Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine chronische Cranial Window Implantationstechnik, die für die Längsbildgebung von neurogliovaskulären Strukturen, Wechselwirkungen und Funktion unter gesunden und kranken Bedingungen verwendet werden kann. Es dient als ergänzende Alternative zum transkraniellen Bildgebungsansatz, der zwar oft bevorzugt wird, aber einige kritische Einschränkungen besitzt.
Abstract
Das Zentralnervensystem (ZNS) wird durch ein komplexes Zusammenspiel von neuronalen, gliaalen, stromalen und vaskulären Zellen reguliert, die seine ordnungsgemäße Funktion erleichtern. Obwohl die Untersuchung dieser Zellen isoliert in vitro oder zusammen ex vivo liefert nützliche physiologische Informationen; wichtige Merkmale der neuronalen Zellphysiologie werden in solchen Kontexten übersehen. Daher ist es notwendig, neuronale Zellen in ihrer nativen in vivo Umgebung zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll beschreibt die sich wiederholende In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung von Nervenzellen im Nagetierkortex als Werkzeug zur Visualisierung und Untersuchung bestimmter Zellen über einen längeren Zeitraum von Stunden bis Monaten. Wir beschreiben detailliert die Verwendung der grob stabilen Gehirnvaskulatur als grobe Karte oder fluoreszierend beschriftete Dendriten als feine Karte ausgewählter Hirnregionen von Interesse. Anhand dieser Karten als visuellen Schlüssel zeigen wir, wie neuronale Zellen für die nachfolgende repetitive In-vivo-Bildgebung präzise verlegt werden können. Anhand von Beispielen für die In-vivo-Bildgebung von fluoreszierend markierten Mikroglia, Neuronen und NG2+ Zellen demonstriert dieses Protokoll die Fähigkeit dieser Technik, eine sich wiederholende Visualisierung der zellulären Dynamik am selben Hirnort über längere Zeiträume zu ermöglichen, die weitere Hilfe beim Verständnis der strukturellen und funktionellen Reaktionen dieser Zellen in der normalen Physiologie oder nach pathologischen Beleidigungen unterstützen kann. Gegebenenfalls kann dieser Ansatz an die funktionelle Bildgebung von Nervenzellen gekoppelt werden, z. B. mit Kalziumbildgebung. Dieser Ansatz ist besonders eine leistungsstarke Technik, um die physikalische Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen des ZNS in vivo zu visualisieren, wenn genetische Mausmodelle oder bestimmte Farbstoffe mit unterschiedlichen fluoreszierenden Tags zur Kennzeichnung der gefährdeten Zellen verfügbar sind.
Introduction
Das zentralnervöse System (ZNS) wird durch ein komplexes Zusammenspiel von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen ansässigen Zelltypen, einschließlich Neuronen, Glia und gefäßassoziierten Zellen, gesteuert. Traditionell wurden Neurozellen in isolierten, ko-kultivierten1,2,3,4,5 (in vitro) oder ausgeschnittenem Hirngewebe (ex vivo)6,7,8,9,10 Kontexte untersucht. Es ist jedoch notwendig, das Verhalten neuronaler Zellen und Interaktionen in der nativen Umgebung des intakten Gehirns in vivo weiter zu verstehen. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, um in vivo-Regionen von Interesse abzubilden und diese Regionen in zukünftigen Imaging-Sitzungen genau neu abzubilden, um die komplexen Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen ZNS-Zelltypen über einen längeren Zeitraum zu verfolgen.
Die Entwicklung von in vivo bildgebenden Ansätzen hat signifikante Gewinne für das richtige Verständnis der neuronalen Funktion11,12,13,14,15geliefert. Insbesondere bieten diese Ansätze mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen In-vitro- und Ex-vivo-Ansätzen. Erstens verfügen In-vivo-Bildgebungssysteme über physiologisch relevante Zell- und Gewebekomponenten wie die Vaskulatur mit dem gesamten Repertoire zellulärer Wechselwirkungen, um ein vollständiges Verständnis der neuronalen Netzwerkphysiologie zu ermöglichen. Zweitens deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass bestimmte Nervenzellen (wie Mikroglia) wichtige Merkmale ihrer Identität und damit die Physiologie16,17 verlieren, die in der in vivo-Einstellung erhalten werden können, wenn sie aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt werden. Drittens bieten In-vivo-Bildgebungssysteme die Möglichkeit für stabile Längsuntersuchungen von Wochen bis Monaten, um z.B. zelluläre Wechselwirkungen zu untersuchen. Angesichts der zunehmenden Hinweise auf Beiträge des peripheren Immunsystems18,19 und des Mikrobioms20,21 in der ZNS-Physiologie bieten In-vivo-Systeme eine Plattform, um solche Beiträge und Wirkungen auf ZNS-Zellen zu befragen. Daher sind Ansätze, die Längs-in-vivo-Bildgebung verwenden, um neuroimmune Physiologie und Wechselwirkungen in gesunden, verletzten und kranken Zuständen zu untersuchen, eine große komplementäre Ergänzung zu traditionellen Ansätzen.
In diesem Protokoll beschreiben wir einen zuverlässigen Ansatz, um verschiedene Zelltypen im Gehirn abzubilden, einschließlich Mikroglia, Neuronen und NG2+ Zellen als Beispiele. Es wurden zwei Ansätze zur Visualisierung von Nervenzellen in vivo entwickelt: der ausgedünnte Schädelansatz und der offene Schädel mit einem Schädelfensteransatz. Obwohl verdünnte Schädelansätze im Einsatz sind und bevorzugt werden, weil sie einige der Nachteile des offenen Schädelansatzes überwinden, wie z.B. Glialzellaktivierung, überphysiologische Wirbelsäulendynamik und die Verwendung von entzündungshemmenden Mitteln22,23,24,25, verdünnte Schädelansätze zeigen auch einige kritische Nachteile. Erstens ist das Ausdünnungsverfahren ein sehr heikles Verfahren, das viele Forscher nur schwer perfektionieren können, vor allem, wenn eine erneute Ausdünnung notwendig ist. Dies ist der Fall, weil es für Experimentatoren oft schwierig ist, festzustellen, dass sie den Schädel auf eine Tiefe von 20 m ausgedünnt haben. Zweitens müsste für angemessene Vergleiche zwischen Mäusen die Ausdünnung identisch sein, und eine Vielzahl von Ausdünnungserfolgen zwischen Bildgebungssitzungen oder Mäusen könnte die Visualisierung neuronaler Strukturen erschweren. Drittens können Tiere mit verdünnten Schädeln bei Verwendung bei der Längsbildgebung nur für eine begrenzte Anzahl von Sitzungen verwendet werden, wenn eine erneute Ausdünnung des Schädels zum Einsatz kommt. Forth, da ein Teil des Knochengewebes noch erhalten bleibt, könnte die Klarheit in der Tiefe der Bildgebung durch den ausgedünnten Schädelansatz beeinträchtigt werden, der eine großartige Visualisierung von oberflächlicheren, aber nicht so viel mit tieferen Regionen ermöglicht. Vor diesem Hintergrund können tiefere Hirnstrukturen wie der Hippocampus nicht erfolgreich mit dem ausgedünnten Schädelansatz abgebildet werden. Diese Überlegungen werfen die Notwendigkeit alternativer und ergänzender Ansätze auf, die diese Bedenken ausräumen könnten.
Alternativ zum ausgedünnten Schädelansatz verwendet der Ansatz der offenen Schädelfensterimplantation ein Verfahren, bei dem der Schädel durch einen optisch klaren Glasdeckel ersetzt wird. Dies ermöglicht eine nahezu unbegrenzte Anzahl von Bildgebungssitzungen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode aufgrund des Ersatzes des Schädels durch den Glasdeckel ein klares Sichtfenster fluoreszierender Gehirnzellen für längere Zeit von Stunden bis Monaten und kann daher eingesetzt werden, um Zellaktivität und Wechselwirkungen zu untersuchen, die für Physiologie, Alterung und Pathologie relevant sind.
Insgesamt beschreiben wir Schritte, die befolgt werden können, um chronische Schädelfenster durch eine stereotaxic-Kraniotomie zu implantieren, die in vivo-Bildgebung von Hirnregionen von Interesse ermöglicht. Wir beschreiben auch, wie die grob stabile Gehirnvaskulatur oder die fluoreszierend markierten Dendriten verwendet werden könnten, um eine grobe oder eine feine Karte bzw. der Hirnregionen von Interesse zu erzeugen. Dieser Ansatz kann dann für wiederholte Bildgebung über mehrere Sitzungen verwendet werden. Die Bedeutung dieser Technik liegt daher in ihrer Fähigkeit, die langfristigen Veränderungen oder Stase in Gehirnelementen einschließlich der Anordnung, Morphologie und Wechselwirkungen der verschiedenen zellulären Typen abzubilden.
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Protocol
Alle Schritte entsprechen den Richtlinien, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Virginia festgelegt und genehmigt wurden.
1. Mauspräparat für die Schädelfensterimplantation
HINWEIS: Verschiedene transgene Mauslinien mit floreszenten Tags eignen sich für die Bildgebung.
- Verwenden Sie CX3CR1GFP/+ Mäuse26, um Mikroglia in vivo zu visualisieren. Typischerweise werden jugendliche bis junge Erwachsene, 4 bis 10 Wochen alte Mäuse mit einem Gewicht von 17-25 g, verwendet.
HINWEIS: Obwohl dieser Ansatz sogar für vorentwöhnte Mäuse geeignet ist, kann die Notwendigkeit, die Mäuse mit ihren Müttern zur Fütterung in ihren Käfig zurückbringen, die Genesung erschweren, wenn die Mutter sich nach der Operation nicht angemessen um Welpen kümmert. Daher wird die Verwendung von Mäusen nach der Entwöhnung empfohlen. - Anästhesisieren Sie die Maus mit Isofluran (5% Sauerstoffdurchfluss für die Induktion für 1 min) in einer Anästhesiekammer. Stellen Sie fest, dass die Maus keine Bewegungs- oder Zuckungsreaktionen auf Zehen- und/oder Schwanzkneifen anzeigt. Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und im Freien gründlich rasieren Sie das Haar auf dem Kopf zwischen den Ohren von etwa der Augenhöhe bis zur Spitze des Halsbereichs mit einem Haarschneider.
HINWEIS: Die Konzentration von Isofluran würde von der Größe der Induktionskammer abhängen. Daher können für kleinere Kammern 3-4% Isofluran verwendet werden, um effektiv Anästhesie zu induzieren, während größere Kammern bis zu 5% benötigen. - Bewegen Sie die Maus auf die stereotaktische Operationsstation Nasenkegel für Anästhesie (1,5-2% für die Wartung für die Operation), stabilisieren Sie ihren Kopf mit Ohrbügeln, und halten Sie die Maus auf einem Heizpad, um die Körpertemperatur warm zu halten.
- Schmieren Sie beide Augen mit Augensalbe. Injizieren Sie 100 l 0,25% Bupivicain (um der Maus eine lokale Analgesie zu bieten, die 8-12 h dauert) und 100 l von 4 mg/ml Dexamethason (um die Entzündung zu reduzieren, die durch den chirurgischen Eingriff entstehen kann) subkutan an der Einschnittstelle. Lassen Sie die Maus mindestens 5 min sitzen, bevor Sie zum nächsten Schritt wechseln.
- Reinigen Sie den rasierten Kopf mit drei abwechselnden Tupfern Betadin und 70% Alkohol. Machen Sie einen Mittellinien-Kopfhautschnitt mit chirurgischer Klinge oder Schere, die sich von der Rückseite des Schädelbereichs zwischen den Ohren bis zum vorderen Bereich zwischen den Augen erstreckt. Die restliche Haut wird geschnitten, um den Schädel freizulegen.
- Reinigen Sie das Bindegewebe zwischen der Kopfhaut und dem darunter liegenden Schädel mit 3% Wasserstoffperoxid (H2O2) und lokalisieren Sie den Hirnbereich, der mit stereotaktischen Koordinaten abgebildet werden soll.
HINWEIS: Es gibt oft einige Blutungen (Schritt 1.5) aus dem Schnitt auf der Schädeloberfläche. Diese Blutung löst sich in der Regel von selbst innerhalb von 3-5 min. Reinigung mit dem Peroxid hilft. Vorherige Bupivacaine Behandlung (Schritt 1.4) wird auch festgestellt, um die Menge der Blutungwährend während dieser Zeit zu begrenzen.
2. Maus-Kranielle Fenster-Implantationchirurgie
- Bohren Sie mit einem Zahnbohrer (0,7 mm Spitzendurchmesser) eine kreisförmige Öffnung von 4 mm in den Schädel und entfernen Sie diesen Teil des Schädels vorsichtig mit spitzen Zangen. Für die Abbildung des somatosensorischen Kortex von 6-8 Wochen alten Mäusen, lokalisieren Sie das Zentrum der Kraniotomie bei -2,5 posterior und 2,0 seitlich zu Bregma. Während des Bohrens befeuchten Sie den Schädel regelmäßig mit sterilen Saline- und Wattestäbchen, um das Gehirn zu kühlen, Knochenablagerungen abzureinigen und den Schädelknochen zur eventuellen Entfernung zu erweichen.
HINWEIS: Die Koordinaten für die Kraniotomie variieren je nach Interessengebiet und Alter der Mäuse. - Nachdem der Schädel entfernt wurde, legen Sie vorsichtig ein kleines Deckglas (Größe #0 bei 0,1 x 0,02 mm Dicke) mit Saline in der Craniotomie befeuchtet. Überschüssige Saline mit einem sterilen Wisch abtrocknen.
- Mit einem spitzen Applikator (wie eine Pipette Spitze oder das spitze Ende eines gebrochenen Holzwatte-Tupfer-Sticks), cyanoacrylat Leim um das Fenster auftragen und lassen Sie es an Gehirn und Schädel zu befestigen. Tragen Sie den Primerkleber auf den Rest des Schädels auf und härten Sie ihn mit einem aushärtenden Licht für 20-40 s aus. Bereiten Sie einen Brunnen um das Fenster mit dem endigen Kleber vor und härten Sie mit einem Aushärtelicht für 20-40 s aus.
- Kleben Sie eine kleine Kopfplatte auf den Schädel auf der kontralateralen Hemisphäre der Kraniotomie zuerst mit dem Primerkleber als Primer und dann mit dem Endkleber. Beide mit dem Aushärtelicht für je 20-40 s aushärten.
HINWEIS: Nähte werden nicht benötigt, wenn der Schädel während dieses Vorgangs vollständig mit dem Kleber bedeckt ist.
3. Post-Chirurgie-Pflege
- Lassen Sie die Maus in Abwesenheit von Anästhesie aufwachen (Erholung auf einem Heizkissen verkürzt die Erholungszeit) und bringen Sie sie in ihren HeimischenKäfig zurück, sobald sie vollständig wach ist. Injizieren Sie eine subkutane Dosis Buprenorphin SR (0,5 mg/kg) als postoperative Analgesie, die für 72 h ausreicht.
- Um eine gesunde Genesung von der Operation zu erleichtern, stellen Sie der Maus eine zusätzliche weiche Nahrung zur Verfügung, die in Form von regelmäßigen festen Chow in Wasser sein kann, um das Chow oder Nahrung in Form eines Gels zu erweichen.
HINWEIS: Eine einmalige Versorgung der Soft Food unmittelbar nach der Operation ist ausreichend. - Überwachen Sie die Maus täglich auf Gesundheit und richtige Genesung für die ersten 72 h des chirurgischen Eingriffs. Danach, führen Sie die Bildgebung bereits ab 2 Wochen nach der Fensterimplantationschirurgie durch.
HINWEIS: Wenn es gut gemacht wird, erholen sich Mäuse gut und zeigen normales ambulantes Verhalten, ausreichende Käfigexploration, gute Hydratation, stabile Gewichtszunahme und umfangreiche Interaktionen mit anderen Mäusen im Käfig und anderen Gegenständen im Käfig. Mäuse, die Lethargie, Dehydrierung und mehr als 10% Gewichtsverlust nach der Operation zeigen, werden eingeschläfert und aus der Studie entfernt.
4. Zwei-Photonen-Gehirn-Mapping für die erste Bildgebung
- Anästhesisieren Sie die Maus (Isoflurane, 5 % Induktion und 1,5 % Wartung). Stabilisieren Sie den Kopf mit Schrauben, um die Kopfplatte auf der Zwei-Photon-Mikroskop-Bühne zu montieren, und werden auf einer Heizplatte bei 35 °C gehalten. Injizieren Sie intraperitoneal 100 l Blutgefäßfarbstoff wie Rhodamine B (2 mg/ml).
HINWEIS: Die Bildgebung könnte auch bei wachen Mäusen ohne Anästhesie durchgeführt werden. Neuere Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Anästhesie die mikrogliaale Überwachungsdynamikbeeinflusst 27,28,29 und dass die Kopffixierung für zwei Photonenbilder bei wachen Mäusen den Stress auch während der chronischen Bildgebung für mindestens 25 Tage erhöht (siehe Juczewski et al., 2020)30. - Reinigen Sie die Oberfläche des Schädelfensters sanft mit einem Wattestäbchen, der mit 70 % Ethanol umgesiebt ist. Legen Sie ein paar Tropfen Wasser oder Salzine auf das Schädelfenster und senken Sie die Objektivlinse in die Lösung, da das Ziel eine Tauchlinse ist.
- Zeichnen Sie eine grobe Karte von Hand, um die wichtigsten Sehenswürdigkeiten des Blutgefäßes in einem Labor-Notebook zu bezeichnen, während Sie das Okular durch Epifloreszenz betrachten. Verwenden Sie diese Zeichnung, um die spezifischen Bereiche während zweier Photonenabbildungen zu identifizieren. Alternativ können Sie die Blutgefäße entweder über eine am Mikroskop angebrachte Kamera oder über eine Handkamera oder ein Telefon fotografieren.
HINWEIS: Diese handgezeichneten Bilder und Bilder sollen es erleichtern, die gleichen breiten Bereiche unter dem Mikroskop vor zwei Photonenbildern erneut zu besuchen. Dabei handelt es sich nicht um eine genaue Bildzuordnung. - Sammeln Sie unter zwei Photonenbildern nach Bedarf Bilder von blühenden Zellen und Gefäßen. Nehmen Sie sorgfältige Notizen mit geeigneten Koordinaten auf, um sicherzustellen, dass die genauen Bereiche für die nachfolgende Bildgebung überprüft werden können. Sammeln Sie in dieser ersten Bildgebungssitzung mehrere Sichtfelder, z.B. erfassen Sie z-stack-Bilder alle 1-2 m durch ein Gewebevolumen.
HINWEIS: Beim Sammeln von Bildern von zwei Photonen werden die Landmarken des Blutgefäßes für grobe Kartierung verwendet. Wenn eine feine Kartierung erforderlich ist, werden YFP-markierte Dendriten von Thy1-YFP31-Mäusen verwendet.- Verwenden Sie diese empfohlenen Parameter für die Bildgebung: eine Wellenlänge von 880-900 nm ist optimal; für GFP und/oder dsRed / Rhodamine Anregung, ein 565 nm dichroitischen Spiegel mit 525/50 nm (grüner Kanal) und 620/60 nm (roter Kanal) Emissionsfilter verwendet werden; für gfP- und YFP-Trennung wird ein 509 nm dichroitischer Spiegel mit 500/15 und 537/26 nm Emissionsfiltern verwendet; die Leistung im Gehirn wird bei 25 mW oder darunter gehalten; Bildauflösung beträgt 1024 x 1024 Pixel, das Sichtfeld mit einem 25X 0.9 NA Objektiv bei einem 1,5-fachen Zoomfaktor beträgt 295,24 x 295,24 m.
- Am Ende der Bildgebung, nehmen Sie die Maus von der Bühne, lassen Sie es aus der Anästhesie aufwachen und kehren Sie in seinen heimischen Käfig bis zu einer zukünftigen Bildgebung Sitzung.
5. Zwei-Photonen-Bildgebung und Re-Imaging
- Für zukünftige nachfolgende Bildgebungssitzungen, die von einigen Stunden bis Monaten nach der ersten Bildgebungssitzung stattfinden können, die Maus anästhesieren (Isofluran, 5% Induktion und 1,5% Wartung), am Zwei-Photonen-Mikroskop montieren, auf einer Heizplatte warten und 100 l einen Blutgefäßfarbstoff wie Rhodamine B (2 mg/ml) erneut injizieren.
- Öffnen Sie die zuvor erhaltenen Bilder in ImageJ, und identifizieren Sie mithilfe dieser Bilder sowie der Notizen aus der vorherigen Sitzung die zuvor abgebildeten Bereiche und stellen Sie sie sorgfältig neu ab.
- Wiederholen Sie dies so lange, wie das Bildgebungsfenster klar ist oder für den Umfang der Studie als wesentlich ist.
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Representative Results
Zur Visualisierung der mikrogliaalen Dynamik in vivo wurden doppeltransgene CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-Mäuse verwendet. Die Thy1-YFP H Linie wird im Gegensatz zur Thy1-GFP M-Linie verwendet, um Blütenstaubüberlappungen von Mikroglia (GFP) und Neuronen (YFP) zu vermeiden. Alternative Ansätze könnten eine Reporterlinie verwenden, in der Microglia z.B. mit tdTomato und dann die Thy1-GFP M-Linie beschriftet werden kann. Ein Nachteil der H-Linie ist, dass YFP viele Neuronen kennzeichnet und das Etikett mit zunehmendem Alter zunimmt (persönliche Beobachtung). Die M-Linie zeigt eine spärliche Kennzeichnung von Neuronen. Zwischen 2 – 4 Wochen der Fensterimplantationschirurgie kann der mikrogliaalen Dynamik eine wiederholte Bildgebung folgen. Große Blutgefäße werden verwendet, um bestimmte Regionen zu lokalisieren und dann werden die YFP-markierten Dendriten für die feine Kartierung von Hirnregionen verwendet. Mit diesem Ansatz können spezifische Dendriten als stabile Landmarken für die feine Kartierung von Hirnregionen verwendet werden (Abbildung 1, Pfeile in Abbildung 1b). Während Dendriten stabil sind, bewegen sich einige Mikroglia täglich (Abbildung 1c).
Darüber hinaus ist dieser Ansatz ausreichend für die wöchentliche Längsbildgebung auf lange Sicht. So wurden einzelne transgene CX3CR1GFP/+-Mäuse verwendet, um Mikroglia in Verbindung mit intraperitonealen Injektionen von Rhodamine B zu folgen, um die Vaskulatur während jeder Bildgebungssitzung für bis zu 8 Wochen zu kennzeichnen (Abbildung 2). Alternativ, wie oben besprochen, könnten Thy1-Mäuse für Längs-Feinkartierung verwendet werden. Wenn die wöchentliche Bildgebung durchgeführt wird, wird festgestellt, dass die Vaskulatur stabil fixiert ist, aber Mikroglia kann als dynamisch angesehen werden, wie in drei spezifischen Regionen von Interesse (ROI, gestrichelte Kreise) in Abbildung 2gezeigt wird. Im oberen ROI beginnen Mikroglia, den ROI durch die4. Woche der Bildgebung zu betreten und durch die8. Woche der Bildgebung fortzusetzen. Im mittleren ROI mit einem zweigeteilten Gefäß taucht in der3. Woche eine Mikroglialzelle um das untere Gefäß auf, geht in der6. Woche verloren und eine weitere Mikroglia taucht in der7. Woche auf dem oberen Blutgefäß auf und wird bis in die8. Woche gehalten. Schließlich, im unteren ROI, eine mikrogliaale Zelle in während der6. Woche gehalten und in der7. und8. Woche der Bildgebung verloren. Diese Ergebnisse deuten auf dynamische Veränderungen im mikrogliaalen Positionsnetz über Wochen bis Monate hin.
Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die zelluläre Dynamik nach akuten Verletzungen oder während des pathologischen Krankheitsverlaufs zu untersuchen. Einzelne transgene CX3CR1GFP/+-Mäuse wurden verwendet, um Mikroglia in Verbindung mit intraperitonealen Injektionen von Rhodamine B zu folgen, um die Vaskulatur vor (Daten nicht gezeigt) und nach schweren Anfällen, die durch Kainsäure induziert wurden (Abbildung 3). Nach Anfällen wird die Gefäßbettstruktur ohne unverhafter Störungen erhalten (Abbildung 3a). Jedoch, das mikrogliaale Zellnetz und Positionallandschaft ist vorübergehend verändert (einige Zellen sind "gewonnen" und andere sind "verloren" im Sichtfeld) mit größeren Veränderungen innerhalb 24-48 h der Anfälle, die wieder normal um 72 h(Abbildung 3b) wie wir zuvor berichtet32.
Schließlich kann dieser Ansatz auch verwendet werden, um Zell-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen oder die Dynamik zwischen neuronalen Zelltypen zu vergleichen. Doppeltransgene CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ Mäuse wurden verwendet, um Mikroglia und NG2+ Zellen in vivo zu verfolgen. Ohne Kennzeichnung der Vaskulatur können Mikroglia- und NG2-Zellen identifiziert werden (Abbildung 4a). NG2 ist ein Proteoglykan, der sowohl gefäßassoziierte Pericyte als auch Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (OPCs)33,34beschriftet. Pericyten haben in der Regel längliche Prozesse, die entlang der Gefäßwand folgen (vermutlich identifiziert mit Pfeilspitzen in Abbildung 4a) und OPCs zeigen in der Regel größere Zellkörper, die sich im Gehirnparenchym abseits der Vaskulatur befinden (vermutlich mit Pfeilen in Abbildung 4aidentifiziert). Um Pericytes und OPCs angemessen zu unterscheiden, ist die Vaskulatur mit Rhodamine B gekennzeichnet. Die hellere Blütenpracht von NG2+-vessel assoziierten Zellen (Pericyten, Pfeilspitzen) kann von der schwächeren Blütenfloreszenz der luminalen Rhodalin trotz ähnlicher Anregung durch zwei Photonenbildgebung unterschieden werden (Abbildung 4b,c). Die tägliche Bildgebung zeigt, dass Pericyte stabil positioniert sind, während OPCs (Sternchen in Abbildung 4b)und Mikroglia (Kreise in Abbildung 4b) dynamisch mit früheren Berichten32,35,36übereinstimmen.
Abbildung 1: Tägliche Abbildung von Mikroglia mit feiner Kartierung mit neuronalen Dendriten in doppeltransgenen CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-Mäusen. (a) Repräsentatives Zwei-Photonen-Bild von Mikroglia (grün) und Dendriten (rot) von einer doppeltransgenen CX3CR1GFP/+:Thy1YFP-Maus. (b-c), Tägliche Bilder von geschachtelten Regionen in (a) mit wiederholt abgebildeten Dendriten (Pfeile in b) und Dendriten mit Mikroglia (c). Während dendritische Strukturen positionell stabil waren, wurden einige Mikroglia serviert, um von ihrer ursprünglichen Position in den folgenden Tagen zu translozieren. Solche Zellen wurden mit einer Zahl (1, 2 oder 3) identifiziert. Am Vortag wurde ihre Position mit einem weißen Sternchen und an einem darauffolgenden Tag mit einem gelben Sternchen notiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Langfristige wöchentliche Bildgebung von Mikroglia bei CX3CR1GFP/+ Mäusen für mehrere Monate. (a-h), Repräsentative Zwei-Photonen-Bilder von Mikroglia (grün) von einer CX3CR1GFP/+ Maus während der wiederholten Bildgebung mit akut beschrifteter Vaskulatur (rot, Rhodamine, 2 mg/ml, i.p.) als grobes Wahrzeichen, um das mikrogliale Netzwerk bis zu 8 Wochen lang zu verfolgen. Die Vaskulatur war während der Bildgebungszeit strukturell stabil. Drei kleine Regionen mit der Vaskulatur (gestrichelte Kreise) wurden hervorgehoben, um die Bewegung von mikrogliaalen Somatainn in (obere zwei gestrichelte Kreise) oder aus (unterer Kreis) dieser Regionen anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Langfristige tägliche Bildgebung von Mikroglia bei CX3CR1GFP/+ Mäusen nach Anfällen. (a-b), Repräsentative Zwei-Photonen-Bilder bei der täglichen Bildgebung des gleichen Sichtfeldes einer bestimmten Hirnregion mit Mikroglia (grün) und akuter Kennzeichnung der Vaskulatur (rot, Rhodamine, 2 mg/ml, i.p.). Die Bildgebung beginnt nach der Induktion schwerer Anfälle mit einem Chemokonvulsivat, Kainsäure. Die Gefäßstruktur wurde beibehalten, da einzelne Gefäßsegmente (Pfeile) im Laufe der Zeit identifiziert werden können (a). Allerdings wurde die mikrogliaale Netzwerkdynamik in den ersten beiden Tagen nach den Anfällen erhöht und kehrt bis zum dritten Tag wieder auf ein normales Niveau zurück (b). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Tägliche Bildgebung von Mikroglia und NG2+ Zellen in CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ Mäuse. (a) Ein repräsentatives Zwei-Photonen-Bild von Mikroglia (grün) und NG2+ Zellen (rot) in vivo. Die nicht beschriftete Vaskulatur unterscheidet nicht NG2-Zellen (Perizyten, vermutlich mit Pfeilspitzen identifiziert) und NG2-Zellen, die nicht mit der Vaskulatur in Verbindung stehen (Oligodendrozyten-Vorläuferzellen oder OPCs, vermutlich mit Pfeilen identifiziert). (b) Repräsentative Zwei-Photonen-Bilder von Mikroglia (grün) und NG2+ Zellen (rot) in aufeinander folgenden Tagen der Bildgebung mit der Vaskulatur mit Rhodamine beschriftet. Pericytes (Pfeilspitzen) sind stationär, während OPCs dynamisch sind (weiße bis gelbe Sternchen). Mikroglia sind auch dynamisch (Kreise: gestrichelte Kreise stellen eine Position ohne Mikroglia dar und gefüllte Kreise stellen eine Position mit einer entsprechenden Mikroglia dar). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das Aufkommen der in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung hat Möglichkeiten eröffnet, die Fülle von zellulären Interaktionen und Dynamiken zu erforschen, die im gesunden Gehirn auftreten. Erste Studien konzentrierten sich auf die Verwendung des offenen Schädel-Craniotomie-Ansatzes zur Bildneuronaldendriten durch akute und chronische Bildgebung37,38. Dies kann auch verwendet werden, um neuroimmune Wechselwirkungen im Gehirn zu klären. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur zuverlässigen Abbildung fluoreszierender Zellen (insbesondere Mikroglia, der ansässigen Immunzelle des Gehirns) für längere Zeit kurz- oder langfristig. Die Verwendung von farbstoffmarkierten Gefäß- und/oder fluoreszierend getaggten Dendriten ist für grobe oder feine Kartierung der Voninteresseen reichen Hirnregionen detailliert, um eine wiederholte, zuverlässige Abbildung von Zellen zu ermöglichen. Obwohl die Thy1YFP-Linie für die Verwendung für feine Gehirnkartierung vorgeschlagen wird, könnten alternative Ansätze andere Techniken oder Mauslinien zur Kennzeichnung ausgewählter neuronaler Populationen verwenden, wie z. B. in der Utero-Elektroporation39,40, frühen postnatalen AAV-Injektionen41 oder der Verwendung von TRAP-Mäusen42. Obwohl die kortikale Bildgebung im Mittelpunkt dieser Diskussion stand, kann dieser Ansatz angepasst werden, um tiefe Hirnstrukturen langfristig sowie43zu visualisieren.
Für dieses Protokoll kann der chirurgische Eingriff an jeder Maus in 30-60 min von der Einleitung der Anästhesie bis zur Genesung von der Anästhesie abgeschlossen werden. Während der Operation wird der Schädel sorgfältig entfernt und durch ein steriles Deckglas ersetzt, das nach mindestens zwei Wochen für eine Langzeitbildgebung implantiert wird. Sterblichkeit ist extrem selten (weniger als 5%) bei Wildtypmäusen, obwohl Mäuse mit Gerinnungsproblemen, wie P2Y12R Knockout-Mäuse, eine höhere Mortalität und ein höheres Chirurgisches Versagen aufweisen. Bei solchen Mäusen können Blutungen über einen längeren Zeitraum anhalten und Mäuse können innerhalb der ersten 48 h der Kraniotomie sterben, vermutlich aufgrund von Komplikationen durch innere Blutungen. Mäuse mit implantierten Fenstern aus diesem Protokoll wurden nicht bemerkt, um irgendwelche Anzeichen einer Infektion zu zeigen und das Protokoll kann zuverlässig verwendet werden, um klare Fenster für die langfristige Bildgebung bei 50-80% der Mäuse zu erzeugen.
Alternativ zum aktuellen ansatzbereiten Ansatz der chronischen Fensterimplantation besteht der Ansatz des dünnen Schädels, um Gehirnzellen im intakten Gehirn wiederholt zu visualisieren. Mehrere Studien haben den Wert und sogar die Priorität der Wahl des dünnen Schädelansatzes über den Fensterimplantationsansatz22,23,24,25hervorgehoben. Das Versprechen dieses Ansatzes sollte nicht ignoriert werden, da er, wenn er richtig gemacht wird, mehreren wesentlichen Einschränkungen oder Nachteilen des derzeitigen Ansatzes entgegenwirkt, einschließlich der fehlenden Aktivierung von Gliazellen, des geringen Umsatzes von Stacheln, der physiologischer ist, und des Mangels an Notwendigkeit für die Verwendung von entzündungshemmenden Mitteln, die sich auch auf die Physiologie des Gehirns auswirken könnten. Bei der Auswahl eines Ansatzes für spezifische Forschungsfragen sollten diese schwerwiegenden Einschränkungen berücksichtigt werden, bevor der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz gewählt wird.
Der Reiz dieses Ansatzes ist jedoch vervierfacht. Erstens ist der Ansatz der Schädelfensterimplantation aufgrund der einfachen Beherrschung dieses Verfahrens im Vergleich zum dünnschädeligen Verfahren attraktiv. Eine angemessene Schädelverdünnung kann nicht immer von Experimentatoren gemeistert werden und kann, wenn nicht gut gemacht, zu einer Gliaaktivierung führen, die ihre Anziehungskraft einschränkt. Zweitens gibt dieser Ansatz der Schädelfensterimplantation eine starke Tiefenklarheit der Gehirnstrukturen, während das Gehirn durch ein optisch klares Fenster abgebildet wird. Das Für die Bildgebung verfügbare Fenster ist in der Regel auch viel größer als das, das im Dünnschädel-Ansatz verwendet wird und den Zugang zu einem größeren Gewebevolumen für die Analyse ermöglicht. Drittens ermöglicht dieser Ansatz, wie die Tiefenklarheit, eine gleichmäßige Klarheit durch das Fenster, da der Glasdeckelrutsch gleichmäßig dünn und klar ist. Dies erleichtert Vergleiche zwischen Sitzungen und tieren. Für die Dünne Schädeltechnik ist ein besonderes Fachwissen erforderlich, um bei wiederholten Sitzungen und zwischen Tieren gleichmäßige Klarheit über das Fenster zu schaffen. Schließlich bietet dieser Ansatz viel Flexibilität in der Häufigkeit der Bildgebung von Stunden, Tagen bis Wochen bis Monaten und sogar Jahren. Für den Ansatz des dünnen Schädels wurden maximal fünf Wiederholungen vorgeschlagen24.
Zukünftige Anwendungen dieses Ansatzes sind vielfältig. Erstens könnten Anwendungen die Aufklärung neuartiger neurogliovaskulärer Wechselwirkungen im Gehirn sowohl in der normalen Physiologie als auch in der Pathologie beinhalten. Zweitens, obwohl residente Zellen in diesem Verfahren diskutiert werden, kann der Ansatz verwendet werden, um die Dynamik und Wechselwirkungen von infiltrierenden Immunzellen zu untersuchen, wie es z.B. bei akuten Verletzungen, chronischen Hirninfektionen und/oder neurodegenerativen Erkrankungen auftritt, solange Mäuse mit den jeweiligen fluoreszierend markierten Zellen zur Verfügung stehen. Schließlich wurde dieser Ansatz hauptsächlich im Rahmen struktureller Studien an Gehirnzellen diskutiert. Mit dem Aufkommen der funktionellen Bildgebung, z.B. mit Kalzium44,45,46 oder Spannungsbildgebungstechniken47,48, kann dieser Ansatz jedoch für die funktionelle Bildgebung im Laufe der Zeit bei Gesundheit und Krankheit verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern des Eyo-Labors für die Diskussion der in diesem Manuskript vorgestellten Ideen. Wir danken Dr. Justin Rustenhoven vom Kipnis Lab der University of Virginia für das Geschenk von NG2DsRed Mäusen 33. Diese Arbeit wird durch Fördermittel des National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institute of Health to U.B.E (K22 NS104392) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
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