Summary
Artikeln beskriver kvantifiering av 1) storlek och antal fokala sammanväxningar och 2) cell form index och dess fördelning från konfa bilder av konfluenta monolayers av MCF7 celler.
Abstract
De metoder som presenteras här kvantifiera vissa parametrar för konfluenta vidhäftande cell monolayers från flera lämpligt färgade confocal bilder: vidhäftning till substratet som en funktion av antalet och storleken på fokala sammanväxningar, och cell form, som kännetecknas av cellen form index och andra form deskriptorer. Focal sammanväxningar visualiserades av paxillin färgning och cell-cell gränser präglades av korsningen plakoglobin och aktin. Metoderna för cellodling och färgning var standard; Bilder representerar enstaka fokalplan. bildanalys utfördes med hjälp av offentligt tillgängliga bildbehandlingsprogram. De presenterade protokollen används för att kvantifiera antalet och storleken på fokala sammanväxningar och skillnaderna i cellformfördelning i monolayers, men de kan återanvändas för kvantifiering av storlek och form av någon annan distinkt cellulär struktur som kan färgas (t.ex. mitokondrierna eller atomkärnor). Att bedöma dessa parametrar är viktigt i karakteriseringen av de dynamiska krafterna i vidhäftande cellskikt, inklusive cellvidhäftning och aktomyosinkontraktilitet som påverkar cellformen.
Introduction
Epitelial cell monolayers fungera som ett kollektiv där cell-cell och cell-substrat vidhäftning samt kontraktila krafter och spänningar representerar viktiga parametrar och deras rätt balans bidrar till den övergripande integriteten hos enheten1,2,3. Att bedöma dessa parametrar representerar således ett sätt att fastställa celllagrets aktuella status.
De två metoder som beskrivs här representerar en tvådimensionell analys av konfluenta monolayers av vidhäftande, epitelceller (i detta fall MCF7 bröstcancer cellinje). Analysen utförs med hjälp av konfokala bilder (enstaka Z-skivor) från olika regioner på Z-axeln. basala regionen nära ett substrat för fokalvidhäftning (FA) mätningar och apikal region för cellform mätningar. De presenterade metoderna är relativt enkla och kräver standard laboratorieteknik och programvara med öppen källkod. Konfokalmikroskopi är tillräcklig för detta protokoll, så det kan utföras utan att använda mer specialiserade TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopi. Således skulle protokollet kunna genomföras i en relativt standard laboratorium inställning. Även om metodernas noggrannhet är begränsad, kan de skilja på grundläggande skillnader i fokal vidhäftning och cellform.
Båda metoderna som beskrivs här består av standard experimentella procedurer såsom cellodling, immunstaining, konfial avbildning och bildanalys som utförs med ImageJ. Alla bildbehandlingsprogram med lämpliga funktioner kan dock användas. De presenterade metoderna kan spåra och jämföra förändringar som orsakas av farmakologisk behandling eller minimal genetisk modifiering. Att erhålla bestämda värden rekommenderas inte, på grund av den begränsade precisionen hos dessa metoder. Två automatiserade makron ingick, för att underlätta mätningar av många bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedande åtgärder
- Cellsådd för att erhålla konfluent monolager
- Innan sådd, belägga brunnarna i en 4-brunnar kammare bild med kollagen I (eller annan ECM komponent val). För kollagen I-beläggning, följ ett kommersiellt protokoll: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html vid en koncentration av 8 μg/cm2.
- Frö 400.000 celler till en brunn av en 4-brunnskammare bild.
- Odla cellerna i 24 timmar (eller längre, beroende på de experimentella effektmåtten) före färgning, i en inkubator vid 37 °C, 5 % CO2. Detta steg möjliggör en mognad av cellcellkontakter och bildandet av monolayers.
- Använd ett optiskt, inverterat mikroskop för att kontrollera sammanflödet (ca 90% krävs) och ett allmänt tillstånd av monolager. Fortsätt inte om cellerna flyter eller ser stressade ut.
- Immunfluorescerande färgning
OBS: Celler kan färgas med ett protokoll som du väljer. Här utfördes immunofluorescens som tidigare beskrivits4.- För fokal vidhäftningsanalys, fläcka cellerna med ett fokalt vidhäftningsprotein (i detta protokoll paxillin). För cellform analys fläck med cell-cell korsning protein val (i detta protokoll desmosomal protein plakoglobin).
- För proceduren, använd 0,5 ml specificerade lösningar om inte annat anges.
- Fix celler i 4% formaldehyd i PBS för 30 min på is.
- Inkubera med 0,1 M ammoniumklorid (i PBS) i 10 min för att släcka autofluorescens.
- Lägg till 0,5% Triton X-100 (i PBS) i 30 min (permeabilisering).
- Blockera med 5% mjölk (eller 1% BSA) i TBS-T för 1 h.
- Inkubera med primär antikropp vid 4 °C över natten (anti-paxillin: kanin, 1:250, anti-plakoglobin: kanin, 1:400)
- Inkubera med sekundär antikropp i 30 min (Alexa Fluor 594 get anti-kanin, 1:500, 1:500)
- Betsa med 300 nM DAPI i 1-5 min, skyddad från ljus.
OBS: Alternativt kan ytterligare färgning av aktin med fluorescerande falloidinkonjugat (conc. 1:400) utföras; falloidin ska tillsättas i samma steg som den sekundära antikroppen.
- Konfikt bildbehandling
- Ta bilder av enstaka Z-skivor med hjälp av ett konfokalmikroskop (t.ex.
OBS: Valfri aktinfärgning kan hjälpa till att bedöma rätt fokalplan. När aktinfärgning förekommer i den apikala regionen medan aktinstressfibrer finns i basala regionen, nära substratet, vilket illustreras på figur 1. - Focal vidhäftning imaging
- Välj Z-skivor för fokusvidhäftningsanalys från basala regionen, nära substratet.
- Använd ett mål med den högsta numeriska bländaren (att föredra 63x N.A.: 1.4).
OBS: Formen på FA är mycket specifik och lätt att känna igen. Således rekommenderas att starta skanningen från ett fokalplan under cellerna och sedan långsamt skanna mot dem, tills FA är tydligt synliga. Bildanalys kommer att vara mer exakt från mindre synfält, som tenderar att vara mer enhetlig, men detta innebär att färre celler kommer att beräknas i ett enda synfält.
- Bildbehandling av cellceller
- Använd ett 40x eller 63x mål.
- Välj kanaler för kärnfärgning och önskad korsning protein färgning.
- Välj Z-segment för cellformanalys från monolayers apikala region.
- Ta bilder för minst 3 olika synfält (200-400 celler).
- Ta bilder av enstaka Z-skivor med hjälp av ett konfokalmikroskop (t.ex.
2. Bildanalys
OBS: Förutsatt makron fungerar optimalt på ImageJ version 1.50f eller nyare. Används endast för kvantifiering av bilder med högt signal-brusförhållande och utan under- eller övermättade pixlar. De beskrivna metoderna omfattar steg som kräver manuell parameterjustering. Således rekommenderas en blind analys/blindad experimentinställning. För att kryptera namn på bildfilar kan ImageJ-plugins som "Blind Analysis Tool" (finns på: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) användas.
- Analys av fokal vidhäftning
De rekommenderade indatafilerna för följande metoder är: bilder av FAs representerade i 8-bitars gråskala som sparats i .tiff-format.- Öppna bilden med ImageJ.
- Ange en bilds skala till pixlar (Analyze | Ange skala; Ta bort skala och markera alternativet Globalt).
- Inkludera filnamnet och roi-området i mätalternativen (Analyze | Ställ in mått...); kontrollera alternativ för områdes- och bildskärmsetikett.
- Subtrahera bakgrund (Process | Subtrahera bakgrund; ange parametern Rullande bollradie till 50 pixlar; markera Glidande paraboloid alternativ). När det gäller pseudofärgade RGB-bilder: delade RGB-kanaler, lämna kanalen med FAs öppnas, stäng återstående kanaler (Bild | Färg | Delade kanaler).
- Bestäm området för den minsta regionen av intresse (ROI). Med hjälp av frihands- eller polygonval beskriver de minsta enskilda fokalvidhäftningen och mäter dess yta (Analysera | Mått). Upprepa det här steget för olika avkastnings- och avkastningsvillkor (FA) från några slumpmässigt valda bilder (för totalt 20 avkastningsvillkor). Beräkna och spara medelvärdet av erhållna resultat.
OBS: Detta steg krävs endast när en viss uppsättning bilder analyseras för första gången (specifik cellinje, beläggningsglas med specifika extracellulära matriskomponenter, olika kulturförhållanden). - Konvertera bilden till binär med någon av följande metoder:
- Ange det globala tröskelvärdet (Bild | Justera | Tröskelvärdet. markera Alternativ för standard, svartvit och mörk bakgrund, justera tröskelvärdet manuellt eller ställ in det automatiskt).
- Ange det lokala tröskelvärdet (Bild | Justera | Automatiskt lokalt tröskelvärde...; ställ in Metod till Phansalkar och kontrollera Vita objekt på svart bakgrundsalternativ. Invertera sedan bilden (Redigera | Invertera).
- Mät antalet och området för rois. Välj Analysera | Analysera partiklar; kontrollera Pixelenheter, Visa resultat, Rensa resultat och Summera alternativ, ange parameterstorlek, som en lägre gräns använd medelvärdet för de minsta ROIs från steg 2.1.5. Den övre gränsen kan ställas in på 25% av ett typiskt cellområde.
- Överföringsdata (som innehåller bildnamn, antal FAs, totalt och genomsnittligt område för FAs; respektive Segment, Antal, Total yta, Genomsnittlig storlek) från fönstret Sammanfattning till det datahanterarprogram som du väljer.
- Bestäm antalet celler per bild genom att räkna DAPI-färgade kärnor. Inventering kan göras manuellt(Plugins | Analysera | Cellräknare) eller som i tillgängliga protokoll, till exempel: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
- Alternativt, för att underlätta FAs räkna, använda bifogade ImageJ makro (FAs.ijm).
- Flytta .ijm-filen med makrot till plugins eller makromapp i ImageJ-källfilmappar.
- Bestäm ett område med den minsta avkastningen enligt beskrivningen i steg 2.1.4.
- Öppna makrofil (Plugins | Makron | Redigera...).
- Innan makrot körs anger du värdet på tre variabler: fyllningsvärdet för area_of_the_smallest_region_of_interest med ett tal som förvärvats under steg 2.1.4. Ange threshold_type värde på manuell eller automatisk.
- Spara ändringar (makrot ska vara klart att användas).
- Anropa makrot från ImageJ-panelen eller gör en genväg till den. Makrot börjar med det öppna standarddialogfönstret. Markera den bild som ska bearbetas.
OBS: Vid manuell tröskeljustering krävs manuell bekräftelse av tröskelvärdet (undvik att acceptera ändringar med knappen Använd i dialogrutan Tröskelvärde, använd anpassade dialogfönster för åtgärd krävs i stället). Resultaten som erhålls genom att arbeta med makrot är desamma som de som beskrivs i steg 2.1.8 (ingår i fönstret Sammanfattning). Dessutom, när det gäller manuell tröskeljustering lägre tröskelnivå visas i ett loggdialogruta fönster, eftersom det här värdet gör det möjligt att återge erhållna resultat i framtiden om det behövs. Kompletterande siffror S1 och S2 ingick som en utbildningsdatauppsättning för FAs.ijm makro.
- Analys av cellform
- Manuell
- Öppna en bild i ImageJ eller ett annat bildbehandlingsprogram med liknande funktioner (ytterligare instruktioner gäller ImageJ). Välj de parametrar som ska mätas genom att välja från menyn Analys | Ange mått och markera formbeskrivningar i rutan visas.
- Manuellt avgränsa cellkanter, markerade med korsningsproteiner som du väljer, med hjälp av ikonen Frihandsval. De valda parametrarna beräknas automatiskt för varje cell. Lagra resultaten efter att ha markerat varje cell genom att klicka på Redigera | Urval | Lägg till i hanteraren. Endast kompletta, helt synliga celler, med oavbrutna kantlinjer bör räknas.
- När alla celler i synfältet beskrivs gör du mätningen genom att markera alla tal som visas i den vänstra rutan i ROI-hanteraren (motsvarande celler) och klicka på Mät Resultaten visas i rutan Resultat och kan överföras till det kalkylblad som valts.
- Automatiserad
OBS: För att underlätta kvantifiering av cellformbeskrivningar (CSI, bildförhållande, rundhet, soliditet) har ett ImageJ-makro förberetts och bifogats den här artikeln (CSI.ijm). Makrot är främst baserat på ImageJ plugin kallas MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)5. Makrot kör följande steg: 1) Förlängning av varje kantlinje med 10 svarta pixlar [MorpholibJ]; 2) Rundor av dilations och erosioner - morfologiskt filter [MorpholibJ]; 3) Generering av binär bild av celler gränser genom morfologiska segmentering [MorpholibJ]; 4) Dilation av cellgränser; 5) Inversion av pixlar värde; 6) Generering av val och mätning av område och omkrets av celler på bilden; och 7) Spara bild med konturerade celler och ImageJ ROI val till en ny fil.- Flytta ijm-filen med makrot till mappen plugins eller makron som finns i mapparna för BildJ-källfiler. Anropa makrot från imagej-panelen eller gör en genväg till det.
- Före kvantifieringen av en ny datauppsättning bestämmer du värdena för de minsta och största regionerna av intresse. Disposition (frihand eller polygon val) några (3-10) exempel på de minsta och största cellerna på bilden och sedan mäta deras område (Analysera | Mått).
- Du kan också köra makrot med standardinställningarna (den nedre storleksgränsen är inställd på 0 och den övre gränsen är inställd på oändlighet), vänta tills makrot är klart och välj Alternativet Ange cellstorleksgränser. Mät området för de minsta och de största cellerna genom att klicka på deras etikett och tryck sedan på Mät i ImageJ ROI Manager. Ange värdet för the_smallest_cell- och the_biggest_cell variabler. Spara ändringar, stäng alla makrodialogrutor och kör makrot igen.
Makrot kan användas utan att ange ROI-storleksgränser, men det rekommenderas inte eftersom det avsevärt ökar risken för att olämpliga cellfragment eller cellkluster mäts. - Starta makrot med standardfönstret Öppna. Markera den bild som ska bearbetas (gråskala).
- Analysera resultaten. Utdata från makrot består av: tabell över resultaten (celletikett, bildetikett, cellområde [pixlar2], cellomkrets [pixlar2], cirkuläritet [CSI], bildförhållande, rundhet, soliditet), bild med konturerade celler och ROI-markeringar lista (som också sparas i ny fil i undermappen Resultat). Resultattabellen kopieras automatiskt till användarens Urklipp.
OBS: Kompletterande siffror S3 och S4 ingick som en utbildningsdatauppsättning för CSI.ijm-makrot.
- Manuell
3. Kvantifiering
- Kvantifiering av fas
- Beräkna medelvärdet FAs tal och genomsnittlig FA storlek per cell / kärnor.
Obs: För vissa cellinjer är det möjligt att räkna FAs separat i olika celler. För cellinjer som har starka cellcellkontakter och växer som monolayrar som MCF7 kan antal och storlek på FAs per cell beräknas genom att dividera de värden som erhålls från FAs som räknar med antalet kärnor i hela bilden. - Bedöma statistisk signifikans av potentiella skillnader mellan populationer (experimentella grupper). Beroende på fördelningen och variansen av data, för jämförelse av de två olika grupperna använder Student t-test (normal fördelning) eller icke-parametrisk U-test (Mann-Whitney). För jämförelse av flera grupper använder enkelriktad ANOVA eller Kruskal–Wallis i samband med lämpliga post-hoc-tester.
- Beräkna medelvärdet FAs tal och genomsnittlig FA storlek per cell / kärnor.
- Analys av cellform
- Beräkning av formbeskrivningar
- Manuell analys: Beräkna cellformindex (CSI, även kallat cirkuläritet eller cellform) i det kalkylblad som varje uppmätt cell ska väljas från lämpligt område och omkrets med hjälp av formeln:
OBS: CSI förutsätter värden mellan 1 (cirkulär) och 0 (långsträckt). Exemplen på olika cellformer (med samma område) och deras respektive gemensamma säkerhetsanalyser presenteras i figur 2. I automatiserad analys beräknas värdena för formbeskrivare (värvning och definieras nedan) automatiskt och visas i resultatrutan:
(1) CSI = 4π*område/(omkrets)2
(2) AR = större axel/mindre axel
(3) Rundhet = 4*area/π*(huvudaxel)2
(4) Soliditet = område/konvex areal
- Manuell analys: Beräkna cellformindex (CSI, även kallat cirkuläritet eller cellform) i det kalkylblad som varje uppmätt cell ska väljas från lämpligt område och omkrets med hjälp av formeln:
- Histogram av cellformfördelning
- Rita cellformfördelning som ett histogram av cirkuläritet (CSI). Klassificera celler enligt deras CSI-värde (beräknat för minst 200–400 celler) till ett av de tio enhetliga intervallen (intervall: 0–1, lagerplatsbredd: 0,1). Histogrammet visar antalet celler i varje kategori.
OBS: Histogrammet som visar formfördelningen av det typiska MCF7-celllagret visar en topp på cirka 0,7-0,8 CSI. Om cellernas form förvrängs av någon faktor (t.ex. paklitaxelbehandling, som orsakar G2/M-fasstopp och i följden är fler celler runda) bör den reflekteras på histogrammet.
- Rita cellformfördelning som ett histogram av cirkuläritet (CSI). Klassificera celler enligt deras CSI-värde (beräknat för minst 200–400 celler) till ett av de tio enhetliga intervallen (intervall: 0–1, lagerplatsbredd: 0,1). Histogrammet visar antalet celler i varje kategori.
- Ackumulerade fördelningsdiagram
- Jämför kumulativa CSI-distributioner för varje cellinje, eftersom det är det bästa sättet att bedöma statistiskt viktiga skillnader i cellformsändringar (eller andra ändringar i fördelningen. Den kan till exempel användas för att spåra den förändrade fördelningen av FAs.
- Beräkna den kumulativa distributionsfunktionen (CDF) för att jämföra distributioner. CDF tilldelar för ett givet CSI-värde (ritat på X-axeln) den procentandel (eller relativa antal) för vilken alla värden är mindre eller lika med detta CSI-värde (ritas på Y-axeln). Eftersom CSI-värdet blir högre blir alltså procentandelen av uppsättningen värden som är mindre eller lika med det här värdet också högre. CDF kan beräknas av den statistiska programvaran val, eller manuellt.
- För statistisk analys, använd Kolgomorov-Smirnov ickeparametriskt test.
- Beräkning av formbeskrivningar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analys av fokal vidhäftning
Knockdown av HAX1 genen har tidigare visat sig påverka fokal sammanväxningar6. Celler odlades på kollagen I-belagda ytan för 48 h. Bilder av MCF7 kontrollceller och MCF7 celler med en HAX1 knockdown(HAX1 KD) från tre oberoende experiment färgas med fokal vidhäftning protein paxillin erhölls med hjälp av ett konfokalt mikroskop (bild från enda fokalplan / Z-skiva från basala regionen). FAs från cirka 2.000-2.500 celler från varje cellinje kvantifierades med hjälp av det beskrivna protokollet. Medelvärdet för den minsta fokalvidhäftningen var satt till 50 (pixel2). Representativa bilder av FAs räknas med ImageJ, inklusive den slutliga, numrerade konturer och överlagring av FAs konturer med den ursprungliga bilden, visas för båda cellinjerna på figur 3A. Skillnader i antal och storlek på FAs i båda cellinjerna presenteras på figur 3B.
Analys av cellform
Manuell bedömning: MCF7-celler odlades i 24 timmar, Mediet byttes ut mot samma färska medium (obehandlat) eller mediet med 0,1 μM paklitaxel (PTX) – för att inducera cellavrundning - och odlade mot ytterligare 24 timmar. Bilder av de konfluent mcf7-monolayer som färgats med antiplakoglobinantikropp och DAPI erhölls med hjälp av ett konocalmikroskop (enda Z-skiva från apikalt område). Omkring 200-400 celler (2-3 synfält) från varje experiment (obehandlat/behandlat) dokumenterades (40x-mål) och bilderna bedömdes med imagej-bildbehandlingsprogram (figur 4A). Representativa regioner i varje cellskikt med konturerade celler visas i figur 4A (obehandlade och PTX-behandlade celler). Alla celler kategoriserades enligt deras CSI-värden (10 intervall, bin bredd 0,1) och presenteras i respektive histogram (figur 4B), som visar en ökning av den sista bin (0,9-1) och tillplattad av de viktigaste topparna (0,6-0,9) för PTX-behandlade celler, jämfört med den obehandlade kontrollen. Skillnader i den kumulativa fördelningen av CSI beräknades för statistisk signifikans med kolgomorov-Smirnov-testet (K-S), ett icke-parametriskt test av likheten mellan endimensionella sannolikhetsfördelningar. Frekvensfördelning histogram och kumulativa fördelningsområden (figur 4C) genererades med programvara.
Automatiserad bedömning: MCF7 celler odlades för 24 h, fast och färgas med fluorofore-konjugerade fallosoidin att visualisera aktin. Bilder togs med hjälp av ett konfokalt mikroskop (enda Z-skiva från apical region). Gråskalebilderna av monolayers analyserades med hjälp av den bifogade makrofilen, enligt det medföljande protokollet (Figur 5A-C). Totalt kvantifierades 512 celler från 12 synfält. Resultaten ritades som ett histogram som presenterar fördelning av cirkuläritet (figur 5D).
Figur 1: Actin färgning med fluoroforekonjugerad falloidin, två olika Z-skivor från samma synfält. (A)Den apikala regionen med kortikal aktin. (B) Den basala regionen med aktin stressfibrer. Bar: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Exempel på olika CSI-värden (Cell Shape Index) för former med olika omkrets, men samma område. Den mycket långsträckta formen till vänster har CSI nära 0, medan den idealiska cirkeln till höger har CSI på 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av fokal vidhäftning. a) Representativa bilder av MCF7-baserade cellinjer: CONTROL och HAX1 KD färgade med paxillin. från vänster till höger: (1) paxillin och kärnor (2) skisserade och numrerade FAs (3) överlagring av FAs konturer och den ursprungliga bilden. Bar: 20 μm. Inmängder (under varje bild) visar zoomade lådområden. (B)Områden som visar skillnaden i FAs storlek och tal mellan de två cellinjerna. Statistisk signifikans bedömdes med hjälp av Student t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Förändringar i cellform som induceras av paklitaxel (PTX) i MCF7-cellskiktet; manuellt antal. (A)Representativa regioner i MCF7-monolager, celler som inte behandlats och behandlats med PTX, färgade med korsningsproteinplakoglobin och DAPI, bar: 20 μm. Panelen till höger visar bilden som bearbetas i ImageJ. cellkanter är konturerade och alla räknade celler numreras. b)Histogram som visar CSI-distribution i obehandlade och PTX-behandlade celler, 200–400 celler i varje experiment (obehandlat/behandlat), binbredd: 0.1. Tomter genererades med hjälp av frekvensfördelningsanalys med relativa frekvenser som en bråkdel. C)Det sammanlagt fördelningsområdet för de obehandlade och PTX-behandlade monolayersna. Statistisk skillnad beräknad med Kolgomorov-Smirnov ickeparametriskt test (KS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cellform i MCF7-monolager som bedöms med hjälp av den automatiserade metoden. (A-C) Ett exempel på den automatiserade bildanalys som illustrerar efterföljande steg som utförs av det bifogade makrot. (A) Inmatningsbild; när aktin; gråskala, skalstång 10 μm (för informativa ändamål; skalstreck bör inte bäddas in i analyserade bilder). B)Cellskikt efter segmentering. cellkantlinjer som beskrivs. celler utan fullständiga kantlinjer elimineras. (C) Överlägg av cellen konturer på den ursprungliga bilden. (D) Ett histogram som visar fördelningen av CSI i den analyserade datauppsättningen, 512 celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1, S2: MCF7 celler, paxillin och DAPI-färgade för att visualisera FA och atomkärnor. Tillhandahålls som en utbildningsdatauppsättning för FAs.ijm-makrot.
Figur S1: Klicka här för att ladda ner denna siffra.
Figur S2: Klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur S3, S4: MCF7 celler, plakoglobin och DAPI-färgade för att visualisera cell-cell korsningar och kärnor. Tillhandahålls som en utbildningsdatauppsättning för CSI.ijm-makrot.
Figur S3: Klicka här för att ladda ner denna siffra.
Bild S4: Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell-cell och cell-substrat vidhäftning utgör inneboende attribut av epitelceller och spela den avgörande rollen i vävnad morphogenesis och embriogenesis. I vuxna vävnader är korrekt reglering av mekaniska egenskaper hos celllagret avgörande för att upprätthålla homeostas och förhindra patologiska reaktioner som tumörprogression och metastasering. Storleken och antalet fokala sammanväxningar beror på styrkan hos cellsubstratvidhäftning, medan cellformen beror på kontraktila krafter och är relaterad till status för cell-cell-kontakter.
Här beskriver vi två enkla metoder för kvantitativ analys av området, antal och form av cellulära strukturer färgas av immunofluorescens, i detta fall focal vidhäftningar och hela cellerna i celllagret. De föreslagna verktygen kan dock återanvändas för kvantifiering av varje vald struktur. Den viktigaste frågan för dessa analyser är kvaliteten på immunofluorescent färgning och konfial avbildning. Dessa metoder kan implementeras i alla standardlaboratorium utrustade med en cellodlingsenhet och ett konfokalmikroskop. De är utformade för att jämföra cellinjer, särskilt när skillnaderna (naturliga eller inducerade genom specifik behandling) i de uppmätta parametrarna är betydande. De rekommenderas inte att mäta små skillnader eller att fastställa absoluta mätningar, eftersom de är känsliga för minimala förändringar i de ursprungliga godtyckliga inställningarna, särskilt när det gäller fokala sammanväxningar. Denna metod för FAs kvantifiering är sämre än mer avancerade och specifika metoder som TIRF mikroskopi, men det har en fördel av att inte kräva sofistikerad utrustning.
Liknande metoder för mätningar av fokal vidhäftning beskrevs före7,,8,,9,10. Här har vi specificerat inställningarna och skapat ett gratis ImageJ-makro, med flera alternativ, för att underlätta mätningarna.
Cellformanalys beskrevs många gånger, inklusive mycket komplexa och detaljerade metoder11,12. Här presenterar vi en enkel metod för att spåra förändringar i epitelial cell monolayers, vilket kan vara mycket viktigt för att jämföra cell morfologi eller utvecklingsmässiga förändringar. Den manuella metoden för cellformanalys i de monolager som presenteras i detta protokoll beskrevs i en tidigare rapport6. CSI-formeln som ett sätt att beskriva och jämföra formen på ett eller flera objekt används ofta inom olika discipliner13,14, inklusive geologi från vilken det har sitt ursprung. Presentation av resultaten i form av ett histogram och/eller som en kumulativ fördelningsfunktion används ofta för jämförelser av fördelningar av något slag8,,10,15.
Noterbart är att vi här presenterar ett verktyg för den automatiserade cellformanalysen baserad på ImageJ-insticksprogrammet MorhpLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ). Vi tillhandahåller en makrofil som kan utföra denna analys snabbt och effektivt. Den här metoden känner inte alltid igen rätt cellkanter, men procentandelen felaktiga mätningar (som finns i varje automatiserad analys) är minimal och bör inte påverka slutresultatet avsevärt, särskilt om tillräckligt många celler analyseras. Celler utan fullständiga kantlinjer elimineras. Automatiserad cellform analys har obestridliga fördelar och vi presenterar denna metod så att den kan uppskattas av det vetenskapliga samfundet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av polska National Science Center under bidrag nr 2014/14/M/NZ1/00437.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, Pt 18 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, Pt 2 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
