget i laboratoriet, er de blevet tilberedt og frosset til langtidsopbevaring ved -80 °C2. B) Der er fremstillet en "master chunk"-plade af en frossen ormbestand, som opbevares ved 15 °C, og som højst skal anvendes i en måned. (C) Hver prøve gennemgik fire på hinanden følgende chunking-trin for at reducere generationsstress, før den voksede på LSCP. (D) 5 individuelle gravide voksne blev plukket fra "chunk 4" 6 cm plade i trin (D) og stedet bleget på fem givne områder af LSCP. (E) LSCP'et blev placeret i et kontrolleret temperaturrum og dyrket ved 20 °C, indtil LSCP var fuld af voksne orme, nåede en stor befolkningsstørrelse og havde minimale bakterier tilbage. (F) Ormens befolkning blev høstet og indsamlet til nedstrøms trin. (G)Aliquots blev oprettet fra LSCP og blev flash frosset til downstream ønskede applikationer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over LSCP-høst og estimering af befolkningsstørrelsen. (A) 50 mL M9 blev brugt til at vaske orme af NGMA-overfladen. Ormeaffjedringen blev pipetteret ind i et 50 mL konisk rør. Trin (A) blev gentaget to gange. (B) 15 mL ormeaffjedring blev hældt i et nyt 15 mL konisk rør. Orme blev pelleted af centrifuging. M9 + vragrester blev suget ud uden at forstyrre orm pellet. Trin (B) blev gentaget, indtil alle 150 mL ormeaffjedring blev indsamlet. (C) Ormen pellet blev vasket og centrifuged tre gange med M9 at fjerne de resterende snavs. Når prøven var ren, blev ormepillen genbrugt i 10 mL ddH2O. (D) Der blev oprettet en seriel fortynding af prøven for at estimere ormens befolkningsstørrelse. Den eller de fortyndingsfaktorer, der gjorde det muligt at tælle orme nøjagtigt, blev anvendt. Den eller de anvendte fortyndingsfaktorer ændrede sig afhængigt af LSCP's befolkningsstørrelse. (E) Når fortyndingsfaktoren eller -faktorerne var valgt, blev alle orme fra alle tre aliquot-replikater af denne fortynding pipetteret på et rent dias, og orme blev talt under et dissekerende mikroskop. (F)Prøven blev opdelt i aliquots af passende størrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: LSCP-metoden genererede i gennemsnit en population på 2,4 millioner orme i blandet stadie. LSCP giver befolkningsstørrelser i de mindste befolkningstilvækster på omkring 94.500 og på den største befolkningstilvækst på omkring 9.290.000. Den gennemsnitlige befolkningsstørrelse på tværs af alle stammer var 2,4 millioner orme. Bjælker under C. elegans stamme navne angiver, om en stamme er en CGC mutant eller CeNDR naturlige isolere. LSCP-prøvestørrelsen vises for hver stamme. Sammenligninger for alle par ved hjælp af Tukeys HSD-test blev udført. Der blev ikke observeret signifikante forskelle mellem de anslåede befolkningsstørrelser på tværs af C. elegansstammer (F(14,108) = 0,7, p = 0,77). Farvede bjælker angiver standardfarveskærme for respektive C. elegans stammerepræsentation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: LSCP-metoden genererede store populationer af orme i blandet fase på 10 – 20 dage. En given C. elegans LSCP voksede, indtil prøven var fuld af voksne orme, nåede en stor befolkning størrelse, og havde minimal bakteriel græsplæne tilbage. LSCPs tog mellem 10 - 20 dage at vokse til en fuld blandet fase befolkning, afhængigt af belastningen. Den gennemsnitlige væksttid på tværs af stammerne var 12,2 dage. LSCP-prøvestørrelsen vises for hver stamme. Hver fejllinje blev konstrueret ved hjælp af 1 standardafvigelse fra middelværdien. Niveauer, der ikke er forbundet med samme bogstav, er væsentligt forskellige. Sammenligninger for alle par ved hjælp af Tukeys HSD-test. Der blev konstateret en betydelig forskel i den mængde væksttid på LSCP, der var nødvendig på tværs af C. elegans-stammer (F(14.108) = 8,8, p < 0,0001*). Farvede bjælker angiver standardfarveskærme for respektive C. elegans stammerepræsentation. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Blandet befolknings- og vækstmåling af referencestammen af vildtypen, PD1074. En repræsentativ LPFC-fordeling af en LSCP-vækst af referencestammen af vild type, en variant af den oprindelige N2 Bristol-stamme (PD1074), dokumenterer størrelsesfordelingen og hændelsestællingerne for en population i blandede trin. X-aksen viser længden (Flyvetid, TOF) af de sorterede orme. Y-aksen viser ormenes optiske tæthed (optisk udryddelse, EXT) sorteret. Hvert datapunkt er en orm, der er dokumenteret i eksemplet. Hvert tof-område, der blev brugt til billedanalyse, vises i en anden farve. Der blev oprettet 20 TOF-regioner (R2 – R21) fra en tof på 50 til 2050. Nærmere oplysninger om hver enkelt tof-region findes i supplerende tabel 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Billeder af orme sorteret fra TOF-områder fra R2 – R12 viser PD1074 LPFC-distributionen. I region R2 kan L1 orme identificeres, og i region R9 identificeres overvejende gravide voksne, der spænder over de to udviklingsmæssige larve ekstremer, hvilket giver os omtrentlige regioner inden for flowcytometerfordelingen af, hvor stadier forventes i fordelingen. Skalalinjen repræsenterer 1 mm. Repræsentative billeder er taget fra LPFC-fordelingen, der vises i figur 5, og de farvede bokse svarer til områder fra figur 5. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Befolkningsfordeling på tværs af flyvetidsområder i referencestammen af vildtype, PD1074. Fordeling af orme i hele tof-området, der viser de områder, hvor orme blev fundet. Hvert PD1074 LSCP repræsenteres som en individuel farve. (A)X-aksen viser de tyve TOF-områder (R2 – R21), der er observeret og talt for LSCP'et, og viser hele størrelsesfordelingen. Y-aksen viser procentdelen af orme fra et givet LSCP, der havde en kropsstørrelse, der faldt i et givet TOF-område. (B) Da en mindre del af ormens befolkning ligger mellem R7-R21-regionerne, blev loggen over den procentdel af ormene, der faldt inden for hvert område, taget for at vise befolkningsfordelingen. X-aksen viser tof-områderne R7-R21. Y-aksen viser loggen på procentdelen af orme fra et givet LSCP, der havde en kropsstørrelse, der faldt ind i et givet TOF-område. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Gennemsnitlig daglig temperatur (°C) af vækstbetingelserne, hvorunder LSCP blev dyrket og håndteret. Rapporterede temperaturer i det kontrollerede temperaturrum (CT) blev dokumenteret og indsamlet i hele seksmåneders spændvidden for prøvevækst og -indsamling. Den gennemsnitlige daglige temperatur rapporteres her. Der blev ikke observeret signifikante forskelle mellem den temperatur, hvor LCSP voksede i projektets løbetid (F(5,24) = 2,59, p = 0,0524). Hele temperaturforskellen strakte sig ikke over 0,003 °C i hele prøvevækstens og -generationens seksmåneders varighed. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende tabel 1: Tof-indhegnede områder, der bruges til at sortere orme i 384-brøndsplader til billeddannelse. Der blev oprettet områder med placering for at spænde over en tof på 100 på tværs af hele tof-fordelingen fra 50 – 2050. Gated regioner kan ændres og optimeres til dine behov. Hvert tof-område, der blev brugt til billedanalyse, vises i en anden farve. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: 384-brønds pladeskabelon for tof-områder og replikatlayout. Hver prøve blev sorteret i en 384-godt plade til billeddannelse. Der blev oprettet fire replikater for hvert område, der er valgt til sortering. Gated regioner kan ændres og optimeres til dine behov. Se supplerende tabel 1 for specifikke lukkede områder, der er oprettet og anvendt i denne protokol. Hvert tof-område, der blev brugt til billedanalyse, vises i en anden farve. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 3: C. eleganstammer, der anvendes i denne protokol, indeholder en blanding af CGC- og CeNDR-stammer. Stammen, genotypen, stammekilden og detaljerne er beskrevet i denne tabel. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

En række fartøjer kan bruges som LSCP. I denne protokol blev der brugt en standard glasbageplade. De LSC'er, der var i brug, havde ydre dimensioner på 35,56 x 20,32 cm, indvendige dimensioner på 27,94 x 17,78 cm og ca. 4,45 cm dybe og kom med et monteret låg. Således er mængden af bakterier, der anvendes her, blevet optimeret til et LSCP med ovenstående dimensioner for at give en stor population af orme i blandet fase. Bakteriel volumen og koncentration kan justeres, så de passer til forsøgsbehovene.

Forurening med skimmel, svampe eller andre bakterielle kilder kan forekomme på ethvert trin i LSCP-metoden, så håndter prøver med omhu. Før du starter et trin i protokollen, skal du sikre dig, at arbejdsområdet rengøres med 70% ethanol og 10% blegemiddel. Hvis det er muligt, behandle brugte områder med UV-lys i 30 min og tænde en HEPA luftfilter 30 min før du starter hvert trin.

Ved at dyrke LSCP i kontrollerede omgivelser (dvs.i et CT-rum, der er indstillet til 20 °C), kan brugeren lettere spore prøvens vækst og dokumentere potentiel kontaminering. Hvis LSCP's overflade bliver forurenet, skal forureningen enten udskæres, når det er muligt, og prøven fortsætte med at vokse eller kassere prøven, hvis kontamineringen ikke er mulig at kontrollere. Det er bydende nødvendigt at håndtere forurening hurtigt for at reducere uønsket vækst og for at sikre, at det ikke udkonkurrerer orme for ressourcer.

Denne metode er beregnet til dem, der ønsker at dyrke store blandede befolkningskulturer i C. elegans. Selv om det kan være muligt at dyrke synkroniserede populationer af orme på LSCP som gjort på kommercielt tilgængelige Petri retter og i flydende kultur, har forfatterne ikke testet denne mulighed. Hvis brugerne desuden ønsker at dyrke mere end ca. 2,4 millioner orme i gennemsnit i en given prøve, anbefales en anden metode4. Vækstsucces afhænger af den belastning, der behandles i pipelinen. Forfatterne var i stand til at vokse populationer på ca. 2,4 millioner orme i mindst fem biologiske replikater af 15 C. elegans stammer, hvilket indikerer, at metoden er robust.

Før eksperimentet påbegyndes, skal du bemærke, at en given orms alder og sundhed kan påvirke fecundity og efterfølgende befolkningstilvæksttid. Sørg for, at orme opretholdes under sunde forhold med minimal stress, før de bruges i denne rørledning. Det antages, at der er skabt, frosset og opbevaret lagerprøver ved -80 °C for at reducere den genetiske afdrift over tid.

Afhængigt af behovene i et givet eksperiment kan antallet af begyndende gravide voksne på et LSCP ændres. Ændring af antallet af begyndende gravide voksne på LSCP vil ændre vækstraten og dermed tid til at høste. Fem gravide voksne er vant til frø hver LSCP af følgende grunde: (1) En enkel, hurtig og effektiv måde at frø mange C. elegans stammer på LSCPs på én gang var nødvendig, og (2) for at reducere aldersforskellene blandt de gravide voksne plukket, der kan føre til vækst heterogenitet.

Denne metode giver brugeren mulighed for at høste store populationer af orme med alle livscyklusstadier til stede. Med de nuværende metoder til rådighed, indsamling af store prøver af C. elegans kræver blegemiddel synkronisering for at opnå det antal orme ønskede for downstream arbejde. I betragtning af denne tilgang kan man nu dyrke så mange orme som tidligere muligt i fermenteringsmaskiner eller store flydende kulturer uden vanskeligheder forbundet med blegemiddelsynkronisering og flere håndteringstrin. Vores protokol gør det muligt at målrette interessestammer effektivt, bruge minimal håndteringstid til at dyrke selve prøven og isolere stadier af orme eller befolkningen efter behov i downstream-rørledninger.

En LPFC blev brugt som et værktøj til at dokumentere befolkningsfordelingen og størrelsen i et givet LSCP. Den anvendte LPFC er et kontinuerligt flowsystem, der analyserer, sorterer og dispenserer orme baseret på deres størrelse (TOF) og optisk tæthed. Som en given orm passerer gennem flowcellen, opfanger den aksiale lystabsdetektor mængden af signallys, der er blokeret af en 488 nm solid state laser i den tid, det tager en orm at passere igennem, hvilket giver brugeren tof og optisk tæthed af ormen. Fluorescens indsamling optik og detektorer kan også bruges til at maksimere fluorescens følsomhed og indsamling på hver prøve. LPFC-indsamlingsparametrene varierer afhængigt af instrumentet. Brugere kan anvende en række forskellige platforme til at registrere ormens størrelse og er ikke begrænset til at bruge denne protokol, hvis en LPFC ikke er tilgængelig.

Forfatterne bruger prøver dyrket i den metode, der er beskrevet her for at identificere ukendte metabolitter i forskellige stammer af C. elegans via Flydende kromatografi – Massespektrometri, NMR-spektroskopi og RNA-sekventering. Forfatterne planlægger at fortsætte med at bruge denne metode til vækst af prøver i denne rørledning med en række C. elegans stammer som nye stammer af interesse let kan behandles ved hjælp af denne rørledning.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer af Edison Lab for nyttige diskussioner og feedback på dette manuskript; især B.M. Garcia. Nogle stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), og CeNDR, som er finansieret af NSF Living Collections CSBR 1930382. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra NIH (U2CES030167).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Sterile Serological Pipettes VWR 89130-898
10 ul pipette tips VWR 89079-438
100 ul pipette tips VWR 89079-442
1000 mL Graduated Cylinder VWR 10124-380
1000 ul pipette tips VWR 89079-488
15 mL conical tubes VWR 89039-668
190 Proof Ethanol VWR 89125-166
2 L Wide Neck Erlenmeyer Flask VWR 75804-654
50 mL conical tubes VWR 75874-294
Agar Sigma 05040-100G
Agarose Sigma A9539-500G
BVC Control G Fluid Aspiration System Vacuubrand
Calcium Chloride Sigma 449709-10G
Cholesterol Sigma C3045-25G
Clorox Bleach VWR 89414-502
Conviron Control Temperature Room Conviron https://www.conviron.com/environmental-rooms
Corning Low Volume 384 Well Black with Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate VWR 89089-866
Fisher Scientific Accuspin 3R Fisher
Flat-Bottom 24-Well Plate VWR 29443-952
Honeywell True HEPA Purifier 465 sq ft. Home Depot 204390560
HT115 E. coli (DE3) CGC HT115(DE3) https://cgc.umn.edu/strain/HT115(DE3)
Kimwipes VWR 470224-038
Large Scale Culture Plate (LSCP) Pyrex 1090948 Pyrex 2-quart Glass Baking Dish with Red Lid
Magnesium Sulfate Sigma C86677-25G
MgSO4 VWR 97062-998
Microscope Plain Slides VWR 16004-422
Millipore Filter Millipore 1.11727.2500
Molecular Devices ImageXpress Molecular Devices Model Number:IXMConfocal https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/high-content-imaging/imagexpress-micro-confocal#gref , Authors used MetaXpress Software Version 6.5.4.532
Nystatin (10mg/mL) Sigma N6261-25MU
Peptone Sigma P7750-100G
Petri Dishes (6 cm) VWR 25384-092
Pipette Controller VWR 613-4180
Potassium Chloride Fisher P217-3
Potassium Phosphate Monobasic VWR 0781-500G
Potasssium Hydroxide Fisher P250-500
Red Fluroscent Microspheres Polysciences 19507-5
Sodium Chloride Sigma 746398-500G
Sodium Hydroxide Fisher 111357
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher BP332-500
Standard Gilson Pipette Set Gilson FA10002M, FA10004M, FA10006M
Streptomycin (100mg/mL) Sigma S6501-25G
Union Biometrica COPAS BioSorter Union Biometrica https://www.unionbio.com/biosorter/ , authors used: Flow Pilot software version 1.6.1.3.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Félix, M. A., Braendle, C. The natural history of Caenorhabditis elegans. Current Biology. 20, (22), 965-969 (2010).
  2. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. 1-31 (2015).
  3. Brenner, S. The genetics of behaviour. British Medical Bulletin. 29, (3), 269-271 (1973).
  4. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/ (2006).
  5. Xiong, H., Pears, C., Woollard, A. An enhanced C. elegans based platform for toxicity assessment. Scientific Reports. 7, (1), 9839 (2017).
  6. Loer, C. M., et al. Cuticle integrity and biogenic amine synthesis in Caenorhabditis elegans require the cofactor tetrahydrobiopterin (BH4). Genetics. 200, (1), 237-253 (2015).
  7. Li, Y., Paik, Y. K. A potential role for fatty acid biosynthesis genes during molting and cuticle formation in Caenorhabditis elegans. BMB Reports. 44, (4), 285-290 (2011).
  8. Meli, V. S., Osuna, B., Ruvkun, G., Frand, A. R. MLT-10 Defines a Family of DUF644 and Proline-rich Repeat Proteins Involved in the Molting Cycle of Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 21, (10), 1648-1661 (2010).
  9. Fritz, J. A., Behm, C. A. CUTI-1: A novel tetraspan protein involved in C. elegans CUTicle formation and epithelial integrity. PloS One. 4, (4), 5117 (2009).
  10. Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218, (4572), 578-580 (1982).
  11. Jeong, P. Y., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433, (7025), 541-545 (2005).
  12. Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454, (7208), 1115-1118 (2008).
  13. Kaplan, F., et al. Ascaroside Expression in Caenorhabditis elegans Is Strongly Dependent on Diet and Developmental Stage. PLoS One. 6, (3), 17804 (2011).
  14. Golden, J., Riddle, D. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218, (4572), 578-580 (1982).
  15. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19, (1), 562 (2018).
  16. Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. A Variant in the Neuropeptide Receptor npr-1 is a Major Determinant of Caenorhabditis elegans Growth and Physiology. PLoS Genetics. 10, (2), 1004156 (2014).
  17. Rosenblatt, M. A central limit theorem and a strong mixing condition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 42, (1), 43-47 (1956).
  18. Boyd, W. A., Smith, M. V., Freedman, J. H. Caenorhabditis elegans as a model in developmental toxicology. Methods in Molecular Biology. 889, 15-24 (2012).
  19. Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6, (7), 1923-1933 (2016).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Available from: http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html (2020).
  21. Denver, D. R., Morris, K., Streelman, J. T., Kim, S. K., Lynch, M., Thomas, W. K. The transcriptional consequences of mutation and natural selection in Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37, (5), 544-548 (2005).
  22. Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8, (1), 1-7 (2003).
  23. Kevin, S., Pulak, R. Techniques for Analysis, Sorting, and Dispensing of C. elegans on the COPAS Flow-Sorting System. C. elegans. Methods in Molecular Biology. Strange, K. 351, Humana Press. 275-286 (2006).
  24. Lee, D., et al. Selection and gene flow shape niche-associated variation in pheromone response. Nature Ecology & Evolution. 3, (10), 1455-1463 (2019).
  25. Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2016).
  26. Nika, L., Gibson, T., Konkus, R., Karp, X. Fluorescent Beads Are a Versatile Tool for Staging Caenorhabditis elegans in Different Life Histories. Genes, Genomes, Genetics. 6, (7), 1923-1933 (2016).
Kultur og assay af storstilet blandet stadie <em>Caenorhabditis elegans Populationer</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shaver, A. O., Gouveia, G. J., Kirby, P. S., Andersen, E. C., Edison, A. S. Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations. J. Vis. Exp. (171), e61453, doi:10.3791/61453 (2021).More

Shaver, A. O., Gouveia, G. J., Kirby, P. S., Andersen, E. C., Edison, A. S. Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations. J. Vis. Exp. (171), e61453, doi:10.3791/61453 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter