Summary
Bu protokol, nöro-glio-vasküler yapıların uzunlamasına görüntülemesi, hem sağlıklı hem de hastalıklı koşullarda fonksiyon ve fonksiyon için kullanılabilecek kronik bir kafatası pencere implantasyon tekniğini açıklamaktadır. Genellikle tercih edilirken bazı kritik sınırlamalara sahip olan transkraniyal görüntüleme yaklaşımına tamamlayıcı bir alternatif olarak hizmet vermektedir.
Abstract
Merkezi sinir sistemi (CNS) nöronal karmaşık bir etkileşim tarafından düzenlenir, glial, stromal, ve vasküler hücrelerin uygun işlevini kolaylaştırmak. Her ne kadar bu hücreleri in vitro veya birlikte ex vivo izole olarak incelemek yararlı fizyolojik bilgiler sağlar; nöral hücre fizyolojisinin belirgin özellikleri bu bağlamda özlenecektir. Bu nedenle, in vivo ortamda kendi yerli nöral hücrelerin incelenmesi için bir ihtiyaç vardır. Burada ayrıntılı protokol, kemirgen korteksteki nöral hücrelerin in vivo iki foton görüntülemesini, belirli hücreleri saatler ile aylar arasında uzun süreler boyunca görselleştirmek ve incelemek için bir araç olarak tanımlar. Biz ayrıntılı olarak kaba bir harita veya floresan ilgi belirli beyin bölgelerinin ince bir harita olarak dendritler etiketli olarak brüt kararlı beyin vaskülatür kullanımını açıklar. Bu haritaları görsel bir anahtar olarak kullanarak, nöral hücrelerin in vivo görüntülemede sonraki tekrarlayan lar için nasıl tam olarak yer değiştirilebileceğini gösteriyoruz. Floresan etiketli mikroglia, nöronlar ve NG2+ hücrelerin in vivo görüntüleme örneklerini kullanarak, bu protokol bu tekniğin uzun süre boyunca aynı beyin yerinde hücresel dinamiklerin tekrarlayan görselleştirme izin yeteneğini göstermektedir, bu daha fazla normal fizyoloji veya aşağıdaki patolojik hakaret bu hücrelerin yapısal ve fonksiyonel tepkileri anlamada yardımcı olabilir. Gerektiğinde bu yaklaşım, örneğin kalsiyum görüntüleme ile nöral hücrelerin fonksiyonel görüntüleme ile birleştiğinde olabilir. Bu yaklaşım, özellikle genetik fare modelleri veya ilgi hücreleri etiketlemek için farklı floresan etiketleri ile belirli boyalar mevcut olduğunda cns in vivo farklı hücre türleri arasındaki fiziksel etkileşimi görselleştirmek için güçlü bir tekniktir.
Introduction
Merkezi sinir sistemi (CNS) nöronlar, glia ve damar ilişkili hücreler de dahil olmak üzere çeşitli yerleşik hücre türleri arasındaki etkileşimlerin karmaşık bir etkileşim tarafından yönetilir. Geleneksel olarak, nöral hücreler izole, co-kültürlü1,2,,3,4,5 (in vitro) veya excised beyin dokusu (ex vivo)6,7,8,9,10 bağlamlarda incelenmiştir., Ancak, daha fazla in vivo bozulmamış beynin yerli ortamda nöral hücre davranışı ve etkileşimleri anlamak için ihtiyaç vardır. Bu protokolde, in vivo ilgi alanlarının haritasını çıkarmak ve bu bölgeleri gelecekteki görüntüleme oturumlarında tam olarak yeniden görebilmek için çeşitli CNS hücre türleri arasındaki karmaşık etkileşimleri uzun süreler boyunca izlemek için bir yöntem açıklıyoruz.
In vivo görüntüleme yaklaşımlarının geliştirilmesi nöral fonksiyonun doğru anlaşılması için önemli kazanımlar sağlamıştır11,12,13,,14,15. Özellikle, bu yaklaşımlar geleneksel in vitro ve ex vivo yaklaşımlar üzerinde çeşitli avantajlar sağlar. İlk olarak, in vivo görüntüleme sistemleri nöral ağ fizyolojisi tam bir anlayış sağlamak için hücresel etkileşimlerin tam repertoi ile vaskülatür gibi fizyolojik olarak ilgili hücre ve doku bileşenleri var. İkinci olarak, son bulgular kendi doğal ortamdan kaldırıldığında, bazı nöral hücrelerin (mikroglia gibi) kimliklerinin önemli özelliklerini kaybetmek ve böylece fizyoloji16,17 in vivo ortamda korunabilir öneririz. Üçüncü olarak, in vivo görüntüleme sistemleri CNS hücresel etkileşimleri incelemek için haftalar ile aylar arasında istikrarlı uzunlamasına araştırmalar alametim sağlar. Son olarak, periferik bağışıklık sistemi katkıları için artan kanıt göz önüne alındığında18,19 ve mikrobiyom20,21 CNS fizyolojisi, in vivo sistemleri cns hücreleri üzerinde bu tür katkıları ve etkileri sorgulamak için bir platform sağlar. Bu nedenle, nöro-immün fizyoloji ve sağlıklı, yaralı ve hastalıklı durumlarda etkileşimleri incelemek için in vivo görüntüleme de longitudinal kullanan yaklaşımlar geleneksel yaklaşımlara büyük bir tamamlayıcı ektir.
Bu protokolde, mikroglia, nöronlar ve NG2+ hücreleri de dahil olmak üzere beyindeki farklı hücre tiplerini görüntülemek için güvenilir bir yaklaşımı örnek olarak tanımlıyoruz. In vivo nöral hücreleri görselleştirmek için iki yaklaşım geliştirilmiştir: inceltilmiş kafatası yaklaşımı ve kafatası pencere yaklaşımı ile açık kafatası. İnceltilmiş kafatası yaklaşımları kullanımda olmasına ve glial hücre aktivasyonu, daha yüksek fizyolojik omurga dinamiği ve anti-inflamatuar ajanların kullanımı22,23,,24,25, inceltilmiş kafatası yaklaşımları gibi açık kafatası yaklaşımının bazı dezavantajları aşmak çünkü tercih edilir de birkaç kritik sakıncaları göstermektedir. İlk olarak, incelme prosedürü birçok araştırmacı özellikle yeniden inceltme gerekli olduğunda mükemmel bulmak zor bir çok hassas bir işlemdir. Bu durum, deneycilerin kafatasını ~20 μm derinliğe kadar inceltmiş olduklarını tespit etmeleri genellikle zor olduğundan durum böyledir. İkinci olarak, fareler arasında yeterli karşılaştırmalar için, inceltme aynı olması gerekir ve görüntüleme oturumları veya fareler arasında inceltme başarı çeşitli nöral yapıların görselleştirilmesi karmaşık olabilir. Üçüncü olarak, uzunlamasına görüntüleme için kullanıldığında, inceltilmiş kafatasları olan hayvanlar sadece kafatasının yeniden inceltilmesi kullanıldığında sınırlı sayıda seans için kullanılabilir. İleri, bazı kemik dokusu hala kalır bu yana, görüntüleme derinliği netlik daha yüzeysel ama çok daha derin bölgeler ile büyük görselleştirme için izin inceltilmiş kafatası yaklaşımı tehlikeye olabilir. Bunun ışığında, hipokampus gibi daha derin beyin yapıları, inceltilmiş kafatası yaklaşımı ile başarılı bir şekilde görüntülenemez. Bu hususlar, bu endişelerin üstesinden gelebilecek alternatif ve tamamlayıcı yaklaşımlara duyulan ihtiyacı gündeme getirecektir.
İnceltilmiş kafatası yaklaşımına alternatif olarak, açık kafatası penceresi implantasyon yaklaşımı, kafatasının optik olarak net cam kapak kaydırışla değiştirildiği bir prosedür kullanır. Bu, neredeyse sınırsız sayıda görüntüleme oturumu na olanak sağlar. Ayrıca, cam kapak lı kafatasının değiştirilmesi göz önüne alındığında, bu yöntem floresan etiketli beyin hücrelerinin saatlerce nisbeten aylara kadar geniş süreler için net bir görüntüleme penceresi sağlar ve bu nedenle, fizyoloji, yaşlanma ve patoloji ile ilgili hücre aktivitesi ve etkileşimleri incelemek için istihdam edilebilir.
Genel olarak, ilgi beyin bölgelerinin in vivo görüntüleme sağlayan bir stereotaksik kraniyotomi ile implant kronik kranial pencereler yapmak için takip edilebilir adımları ayrıntılı. Ayrıca, brüt olarak kararlı beyin vaskülatürü veya floresan etiketli dendritlerin, ilgi çekici beyin bölgelerinin sırasıyla kaba veya güzel bir haritasını oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini de anlatıyoruz. Bu yaklaşım daha sonra birkaç oturum boyunca tekrarlanan görüntüleme için kullanılabilir. Bu tekniğin önemi, bu nedenle, düzenleme, morfoloji ve farklı hücresel türlerin etkileşimleri de dahil olmak üzere beyin elemanlarında uzun vadeli değişiklikler veya durağan görüntü yeteneği yatıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm adımlar, Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen ve onaylanan yönergelere uygundur.
1. Kafatası penceresi implantasyonu için fare hazırlığı
NOT: Floresan etiketleri ile çeşitli transgenik fare hatları görüntüleme için uygundur.
- Vivo in microglia görselleştirmek için CX3CR1GFP / + fareler26 kullanın. Tipik olarak, genç erişkin 4-10 haftalık 17-25 g ağırlığında fareler kullanılır.
NOT: Bu yaklaşım önceden sütten kesilmiş fareler için bile uygun olsa da, farelerin beslenmesi için anneleriyle birlikte kafeslerine geri dönme ihtiyacı, annenin ameliyat sonrası yavrulara yeterli özen göstermezse iyileşmeyi zorlaştırabilir. Bu nedenle, farelerin su dışı atan sonrası kullanılması önerilir. - Anestezik bir odada izofluran (1 dk indüksiyon için oksijen% 5 akışı) kullanarak fare anestezik. Farenin toe ve/veya kuyruk çimdiklerine herhangi bir hareket veya seğirme yanıtı gösterip göstermediğini kontrol edin. Fareyi odadan çıkarıp açık havada bir saç düzeltici kullanarak göz seviyesinden boyun bölgesinin üst kısmına kadar kulakların arasındaki baş daki saçı iyice tıraş edin.
NOT: Kullanılan isofluran konsantrasyonu indüksiyon odasının büyüklüğüne bağlıdır. Bu nedenle, küçük odalar için, 3-4% izofluran etkili anestezi neden kullanılabilir iken büyük odaları% 5'e kadar gerektirecektir. - Anestezi için stereotaktik cerrahi istasyonu burun koni fare taşıyın (1.5-2% ameliyat için bakım için), kulak çubukları kullanarak başını stabilize, ve vücut ısısını sıcak tutmak için bir ısıtma yastığı üzerinde fare korumak.
- Her iki gözü de göz merhemiyle yağlatın. İnsizyon yerinde 100 μL %0,25 bupivicaine (fareye 8-12 saat sürecek lokal analjezi sağlamak için) ve 100 μL 4 mg/mL deksametazon (ameliyat işleminden kaynaklanabilecek iltihabı azaltmak için) enjekte edin. Farenin bir sonraki adıma geçmeden önce en az 5 dakika boyunca oturmasını bekleyin.
- Üç alternatif betadin ve %70 alkol ile tıraşlı başı temizleyin. Kulaklar arasındaki kafatası bölgesinin arkasından gözler arasındaki frontal bölgeye kadar uzanan cerrahi bıçak veya makas kullanarak bir orta hat kafa derisi kesi yapın. Kalan deri kafatasını ortaya çıkarmak için kesilir.
- Kafa derisi ve altta yatan kafatası arasında bulunan bağ dokusunu %3 hidrojen peroksit (H2O2)ile temizleyin ve stereotaktik koordinatlarla görüntülenecek beyin bölgesini yerelleştirin.
NOT: Kafatası yüzeyindeki kesiden genellikle bazı kanamalar (adım 1.5) çıkar. Bu kanama genellikle 3-5 dk. peroksit ile temizlenmesi ne kadar yardımcı olur kendi kendine gider. Önceki bupivacaine tedavisi (adım 1.4) da bu süre içinde kanama miktarını sınırlamak için belirtilmiştir.
2. Fare kranial pencere implantasyonu cerrahisi
- Bir diş matkap ucu (0,7 mm uç çapı) kullanarak kafatası içine dairesel bir açılış ~ 4 mm matkap ve dikkatle sivri forceps kullanarak kafatasının bu kısmını çıkarın. 6-8 haftalık farelerin somatosensoriyel korteksini görüntülemek için kraniyotominin merkezini -2.5 posterior ve ± 2.0 lateral bregma'da bulun. Delme sırasında, beyni soğutmak, kemik enkazını temizlemek ve nihai kaldırma için kafatası kemiğini yumuşatmak için kafatasını steril salin ve pamuklu bezlerle düzenli olarak nemlendirin.
NOT: Kraniyotominin koordinatları ilgi bölgesine ve farelerin yaşına göre değişir. - Kafatası çıkarıldıktan sonra, kraniyotomide tuzlu su ile nemlendirilmiş küçük bir kapak camı (0,1 ± 0,02 mm kalınlığında #0 boyutu) dikkatlice yerleştirin. Steril bir mendil kullanarak fazla tuzlu eti kurutun.
- Sivri bir aplikatör kullanarak (pipet ucu veya kırık ahşap pamuklu bez çubuğunun sivri ucu gibi), pencerenin etrafına siyanoakrilat tutkal uygulayın ve beyne ve kafatasına bağlanmasına izin verin. Kafatasının geri kalanına astar tutkal uygulayın ve 20-40 s. 20-40 s. son tutkal ve 20-40 s için bir kür ışığı ile tedavi ile pencere etrafında bir kuyu hazırlayın bir kür ışığı ile tedavi.
- Yapıştırın kafatası üzerinde kafatası üzerine küçük bir kafa plakası bir astar olarak astar tutkal ve daha sonra son tutkal ile ilk kraniyotomi kontralateral hemisfer üzerinde. Her biri 20-40 s kür ışığı ile hem cure.
NOT: Bu işlem sırasında kafatası tamamen tutkal ile kaplı ise dikiş gerekli değildir.
3. Ameliyat sonrası bakım
- Farenin anestezi yokluğunda uyanmasına izin verin (ısıtma yastığında yapılan geri kazanım iyileşme süresini kısaltır) ve tamamen uyanık olduğunda ev kafesine geri döndürün. 72 saat için yeterli olan postoperatif analjezi olarak bir adet subkutan doz buprenorfin SR (0.5 mg/kg) enjekte edin.
- Ameliyattan sağlıklı bir iyileşme kolaylaştırmak için, fare bir jel şeklinde chow veya gıda yumuşatmak için suda düzenli katı yemek şeklinde olabilir ekstra yumuşak bir gıda sağlar.
NOT: Ameliyattan hemen sonra yumuşak yiyeceklerin bir kerelik temini yeterlidir. - Ameliyat prosedürünün ilk 72 saat sağlık ve uygun iyileşme için günlük fareyi izleyin. Daha sonra, pencere implantasyon cerrahisi nden itibaren 2 hafta gibi erken bir süre itibaren görüntüleme gerçekleştirin.
NOT: Eğer iyi yapılırsa, fareler iyi normal ambulatuar davranışlar, yeterli kafes keşif, iyi hidrasyon, istikrarlı kilo alımı ve kafes ve kafesteki diğer fareler ile geniş etkileşimler gösteren kurtarmak. Ameliyat sonrası uyuşukluk, dehidratasyon ve %10'dan fazla kilo kaybı gösteren fareler ötenazi yedirilir ve çalışmadan çıkarılır.
4. İlk görüntüleme için iki foton beyin haritalama
- Fareyi anestezik (Isoflurane, % 5 indüksiyon ve % 1,5 bakım). Baş plakayı iki fotonlu mikroskop aşamasına monte etmek için vidaları kullanarak başı sabitlayın ve 35 °C'de bir ısıtma plakası üzerinde muhafaza edin. Rhodamine B (2 mg/mL) gibi intraperitoneally 100 μL kan damarı boyası enjekte edin.
NOT: Anestezi olmadan uyanık farelerde görüntüleme de yapılabilir. Ancak, son çalışmalar anestezi mikroglial gözetim dinamikleri etkiler göstermektedir27,28,29 ve uyanık farelerde iki foton görüntüleme için kafa fiksasyonu en az 25 gün boyunca kronik görüntüleme sırasında bile stresartar (Juczewski ve ark bakınız, 2020)30. - %70 etanolle dabbed pamuklu bir bez kullanarak kafatası penceresinin yüzeyini nazikçe temizleyin. Kafatası penceresine birkaç damla su veya salin koyun ve amaç bir daldırma lens olduğundan objektif lensi çözeltiye indirin.
- Bir laboratuvar not defterindeki ana kan damarı simgelerini göstermek için kaba bir harita çizin ve epiflorescence ile mercek ten bakın. İki foton görüntüleme sırasında belirli bölgeleri tanımlamak için bu çizimi kullanın. Alternatif olarak, mikroskoba takılan bir kamera veya el kamerası veya telefon aracılığıyla kan damarlarının fotoğraflarını çekin.
NOT: Bu elle çizilmiş resimler ve resimler, iki foton görüntülemeden önce mikroskop altında aynı geniş bölgeleri yeniden ziyaret etmeyi kolaylaştırmak içindir. Bunlar kesin görüntü eşleme değildir. - İki foton görüntüleme altında, floresan hücrelerin ve damarların gerektiği gibi görüntülerini toplamak. Kesin bölgelerin sonraki görüntüleme için tekrar ziyaret edilebilmesini sağlamak için uygun koordinatlarla dikkatli notlar alın. Bu ilk görüntüleme oturumunda çeşitli görüş alanlarını toplayın, örneğin her 1-2 μm'lik bir doku hacmi nden z-stack görüntüleri elde edin.
NOT: İki foton ile görüntü toplarken, kan damarı işaretleri kaba haritalama için kullanılır. İnce haritalama gerekiyorsa Thy1-YFP31 fareden YFP etiketli dendritler kullanılır.- Görüntüleme için önerilen bu parametreleri kullanın: 880-900 nm dalga boyu optimaldir; GFP ve/veya dsRed / Rhodamine uyarma için, 525/50 nm (yeşil kanal) ve 620/60 nm (kırmızı kanal) emisyon filtreleri ile 565 nm dikroik ayna kullanılır; GFP ve YFP ayrımı için 500/15 ve 537/26 nm emisyon filtreli 509 nm dikroik ayna kullanılır; beyindeki güç 25 mW veya altında korunur; görüntü çözünürlüğü 1024 x 1024 piksel, 1.5X zum faktöründe 25X 0.9 NA hedefi ile alınan görüş alanı 295.24 x 295.24 μm'dir.
- Görüntülemenin sonunda fareyi sahneden alın, anesteziden uyanmasına ve ilerideki bir görüntüleme seansına kadar ev kafesine dönmesine izin verin.
5. İki foton görüntüleme ve yeniden görüntüleme
- İlk görüntüleme seansından sonra birkaç saat ile aylar arasında herhangi bir yerde olabilecek sonraki görüntüleme seansları için fareyi anestezi (Isoflurane, %5 indüksiyon ve %1,5 bakım), iki foton mikroskobuna monte edin, ısıtma plakasını koruyun ve Rhodamine B (2 mg/mL) gibi 100 μl'lik bir kan damarı boyasını yeniden enjekte edin.
- ImageJ'de daha önce elde edilen görüntüleri açın ve bu görüntüleri ve önceki oturumdaki notları kullanarak, daha önce görüntülenmiş alanları belirleyin ve dikkatlice yeniden görüntüleyin.
- Görüntüleme penceresi açık olduğu veya çalışmanın kapsamı için gerekli olduğu sürece bunu tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo'da mikroglial dinamikleri görselleştirmek için çift transgenik CX3CR1GFP/+:Thy1YFP fareler kullanıldı. Thy1-YFP H hattı, mikroglia (GFP) ve nöronların (YFP) floresan üst üste raşitini önlemek için Thy1-GFP M hattının aksine kullanılır. Alternatif yaklaşımlar, microglia'nın tdTomato ve daha sonra Thy1-GFP M hattı gibi etiketlendiği bir muhabir hattı kullanabilir. H çizgisinin bir dezavantajı YFP etiketlernbir sürü ve etiket artan yaş (kişisel gözlem) ile artar olmasıdır. M hattı nöronların seyrek etiketleme sergiler. 2 -4 haftalık pencere implantasyonu ameliyatında mikroglial dinamikler tekrarlanan görüntüleme ile takip edilebilir. Büyük kan damarları belirli bölgeleri lokalize etmek için kullanılır ve daha sonra YFP etiketli dendritler beyin bölgelerinin ince haritalama için kullanılır. Bu yaklaşımla, belirli dendritler beyin bölgelerinin ince haritalaması için sabit yerler olarak kullanılabilir(Şekil 1, Şekil 1b'dekioklar). Dendritler stabil olmakla birlikte, bazı mikroglialar günlük hareket eder (Şekil 1c).
Buna ek olarak, bu yaklaşım uzun vadede haftalık boylamsal görüntüleme için yeterlidir. Böylece, tek transgenik CX3CR1GFP/+ fareler, her görüntüleme seansında vaskülatürü 8 haftaya kadar etiketlemek için Rhodamine B intraperitoneal enjeksiyonları ile birleşen mikrogliayı takip etmek için kullanılmıştır(Şekil 2). Alternatif olarak, yukarıda da belirtildiği gibi, Thy1 fareler uzunlamasına ince haritalama için kullanılabilir. Haftalık görüntüleme yapıldığında, vaskülatürin düzenli olarak sabit olduğu belirtilmektedir, ancak mikroglianın Şekil 2'deüç özel ilgi bölgesinde (RoI, kesik daireler) gösterildiği gibi dinamik olduğu görülebilir. En yüksek Yatırım Getirisinde, mikroglia görüntülemenin4. th Orta roi'da çatallı bir damar ile,3. haftada alt damar çevresinde mikroglial hücre ortaya çıkar,6. haftada kaybolur ve7. haftada üst kan damarında başka bir mikroglia ortaya çıkar ve8. Son olarak, alt yatırım getirisinde, mikroglial hücreth 6.th th Bu sonuçlar, mikroglial konumsal ağdaki dinamik değişiklikleri haftalar calar arasında gösterir.
Bu yaklaşım aynı zamanda akut yaralanma sonrası veya patolojik hastalık ilerlemesi sırasında hücresel dinamikleri araştırmak için kullanılabilir. Tek transgenik CX3CR1GFP/+ fareler, rhodamine B intraperitoneal enjeksiyonları ile birleştiğinde mikroglia'yı takip ederek daha önce vaskülatürü etiketlemek için (veriler gösterilmez) ve kainik asit tarafından indüklenen şiddetli nöbetleri takiben kullanıldı (Şekil 3). Nöbetler sonrasında vasküler yatak yapısı, aşırı tedirginlik olmadan korunur(Şekil 3a). Ancak, mikroglial hücresel ağ ve konumsal manzara geçici olarak değiştirilir (bazı hücreler "kazanılır" ve diğerleri görüş alanında "kaybolur") daha önce bildirdiğimiz gibi normale 72 h(Şekil 3b)tarafından geri yüklenir nöbetlerin 24-48 h içinde daha büyük değişiklikler ile32.
Son olarak, bu yaklaşım hücre hücre etkileşimlerini araştırmak veya nöral hücre türleri arasındaki dinamikleri karşılaştırmak için de kullanılabilir. Çift transgenik CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ fareler in vivo mikroglia ve NG2+ hücrelerini izlemek için kullanıldı. Vaskülatür etiketlenmeden mikroglia ve NG2 hücreleri tanımlanabilir (Şekil 4a). NG2 hem damar ilişkili perisitler ve oligodendrosit öncühücreleri (OPCs)33,,34etiketler bir proteoglikan olduğunu. Perisitler genellikle vasküler duvar boyunca takip eden uzun süreçlere sahiptir (şekil 4a'daok başları ile özdeşleşmiştir) ve OPC'ler genellikle beyin parankiminde bulunan daha büyük hücre gövdelerini gösterirler (tahminen Şekil 4a'dakioklarla tanımlanır). Perisit ve OPC'leri yeterince ayırt etmek için vaskülatür Rhodamine B ile etiketlenir. NG2+-damar ilişkili hücrelerin parlak floresans (perisitler, ok başları) iki foton görüntüleme ile benzer uyarma rağmen luminal Rhodamine sönük floresans ayırt edilebilir(Şekil 4b,c). Günlük görüntüleme perisitlerin stably konumlandırılmış olduğunu gösterir, OPCs (Şekil 4byıldız) ve mikroglia (Şekil 4bdaireler) önceki raporlar ile tutarlı dinamik32,35,36.
Şekil 1: Çift transgenik CX3CR1GFP/+nöronal dendritlerle ince haritalama kullanılarak mikroglianın günlük görüntülemesi:Thy1YFP fareler. (a) Çift transgenik CX3CR1GFP/+:Thy1YFP faresinden mikroglia (yeşil) ve dendritlerin (kırmızı) temsilcisi iki foton görüntüsü. (b-c), Kutulu bölgenin günlük görüntüleri (a) tekrar tekrar görüntülenen dendritleri (b'deki oklar) ve mikroglia ile dendritleri gösteren (c). Dendritik yapılar konumsal olarak stabil iken, bazı mikrogliaların sonraki günlerde orijinal konumlarından başka bir yere nakledildiği belirtilmiştir. Bu hücreler bir sayı (1, 2 veya 3) ile tanımlanmıştır. Önceki gün, konumları beyaz bir yıldız ile not edildi ve bir sonraki gün, konumlarını sarı bir yıldız ile kaydedildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CX3CR1GFP/+ farelerde mikroglianın birkaç ay boyunca uzun süreli haftalık görüntülemesi. (a-h), Akut etiketli vaskülatür (kırmızı, Rhodamine, 2 mg/mL, i.p.) kullanılarak tekrarlanan görüntüleme sırasında bir CX3CR1GFP/+ fareden mikroglianın (yeşil) temsili iki foton görüntüleri, mikroglial ağı 8 haftaya kadar takip etmek için kaba bir dönüm noktası olarak. Vaskülatür görüntüleme dönemi boyunca yapısal olarak stabildi. Bu bölgelerin içine mikroglial somata hareketini (üstteki iki kesik çember) veya dışarıya (alt daire) göstermek için vaskülatür (kesik daireler) ile üç küçük bölge vurgulanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nöbetler sonrası CX3CR1GFP/+ farelerde mikroglianın uzun süreli günlük görüntülemesi. (a-b), Belirli bir beyin bölgesinin mikroglia (yeşil) ve damar akut etiketleme (kırmızı, Rhodamine, 2 mg/mL, i.p.) ile aynı görüş alanının günlük görüntüleme sırasında temsili iki foton görüntüleri. Görüntüleme, kemokonvülsif ajan kainik asit kullanılarak şiddetli nöbetlerin indüksiyonundan sonra başlar. Vasküler yapı bireysel vasküler segmentler (oklar) zaman içinde tespit edilebilir olarak muhafaza edildi(a). Ancak nöbetleri takip eden ilk iki gün mikroglial ağ dinamiği artmış ve üçüncü gün normal düzeylere geri dönüldü(b). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ farelerde mikroglia ve NG2+ hücrelerin günlük görüntülemesi. (a) Temsili iki foton lu mikroglia (yeşil) ve NG2+ hücreleri (kırmızı) in vivo. Etiketlenmemiş vaskülatür, vaskülatürle ilişkili olmayan NG2 hücrelerini (perisitler, tahminen ok uçlarıile tanımlanır) ve NG2 hücrelerini (oligodendrosit öncühücreleri veya OPC'ler, tahminen oklarla tanımlanır) ayırt etmeyi başaramaz. (b)Rhodamine etiketli vaskülatür ile art arda görüntüleme gün mikroglia (yeşil) ve NG2+ hücreleri (kırmızı) temsil iki foton görüntüleri. Perisitler (ok uçları) sabitken OPC'ler dinamiktir (beyazdan sarıyıldıza). Microglia da dinamiktir (daireler: kesikli daireler mikroglia olmayan bir pozisyonu temsil eder ve dolu daire karşılık gelen bir microglia ile bir pozisyon temsil eder). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo iki foton görüntüleme gelişiyle sağlıklı beyinde meydana gelen hücresel etkileşimler ve dinamikleri bolluk keşfetmek için fırsatlar açtı. İlk çalışmalar hem akut hem de kronik görüntüleme ile görüntü nöronal dendritler için açık kafatası kraniyotomi yaklaşımı kullanarak odaklanmıştır37,38. Bu da beyindeki nöroimmün etkileşimleri açıklamak için kullanılabilir. Bu protokol, kısa veya uzun vadede uzun süre floresan etiketli hücrelerin (özellikle mikroglia, beynin yerleşik bağışıklık hücresi) güvenilir görüntüleme için bir yöntem açıklar. Boya etiketli vasküler ve / veya floresan etiketli dendrites kullanımı hücrelerin tekrarlanan, güvenilir görüntüleme sağlamak için ilgi beyin bölgelerinin kaba veya ince haritalama için ayrıntılı. Thy1YFP hattı ince beyin haritalama için kullanılmak üzere önerilmesine rağmen, alternatif yaklaşımlar rahim elektroporasyon39gibi belirli nöronal popülasyonları etiketlemek için diğer teknikler veya fare hatları kullanabilirsiniz39 ,40, erken postnatal AAV enjeksiyonları41 veya TRAP farelerin kullanımı42. Ayrıca, kortikal görüntüleme bu tartışmanın odak noktası olmasına rağmen, bu yaklaşım da uzun vadede derin beyin yapıları görselleştirmek için adapte edilebilir43.
Bu protokol için her farenin ameliyat işlemi anestezinin başlamasından anestezinin iyileşmesine kadar 30-60 dakika içinde tamamlanabilir. Ameliyat sırasında kafatası dikkatlice çıkarılır ve en az iki hafta sonra uzun süreli görüntüleme için implante edilen steril bir kapak camı ile değiştirilir. Mortalite son derece nadirdir (%5'ten az). wildtype farelerde, p2Y12R nakavt fareler gibi pıhtılaşma problemi olan fareler, daha yüksek mortalite ve cerrahi başarısızlık gösterir. Bu tür farelerde kanama daha uzun süre devam edebilir ve fareler muhtemelen iç kanamakomplikasyonları nedeniyle kraniyotominin ilk 48 saat içinde ölebilir. Bu protokolden implante pencereleri olan farelerherhangi bir enfeksiyon belirtisi göstermek için fark edilmemiştir ve protokol farelerin %50-80'inde uzun süreli görüntüleme için açık pencereler oluşturmak için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.
Mevcut kronik pencere implantasyon yaklaşımı alternatif olarak, ince kafatası yaklaşımı tekrar tekrar bozulmamış beyin hücreleri görselleştirmek için var. Çeşitli çalışmalar değeri ve hatta pencere implantasyon yaklaşımı 22,23,2424,25üzerinde ince kafatası yaklaşımının seçim önceliği vurgulanmıştır.25 Bu yaklaşımın vaadi göz ardı edilmemelidir, düzgün yapıldığında, glial hücrelerin aktivasyonu eksikliği de dahil olmak üzere mevcut yaklaşımın çeşitli belirgin sınırlamalar veya dezavantajları karşı, daha fizyolojik dikenlerin düşük ciro, ve aynı zamanda beyin fizyolojisi etkileyebilir anti-inflamatuar ajanların kullanımı için ihtiyaç eksikliği. Belirli araştırma soruları için bir yaklaşım seçerken, bu protokolde ayrıntılı olarak belirtilen yaklaşımı seçmeden önce bu ciddi sınırlamalar göz önünde bulundurulmalıdır.
Ancak, bu yaklaşımın itiraz dört kat. İlk olarak, kafatası pencere implantasyon yaklaşımı ince kafatası prosedürüne göre bu prosedürün ustalık kolaylığı nedeniyle çekicidir. Uygun kafatası inceltme her zaman deneyciler tarafından hakim olamaz ve iyi yapılmazsa glial aktivasyon çekiciliğini sınırlayan neden olabilir. İkinci olarak, bu kafatası pencere implantasyon yaklaşımı beyin optik olarak net bir pencereden görüntülenir gibi beyin yapılarının güçlü derinlik netliği verir. Görüntüleme için kullanılabilir pencere de genellikle analiz için doku daha büyük bir hacim erişim sağlayan ince kafatası yaklaşımıkullanılan çok daha büyüktür. Üçüncü olarak, derinlik netliği gibi, cam kapak lı düzgün ince ve net olduğundan bu yaklaşım pencereden düzgün bir netlik sağlar. Bu seanslar ve hayvanlar arasında karşılaştırmalar kolaylaştırır. Tekrarlanan seanslar sırasında ve hayvanlar arasında pencere boyunca bile netlik sağlamak için ince kafatası tekniği için özel uzmanlık gereklidir. Son olarak, bu yaklaşım saat görüntüleme sıklığında çok esneklik sağlar, gün hafta ve ay ve hatta yıl. İnce kafatası yaklaşımı için, en fazla beş tekrar24önerilmiştir.
Bu yaklaşımın gelecekteki uygulamaları çoktür. İlk olarak, uygulamalar hem normal fizyoloji ve patoloji beyinde yeni nöro-glio-vasküler etkileşimleri açıklığa kavuşturulması içerebilir. İkinci olarak, yerleşik hücreler bu prosedürde tartışılsa da, yaklaşım, akut yaralanma, kronik beyin enfeksiyonu ve/veya nörodejeneratif durumlar sırasında, ilgili floresan etiketli hücrelere sahip fareler mevcut olduğu sürece, bağışıklık hücrelerine sızma dinamiklerini ve etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Son olarak, bu yaklaşım beyin hücrelerinin yapısal çalışmalar bağlamında ağırlıklı olarak ele alınmıştır. Ancak, fonksiyonel görüntüleme nin ortaya çıkmasıyla örneğin kalsiyum44,45,46 veya voltaj görüntüleme teknikleri47,48, bu yaklaşım sağlık ve hastalıkta zaman içinde fonksiyonel görüntüleme için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Eyo laboratuvarı üyelerine bu el yazmasında sunulan fikirleri tartıştıkları için teşekkür ederiz. Biz NG2DsRed fareler33hediye için Virginia Üniversitesi'nde Kipnis Lab Dr Justin Rustenhoven teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve Ulusal Sağlık Enstitüsü İnme Enstitüsü'nden U.B.E'ye (K22 NS104392) yapılan fonla desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
