Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

Published: August 7, 2020 doi: 10.3791/61454
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia, 2Department of Neuroscience, University of Virginia

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

Abstract

מערכת העצבים המרכזית (CN) מוסדר על ידי הגומלין מורכבים של הנוירואליות, glial, סטרומה, ובתאי כלי דם המאפשרים את תפקידה התקין. למרות שלומדים תאים אלה בבידוד בחוץ-גופית או ביחד לשעבר vivo מספק מידע פיזיולוגי שימושי; תכונות בולטות של פיזיולוגיה התא העצבי יהיה לפספס הקשרים כאלה. לכן, יש צורך ללמוד תאים עצביים הילידים שלהם בסביבה vivo. הפרוטוקול מפורט כאן מתאר חוזר ונשנה ב vivo שני פוטון הדמיה של תאים עצביים בקליפת מכרסם ככלי כדי להמחיש וללמוד תאים ספציפיים על פני תקופות ממושכות של זמן משעות לחודשים. אנו מתארים בפרוטרוט את השימוש במוח יציב בצורה גסה ובאופן מחוספס כמפה גס או מתויג הדנדריטים הדנדטים כמפה יפה של אזורי המוח הנבחרים של עניין. באמצעות מפות אלה כמפתח חזותי, אנו מראים כיצד התאים העצביים יכול להיות מועבר בדיוק עבור חוזרות ונשנות של vivo הדמיה. באמצעות דוגמאות של הדמיה vivo של מיקרוגליה מתויג, נוירונים, ו NG2+ תאים, פרוטוקול זה מדגים את היכולת של טכניקה זו כדי לאפשר הדמיה חוזרת של דינמיקה הסלולר באותו מיקום המוח על פני תקופות זמן ממושכות, כי יכול לסייע עוד יותר בהבנת התגובות מבניים ופונקציונלי של תאים אלה בפיזיולוגיה נורמלית או לאחר עלבונות פתולוגיים. במידת הצורך, גישה זו יכולה להיות משולב הדמיה תפקודית של תאים עצביים, למשל, עם הדמיה סידן. גישה זו היא במיוחד טכניקה רבת עוצמה כדי להמחיש את האינטראקציה הפיזית בין סוגי תאים שונים של ה-CN ב vivo כאשר מודלים של עכבר גנטי או צבעים ספציפיים עם תגי פלורסנט ברורים כדי לתייג את תאי העניין זמינים.

Introduction

מערכת העצבים המרכזית (CN) נשלטת על ידי הגומלין המורכבים של אינטראקציות בין סוגי תאים שונים הכוללים נוירונים, גליה ותאים המשויכים לספינה. באופן מסורתי, התאים העצביים נחקרו בבידוד, שיתוף תרבותי1,2,3,4,5 (בתוך מבחנה) או ברקמת מוח מחפירה (ex vivo)6,7,8,9, 10 ההקשרים10 . עם זאת, יש צורך להבין עוד התנהגות התא העצבי ואינטראקציות בסביבה הטבעית של המוח שלם בvivo. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה למפות באזורים vivo מעניינים ולשחזר בדיוק את האזורים האלה בהפעלות הדמיה עתידיות כדי לעקוב אחר האינטראקציות המורכבות בין סוגי תאי ה-CN השונים בפרקי זמן ארוכים.

התפתחות בגישות הדמיה vivo סיפקה רווחים משמעותיים עבור הבנה נכונה של תפקוד עצבי11,12,13,14,15. באופן ספציפי, גישות אלה מספקות מספר יתרונות על פני המסורתית בגישות מחוץ לvivo ולשעבר. ראשית, במערכות הדמיה vivo יש מבחינה פיזיולוגית רכיבים סלולריים ורקמות כגון ואצלב עם הרפרטואר המלא של אינטראקציות סלולריות כדי לספק הבנה מלאה של הפיזיולוגיה של הרשת העצבית. שנית, ממצאים אחרונים מראים כי כאשר הוסרו מן הסביבה הטבעית שלהם, תאים עצביים מסוימים (כגון microglia) לאבד תכונות חשובות של זהותם ולכן פיזיולוגיה16,17 אשר ניתן לשמור בvivo בהגדרה. שלישית, במערכות הדמיה vivo לספק את ההזדמנות לחקירות האורך יציבה של שבועות עד חודשים כדי ללמוד אינטראקציות הסלולר של ה-CN. לבסוף, בהינתן הראיות ההולכות וגדלות עבור תרומות ממערכת החיסון ההיקפית18,19 ו-microbiome20,21 ב הנוירופיזיולוגיה, ב vivo מערכות לספק פלטפורמה לחקור תרומות כאלה ואפקטים על תאי הבסיס. לפיכך, גישות העושות שימוש אורכי בהדמיה הvivo לחקר הפיזיולוגיה החיסונית והאינטראקציות של מדינות בריאות, פצועים ומצבים נגועים הם תוספת משלימה מאוד לגישות המסורתיות.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים גישה מהימנה לתמונה סוגי תאים שונים במוח כולל microglia, נוירונים ו NG2+ תאים כדוגמאות. שתי גישות להמחיש את תאי העצבים בvivo פותחו: גישת הגולגולת הדקה והגולגולת הפתוחה עם גישה לחלון הגולגולת. למרות הגישות הגולגולת דיללו נמצאים בשימוש והם העדיפו כי הם להתגבר על כמה חסרונות של גישה הגולגולת הפתוחה כגון הפעלת התא גליה, גבוה יותר מאשר הדינמיקה של עמוד השדרה והשימוש של סוכנים אנטי דלקתיות22,23,24,25, הגולגולת דיללו גישות גם להראות כמה חסרונות קריטיים. ראשון, ההליך דליל הוא הליך עדין מאוד, כי חוקרים רבים למצוא קשה למושלם במיוחד כאשר מחדש דליל הוא הכרחי. זה המקרה כי זה לעתים קרובות קשה לניסויים כדי לוודא כי יש להם לדבר את הגולגולת לעומק ~ 20 יקרומטר. שנית, עבור השוואות נאותה בין עכברים, דליל צריך להיות זהה מגוון של הצלחות דליל בין הפעלות הדמיה או עכברים יכול לסבך ויזואליזציה של מבנים עצביים. שלישית, כאשר מועסק עבור הדמיה האורך, בעלי חיים עם גולגולות דיללו ניתן להשתמש רק עבור מספר מוגבל של הפעלות כאשר מחדש דליל של הגולגולת מועסק. בנוסף, מאז חלק רקמת העצם עדיין נשאר, בהירות בעומק של הדמיה יכול להיות נפרץ מפני גישה הגולגולת דיללו המאפשר ויזואליזציה גדולה של שטחי יותר, אבל לא כמו עם אזורים עמוקים יותר. לאור זה, מבנים במוח עמוק יותר כגון ההיפוקמפוס, לא ניתן לבצע התמונה בהצלחה עם גישה הגולגולת דיללו. שיקולים אלה מעלים את הצורך בגישות חלופיות ומשלימות העלולות להתגבר על החששות הללו.

חלופה גישה הגולגולת דיללו, הגישה הפתוחה הגולגולת החלון משתמשת בהליך שבו הגולגולת מוחלף עם שמיכות זכוכית ברורה אופטית. הדבר מאפשר מספר קרוב-בלתי מוגבל של הפעלות דימות. יתר על כן, בהתחשב החלפת הגולגולת עם שמיכות זכוכית, שיטה זו מאפשרת חלון צפייה ברור של כדוריות המוח מתויג fluorescently לתקופות נרחבות של פעמים משעות עד חודשים, ולכן, יכול להיות מועסק כדי ללמוד פעילות תאים ואינטראקציות הרלוונטיות לפיזיולוגיה, הזדקנות פתולוגיה.

באופן כללי, אנו פירוט צעדים שניתן לעקוב אחר לעשות השתל חלונות גולגולת כרונית באמצעות פתיחת גולגולת סטריאוטקאית המאפשרת הדמיה vivo של אזורי המוח של עניין. כמו כן נתאר כיצד המוח היציב בצורה גסה ובעל הדנדריטים המסומנים בעזרת הדנדטים יכולים לשמש להפקת מפה מחוספס או משובח, בהתאמה לאזורי המוח של העניין. גישה זו יכולה לשמש להדמיה חוזרת על פני מספר מפגשים. החשיבות של טכניקה זו, לפיכך, טמונה ביכולתה לדמות את השינויים לטווח הארוך או הקיפאון במרכיבי המוח, כולל ההסדר, המבנה והאינטראקציות של סוגי הסלולר השונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השלבים מוגדרים בהתאם להנחיות שנקבעו ואושרו על-ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת וירג.

1. הכנת העכבר על השתלת חלון הגולגולת

הערה: קווי העכבר הטרנסגניים שונים עם תגי פלורלי מתאימים להדמיה.

  1. השתמש CX3CR1gfp/+ עכברים26 כדי להמחיש מיקרוגלייה ב vivo. בדרך כלל, נוער למבוגר צעיר 4 עד 10 שבועות עכברים בן שוקל 17-25 g משמשים.
    הערה: למרות שגישה זו אפילו מתאימה לעכברים שטרם הוקעו, הצורך להחזיר את העכברים לכלוב שלהם עם אימם לאכילה, עלול לסבך את ההחלמה אם האם לא לטפל הולם בגורים לאחר הניתוח. לכן, השימוש בעכברים שלאחר הגמילה מומלץ.
  2. השתמש בעכבר באמצעות isofלבנה (5% זורם חמצן עבור אינדוקציה 1 דקות) בחדר הרדמה. בדוק כי העכבר אינו מראה שום תנועה או התגובות מתעוות על הבוהן ו/או pinches הזנב. להוציא את העכבר מהחדר ובאוויר הפתוח לגלח ביסודיות את השיער על הראש בין האוזניים מפני רמת העין לחלק העליון של אזור הצוואר באמצעות קוצץ שיער.
    הערה: הריכוז של isofלאנה היה תלוי בגודל של חדר האינדוקציה. לכן, עבור תאים קטנים יותר, 3-4% isofלהלנה יכול לשמש ביעילות לגרום להרדמה בעוד התאים הגדולים ידרוש עד 5%.
  3. הזיזו את העכבר לתוך מיכל הניתוח סטריאוטקטיקה להרדמה (1.5-2% עבור תחזוקה לניתוח), ייצוב ראשו באמצעות ברים האוזן, ולשמור על העכבר על משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף חם.
  4. שימון שתי העיניים עם משחה העין. הכנס 100 μL של 0.25% bupivicaine (כדי לספק כאבים מקומיים לעכבר כי יהיה האחרון 8-12 h) ו100 μL של 4 מ"ג/mL dexamethone (כדי להפחית את הדלקת שעלולה לנבוע הליך הניתוח) תת-עורי באתר החתך. אפשר לעכבר לשבת לפחות 5 דקות לפני המעבר לשלב הבא.
  5. נקה את הראש המגולח עם שלושה מטליות לסירוגין של בטאדין ו 70% אלכוהול. הפוך את חתך הקרקפת באמצע קו באמצעות להב או מספריים כירורגיים המשתרעת מאחורי אזור הגולגולת בין האוזניים לאזור הקדמי בין העיניים. העור הנותר נחתך. כדי לחשוף את הגולגולת
  6. נקה את רקמת החיבור הממוקמת בין הקרקפת לבין הגולגולת הבסיסית עם 3% חמצן מימן (H2O2) ולהתאים את אזור המוח כדי להיות בתמונה עם קואורדינטות סטריאוטקטיקה.
    הערה: יש לעתים קרובות קצת דימום (שלב 1.5) מן החתך על פני הגולגולת. דימום זה בדרך כלל פותר על ידי עצמו בתוך 3-5 דקות.. ניקוי עם מי חמצן עוזר הטיפול הקודם bupi, (שלב 1.4) הוא ציין גם להגביל את כמות הדימום בזמן הזה.

2. עכבר הגולגולת ניתוח השרשה

  1. מקדחה פתיחה מעגלית ~ 4 מ"מ לתוך הגולגולת באמצעות סיבית מקדחה שיניים (0.7 מ"מ בקוטר טיפ) ובזהירות להסיר את החלק הזה של הגולגולת באמצעות מלקחיים מחודדים. לדימות הקליפה הסוחושית של העכברים בני 6-8 שבועות, לאתר את מרכז הפיום הגולגולת ב-2.5 האחורי ו ± 2.0 לרוחב לברגמה. במהלך קידוח, באופן קבוע להרטיב את הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילי כותנה כדי לקרר את המוח, ניקוי פסולת העצם לרכך את עצם הגולגולת להסרת בסופו של דבר.
    הערה: הקואורדינטות לפתיחת הגולגולת ישתנו בהתאם לאזור העניין ולגיל העכברים.
  2. לאחר הסרת הגולגולת, בזהירות מקום coverglass קטן (גודל #0 ב 0.1 ± 0.02 מ"מ עובי) לחלח עם תמיסת מלח בפתיחת הגולגולת. יבש מלוחים עודפים באמצעות מחיקה סטרילית.
  3. שימוש במוליך מחודד (כגון טיפ פיפטה או הקצה המחודד של מקל שבור כותנה עץ), למרוח דבק ציאנואקרילי מסביב לחלון ולאפשר לו להצמיד למוח ולגולגולת. החל את הדבק פריימר על שאר הגולגולת ולרפא אותו עם אור ריפוי עבור 20-40 s. הכינו היטב מסביב לחלון עם הדבק הסופי ולרפא עם אור ריפוי עבור 20-40 s.
  4. הדבק צלחת ראש קטנה על הגולגולת על האונה הצלעות הימנית של פתיחת הגולגולת תחילה עם הדבק פריימר כמו פריימר ולאחר מכן עם הדבק הסופי. לרפא את שניהם עם אור ריפוי עבור 20-40 s כל אחד.
    הערה: אין צורך בתפרים אם הגולגולת מכוסה לחלוטין בדבק במהלך הליך זה.

3. טיפול לאחר הניתוח

  1. לאפשר לעכבר להתעורר בהעדר הרדמה (שחזור שנעשה על משטח חימום מתקצר את זמן ההחלמה) ולהחזיר אותו לכלוב הבית שלו פעם הערה לגמרי. הכנס מינון תת עורי אחד של בופרנורפין SR (0.5 מ"ג/ק"ג) כשככי כאבים שלאחר הניתוח מספיקה עבור 72 h.
  2. כדי להקל על התאוששות בריאה מהניתוח, לספק לעכבר מזון רך נוסף, אשר יכול להיות בצורה של אוכל אחיד רגיל במים כדי לרכך את האוכל או המזון בצורה של ג'ל.
    הערה: הוראה חד פעמי של המזון הרך מיד לאחר הניתוח מספיקה.
  3. לפקח על העכבר מדי יום לבריאות התאוששות נכונה עבור 72 הראשון של הליך הניתוח. לאחר מכן, לבצע הדמיה מוקדם יותר 2 שבועות מניתוח השרשה חלון.
    הערה: אם נעשה טוב, עכברים לשחזר היטב מראה התנהגויות אמבולטורי רגיל, מספיק חקר כלוב, לחות טובה, עלייה במשקל יציבה אינטראקציה נרחבת עם עכברים אחרים בכלוב ופריטים אחרים בכלוב. עכברים המראים עייפות, התייבשות ויותר מ 10% אובדן משקל לאחר הניתוח מורדמים והוסרו מן המחקר.

4. שני-פוטון מיפוי המוח עבור הדמיה ראשונית

  1. השתיל את העכבר (Isofלורה, 5% אינדוקציה ו 1.5% תחזוקה). ייצוב הראש באמצעות ברגים על מנת לטעון את הלוחית העליונה על מיקרוסקופ שני פוטון, להיות מתוחזק על צלחת חימום ב 35 ° c. הכנס intraperitoneally 100 μL של צבע כלי דם כגון Rhodamine B (2 מ"ג/mL).
    הערה: ניתן לעשות הדמיה גם בעכברים ערים ללא הרדמה. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה עולה כי הרדמה משפיע על הדינמיקה microglial מעקב27,28,29 וקיבוע ראש עבור שני הדמיה פוטון בעכברים ער מגביר את הלחץ גם במהלך הדמיה כרונית לפחות 25 ימים (ראה juצ'כיה ואח ', 2020)30.
  2. לנקות את פני השטח של חלון הגולגולת בעדינות באמצעות ספוגית כותנה המיטה ב 70% אתנול. לשים כמה טיפות מים או תמיסת מלח על החלון הגולגולת ולהקטין את העדשה האובייקטיבית לתוך הפתרון מאז המטרה היא עדשה טבילה.
  3. יד לצייר מפה גסה כדי לציין את מוקדי העניין של כלי הדם העיקריים במחברת מעבדה תוך הסתכלות דרך עינית על ידי אפיפלורנציה. השתמש בציור זה כדי לזהות את האזורים הספציפיים במהלך שני תמונות פוטון. לחילופין, צלם את כלי הדם באמצעות מצלמה הותאמה למיקרוסקופ או דרך מצלמה או טלפון מוחזקים ביד.
    הערה: תמונות ותמונות שצוירו ביד הן כדי להקל על ביקור משני האזורים הרחבים שמתחת למיקרוסקופ לפני שתי הדמיה של פוטון. . אלה לא מיפוי תמונה מדויק
  4. מתחת לשני הדמיה פוטון, לאסוף תמונות של תאי הפלוריום וכלים לפי הצורך. קח הערות זהירות עם קואורדינטות מתאימות כדי להבטיח כי האזורים המדויקים ניתן לעבור בעיון הדמיה הבאים. לאסוף מספר שדות של תצוגה הפעלה זו הדמיה ראשונית למשל לרכוש z-מחסנית תמונות כל 1-2 יקרומטר באמצעות נפח של רקמות.
    הערה: במהלך איסוף תמונות על-ידי שני פוטון, נקודות הציון של כלי הדם משמשות למיפוי גס. אם יש צורך במיפוי משובח, משתמשים בדנדריטים בעלי תווית YFP מ-Thy1-YFP31 עכברים.
    1. השתמש בפרמטרים המומלצים הבאים לדימות: אורך גל של 880-900 ננומטר הוא אופטימלי; עבור GFP ו/או dsRed/Rhodamine, a 565 nm דיקרואיק מראה עם 525/50 nm (ערוץ ירוק) ו 620/60 nm (ערוץ אדום) מסנני פליטה משמשים; עבור הפרדת GFP ו-YFP, 509 nm דיקרואיק מראה עם 500/15 ו 537/26 ננומטר מסנני פליטה משמשים; הכוח במוח מתוחזק ב -25 mW או למטה; רזולוציית התמונה היא 1024 x 1024 פיקסלים, השדה של תצוגה נלקח עם מטרה 25X 0.9 NA בפקטור 1.5 X זום 295.24 x 295.24 μm.
  5. בסוף ההדמיה, לקחת את העכבר מהבמה, לאפשר לו להתעורר מהרדמה ולחזור לכלוב הבית שלו עד למפגש הדמיה עתידית.

5. שני-פוטון דימות והדמיה מחדש

  1. להמשך הפעלות הדמיה בעתיד, אשר יכול להיות בכל מקום החל מספר שעות לחודשים לאחר הפעלת ההדמיה הראשונית, מורדם העכבר (Isofלאנה, 5% אינדוקציה ו 1.5% תחזוקה), הר על מיקרוסקופ שני פוטון, לשמור על צלחת חימום מחדש להזריק 100 μl צבע כלי הדם כגון Rhodamine B (
  2. פתחו את התמונות שהושגו קודם לכן ב-ImageJ, והשתמשו בתמונות אלה וכן בהערות מההפעלה הקודמת, מזהים את אזורי התמונה הקודמים ומשחזרים אותם בקפידה.
  3. חזור על פעולה זו כל עוד חלון ההדמיה ברור או חיוני למידת המחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להמחיש את הדינמיקה microglial ב vivo, כפול טרנסגניים CX3CR1gfp/+: עכברים Thy1yfp שימשו. הקו Thy1-YFP H משמש לעומת קו Thy1-GFP M כדי למנוע חפיפה של מיקרוגליה (GFP) ונוירונים (YFP). גישות חלופיות יכול להשתמש בשורה כתב שבו מיקרוגלייה מתויגים עם למשל, tdtomato ולאחר מכן את הקו Thy1-gfp M ניתן להשתמש. חיסרון של קו H הוא כי תוויות YFP הרבה נוירונים והתווית עולה עם הגדלת גיל (התבוננות אישית). הקו M מציג תיוג דליל של נוירונים. בין 2 – 4 שבועות של ניתוח השרשה חלון, דינמיקה microglial יכול להיות ואחריו הדמיה חוזרת. כלי דם גדולים משמשים להתאמת אזורים מסוימים ולאחר מכן הדנדריטים המסומנים בתווית YFP משמשים למיפוי עדין של אזורי המוח. בעזרת גישה זו, ניתן להשתמש בדנדריטים ספציפיים כנקודות ציון יציבות עבור המיפוי המשובח של אזורי המוח (איור 1, חיצים באיור 1b). בעוד הדנדריטים הם יציבים, חלק המעבר מיקרוגלייה מדי יום (איור 1c).

בנוסף, גישה זו מספיקה לדימות האורך שבועי בטווח הארוך. כך, CX3CR1 gfp בודד הטרנסגניים/+ עכברים שימשו כדי לעקוב מיקרוגלייה ביחד עם זריקות הצפק הפנימי של rhodamine B כדי לתייג את יום במהלך כל הפעלה הדמיה של עד 8 שבועות (איור 2). לחילופין, כפי שמתואר לעיל, Thy1 עכברים ניתן להשתמש עבור מיפוי בסדר האורך. כאשר מבוצעת הדמיה שבועית, ואצלב הוא ציין להיות קבוע באופן בלתי נשכח, אבל מיקרוגלייה ניתן לראות להיות דינמי כפי שמוצג בשלושה אזורים ספציפיים של עניין (ROI, מקווקו עיגולים) באיור 2. ב roi העליון, מיקרוגלייה להתחיל להיכנס roi על ידי השבוע 4 של הדמיה ולהמשיךבשבוע 8 של הדמיה.th במהלך התשואה האמצעית עם כלי קיבול, תא microglial מופיע סביב הספינה התחתונה בשבוע 3, הוא איבדבשבוע 6 ועודth מיקרוגלייה מופיע על כלי הדם העליון בשבועה -7 והוא נשמרלשבוע 8 . לבסוף, ב ROI התחתון, תא microglial שנשמר במהלךהשבוע 6 ואיבד בשבועות 7 ו 8 של הדמיה. תוצאות אלה מצביעות על שינויים דינאמיים ברשת המיקרוגליאל במשך שבועות עד חודשים.

גישה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור את הדינמיקה התאית בעקבות פציעה חריפה או במהלך התקדמות המחלה פתולוגית. בודד טרנסגניים CX3CR1gfp/+ עכברים שימשו כדי לעקוב מיקרוגלייה ביחד עם זריקות הצפק של rhodamine B כדי לתייג את יום לפני (נתונים לא מוצגים) ובעקבות התקפים חמורים הנגרמת על ידי חומצה kainic (איור 3). בעקבות התקפים, מבנה מיטה כלי הדם נשמרת ללא רטבאליות גלויה (איור 3a). עם זאת, הרשת הסלולרית microglial ונוף הסביבה הוא שונה באופן משני (תאים מסוימים הם "צבר" ואחרים "אבודים" בשדה התצוגה) עם שינויים גדולים יותר בתוך 24-48 h של התקפים כי הוא שוחזר נורמלי על ידי 72 h (איור 3b) כפי שדווחו בעבר32.

לבסוף, גישה זו יכולה לשמש גם לחקירת אינטראקציות של תאי תא או השוואת דינמיקה בין סוגי תאים עצביים. כפול טרנסגניים CX3CR1gfp/+: NG2dsred/+ עכברים שימשו למעקב מיקרוגלייה ו NG2+ תאים בvivo. ללא תיוג הזרע, מיקרוגלייה ו NG2 תאים ניתן לזהות (איור 4a). NG2 הוא פרוטנוספגליי כי תוויות הן כלציטים הקשורים לכלי הקיבול ו אוליגודנדרוציטים התאים הקודמי (opcs)33,34. קרום הלב בדרך כלל יש תהליכים מאורכים העוקבים לאורך הקיר כלי הדם (מזוהה באופן מבוקר עם ראשי חץ באיור 4a) ו opcs בדרך כלל להראות גופים תא גדול יותר השוכנים במוח בתוך מצכימה מתוך ואצלב (מזוהה באופן גמיש עם חיצים באיור 4a). כדי להבדיל בצורה מספקת את קרום הלב ו-OPCs, מתויג ולבלטורה באמצעות רומדיין ב. הזדקנות בהירה של NG2+-כלי התאים הקשורים (קרום הלב, ראשי חץ) ניתן להבדיל מתוך הזדקנות האור של הלומיאל למרות עירור דומה על ידי שני הדמיה פוטון (איור 4ב, ג). הדמיה יומית מראה כי קרום הלב ממוקם באופן בלתי נשכח, בעוד opcs (כוכביות באיור 4b) ו מיקרוגלייה (עיגולים באיור 4b) הם דינמיים עקבי עם הדיווחים הקודמים32,35,36.

Figure 1
איור 1: הדמיה יומית של מיקרוגלייה באמצעות מיפוי עדין עם הדנדריטים העצביים ב CX3CR1gfpכפולים באמצעות העברה כפולה/+: עכברים Thy1yfp . (א) נציג שני פוטונים של מיקרוגליה (ירוק) ו דנדטים (אדום) מ CX3CR1gfp כפולה/+: Thy1yfp העכבר. (ב-ג), תמונות יומיות של האזור הארוז ב-(א), המציגה משוב ושוב את הדנדריטים (חיצים ב-b) ודנדטים עם מיקרוגלייה (c). בעוד מבנים דנדריטים היו יציבים בצורה יציבה, כמה מיקרוגלייה היו ציין לשנות את המיקום המקורי שלהם בימים הבאים. תאים כאלה זוהו עם מספר (1, 2 או 3). ביום הקודם, מעמדו המצוין בכוכבית לבנה וביום המחרת, מעמדו המצוין בכוכבית צהובה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה לטווח ארוך שבועי של מיקרוגלייה ב CX3CR1gfp/+ עכברים במשך כמה חודשים. (a-h), הנציג two-פוטון תמונות של מיקרוגלייה (ירוק) מ CX3CR1gfp/+ עכבר במהלך הדמיה חוזרת באמצעות התווית בחריפות (אדום, rhodamine, 2 מ"ג/mL, כיתה) כנקודת ציון גסה כדי לעקוב אחר רשת microglial עבור עד 8 שבועות. הוזוקובלטורה היה יציב מבחינה מבנית בתקופת ההדמיה. שלושה אזורים קטנים עם ואצלב (עיגולים מקווקווים) היו מודגשים כדי לציין את התנועה של מיקרוגליאל somata לתוך (שני מעגלים מקווקווים העליון) או מתוך (המעגל התחתון) אזורים אלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה יומית לטווח ארוך של מיקרוגלייה ב CX3CR1gfp/+ עכברים בעקבות התקפים. (a-b), נציג שני-פוטון תמונות במהלך הדמיה יומית של אותו שדה של השקפה של אזור מוחי מסוים עם מיקרוגלייה (ירוק) ותיוג חריפה של ואצלב (אדום, rhodamine, 2 מ"ג/mL, כיתה). הדמיה מתחיל לאחר אינדוקציה של התקפים חמורים באמצעות סוכן כימועי, חומצה kainic. מבנה כלי הדם נשמר כמקטעי כלי דם נפרדים (חיצים) ניתן לזהות באמצעות זמן (א). עם זאת, הדינמיקה הרשת microglial הוגדלה במהלך היומיים הראשונים בעקבות התקפים וחוזר רמות נורמליות על ידי היום השלישי (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הדמיה יומית של מיקרוגלייה ו NG2+ תאים ב CX3CR1gfp/+: NG2dsred/+ עכברים. (א) דמות מייצגת של שני פוטונים של מיקרוגלייה (ירוק) ו NG2+ תאים (אדום) ב vivo. הכלי הבידוד שאינו מסומן מצליח להבדיל בין NG2 תאים (קרום הלב, המזוהה באופן גמיש עם ראשי חץ) ותאי NG2 שאינם משויכים לכלי הקשר (אוליגודנדרוציטים תאים מקודמי או OPCs, המזוהים באופן מבוקר עם חיצים). (ב) הנציגה שני הפוטונים של מיקרוגליה (ירוק) ו NG2+ תאים (אדום) בימים רצופים של הדמיה עם ואצלב המסומנים עם rhodamine. בעוד OPCs הם דינמיים (לבן לצהוב כוכביות). מיקרוגלייה הם גם דינאמיים (עיגולים: עיגולים מקווקווים לייצג מיקום ללא מיקרוגלייה ו מעגל מלאה מייצג מיקום עם מיקרוגלייה המקביל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הופעתו של vivo שני פוטון הדמיה פתחה הזדמנויות לחקור שפע של אינטראקציות סלולר ודינמיקה המתרחשים במוח בריא. המחקרים הראשוניים התמקדו בשימוש בגישת הגולגולת הפתוחה לגלונטיס של התמונה באמצעות דימות כרוני ואקוטי37,38. זה יכול לשמש גם כדי להבהיר אינטראקציות נוירוחיסוניות במוח. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור הדמיה אמינה של תאים מתויגים פלואורוסקופים (במיוחד microglia, התא החיסונית התושב של המוח) לתקופות ממושכות של זמן בטווח קצר או ארוך. השימוש בצבעי כלי דם ו/או פלואור מתויג באמצעות צבען מפורט עבור מיפוי מחוספס או עדין של אזורי המוח של עניין כדי לאפשר הדמיה חוזרת, אמינה של תאים. למרות קו Thy1yfp הוא הציע לשימוש עבור מיפוי מוח עדין, גישות חלופיות יכול להשתמש בטכניקות אחרות או קווי העכבר עבור תיוג בחירת אוכלוסיות עצבי כגון ברחם אלקטרופורציה39,40, המוקדמות לאחר מכן זריקות aav41 או שימוש של עכברים מלכודת42. יתר על כן, למרות הדמיה קורטיקלית היה המוקד של הדיון הזה, גישה זו יכולה להיות מותאמת להמחיש מבנים המוח העמוק לטווח ארוך כמו גם43.

עבור פרוטוקול זה, הליך הניתוח על כל עכבר ניתן להשלים ב 30-60 דקות מתחילת ההרדמה עד ההתאוששות מן ההרדמה. במהלך הניתוח, הגולגולת היא הוסר בקפידה הוחלף עם שמיכות סטרילי אשר מושתל להדמיה לטווח ארוך לאחר לפחות שבועיים. התמותה נדירה מאוד (פחות מ 5%) בעכברים מסוג wildtype, למרות עכברים עם בעיות קרישה, כגון עכברים P2Y12R, להראות תמותה גבוהה יותר כשל ניתוח. בעכברים כאלה, דימום עשוי להימשך פרקי זמן ארוכים ועכברים עלולים למות בתוך 48 h הראשון של הפתיחת הגולגולת כנראה עקב סיבוכים של דימום פנימי. עכברים עם חלונות מושתלים מפרוטוקול זה לא הבחינו כדי להראות סימנים של זיהום והפרוטוקול יכול לשמש באופן אמין כדי ליצור חלונות ברורים עבור הדמיה ארוכת טווח ב 50-80% של עכברים.

חלופה לגישה הנוכחית השרשה חלון כרונית, הגישה הגולגולת הדק קיים כדי להמחיש את תאי המוח במוח שלם שוב ושוב. מספר מחקרים הדגישו את הערך ואפילו עדיפות של בחירה של גישה הגולגולת הדק על השרשה חלון גישה22,23,24,25. ההבטחה של גישה זו לא צריך להיות מתעלמים כמו, כאשר נעשה כראוי, זה נגד פועל מספר מגבלות בולטות או חסרונות של הגישה הנוכחית כולל חוסר הפעלה של תאי גליה, מחזור נמוך של הקוצים שהוא פיזיולוגי יותר, ואת חוסר הצורך בשימוש של סוכנים אנטי דלקתיות אשר יכול גם להשפיע על הפיזיולוגיה של המוח. בבחירת גישה לשאלות מחקר ספציפיות, יש לשקול מגבלות חמורות אלה לפני בחירת הגישה המפורטת בפרוטוקול זה.

עם זאת, הערעור של גישה זו הוא ארבע לקפל. ראשית, גישה השרשה חלון הגולגולת הוא אטרקטיבי בשל קלות השליטה של הליך זה ביחס הליך הגולגולת הדק. מתאים דליל הגולגולת לא יכול תמיד להיות שולט על ידי ניסויים ואילו לא עשה היטב יכול לגרום להפעלה גליה הגבלת הערעור שלה. שנית, זו גישה השרשה חלון הגולגולת נותן בהירות עומק חזק של מבנים המוח כמו המוח הוא התמונה דרך חלון ברור בצורה אופטית. החלון הזמין להדמיה הוא גם בדרך כלל הרבה יותר גדול מאשר השתמשו בגישה הגולגולת הדק המאפשר גישה לנפח גדול יותר של רקמות לניתוח. שלישית, כמו בהירות עומק, גישה זו מאפשרת בהירות אחידה דרך החלון מאז שמיכות זכוכית הוא דק וברור. הדבר מקל על השוואות בין מפגשים ובין בעלי חיים. מומחיות מיוחדת נדרשת עבור טכניקת הגולגולת הדק כדי להבטיח אפילו בהירות על פני החלון במהלך הפעלות חוזרות ובין בעלי חיים. בסופו של דבר, גישה זו מציעה גמישות רבה בתדירות ההדמיה משעות, ועד ימים עד שבועות, חודשים ואף שנים. עבור הגישה הגולגולת הדק, מקסימום של חמש חוזר הציע24.

יישומים עתידיים של גישה זו הם רבים. ראשון, היישומים יכולים לכלול בהסבר הרומן נוירו-לווליו-וסקולריים האינטראקציות במוח בפיזיולוגיה ובפתולוגיה נורמלית. שנית, למרות התאים תושב נדונים בהליך זה, את הגישה ניתן להשתמש כדי ללמוד את הדינמיקה ואת האינטראקציות של החדירה תאים חיסוניים כפי שהוא מתרחש למשל, במהלך פציעה חריפה, זיהום המוח כרונית, ו/או מצבים נוירוניווניות כל עוד עכברים עם תאים מתויגים fluorescently בהתאמה המתאימים זמינים. לבסוף, גישה זו נדונה בעיקר בהקשר של מחקרים מבניים של תאי המוח. עם זאת, עם הופעתו של הדמיה תפקודית למשל באמצעות סידן44,45,46 או טכניקות הדמיה מתח47,48, גישה זו יכולה לשמש לדימות פונקציונלי לאורך זמן בריאות ומחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לחברי מעבדת Eyo על הדיון ברעיונות המוצגים בכתב יד זה. אנו מודים לד ר ג'סטין רוסטנבן ממעבדת קיפניס באוניברסיטת וירג במתנה של עכברים NG2Sred 33. עבודה זו נתמכת על ידי מימון מן המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ של המכון הלאומי לבריאות כדי U. B. E (K22 NS104392).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverglass (3mm) Warner Instruments 64-0726
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) Amazon https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System Dental Health Products, Inc 910860-1
Dental Drill Osada: www.osadausa.edu EXL-M40
Drill Bit Fine Science Tools #19008-07
Eye Ointment Henry Schien 1338333
iBond Total Etch (Primer glue) Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) 66040094
Rhodamine B Millipore Sigma 81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue) Top Dent (Ivoclar Vivadent) #595956
Wahl Brav Mini+ Amazon https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
  2. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  3. Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
  4. Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
  5. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
  6. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
  7. Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
  8. Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
  9. Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
  10. Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
  11. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  12. Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
  13. Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
  14. Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
  15. Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
  16. Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
  17. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  18. Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
  19. Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
  20. Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
  21. Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
  22. Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
  23. Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
  24. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  25. Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  26. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  27. Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
  28. Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
  29. Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  30. Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
  31. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  32. Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
  33. Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
  34. Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
  35. Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
  36. Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
  37. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  38. Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
  39. Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
  40. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
  41. Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
  42. Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
  43. Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
  44. Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
  45. Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
  46. Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
  47. Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
  48. Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 162 microglia נוירוחיסוני דימות שני-פוטון ואצלב דנדטים NG2 תאים
מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bisht, K., Sharma, K., Eyo, U. B.… More

Bisht, K., Sharma, K., Eyo, U. B. Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice. J. Vis. Exp. (162), e61454, doi:10.3791/61454 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter