Summary
המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.
Abstract
השיטות המוצגות כאן מכמת כמה פרמטרים של תא מדומה מונואולאן מדומה מספר תמונות ויטראז ' מרובים: הדבקה למצע כפונקציה של מספר וגודל של מיקוד מוקד, וצורה תא, מאופיין על ידי מדד צורת התא ומתארי צורה אחרים. הידקויות מיקוד היו מדמיינו על ידי כתמים פקעבלין וגבולות תא התא סומנו על ידי הצומת פלקוטין ו actin. השיטות לתרבית תאים וכתמים היו סטנדרטיים; תמונות מייצגות מטוסי מוקד יחידים; ניתוח תמונה בוצעה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה זמינה לציבור. הפרוטוקולים המוצגים משמשים כדי לכמת את מספר וגודל של הידקויות מיקוד ואת ההבדלים בפיזור הצורה התא ב monolayers, אבל הם יכולים להיות מחדש עבור כימות של גודל וצורה של כל מבנה הסלולר ברורים אחרים, כי יכול להיות מוכתם (למשל, המיטוa או גרעיני). הערכת פרמטרים אלה חשובה באפיון הכוחות הדינמיים בשכבת התא החסיד, כולל הדבקה בתאים וכיוונון actomyosin המשפיע על צורת התא.
Introduction
תאי אפיתל monolayers לפעול כקולקטיב שבו תא תא ותא הדבקה, כמו גם כוחות ומתחים והמתיחות מייצגים פרמטרים חשובים האיזון הנכון שלהם תורמת השלמות הכוללת של היחידה1,2,3. לפיכך, הערכת פרמטרים אלה מייצגת דרך ליצירת המצב הנוכחי של שכבת התא.
שתי השיטות המתוארות כאן מייצגות ניתוח דו מימדי של המונאולאיירס הקונקולני של חסיד, תאי אפיתל (במקרה זה MCF7 סרטן השד קו התאים). הניתוח מבוצע באמצעות תמונות מיקוד (Z-פרוסות בודדות) מאזורים שונים על ציר Z; אזור בסיס ליד מצע למדידות מיקוד (FA) ולאזור אפיפיורי למדידות בצורת תא. השיטות המוצגות פשוטות יחסית ודורשות טכניקות סטנדרטיות של מעבדה ותוכנות קוד פתוח. מיקרוסקופ confocal וקד מספיק עבור פרוטוקול זה, כך שניתן לבצע מבלי להעסיק TIRF מיוחדים יותר (כולל השתקפות פנימית השתקפויות פלואורסצנטית) מיקרוסקופ. לפיכך, ניתן ליישם את הפרוטוקול במסגרת מעבדה סטנדרטית יחסית. למרות שרמת הדיוק של השיטות מוגבלת, הם יכולים להבחין בין הבדלים בסיסיים בצורה מוקד ובצורת תא.
שתי השיטות המתוארות כאן כוללות את ההליכים הניסיוניים הסטנדרטיים כגון כגון תא, כתמים, דימות ממוקד וניתוח תמונה שבוצעו באמצעות ImageJ. עם זאת, ניתן להשתמש בכל תוכנה לעיבוד תמונה עם הפונקציות המתאימות. השיטות שהוצגו יכול לעקוב ולהשוות שינויים שנגרמו על ידי טיפול תרופתי או שינוי גנטי מינימלי. השגת ערכים מסוימים אינה מומלצת, בשל הדיוק המוגבל של שיטות אלה. שתי פקודות מאקרו אוטומטיות נכללו, כדי להקל על המדידות של תמונות רבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צעדי הכנה
- זריעת תאים להשגת מונאולאיירס שוטפת
- לפני הזריעה, העילו את הבארות של שקופית קאמרית של 4 בארות עם קולגן I (או רכיב ECM אחר של בחירה). עבור קולגן אני ציפוי, בצע פרוטוקול מסחרי: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html בריכוז של 8 μg/cm2.
- הזרע 400,000 תאים לאחד היטב של מגלשה 4-באר קאמרית.
- תרבות התאים עבור 24 שעות (או יותר, תלוי בנקודות הקצה הנסיוניות) לפני הצביעת, בחממה ב 37 ° c, 5% CO2. שלב זה מאפשר התבגרות של אנשי קשר תא התא והיווצרות monolayers.
- השתמשו במיקרוסקופ אופטי והפוך כדי לאמת את השטף (כ-90% נדרש) ומצב כללי של monolayers. אל תמשיך אם התאים צפים או ייראו לחוצים.
- מכתים כתמים
הערה: ניתן לוכתם בתאים באמצעות פרוטוקול של בחירה. כאן, מודלואוורנציה בוצעה כפי שתוארה בעבר4.- לניתוח הדבקה מוקד, יש להכתים את התאים באמצעות חלבון ממוקד של בחירה (בפרוטוקול זה בפקלין). עבור ניתוח צורה תא כתם עם חלבון הצומת תא תא של בחירה (בפרוטוקול זה מבטלת את החלבון הפלזמה).
- עבור ההליך, השתמש 0.5 mL של פתרונות שצוינו אלא אם צוין אחרת.
- תקן תאים ב 4% פורמלדהיד ב PBS עבור 30 דקות על הקרח.
- דגירה עם 0.1 M אמוניום כלוריד (ב PBS) עבור 10 דקות כדי להרוות את הקרינה האוטומטית.
- להוסיף 0.5% טריטון X-100 (ב PBS) עבור 30 דקות (החדירות).
- בלוק עם 5% חלב (או 1% BSA) ב-TBS-T עבור 1 h.
- דגירה עם הנוגדן העיקרי ב 4 ° צ' לילה (אנטי פקלין: ארנב, 1:250, נגד פלקולטה: ארנב, 1:400)
- דגירה עם נוגדן משני עבור 30 דקות (אלקסה Fluor 594 עז נגד ארנב, 1:500, 1:500)
- כתם עם 300 ננומטר DAPI עבור 1-5 דקות, מוגן מפני אור.
הערה: באופן אופציונלי, כתמים נוספים של אקטין עם phalloidin שערי מעלה (conc. 1:400) ניתן לבצע; phalloidin יש להוסיף באותו שלב כמו הנוגדן המשני.
- הדמיה קונפוקלית
- קחו תמונות של Z-פרוסות יחיד בעזרת מיקרוסקופ קונמוקד (למשל, Zeiss LSM800).
הערה: מכתים אקטין אופציונלי עשוי לסייע בהערכת מישור המוקד המתאים. מכתים את הקליפת הקורטיקלית נמצא באזור פסגה בעוד סיבי מתח אקטין נמצאים באזור הבסיס, ליד המצע, כפי שמודגם באיור 1. - דימות ממוקד
- בחר Z-פרוסות עבור ניתוח הדבקה מוקד מאזור הבסיס, קרוב למצע.
- השתמש במטרה עם הצמצם המספרי הגבוה ביותר הזמין (עדיף 63 x N.A.: 1.4).
הערה: צורת הפא היא מאוד ספציפית ומוכרת בקלות. לפיכך, מומלץ להפעיל את הסריקה ממישור מוקד מתחת לתאים ולאחר מכן לסרוק אותם לאט לעברם, עד שניתן יהיה לראות בבירור. ניתוח תמונה יהיה מדויק יותר מאשר שדות קטנים יותר של חזון, אשר נוטים להיות אחיד יותר, אבל זה מרמז כי פחות תאים יחושבו בשדה אחד של השקפה.
- יצירת קשר עם תא תאים
- השתמש ביעד 40x או 63 x.
- בחרו ערוצים לצביעת גרעיני וצביעת החלבון המועדף על הצומת.
- בחר Z-פרוסות עבור ניתוח צורת תא מהאזור הרשמי של ה-monolayers.
- צלם תמונות עבור לפחות 3 שדות ראייה שונים (200-400 תאים).
- קחו תמונות של Z-פרוסות יחיד בעזרת מיקרוסקופ קונמוקד (למשל, Zeiss LSM800).
2. ניתוח תמונה
הערה: פקודות מאקרו שסופקו פועלות באופן אופטימלי בגירסת ImageJ גירסה 1.50 f או חדשה יותר. השתמש לצורך כימות בלבד של תמונות עם יחס אות לרעש גבוה וללא פיקסלים מתחת או רוויים. השיטות המתוארות כוללות שלבים המחייבים התאמת פרמטרים ידניים. לפיכך, מומלץ להגדיר ניסוי עיוור/עיוור להתנסות. להצפנת שמות של קובצי תמונה, ניתן להשתמש בתוספים של ImageJ כגון "כלי ניתוח עיוור" (זמין ב: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools).
- ניתוח הדבקה מוקד
הערה: קבצי הקלט המומלצים עבור השיטות הבאות הם: תמונות של שהוצג בגווני אפור של 8 סיביות שנשמרו בתבנית. tiff.- פתח תמונה באמצעות ImageJ.
- קביעת קנה המידה של תמונה לפיקסלים (לנתח | קביעת קנה מידה; הסר את קנה המידה ובדוק את האפשרות הכללית ).
- כלול את שם הקובץ ואת האזור של ROI באפשרויות מדידה (נתח | קביעת מדידות...); אזור בדוק והצג אפשרויות תווית .
- הפחת רקע (תהליך | הפחת רקע; להגדיר פרמטר מתגלגל רדיוס הכדור כדי 50 פיקסלים; בדוק את האפשרות paraboloid הזזה ). במקרה של תמונות RGB צבעוניות מדומה: פיצול ערוצי RGB, להשאיר את הערוץ עם פתוח, לסגור את הערוצים (תמונה | צבע | ערוצים מפוצלים).
- קבע את האזור של אזור הריבית הקטן ביותר (ROI). שימוש בבחירות ביד חופשית או במצולע מתווה את המוקד הקטן ביותר ומודד את האזור שלו (לנתח | מידה). חזור על שלב זה עבור ROIs שונים (מהר) מתוך כמה תמונות שנבחרו באופן אקראי (עבור סך של 20 ROIs). חשב ושמור את הממוצע של תוצאות שהתקבלו.
הערה: שלב זה נדרש רק כאשר קבוצה נתונה של תמונות מנותח בפעם הראשונה (קו תא ספציפי, ציפוי שקופיות עם רכיבי מטריצה מסוימים מפרט, תנאי תרבות שונים). - המר תמונה לבינארית באמצעות אחת מהשיטות הבאות:
- הגדר את הסף הגלובלי (תמונה | כוונן | מתחת לפני השדה בדוק ברירת מחדל, B &Amp; W ואפשרויות רקע כהה , התאם את הסף באופן ידני או הגדר אותה באופן אוטומטי).
- הגדר את הסף המקומי (תמונה | כוונן | סף מקומי אוטומטי ...; קבע שיטה לפאנקאר ולבדוק אובייקטים לבנים על האפשרות רקע שחור . לאחר מכן, הפוך את התמונה (ערוך | היפוך).
- למדוד את המספר ואת האזור של ROIs. בחר באפשרות ' נתח ' | לנתח חלקיקים; לבדוק יחידות פיקסלים, להציג תוצאות, לנקות את התוצאות ולסכם אפשרויות, להגדיר פרמטר גודל, כגבול נמוך להשתמש בממוצע של rois הקטן ביותר משלב 2.1.5. ניתן להגדיר את הגבול העליון כ-25% מאזור תאים אופייני.
- העברת נתונים (הכוללת את שם התמונה, מספר השטח הכולל והממוצע של האזור המהיר בהתאמה, מונה, אזור כולל, גודל ממוצע) מחלון הסיכום לתוכנית ניהול הנתונים של בחירה.
- קבעו את מספר התאים לכל תמונה באמצעות ספירת גרעינים מוכתמים DAPI. הספירה יכולה להיעשות באופן ידני (תוספים | לנתח את | מונה תאים) או כפרוטוקולים זמינים כגון: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
- לחילופין, כדי להקל על הספירה, השתמש במאקרו המצורף.
- העבר קובץ. ijm עם המאקרו לתוספים או לתיקיית פקודות מאקרו הממוקמים בתיקיות קבצי המקור של ImageJ.
- קבע אזור של ההחזר הקטן ביותר כמתואר בשלב 2.1.4.
- פתח קובץ מאקרו (תוספים | פקודות מאקרו | ערוך...).
- לפני הפעלת המאקרו, קבע את הערך של שלושה משתנים: ערך המילוי של area_of_the_smallest_region_of_interest עם מספר שנרכש במהלך שלב 2.1.4. הגדר ערך threshold_type לידני או לאוטומטי.
- שמור שינויים (המאקרו צריך להיות מוכן לשימוש).
- התקשר למאקרו מהחלונית ImageJ או צור קיצור דרך אליו. המאקרו מתחיל בחלון הדו הרגיל של הפתיחה . בחר את התמונה שתעובד.
הערה: במקרה של התאמת הסף ידנית, האישור הידני של ערך הסף יידרש (הימנע מקבלת שינויים באמצעות לחצן החל בחלון הדו של הסף , השתמש במקום זאת בחלון הדו של הפעולה נדרש מותאם אישית). התוצאות שהתקבלו על-ידי עבודה עם המאקרו זהות לאלה המתוארות בשלב 2.1.8 (כלול בחלון הדו ' סיכום '). בנוסף, במקרה של התאמת הסף הידנית לרמת הסף התחתונה מוצגת בחלון דו-שיח של יומן רישום , מאחר שערך זה מאפשר לשכפל תוצאות שהתקבלו בעתיד במידת הצורך. דמויות משלימות S1 ו- S2 נכללו כערכת נתונים הדרכה עבור מאקרו המהיר.
- ניתוח צורה של תא
- ידני
- פתחו תמונה ב-ImageJ או בתוכנת עיבוד תמונה אחרת עם ערכת פונקציות דומה (הוראות נוספות המתייחסות ל-ImageJ). בחר את הפרמטרים שיש למדוד על-ידי בחירה מתוך ניתוח התפריט | הגדר מידות ומתארי צורה מתקתקת בתיבה המופיעה.
- תיחום באופן ידני גבולות תאים, המסומנים באמצעות חלבון צומת (ים) של בחירה, באמצעות סמל בחירות ביד חופשית . הפרמטרים שנבחרו מחושבים באופן אוטומטי עבור כל תא. אחסן את התוצאות לאחר חלוקה לרמות של כל תא על-ידי לחיצה על ערוך | בחירה | הוסף למנהל. יש לספור רק תאים מלאים וגלויים לחלוטין, עם גבולות ללא הפרעה.
- כאשר כל התאים בשדה התצוגה מתוארים, בצע את המדידה על-ידי סימון כל המספרים המופיעים בתיבה השמאלית של מנהל הROI (המתאימים לתאים) ולחיצה על מדידה התוצאות מופיעות בתיבת התוצאות וניתן להעבירו לגיליון האלקטרוני של בחירה.
- אוטומטי
הערה: כדי להקל על הכמת של מתארי צורה תא (CSI, יחס גובה-רוחב, מעוגלות, אחידות) מאקרו ImageJ מוכן ומצורף למאמר זה (CSI. ijm). המאקרו מבוסס בעיקר על התוסף ImageJ שנקרא מורליג'י (https://imagej.net/MorphoLibJ)5. המאקרו מבצע את השלבים הבאים: 1) הרחבה של כל גבול תמונה על-ידי 10 פיקסלים שחורים [מmorpholibj]; 2) סיבובים של הדילולים וארוסיות-פילטר מורפולוגיים; 3) הדור של תמונה בינארית של גבולות התאים על-ידי פילוח מורפולוגי [מורפולליj]; 4) התרחבות גבולות התא; 5) ערך היפוך פיקסלים; 6) יצירת בחירות ומדידה של שטח והיקף התאים בתמונה; ו -7) שמירת תמונה עם תאים מתוארים ובחירות ImageJ ROI לקובץ חדש.- הזז את קובץ ה-. ijm עם המאקרו לתיקיית התוספים או המאקרו הממוקמת בתיקיות קבצי המקור של ImageJ. התקשר למאקרו מהחלונית ImageJ או צור קיצור דרך אליו.
- לפני כימות ערכת נתונים חדשה, קבע את הערכים של האזורים הקטנים והגדולים ביותר בתחומי העניין. מיתאר (בחירה חופשית או מצולע) כמה (3-10) דוגמאות של התאים הקטנים ביותר והגדולים ביותר בתמונה ולאחר מכן למדוד את האזור שלהם (לנתח | מידה).
- לחלופין, הפעל את המאקרו עם הגדרות ברירת המחדל (מגבלת הגודל התחתון מוגדרת כ-0 והמגבלה העליונה מוגדרת לאינסוף), המתן עד שהמאקרו יסיים ובחר באפשרות קבע גבולות של גודל תא . למדוד את האזור של הקטן ביותר ואת התאים הגדולים ביותר על ידי לחיצה על התווית שלהם ולאחר מכן הקש מדידה ב-IMAGEJ ROI Manager. הגדר את הערך של the_smallest_cell וthe_biggest_cell משתנים . שמור שינויים, סגור את כל חלונות הדו של המאקרו והפעל שוב את המאקרו.
הערה: ניתן להשתמש במאקרו מבלי להגדיר גבולות גודל ROI אך לא מומלץ משום שהוא מגדיל באופן משמעותי את הסיכוי למדוד קטעי תאים או אשכולות תאים לא הולמים. - הפעל את המאקרו באמצעות חלון הדו הרגיל הפתוח . בחר את התמונה שתעובד (גווני אפור).
- . לנתח את התוצאות הפלט שסיפק המאקרו מורכב: טבלת התוצאות (תווית תא, תווית תמונה, אזור תא [פיקסלים2], היקף התא [פיקסלים2], מעגליות [CSI], יחס גובה-רוחב, מעוגלות, אחידות), תמונה עם תאים מתוארים ורשימת בחירות ROI (אשר יישמרו גם בקובץ חדש בתיקיית המשנה של התוצאות ). טבלת התוצאות תועתק באופן אוטומטי ללוח של המשתמש.
הערה: S3 דמויות משלימות ו S4 נכללו כערכת נתונים הדרכה עבור מאקרו CSI. ijm.
- ידני
3. כמת
- קוונפיקציה של האופנה המהיר
- לחשב את המספר הממוצע ממוצע ואת גודל ה-FA הממוצעים לכל תא/גרעין.
הערה: עבור קווי תא מסוימים ניתן לספור בנפרד באופן מידי באופן ברור בתאים נפרדים. עבור קווי תאים בעלי אנשי קשר חזקים תא תא ולצמוח כמו monolayers כגון MCF7, מספר וגודל של התמונה הגבוהה ביותר עבור תא ניתן לחשב על-ידי חלוקת הערכים שהושגו מספירת שורות של מספר הגרעינים בתמונת כולה. - להעריך את המשמעות הסטטיסטית של הבדלים פוטנציאליים בין אוכלוסיות (קבוצות ניסוי). בהתאם להתפלגות ולשונות של הנתונים, להשוואת שתי הקבוצות השונות, השתמש במבחן t (הפצה רגילה) או בבדיקה לא פרמטרית (מאן-ויטני). עבור השוואה בין קבוצות מרובות להשתמש ב-ANOVA או בקרוקל-ווליס באופן חד-מידי בשילוב עם הבדיקות המתאימות לאחר-הוק.
- לחשב את המספר הממוצע ממוצע ואת גודל ה-FA הממוצעים לכל תא/גרעין.
- ניתוח צורה של תא
- חישוב מתארי צורה
- ניתוח ידני: חישוב אינדקס צורות תא (CSI, הנקרא גם מעגליות או צורת תא) בגיליון האלקטרוני של בחירה עבור כל תא נמדד מהאזור המתאים וההיקפי באמצעות הנוסחה:
הערה: CSI מניחה ערכים בין 1 (מעגלי) ו-0 (מוארך). הדוגמאות של צורות תאים שונות (עם אותו אזור) ו-CSIs המתאימים שלהם מוצגים באיור 2. בניתוח אוטומטי הערכים של מתארי צורה (מתגייס ומוגדרים להלן) מחושבים באופן אוטומטי ומופיעים בתיבת התוצאה:
(1) CSI = 4π * אזור/(היקף)2
(2) אר = ציר מרכזי/ציר מינורי
(3) מעוגלות = 4 * אזור/π * (ציר מרכזי)2
(4) אחידות = אזור/אזור קמור
- ניתוח ידני: חישוב אינדקס צורות תא (CSI, הנקרא גם מעגליות או צורת תא) בגיליון האלקטרוני של בחירה עבור כל תא נמדד מהאזור המתאים וההיקפי באמצעות הנוסחה:
- היסטגרמות של התפלגות צורה של תא
- החלקת הפצת צורות תא כהיסטוגרמה של מעגליות (CSI). לסווג תאים לפי ערך CSI שלהם (מחושב למינימום של 200-400 תאים), לאחד עשר מרווחי אחיד (טווח: 0-1, bin רוחב: 0.1). ההיסטוגרמה מציגה את מספר התאים בכל קטגוריה.
הערה: ההיסטוגרמה המציגה התפלגות צורה של שכבת התאים הטיפוסית MCF7 מציגה שיא של כ-0.7-0.8 CSI. אם הצורה של התאים מעוותת באמצעות גורם כלשהו (לדוגמה, טיפול בפייליטקאל, הגורם למעצר שלב של G2/M ובתוצאה מכך תאים נוספים עגולים) הוא אמור להיות משתקף בהיסטוגרמה.
- החלקת הפצת צורות תא כהיסטוגרמה של מעגליות (CSI). לסווג תאים לפי ערך CSI שלהם (מחושב למינימום של 200-400 תאים), לאחד עשר מרווחי אחיד (טווח: 0-1, bin רוחב: 0.1). ההיסטוגרמה מציגה את מספר התאים בכל קטגוריה.
- מחלקות הפצה מצטברות
- השוואת הפצות CSI מצטברות עבור כל קו תא, מכיוון שזוהי הדרך הטובה ביותר להעריך הבדלים חשובים מבחינה סטטיסטית בשינויי צורה של תא (או כל שינוי אחר בהתפלגות. לדוגמה, ניתן להחיל אותו כדי לעקוב אחר ההתפלגות המשתנה של מסלול המהיר.
- חשב את פונקציית ההתפלגות המצטברת (CDF) כדי להשוות הפצות. CDF מקצה לערך CSI נתון (המותווה בציר X) את האחוז (או הספירה היחסית) שעבורו כל הערכים הם פחות או שווים לערך CSI זה (המותווה בציר Y). כך, כפי שערך CSI מקבל גבוה יותר, אחוז מערכת הערכים הפחות או שווה לערך זה מקבל גם גבוה יותר. ניתן לחשב את CDF באמצעות התוכנה הסטטיסטית של הבחירה, או באופן ידני.
- לניתוח סטטיסטי, השתמשו בבדיקה של הקולגואונוב סמירנוף.
- חישוב מתארי צורה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח הדבקה מוקד
הנוק-אין HAX1 ג'ין הוצגה בעבר כדי להשפיע על הידקויות מיקוד6. תאים היו מתורבתים על משטח קולגן I-מצופה עבור 48 h. תמונות של תאים בקרה MCF7 ותאים MCF7 עם מיקוד HAX1 (HAX1 KD) מתוך שלושה ניסויים עצמאיים ויטראז ' מוקד הדבקה ממוקד חלבון מושגת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (תמונה ממטוס מוקד יחיד/Z-פרוסה מאזור בסיס). החל מ-2000-2500 תאים מכל קו בתא, כולם בשימוש בפרוטוקול המתואר. הערך הממוצע להדבקה הקטנה ביותר הוגדר כ-50 (פיקסל2). תמונות מייצגות של הרוזן המהיר עם ImageJ, כולל את המתאר הסופי, ממוספרים וכיסוי של קווי המתאר של התמונה המקורית עם הדימוי המקורי, מוצגים עבור שני קווי התאים באיור 3A. הבדלים במספר ובגודל של בשני קווי התא מוצגים באיור 3B.
ניתוח צורה של תא
הערכה ידנית: תאים MCF7 היו מתורבתים עבור 24 שעות, המדיום הוחלף עבור אותו בינוני טרי (לא מטופל) או בינוני עם 0.1 μm פקליטקסל (ptx) – כדי לגרום לעגל עיגול-ותרבותי עבור עוד 24 h. תמונות של confluent MCF7 monolayers מוכתם עם נוגדן נגד plakoglobin dapi הושגו באמצעות מיקרוסקופ confluent וקד (Z-פרוסה אחת מאזור פסגה). כ 200-400 תאים (2-3 שדות תצוגה) מכל ניסוי (לא מטופל/מטופל) תועדו (40x היעד) ואת התמונות העריכו באמצעות ImageJ עיבוד תמונה תוכנה (איור 4A). אזורים מייצגים של כל שכבת תא עם תאים מתוארים מוצגים באיור 4A (תאים שאינם מטופלים ושטופלו ב-ptx). כל התאים חולקו לפי ערכי CSI שלהם (10 מרווחי, bin רוחב 0.1) והציג את היסטגרמות המתאימות (איור 4B), אשר מראים עלייה בסל האחרון (0.9-1) ואת השיטוח של הפסגות הראשיות (0.6-0.9) עבור תאים ptx-מטופלים, השוואת בקרת מטופל. הבדלים בהתפלגות המצטברת של CSI חושבו למשמעות סטטיסטית באמצעות Kolgomorov-סמירנוף מבחן (K-S), בדיקה לא פרמטרית של השוויון של הפצות הסתברות חד-ממדית. שכיחות בהתפלגות היסטורגרמות ומגרשים הפצה מצטברים (איור 4C) נוצרו באמצעות תוכנה.
הערכה אוטומטית: תאים MCF7 היו מתורבתים עבור 24 שעות, קבוע מוכתם עם fluorophore מעלה מעלה phalloidin כדי להמחיש actin. תמונות נלקחו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (Z-פרוסה אחת מאזור פסגה). תמונות בגווני אפור של המונאולאיירס נותחו באמצעות קובץ המאקרו המצורף, בהתאם לפרוטוקול הכלול (איור 5א-ג). בסך הכל, 512 תאים מתוך 12 שדות התצוגה הוככמת. התוצאות הותוו כהיסטוגרמה המציגה התפלגות של מעגליות (איור 5D).
איור 1: Actin מכתים עם fluorophore-phalloidin מעלה, שתי שונות Z-פרוסות מאותו שדה של נוף. (א) האזור האפיפיורי עם הקורטיקוטין. (ב) אזור הבסיס עם סיבי לחץ אקטין. בר: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: דוגמאות לערכים של ערכי אינדקס צורות תאים (CSI) שונים עבור הצורות בהיקפים ייחודיים, אך באותו אזור. הצורה מוארך מאוד בצד שמאל יש CSI קרוב ל 0, בעוד המעגל האידיאלי בצד ימין יש CSI של 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות הדבקה מיקוד. (א) תמונות מייצגות של קווי תאים MCF7: שליטה וHAX1 ק. ק. מוכתם בפקלין; משמאל לימין: (1) פקלין וגרעינים (2) מתוארים וממוספרים בשכבות (3) של קווי המתאר והתמונה המקורית. בר: 20 μm. מערכות insets (מתחת לכל תמונה) מציגות אזורים מוקטנת. (ב) מגרשים המראים את ההפרש בגודל ובמספר של שני קווי התא. משמעות סטטיסטית הוערך באמצעות מבחן t הסטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: שינויים בצורת התא המושרה על ידי פקליטקסל (ptx) בשכבת התא MCF7; ספירה ידנית. (א) אזורים מייצגים של MCF7 monolayers, תאים מטופלים וטופלו עם ptx, מוכתם עם חלבון הצומת plakoglobin ו dapi, בר: 20 μm. החלונית מימין מציגה את התמונה המעובדת ב-ImageJ; קצוות התא מתוארים וכל התאים הנספרים ממוספרים. (ב) היסטגרמות מציג התפלגות CSI בתאים לא מטופלים ו-ptx-שטופלו, 200-400 תאים בכל ניסוי (לא מטופלים/טופלו), bin רוחב: 0.1. מגרשים נוצרו באמצעות ניתוח הפצת תדר עם תדרים יחסיים כשבר. (ג) העלילה של התפלגות מצטברת עבור monolayers מטופל ו-ptx מטופלים. הפרש סטטיסטי המחושב באמצעות הבדיקה האנטי-פרמטרית של קולומט-סמירנוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: צורת התא ב MCF7 monolayers העריכו באמצעות שיטה אוטומטית. (א-ג) דוגמה לניתוח התמונה האוטומטית המדגימה את השלבים הבאים שבוצעו על-ידי המאקרו המצורף. (A) תמונת קלט; כרוב; גווני אפור, שינוי קנה מידה 10 יקרומטר (למטרות אינפורמטיביות; אין להטביע את סרגלי הממדים בתמונות מנותחות). (ב) שכבת תא לאחר פילוח; גבולות תא מתוארים; תאים ללא גבולות שלמים חוסלו. (ג) כיסוי קווי המתאר של התא בתמונה המקורית. (ד) היסטוגרמה המציגה את התפלגות CSI בערכת הנתונים שנותחה, 512 תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משלימה איור S1, S2: MCF7 תאים, פקעבלין ו DAPI-ויטראז לדמיין את הגרעינים הצבעוניים. מסופק כערכת נתונים של הדרכה עבור מאקרו השירות המהיר.
איור S1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.
איור S2: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.
משלימה S3 איור, S4: MCF7 תאים, plakoglobin ו DAPI-ויטראז ' כדי לדמיין את הצמתים תאים תא גרעיני. מסופק כערכת נתונים של הדרכה עבור מאקרו CSI. ijm.
S3 דמות: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.
איור S4: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תא תא ותא הדבקה של תא מהווים תכונות הטבועה של התאים אפיתל לשחק את התפקיד הקריטי ברקמות מורפולגנזה ו embriogenesis. ברקמות למבוגרים את הרגולציה הנכונה של תכונות מכניות של שכבת התא היא חיונית לשמירה על הומאוסטזיס ומניעת תגובות פתולוגיים כמו התקדמות הגידול גרורות. הגודל והמספר של הידקויות מיקוד תלויים בחוזק של הדבקה בתאים, בעוד שצורת התא תלויה בכוחות הקונקטילה וקשורה למצב של אנשי קשר תא-תא.
כאן, אנו מתארים שתי שיטות פשוטות של ניתוח כמותי של האזור, מספר וצורה של מבנים סלולריים מוכתם על ידי immunofluorescence במקרה זה מיקוד מוקד ואת התאים כולו בשכבת התא. עם זאת, ניתן לסדר מחדש את הכלים המוצעים לקוונפיקציה של כל מבנה שנבחר. הסוגיה המרכזית לניתוח זה היא איכות הצביעת האימונולווקאואני וההדמיה הקונפוקלית. ניתן ליישם שיטות אלה בכל מעבדה סטנדרטית המצוידת ביחידה לתרבות-תא ובמיקרוסקופ קונטואני. הם נועדו להשוות קווי תאים, במיוחד כאשר ההבדלים (טבעי או המושרה על ידי טיפול ספציפי) בפרמטרים נמדד הם ניכרים. הם אינם מומלצים למדוד הבדלי דקות או לבסס מדידות מוחלטות, מכיוון שהם רגישים לשינויים מינימליים בהגדרות השונות הראשוניות, במיוחד במקרה של הידקויות מיקוד. שיטה זו של הקוונפיקציה הוא נחות לשיטות מתקדמות יותר וספציפיות יותר כמו מיקרוסקופ TIRF, אבל יש לו יתרון לא דורש ציוד מתוחכם.
שיטות דומות של מדידות הדבקה מוקד תוארו לפני7,8,9,10. כאן, אנחנו ציינו את ההגדרות ויצרנו מאקרו ImageJ חינם, עם מספר אפשרויות, כדי להקל על המידות.
ניתוח צורות התא תואר פעמים רבות, כולל שיטות מורכבות מאוד ומפורטות11,12. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי לעקוב אחר שינויים של תאי אפיתל monolayers, אשר יכול להיות מאוד חשוב להשוואת מורפולוגיה התא או שינויים התפתחותיים. השיטה הידנית של ניתוח צורות התא במונאולאיירס המוצגת בפרוטוקול זה תוארה בדו ח הקודם6. נוסחת ה-CSI כדרך לתאר ולהשוות את צורת האובייקט (ות) משמשת רבות בתחומים שונים13,14, כולל גאולוגיה ממנה היא מקורו. הצגת התוצאות בצורה של היסטוגרמה ו/או כפונקציית הפצה מצטברת משמשת בדרך כלל להשוואות הפצות של כל סוג8,10,15.
בעיקר, אנו מציגים כאן כלי לניתוח הצורה האוטומטית של התאים בהתבסס על התוסף ImageJ (https://imagej.net/MorphoLibJ). אנו מספקים קובץ מאקרו, שיכול לבצע ניתוח זה במהירות וביעילות. שיטה זו אינה מזהה תמיד את גבולות התא הנכונים, אך אחוז המידות הפגומות (הקיימות בכל ניתוח אוטומטי) הוא מזערי ואין להשפיע באופן משמעותי על התוצאה הסופית, במיוחד אם מספר מספיק של תאים מנותח. תאים ללא גבולות מלאים מסולקים. ניתוח אוטומטי של צורת התא יש יתרונות להכחיש ואנו מציגים שיטה זו כדי להיות מוערך על ידי הקהילה המדעית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי המרכז הלאומי למדע הפולני תחת מענק מס ' 2014/14/M/NZ1/00437.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, Pt 18 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, Pt 2 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
