Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

رسم خرائط دقيقة للدماغ لأداء المتكررة في التصوير فيفو من ديناميات العصبية المناعية في الفئران

Published: August 7, 2020 doi: 10.3791/61454
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia, 2Department of Neuroscience, University of Virginia

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية زرع نافذة القحفية المزمنة التي يمكن استخدامها للتصوير الطولي للهياكل العصبية-الدبقية-الأوعية الدموية، والتفاعلات، والوظيفة في كل من الظروف الصحية والمُرَضَّة. وهو بمثابة بديل تكميلي لنهج التصوير عبر الكريات الذي، رغم أنه يفضل في كثير من الأحيان، فإنه يمتلك بعض القيود الحرجة.

Abstract

وينظم الجهاز العصبي المركزي (CNS) من قبل تفاعل معقد من الخلايا العصبية، دغلي، stromal، والخلايا الوعائية التي تسهل وظيفتها السليمة. على الرغم من أن دراسة هذه الخلايا في عزلة في المختبر أو معا السابقين فيفو يوفر معلومات فسيولوجية مفيدة; سوف نفتقد السمات البارزة من علم وظائف الأعضاء العصبية الخلية في مثل هذه السياقات. لذلك، هناك حاجة لدراسة الخلايا العصبية في وطنهم في بيئة الجسم الحي. البروتوكول مفصلة هنا يصف المتكررة في الجسم الحي صورتين الفوتون من الخلايا العصبية في قشرة القوارض كأداة لتصور ودراسة خلايا محددة على مدى فترات طويلة من الزمن من ساعات إلى أشهر. نحن وصف بالتفصيل استخدام الأوعية الدموية الدماغ مستقرة بشكل صارخ كخريطة الخشنة أو التشعب المسمى الفلورسنت كخريطة دقيقة من مناطق الدماغ المختارة ذات الاهتمام. باستخدام هذه الخرائط كمفتاح مرئي، نُظهر كيف يمكن نقل الخلايا العصبية بدقة للتكرار اللاحقة في التصوير الجسمي. باستخدام أمثلة من التصوير في الجسم الحي من microglia المسمى الفلورسنتلي، والخلايا العصبية، وNG2+ الخلايا، وهذا البروتوكول يدل على قدرة هذه التقنية للسماح التصور المتكرر للديناميات الخلوية في نفس موقع الدماغ على مدى فترات زمنية طويلة، التي يمكن أن تساعد على مزيد من المساعدة في فهم الردود الهيكلية والوظيفية لهذه الخلايا في علم وظائف الأعضاء العادي أو بعد الشتائم المرضية. وعند الضرورة، يمكن أن يقترن هذا النهج بالتصوير الوظيفي للخلايا العصبية، على سبيل المثال، مع تصوير الكالسيوم. هذا النهج هو تقنية قوية خاصة لتصور التفاعل المادي بين أنواع الخلايا المختلفة من الجهاز العصبي المركزي في الجسم الحي عندما نماذج الماوس الجينية أو الأصباغ محددة مع علامات الفلورسنت مميزة لتسمية الخلايا ذات الاهتمام متوفرة.

Introduction

ويحكم الجهاز العصبي المركزي (CNS) من قبل تفاعل معقد من التفاعلات بين أنواع الخلايا المقيمة المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية، جاليا والخلايا المرتبطة بالأوعية. تقليديا، درست الخلايا العصبية في معزولة، شارك في استزراع1،,2،,3،,4،,5 (في المختبر) أو أنسجة الدماغ المخ المخ (السابق vivo)6،7،,8،,9،,10 سياقات., ومع ذلك، هناك حاجة إلى فهم مزيد من سلوك الخلية العصبية والتفاعلات في البيئة الأصلية للدماغ سليمة في الجسم الحي. في هذا البروتوكول، نحن وصف طريقة لرسم خريطة في المناطق vivo من الفائدة وإعادة بالضبط صورة تلك المناطق في المستقبل جلسات التصوير لتتبع التفاعلات المعقدة بين مختلف أنواع الخلايا CNS على مدى فترات طويلة من الزمن.

وقد وفرت تطوير في الأساليب التصوير في الجسم الحي مكاسب كبيرة للفهم السليم من وظيفة العصبية11،12،13،14،15. وتوفر هذه الأساليب على وجه التحديد مزايا عديدة على النهج التقليدية في المختبر وفي المختبر. أولاً، في أنظمة التصوير الحي لديها الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ومكونات الأنسجة مثل الأوعية الدموية مع ذخيرة كاملة من التفاعلات الخلوية لتوفير فهم كامل للفسيولوجيا الشبكة العصبية. ثانيا، تشير النتائج الأخيرة إلى أنه عند إزالتها من بيئتها الأصلية، تفقد بعض الخلايا العصبية (مثل ميكروجليا) ميزات هامة من هويتها، وبالتالي علم وظائف الأعضاء16،17 والتي يمكن الحفاظ عليها في وضع في الجسم الحي. ثالثاً، توفر أنظمة التصوير الحي الفرصة لإجراء تحقيقات طولية مستقرة من أسابيع إلى أشهر لدراسة التفاعلات الخلوية التي يقوم بها الجهاز العصبي المركزي. وأخيرا، ونظرا للأدلة المتزايدة للمساهمات من الجهاز المناعي الطرفي18،,19 والميكروبيوم20،21 في علم وظائف الأعضاء في الجهاز العصبي المركزي، في نظم الجسم الحي توفير منصة لاستجواب هذه المساهمات والآثار على خلايا الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، فإن النهج التي تستخدم الطولية في التصوير الجسمي لدراسة فسيولوجيا المناعة العصبية والتفاعلات في الدول الصحية والمصابة والمرضى هي إضافة تكميلية كبيرة إلى النهج التقليدية.

في هذا البروتوكول، ونحن وصف نهج موثوق به لصورة أنواع الخلايا المختلفة في الدماغ بما في ذلك microglia، والخلايا العصبية والخلاياNG2 + كأمثلة. وقد تم تطوير نهجين لتصور الخلايا العصبية في الجسم الحي: نهج الجمجمة رقيقة والجمجمة المفتوحة مع نهج نافذة الجمجمة. على الرغم من أن الأساليب رقيقة الجمجمة هي قيد الاستخدام ويفضل لأنها التغلب على بعض مساوئ نهج الجمجمة المفتوحة مثل تنشيط الخلايا الدبقية, أعلى من الفسيولوجية ديناميات العمود الفقري واستخدام العوامل المضادة للالتهابات22,23,24,25, كما تظهر ضعف الجمجمة النهج بعض العيوب الحرجة. أولاً، الإجراء ترقق هو إجراء دقيق جداً أن العديد من الباحثين يجدون صعوبة في الكمال خاصة عندما إعادة ترقق ضروري. هذا هو الحال لأنه غالبا ما يكون من الصعب على المجربين التأكد من أن لديهم رقيقة الجمجمة إلى عمق 20 μm~ . ثانياً، بالنسبة للمقارنات الكافية بين الفئران، فإن الترقق يجب أن يكون متطابقًا ويمكن لمجموعة متنوعة من النجاح في الترقق بين جلسات التصوير أو الفئران أن تعقد التصور للهياكل العصبية. ثالثاً، عندما تستخدم في التصوير الطولي، لا يمكن استخدام الحيوانات ذات الجماجم الرقيقة إلا لعدد محدود من الجلسات عند استخدام إعادة ترقق الجمجمة. جيئة وذهابا ، لأن بعض الأنسجة العظمية لا تزال قائمة ، يمكن أن يكون للخطر وضوح في عمق التصوير من نهج الجمجمة رقيقة مما يسمح لتصور كبير من أكثر سطحية ولكن ليس بقدر مع مناطق أعمق. في ضوء هذا، هياكل الدماغ أعمق مثل قرن آمون، لا يمكن أن تكون صورة بنجاح مع نهج الجمجمة رقيقة. وتثير هذه الاعتبارات الحاجة إلى نهج بديلة ومتكاملة يمكن أن تتغلب على هذه الشواغل.

بديل لنهج الجمجمة رقيقة، نهج زرع نافذة الجمجمة المفتوحة يستخدم إجراء الذي يتم استبدال الجمجمة مع غطاء زجاجي واضح بصريا. وهذا يسمح لعدد غير محدود تقريبا من جلسات التصوير. وعلاوة على ذلك ، نظرا لاستبدال الجمجمة مع غطاء الزجاج ، وهذا الأسلوب يسمح لنافذة عرض واضحة من خلايا الدماغ الموسومة الفلورسنت لفترات طويلة من المرات من ساعات إلى أشهر ، وبالتالي ، يمكن استخدامها لدراسة نشاط الخلية والتفاعلات التي هي ذات الصلة لعلم وظائف الأعضاء والشيخوخة وعلم الأمراض.

عموما، نحن تفاصيل الخطوات التي يمكن اتباعها للقيام زرع النوافذ القحفية المزمنة من خلال استئصال القحف ستيريو التي تمكن في التصوير الجسم الحي للمناطق الدماغ من الفائدة. كما نصف كيف يمكن استخدام الأوعية الدموية المستقرة بشكل صارخ أو التشعبات الفلورية المسماة لتوليد خريطة خشنة أو دقيقة ، على التوالي من مناطق الدماغ ذات الاهتمام. ويمكن بعد ذلك استخدام هذا الأسلوب للتصوير المتكرر على مدى عدة جلسات. وتكمن أهمية هذه التقنية في قدرتها على تصوير التغيرات الطويلة الأجل أو الركود في عناصر الدماغ بما في ذلك الترتيب، والمورفولوجيا، والتفاعلات بين الأنواع الخلوية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الخطوات تتفق مع المبادئ التوجيهية التي وضعتها ووافقت عليها لجنة الرعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة فرجينيا.

1. إعداد الماوس لزرع نافذة الجمجمة

ملاحظة: خطوط الماوس المعدلة وراثيا مختلفة مع علامات الفلورسنت هي مناسبة للتصوير.

  1. استخدام CX3CR1GFP / + الفئران26 لتصور microglia في الجسم الحي. عادة، يتم استخدام الأحداث إلى الشباب البالغين 4 إلى 10 أسابيع الفئران التي تزن 17-25 غرام.
    ملاحظة: على الرغم من أن هذا النهج هو حتى مناسبة للفئران قبل الفقمة، والحاجة إلى إعادة الفئران إلى قفصهم مع أمهاتهم للتغذية، قد تعقيد الانتعاش إذا كانت الأم لا تأخذ الرعاية الكافية من الجراء بعد الجراحة. لذلك ، يوصى باستخدام الفئران بعد الفصيص.
  2. تخدير الماوس باستخدام ايزوفلوران (تدفق 5٪ في الأكسجين لالتحريض لمدة 1 دقيقة) في غرفة مخدر. تحقق من أن الماوس لا يظهر أي حركة أو الارتعاش الردود على إصبع قدم و / أو الذيل. أخرج الفأر من الغرفة وفي الهواء الطلق يحلق الشعر على الرأس بين الأذنين من مستوى العين إلى أعلى منطقة الرقبة باستخدام أداة تشذيب الشعر.
    ملاحظة: تركيز isoflurane المستخدمة تعتمد على حجم الغرفة التعريفية. لذلك، بالنسبة للغرف الأصغر، يمكن استخدام 3-4٪ isoflurane للحث على التخدير بشكل فعال في حين أن الغرف الأكبر تتطلب ما يصل إلى 5٪.
  3. حرك الماوس إلى مخروط الأنف في محطة الجراحة المجسمة للتخدير (1.5-2٪ للصيانة للجراحة) ، وتثبيت رأسه باستخدام قضبان الأذن ، والحفاظ على الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم دافئة.
  4. تليين كلتا العينين مع مرهم العين. حقن 100 ميكرولتر من 0.25٪ بوبيفيكاين (لتوفير مسكن محلي للماوس الذي سيستمر 8-12 ساعة) و 100 ميكرولتر من 4 ملغ/مل dexamethasone (للحد من الالتهاب الذي قد ينتج عن إجراء الجراحة) تحت الجلد في موقع الشق. السماح للماوس للجلوس لمدة 5 دقائق على الأقل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  5. تنظيف الرأس حليق مع ثلاث مسحات بالتناوب من بيتادين و 70٪ الكحول. إجراء شق في فروة الرأس في منتصف الخط باستخدام شفرة جراحية أو مقص يمتد من الجزء الخلفي من منطقة الجمجمة بين الأذنين إلى المنطقة الأمامية بين العينين. يتم قطع الجلد المتبقية لفضح الجمجمة.
  6. تنظيف النسيج الضام الموجود بين فروة الرأس والجمجمة الكامنة مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪ (H2O2) وتوطين منطقة الدماغ لتكون صورة مع إحداثيات مجسمة.
    ملاحظة: غالباً ما يكون هناك بعض النزيف (الخطوة 1.5) من شق على سطح الجمجمة. هذا النزيف عادة ما يحل في حد ذاته في غضون 3-5 دقيقة. تنظيف مع بيروكسيد يساعد. كما لوحظ أن علاج البوبيفاكين المسبق (الخطوة 1.4) يحد من كمية النزيف خلال هذا الوقت.

2. ماوس جراحة زرع نافذة القحفية

  1. حفر فتحة دائرية ~ 4 ملم في الجمجمة باستخدام بت حفر الأسنان (0.7 مم طرف قطر) وإزالة بعناية هذا الجزء من الجمجمة باستخدام ملقط مدببة. لتصوير القشرة السوماتوسينتورية للفئران التي يبلغ عمرها 6-8 أسابيع، حدد مركز استئصال القحف في -2.5 الخلفي و± 2.0 الجانبي إلى البرغما. أثناء الحفر، ترطيب الجمجمة بانتظام مع مسحات معقم المالحة والقطن لتبريد الدماغ، وتنظيف قبالة حطام العظام وتنعيم عظم الجمجمة لإزالة في نهاية المطاف.
    ملاحظة: تختلف إحداثيات استئصال القحف حسب المنطقة ذات الاهتمام وعمر الفئران.
  2. بعد إزالة الجمجمة، ضع بعناية غطاء صغير (حجم #0 في 0.1 ± 0.02 مم سماكة) مبللة مع المالحة في استئصال القحف. جففي الملح الزائد باستخدام مسح معقمة.
  3. باستخدام قضيب مدبب (مثل طرف ماصة أو الطرف المدبب لعصا مسحة قطنية خشبية مكسورة)، قم بتطبيق الغراء cyanoacrylate حول النافذة والسماح لها بالتعلق بالدماغ والجمجمة. تطبيق الغراء التمهيدي لبقية الجمجمة وعلاجه مع ضوء علاج ل20-40 S. إعداد بئر حول النافذة مع الغراء النهائي وعلاج مع ضوء علاج ل20-40 s.
  4. الغراء لوحة رأس صغيرة على الجمجمة على نصف الكرة الأرضية contralateral من استئصال القحف أولا مع الغراء التمهيدي كما التمهيدي ثم مع الغراء النهائي. علاج كل من ضوء علاج لمدة 20-40 ق لكل منهما.
    ملاحظة: لا توجد حاجة الغرز إذا كانت الجمجمة مغطاة تماما مع الغراء أثناء هذا الإجراء.

3- الرعاية بعد الجراحة

  1. السماح للماوس للاستيقاظ في غياب التخدير (الانتعاش القيام به على وسادة التدفئة يقصر وقت الانتعاش) وإعادته إلى قفص منزله مرة واحدة مستيقظا تماما. حقن جرعة واحدة تحت الجلد من البوبرينورفين ريال (0.5 ملغم / كغ) كما مسكن ما بعد العملية الجراحية التي تكفي ل 72 ساعة.
  2. لتسهيل الشفاء الصحي من الجراحة ، وتوفير الماوس طعامًا ناعمًا إضافيًا ، والذي يمكن أن يكون في شكل طعام صلب منتظم في الماء لتخفيف الطعام أو الطعام في شكل هلام.
    ملاحظة: تكفي عملية توفير الطعام الطري لمرة واحدة بعد الجراحة مباشرة.
  3. مراقبة الماوس يوميا للصحة والتعافي السليم لأول 72 ساعة من إجراء الجراحة. بعد ذلك، قم بإجراء التصوير من أسبوعين من جراحة زرع النافذة.
    ملاحظة: إذا تم ذلك بشكل جيد، الفئران استرداد جيدا تظهر السلوكيات الإسعافية العادية، واستكشاف قفص كافية، الترطيب جيدة، وزيادة الوزن مستقرة والتفاعلات واسعة النطاق مع الفئران الأخرى في القفص وغيرها من البنود في القفص. الفئران التي تظهر الخمول والجفاف وأكبر من 10٪ فقدان الوزن بعد الجراحة يتم القتل الرحيم وإزالتها من الدراسة.

4. رسم خرائط الدماغ 2-فوتون للتصوير الأولي

  1. تخدير الماوس (Isoflurane ، 5 ٪ الحث و 1.5 ٪ صيانة). قم بتثبيت الرأس باستخدام مسامير لتركيب اللوح الرأسي على مرحلة المجهر ذات الفوتونتين، ويتم الحفاظ على لوحة التدفئة عند 35 درجة مئوية. حقن داخل الصفاق 100 ميكرولتر من صبغة الأوعية الدموية مثل رودامين B (2 ملغ / مل).
    ملاحظة: يمكن أيضًا إجراء التصوير في الفئران المستيقظة دون تخدير. ومع ذلك ، تشير الدراسات الحديثة إلى أن التخدير يؤثر على ديناميات المراقبة المجهرية27،28،29 ، وأن تثبيت الرأس لاثنين من التصوير الفوتوني في الفئران المستيقظة يزيد من الإجهاد حتى أثناء التصوير المزمن لمدة 25 يومًا على الأقل (انظر Juczewski et al.، 2020)30.
  2. تنظيف سطح النافذة القحفية برفق باستخدام مسحة القطن في 70٪ الإيثانول. ضع بضع قطرات من الماء أو ملحي على نافذة الجمجمة وخفض العدسة الهدف في الحل منذ الهدف هو عدسة الغمر.
  3. رسم اليد خريطة خشنة للدلالة على المعالم الرئيسية لالأوعية الدموية في دفتر مختبر في حين تبحث من خلال العدسة عن طريق الولائي. استخدم هذا الرسم لتعريف مناطق معينة أثناء تصوير فوتون اثنين. وبدلاً من ذلك، يمكنك التقاط صور للأوعية الدموية إما من خلال كاميرا مزودة بالمجهر أو من خلال كاميرا محمولة باليد أو هاتف.
    ملاحظة: هذه الصور المرسومة باليد هي لتسهيل إعادة النظر في المناطق واسعة نفسها تحت المجهر قبل التصوير الفوتون اثنين. هذه ليست دقيقة رسم خرائط الصورة.
  4. تحت تصوير فوتونين، اجمع صور الخلايا الفلورية والأوعية حسب الحاجة. خذ ملاحظات دقيقة مع الإحداثيات المناسبة لضمان إمكانية إعادة النظر في المناطق الدقيقة للتصوير اللاحق. جمع عدة مجالات الرؤية في هذه الدورة التصوير الأولي على سبيل المثال الحصول على صور z-المكدس كل 1-2 μm من خلال حجم من الأنسجة.
    ملاحظة: أثناء جمع الصور بواسطة فوتون اثنين، يتم استخدام معالم الأوعية الدموية لرسم الخرائط الخشنة. إذا كان هناك حاجة إلى رسم الخرائط الدقيقة، يتم استخدام تشعبات تحمل علامة YFP من31 ماوس Thy1-YFP.
    1. استخدام هذه المعلمات الموصى بها للتصوير: الطول الموجي من 880-900 نانومتر هو الأمثل; لGFP و / أو dsRed / Rhodamine الإثارة، وتستخدم مرآة 565 نانومتر dichroic مع 525/50 نانومتر (قناة خضراء) و 620/60 نانومتر (قناة حمراء) مرشحات الانبعاثات؛ وبالنسبة لفصل GFP وYFP، تستخدم مرآة 509 نانومتر dichroic مع مرشحات انبعاث 500/15 و537/26 نانومتر؛ يتم الحفاظ على السلطة في الدماغ في 25 ميغاواط أو أقل; دقة الصورة هي 1024 × 1024 بكسل ، مجال الرؤية التي اتخذت مع 25X 0.9 NA الهدف في عامل التكبير 1.5X هو 295.24 × 295.24 ميكرومتر.
  5. في نهاية التصوير، اخلع الفأر عن المسرح، واسمح له باستيقاظ من التخدير والعودة إلى قفصه المنزلي حتى جلسة تصوير مستقبلية.

5. صورتين فوتون وإعادة تصوير

  1. لجلسات التصوير اللاحقة في المستقبل، والتي يمكن أن تكون في أي مكان من بضع ساعات إلى أشهر بعد جلسة التصوير الأولية، تخدير الماوس (Isoflurane، 5٪ تحريض و 1.5٪ الصيانة)، جبل على المجهر 2 فوتون، والحفاظ على لوحة التدفئة وإعادة حقن 100 ميكرولتر صبغة الأوعية الدموية مثل رودامين B (2 ملغ / مل).
  2. افتح الصور التي تم الحصول عليها سابقًا في ImageJ، وباستخدام هذه الصور بالإضافة إلى الملاحظات من الجلسة السابقة، حدد المساحات التي تم تصويرها مسبقًا وقم بإعادة تصويرها بعناية.
  3. كرر هذا طالما أن نافذة التصوير واضحة أو ضرورية لمدى الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتصور ديناميات microglial في الجسم الحي، مزدوجة محورة وراثيا CX3CR1GFP/+:Thy1YFP الفئران استخدمت. يتم استخدام خط Thy1-YFP H بدلاً من خط Thy1-GFP M لتجنب تداخل الفلوريسليس من ميكروجليا (GFP) والخلايا العصبية (YFP). يمكن أن تستخدم النهج البديلة خط مراسل الذي microglia وصفت مع على سبيل المثال، tdTomato ومن ثم يمكن استخدام خط Thy1-GFP M. عيب من خط H هو أن YFP التسميات الكثير من الخلايا العصبية والتسمية يزيد مع زيادة العمر (الملاحظة الشخصية). خط M معارض وضع العلامات متفرقة من الخلايا العصبية. بين 2 - 4 أسابيع من جراحة زرع النافذة، يمكن أن يتبع ديناميات microglial التصوير المتكرر. وتستخدم الأوعية الدموية الكبيرة لتوطين مناطق محددة ومن ثم يتم استخدام dendrites المسمى YFP لرسم خرائط دقيقة من مناطق الدماغ. مع هذا النهج، dendrites محددة يمكن استخدامها كمعلمات مستقرة لرسم خرائط دقيقة من مناطق الدماغ (الشكل 1، الأسهم في الشكل 1b). بينما dendrites مستقرة، بعض microglia التحرك يوميا (الشكل 1c).

وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النهج يكفي للتصوير الطولي الأسبوعي على المدى الطويل. وهكذا، تم استخدام فئران CX3CR1GFP/+ أحادية المعدلة وراثياً لمتابعة ميكروجليا مقرونة بحقن داخل الصفاق من رودامين ب لتسمية الأوعية الدموية خلال كل جلسة تصوير لمدة تصل إلى 8 أسابيع(الشكل 2). بدلا من ذلك ، كما نوقش أعلاه ، يمكن استخدام Thy1 الفئران لرسم الخرائط الدقيقة الطولية. عندما يتم تنفيذ التصوير الأسبوعي ، لوحظ أن الأوعية الدموية ثابتة بشكل ثابت ، ولكن يمكن رؤية microglia لتكون ديناميكية كما هو موضح في ثلاث مناطق محددة من الاهتمام (ROI ، الدوائر المتقطعة) في الشكل 2. في أعلى العائد على الاستثمار ، microglia تبدأ في دخول العائد على الاستثمار منقبل الأسبوع 4 من التصوير وتستمر من خلال الأسبوع8 من التصوير. في العائد على الاستثمار الأوسط مع وعاء ثنائي الفور، تظهر خلية ميكروجليال حول الوعاء السفلي في الأسبوعالثالث، وتضيع في الأسبوعالسادس وmicroglia أخرى تظهر على الأوعية الدموية العلوية في الأسبوعالسابع ويتم الحفاظ عليها فيالأسبوع الثامن. وأخيرا ، في العائد على الاستثمار في أسفل ، وmicroglial الخلية في الحفاظ عليها من خلال الأسبوع 6وخسر في 7و 8th أسابيع من التصوير. وتشير هذه النتائج إلى التغيرات الديناميكية في الشبكة الموضعية microglial على مدى أسابيع إلى أشهر.

ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة للتحقيق في ديناميات الخلوية بعد الإصابة الحادة أو خلال تطور المرض المرضي. تم استخدام فئران CX3CR1GFP/+ أحادية المعدلة وراثياً لمتابعة ميكروجليا مقرونة بحقن داخل الصفاق من رودامين ب لتسمية الأوعية الدموية قبل (البيانات غير المعروضة) وبعد النوبات الشديدة الناجمة عن حمض كاينيك(الشكل 3). بعد النوبات، يتم الحفاظ على هيكل السرير الوعائي دون اضطرابات افظية (الشكل 3a). ومع ذلك ، فإن الشبكة الخلوية microglial والمناظر الطبيعية الموضعية تتغير بشكل عابر (بعض الخلايا "المكتسبة" والبعض الآخر "فقدت" في مجال الرؤية) مع تغييرات أكبر في غضون 24-48 ساعة من المضبوطات التي يتم استعادتها إلى وضعها الطبيعي من قبل 72 ح(الشكل 3b)كما سبق أنأبلغنا 32.

وأخيراً، يمكن استخدام هذا النهج أيضًا لدراسة تفاعلات الخلايا أو مقارنة الديناميكيات بين أنواع الخلايا العصبية. مزدوجة المعدلة وراثيا CX3CR1GFP /+: NG2dsRed / + الفئران استخدمت لتتبع microglia وNG2+ الخلايا في الجسم الحي. دون وضع علامة على الأوعية الدموية، يمكن تحديد الخلايا microglia وNG2 (الشكل 4a). NG2 هو بروتيوغليكان أن تسميات كل من pericytes المرتبطة بالسفن وخلايا السلائف oligodendrocyte (OPCs)33,34. عادة ما يكون لدى Pericytes عمليات ممدوده تتبع على طول جدار الأوعية الدموية (تم تحديدها بشكل افتراضي مع رؤوس الأسهم في الشكل 4a)وعادة ما تظهر OPCs أجسام الخلايا الأكبر التي توجد في الدماغ parenchyma بعيدًا عن الأوعية الدموية (تم تحديدها افتراضيًا مع الأسهم في الشكل 4a). للتمييز بشكل كاف بين البيريكس و OPCs، وصفت الأوعية الدموية مع رودامين B. يمكن تمييز الفلوروس الأكثر إشراقًا من NG2+- الخلايا المرتبطة بالسفن (pericytes ، رؤوس الأسهم) عن الفلوروس الخافق من Rhodamine اللامع على الرغم من الإثارة المماثلة من قبل اثنين من التصوير الفوتون(الشكل 4b , c). يظهر التصوير اليومي أن يتم وضع pericytes بشكل ثابت ، في حين أن OPCs (العلامات النجمية في الشكل 4b)و microglia (الدوائر في الشكل 4b)هي ديناميكية تتفق مع التقارير السابقة32،35،36.

Figure 1
الشكل 1: التصوير اليومي للميكروجليا باستخدام رسم خرائط دقيقة مع dendrites الخلايا العصبية في مزدوجة المعدلة وراثيا CX3CR1GFP /+: Thy1YFP الفئران. (أ)ممثل صورة اثنين من الفوتون من microglia (الأخضر) وdendrites (الأحمر) من مزدوجة المعدلة وراثيا CX3CR1GFP / +: Thy1YFP الماوس. (ب ج) ، صور يومية للمنطقة محاصر في (أ) تظهر بشكل متكرر dendrites imagedrites (السهام في ب) وdendrites مع microglia (ج). في حين أن الهياكل المتجرّدة كانت مستقرة وضعياً، لوحظ أن بعض الهياكل الصغيرة المتحولة من موقعها الأصلي في الأيام اللاحقة. وتم تحديد هذه الخلايا برقم (1 أو 2 أو 3). في اليوم السابق، لوحظ موقفهم مع النجمة البيضاء وفي يوم لاحق، لوحظ موقفهم مع النجمة الصفراء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التصوير الأسبوعي طويل الأجل من microglia في CX3CR1GFP / + الفئران لعدة أشهر. (a-h)، ممثل صور الفوتون من microglia (الأخضر) من الماوس CX3CR1GFP/+ أثناء التصوير المتكرر باستخدام تسمية حادة vasculature (الأحمر، رودامين، 2 ملغ/ مل، i.p.) كمعلم الخشن لتتبع شبكة microglial لمدة تصل إلى 8 أسابيع. كان الأوعية الدموية مستقرة هيكليا خلال فترة التصوير. تم تسليط الضوء على ثلاث مناطق صغيرة ذات الأوعية الدموية (الدوائر المتقطعة) للإشارة إلى حركة سوماتا microglial إلى (أعلى دائرتين متقطعتين) أو خارج (الدائرة السفلية) تلك المناطق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التصوير اليومي طويل الأجل للميكروجليا في فئران CX3CR1GFP/+ بعد النوبات. (a-b, تمثيل صور فوتونية أثناء التصوير اليومي لنفس مجال الرؤية لمنطقة معينة من الدماغ مع microglia (الأخضر) والصف الحاد للأوعية الدموية (الأحمر، Rhodamine، 2 ملغ/ مل، i.p.). التصوير يبدأ بعد تحريض المضبوطات الشديدة باستخدام عامل كيميائي، حمض كاينيك. تم الحفاظ على بنية الأوعية الدموية حيث يمكن تحديد أجزاء الأوعية الدموية الفردية (الأسهم) عبر الزمن (a). ومع ذلك، زادت ديناميات الشبكة الصغيرة خلال اليومين الأولين بعد المضبوطات والعودة إلى المستويات العادية بحلول اليوم الثالث (ب). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التصوير اليومي للميكرليا و NG2+ الخلايا في CX3CR1GFP /+: NG2dsRed / + الفئران. (أ) صورة تمثيلية ذات فوتون من ميكروجليا (الأخضر) و NG2+ الخلايا (الحمراء) في الجسم الحي. فشل الأوعية الدموية غير المُميَّزة في التمييز بين خلايا NG2 (العفاريت، التي تم تحديدها بشكل افتراضي مع رؤوس الأسهم) وخلايا NG2 غير المرتبطة بالأوعية الدموية (خلايا السلائف oligodendrocyte أو OPCs، التي تم تحديدها بشكل افتراضي بالسهام). (ب)ممثل صور فوتونية من microglia (الأخضر) و NG2+ الخلايا (الحمراء) في أيام متتالية من التصوير مع الأوعية الدموية المسمى مع رودامين. Pericytes (رؤوس الأسهم) ثابتة في حين أن OPCs ديناميكية (النجمية البيضاء إلى الصفراء). Microglia هي أيضا ديناميكية (الدوائر: الدوائر متقطعة تمثل موقفا دون microglia وملء دائرة يمثل موقفا مع microglia المقابلة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد فتحت ظهور التصوير في الجسم الحي 2 فوتون الفرص لاستكشاف عدد كبير من التفاعلات الخلوية والديناميات التي تحدث في الدماغ السليم. ركزت الدراسات الأولية على استخدام نهج استئصال القحف في الجمجمة المفتوحة إلى dendrites الخلايا العصبية صورة من قبل كل من التصوير الحاد والمزمن37,38. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه لتوضيح التفاعلات المناعة العصبية في الدماغ. يصف هذا البروتوكول طريقة للتصوير الموثوق للخلايا الموسومة بالفلورسنت (خاصة ميكروجليا، الخلية المناعية المقيمة في الدماغ) لفترات طويلة من الزمن على المدى القصير أو الطويل. استخدام صبغ المسمى الأوعية الدموية و / أو التشعبات الموسومة الفلورسنت مفصلة لرسم الخرائط الخشنة أو الدقيقة للمناطق الدماغية من الفائدة للسماح المتكررة، والتصوير الموثوق للخلايا. على الرغم من أن خط Thy1YFP مقترح للاستخدام في رسم خرائط الدماغ الدقيقة ، يمكن أن تستخدم الطرق البديلة تقنيات أخرى أو خطوط الماوس لوضع علامات على مجموعات الخلايا العصبية المختارة مثل في الإلكتروبوريشنالرحمي 39،40، الحقن المبكر AAV بعد الولادة41 أو استخدام فئران TRAP42. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن التصوير القشري كان محور هذه المناقشة، يمكن تكييف هذا النهج لتصور هياكل الدماغ العميقة على المدى الطويل وكذلك43.

لهذا البروتوكول، يمكن أن تكتمل عملية جراحية على كل فأر في 30-60 دقيقة من بدء التخدير حتى الشفاء من التخدير. خلال الجراحة، تتم إزالة الجمجمة بعناية واستبدالها بغطاء زجاجي معقمة يتم زرعها للتصوير على المدى الطويل بعد أسبوعين على الأقل. الوفيات نادرة للغاية (أقل من 5٪ من الوفيات) في الفئران wildtype، على الرغم من الفئران مع مشاكل تخثر، مثل الفئران خروج المغلوب P2Y12R، وتظهر ارتفاع معدل الوفيات وفشل الجراحة. في مثل هذه الفئران ، قد يستمر النزيف لفترات أطول من الزمن وقد تموت الفئران في غضون أول 48 ساعة من استئصال القحف المفترض بسبب مضاعفات النزيف الداخلي. لم يتم ملاحظة الفئران التي تحتوي على نوافذ مزروعة من هذا البروتوكول لإظهار أي علامات على العدوى ويمكن استخدام البروتوكول بشكل موثوق لتوليد نوافذ واضحة للتصوير طويل الأجل في 50-80٪ من الفئران.

بديل لنهج زرع النافذة المزمنة الحالية ، يوجد نهج الجمجمة الرقيقة لتصور خلايا الدماغ في الدماغ السليم مرارًا وتكرارًا. وقد أبرزت العديد من الدراسات قيمة وحتى أولوية اختيار نهج الجمجمة رقيقة على نهج زرع نافذة22,23,24,25. وينبغي عدم تجاهل الوعد من هذا النهج كما، عندما فعلت بشكل صحيح، فإنه يقاوم العديد من القيود البارزة أو عيوب النهج الحالي بما في ذلك عدم تنشيط الخلايا الدبقية، وانخفاض دوران العمود الفقري الذي هو أكثر فسيولوجية، وعدم وجود حاجة لاستخدام العوامل المضادة للالتهابات التي يمكن أن تؤثر أيضا على فسيولوجيا الدماغ. وينبغي النظر في هذه القيود الخطيرة لدى اختيار نهج لمسائل بحثية محددة قبل اختيار النهج المفصل في هذا البروتوكول.

غير أن جاذبية هذا النهج ذات أربعة أضعاف. أولاً، نهج زرع نافذة الجمجمة جذابة بسبب سهولة إتقان هذا الإجراء بالنسبة لإجراء الجمجمة رقيقة. لا يمكن دائمًا أن يتقن الترقق المناسب للجمجمة من قبل المجربين وإذا لم يتم ذلك بشكل جيد يمكن أن يؤدي إلى تنشيط glial الحد من جاذبيته. ثانياً، يعطي نهج زرع النوافذ القحفي هذا وضوحًا قويًا للعمق في هياكل الدماغ حيث يتم تصوير الدماغ من خلال نافذة واضحة بصريًا. النافذة المتاحة للتصوير هي أيضا عادة أكبر بكثير من تلك المستخدمة في نهج الجمجمة رقيقة مما يسمح بالوصول إلى حجم أكبر من الأنسجة للتحليل. ثالثاً، مثل وضوح العمق، يسمح هذا النهج بوضوح موحد من خلال النافذة لأن غطاء الزجاج رقيق وواضح بشكل موحد. وهذا يسهل المقارنات بين الدورات وبين الحيوانات. مطلوب خبرة خاصة لتقنية الجمجمة الرقيقة لضمان الوضوح حتى عبر النافذة خلال الجلسات المتكررة وبين الحيوانات. وأخيراً، يوفر هذا النهج مرونة كبيرة في وتيرة التصوير من ساعات، إلى أيام إلى أسابيع إلى شهور وحتى سنوات. بالنسبة لنهج الجمجمة الرقيقة ، تم اقتراح ما لا يزيد عن خمسة تكرارات24.

والتطبيقات المستقبلية لهذا النهج كثيرة. أولاً، يمكن أن تنطوي التطبيقات على توضيح تفاعلات عصبية-جليو-الأوعية الدموية الجديدة في الدماغ في كل من علم وظائف الأعضاء العادي وعلم الأمراض. ثانياً، على الرغم من أن الخلايا المقيمة تناقش في هذا الإجراء، يمكن استخدام هذا النهج لدراسة ديناميات وتفاعلات اختراق الخلايا المناعية كما يحدث على سبيل المثال، خلال الإصابة الحادة، وعدوى الدماغ المزمنة، و/أو الحالات العصبية طالما أن الفئران التي تجرى عليها الخلايا ذات العلامات الفلورية المتاحة. وأخيراً، تمت مناقشة هذا النهج بشكل رئيسي في سياق الدراسات الهيكلية لخلايا الدماغ. ومع ذلك، مع ظهور التصوير الوظيفي على سبيل المثال باستخدام الكالسيوم44،,45،,46 أو تقنيات التصوير الجهد47،,48،يمكن استخدام هذا النهج للتصوير الوظيفي مع مرور الوقت في الصحة والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر أعضاء مختبر إيو على مناقشة الأفكار المعروضة في هذه المخطوطة. نشكر الدكتور جاستن روستينهوفن من مختبر كيبنيس في جامعة فرجينيا على هدية فئرانNG2 DsRed 33. ويدعم هذا العمل من خلال تمويل من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية من المعهد الوطني للصحة إلى U.B.E (K22 NS104392).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass (3mm) Warner Instruments 64-0726
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) Amazon https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System Dental Health Products, Inc 910860-1
Dental Drill Osada: www.osadausa.edu EXL-M40
Drill Bit Fine Science Tools #19008-07
Eye Ointment Henry Schien 1338333
iBond Total Etch (Primer glue) Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) 66040094
Rhodamine B Millipore Sigma 81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue) Top Dent (Ivoclar Vivadent) #595956
Wahl Brav Mini+ Amazon https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
  2. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  3. Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
  4. Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
  5. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
  6. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  7. Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
  8. Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
  9. Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
  10. Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
  11. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  12. Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
  13. Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
  14. Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
  15. Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
  16. Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
  17. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  18. Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
  19. Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
  20. Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
  21. Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
  22. Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
  23. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
  24. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  25. Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  26. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  27. Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
  28. Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
  29. Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  30. Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
  31. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  32. Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
  33. Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
  34. Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
  35. Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
  36. Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
  37. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  38. Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
  39. Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
  40. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
  41. Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
  42. Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
  43. Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
  44. Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
  45. Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
  46. Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
  47. Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
  48. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 162، ميكروغليا، المناعة العصبية، التصوير، فوتون اثنين، الأوعية الدموية، التشعبات، خلايا NG2
رسم خرائط دقيقة للدماغ لأداء المتكررة في التصوير فيفو من ديناميات العصبية المناعية في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bisht, K., Sharma, K., Eyo, U. B.… More

Bisht, K., Sharma, K., Eyo, U. B. Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice. J. Vis. Exp. (162), e61454, doi:10.3791/61454 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter