Summary
L'articolo descrive la quantificazione di 1) le dimensioni e il numero di adereni focali e 2) l'indice di forma cellulare e la sua distribuzione da immagini confocali dei monostrati confluenti delle cellule MCF7.
Abstract
I metodi qui presentati quantificano alcuni parametri dei monostrati cellulari aderenti confluenti da più immagini confocali opportunamente macchiate: adesione al substrato in funzione del numero e delle dimensioni delle adere focali e della forma cellulare, caratterizzata dall'indice di forma cellulare e da altri descrittori di forma. Le adesioni focali sono state visualizzate dalla colorazione paxillin a zintillina e i confini delle cellule cellulari sono stati contrassegnati da plakoglobina di giunzione e actina. I metodi per la coltura cellulare e la colorazione erano standard; le immagini rappresentano singoli piani focali; l'analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando un software di elaborazione delle immagini disponibile pubblicamente. I protocolli presentati vengono utilizzati per quantificare il numero e le dimensioni delle ademonie focali e le differenze nella distribuzione della forma cellulare nei monostrati, ma possono essere riutilizzati per la quantificazione delle dimensioni e della forma di qualsiasi altra struttura cellulare distinta che può essere macchiata (ad esempio, mitocondri o nuclei). La valutazione di questi parametri è importante nella caratterizzazione delle forze dinamiche nello strato cellulare aderente, compresa l'adesione cellulare e la contrattiglio anomiosina che influenza la forma delle cellule.
Introduction
I monostrati cellulari epiteliali agiscono come un collettivo in cui l'adesione cellulare e substrato cellulare, così come le forze e le tensioni contrattuali rappresentano parametri importanti e il loro corretto equilibrio contribuisce all'integrità complessiva dell'unità1,2,3. Pertanto, la valutazione di questi parametri rappresenta un modo per stabilire lo stato corrente del livello della cella.
I due metodi qui descritti rappresentano un'analisi bidimensionale dei monostrati confluenti delle cellule epiteliali aderenti (in questo caso la linea cellulare del cancro al seno MCF7). L'analisi viene eseguita utilizzando immagini confocali (singole sezioni z) provenienti da diverse regioni sull'asse z; regione basale vicino a un substrato per misurazioni di adesione focale (FA) e regione apicale per le misurazioni della forma delle cellule. I metodi presentati sono relativamente semplici e richiedono tecniche di laboratorio standard e software open-source. La microscopia confocale è sufficiente per questo protocollo, quindi può essere eseguita senza utilizzare una microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) più specializzata. Pertanto, il protocollo potrebbe essere implementato in un ambiente di laboratorio relativamente standard. Anche se l'accuratezza dei metodi è limitata, possono distinguere le differenze di base nell'adesione focale e nella forma delle cellule.
Entrambi i metodi qui descritti consistono nelle procedure sperimentali standard come la coltura cellulare, l'immunostaining, l'imaging confocale e l'analisi delle immagini eseguite utilizzando ImageJ. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi software di elaborazione delle immagini con le funzioni appropriate. I metodi presentati possono monitorare e confrontare i cambiamenti inflitti dal trattamento farmacologico o dalla modificazione genetica minima. Non è consigliabile ottenere valori definiti, a causa della precisione limitata di questi metodi. Sono state incluse due macro automatizzate, per facilitare le misurazioni di molte immagini.
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Protocol
1. Passi preparatori
- Semina cellulare per ottenere monostrati confluenti
- Prima della seminazione, ricoprire i pozze di uno scivolo camera 4-pozzi con collagene I (o altro componente ECM di scelta). Per il rivestimento i collagene, seguire un protocollo commerciale: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html ad una concentrazione di 8 g/cm2.
- Seme 400.000 cellule ad un pozzo di uno scivolo a 4 camere.
- Coltura le cellule per 24 h (o più a lungo, a seconda degli endpoint sperimentali) prima di colorare, in un'incubatrice a 37 gradi centigradi, 5% CO2. Questo passaggio consente una maturazione dei contatti cellulare e la formazione di monostrati.
- Utilizzare un microscopio ottico invertito per verificare la confluenza (circa il 90%) e una condizione generale dei monostrati. Non procedere se le celle sono galleggianti o sembrano stressate.
- Colorazione immunofluorescente
NOTA: Le celle possono essere macchiate con un protocollo di scelta. Qui, l'immunofluorescenza è stata eseguita come descritto in precedenza4.- Per l'analisi dell'adesione focale, macchiare le cellule con una proteina di adesione focale di scelta (in questo protocollo paxillin). Per l'analisi della forma cellulare macchia con proteina di giunzione cellula-cellula di scelta (in questo protocollo plakoglobin a proteine desmosomiche).
- Per la procedura, utilizzare 0,5 mL di soluzioni specificate, se non diversamente specificato.
- Fissare le cellule nel 4% formaldeide in PBS per 30 min sul ghiaccio.
- Incubare con cloruro di ammonio da 0,1 m (in PBS) per 10 minuti per dissondare l'auto-fluorescenza.
- Aggiungere 0,5% Triton X-100 (in PBS) per 30 min (permeabilization).
- Blocco con 5% di latte (o 1% BSA) in TBS-T per 1 h.
- Incubare con anticorpo primario a 4 gradi durante la notte (anti-paxillina: coniglio, 1:250, anti-plakoglobin: coniglio, 1:400)
- Incubare con anticorpo secondario per 30 min (Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio, 1:500, 1:500)
- Macchie con 300 nM DAPI per 1-5 min, protetti dalla luce.
NOTA: Facoltativamente, può essere eseguita un'ulteriore colorazione dell'atto con coniugati di faloidina fluorescente (conc. 1:400); phalloidin deve essere aggiunto nello stesso passaggio dell'anticorpo secondario.
- Immagini confocali
- Prendere le immagini di singole fette di z utilizzando un microscopio confocale (ad es., l'isola lsM800).
NOTA: la colorazione dell'atto opzionale può aiutare a valutare il piano focale corretto. La colorazione dell'attrattiva corticale è presente nella regione apicale, mentre le fibre di stress di actina sono presenti nella regione basale, vicino al substrato, come illustrato nella figura 1. - Imaging adeno focale
- Scegliete le sezioni z per l'analisi dell'adesione focale dalla regione basale, vicino al substrato.
- Utilizzare un obiettivo con l'apertura numerica più alta disponibile (preferibilmente 63x N.A.: 1.4).
NOTA: La forma di FA è molto specifica e facilmente riconoscibile. Pertanto, si consiglia di avviare la scansione da un piano focale sotto le cellule e quindi lentamente la scansione verso di loro, fino a quando le FA non sono chiaramente visibili. L'analisi delle immagini sarà più accurata da campi di visione più piccoli, che tendono ad essere più uniformi, ma ciò implica che verrà calcolato un numero inferiore di celle in un unico campo visivo.
- Creazione di contatti con celle a celle
- Utilizzare un obiettivo 40x o 63x.
- Selezionare i canali per la colorazione nucleare e la colorazione proteica di giunzione preferita.
- Scegliete le sezioni z per l'analisi della forma delle celle dall'area apicale dei monostrati.
- Scattare foto per almeno 3 diversi campi di visione (200-400 celle).
- Prendere le immagini di singole fette di z utilizzando un microscopio confocale (ad es., l'isola lsM800).
2. Analisi dell'immagine
NOTA: le macro fornite funzionano in modo ottimale su ImageJ versione 1.50f o successiva. Utilizzare per la quantificazione solo di immagini con un elevato rapporto segnale-rumore e senza pixel sotto o sovrasatura. I metodi descritti includono passaggi che richiedono la regolazione manuale dei parametri. Pertanto, si consiglia un'analisi cieca/impostazione di esperimento cieco. Per crittografare i nomi dei file di immagine, è possibile utilizzare plugin ImageJ come "Blind Analysis Tool" (disponibile all'indirizzo: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools).
- Analisi dell'adesione focale
NOTA: i file di input consigliati per i seguenti metodi sono: immagini di FU rappresentate in scala di grigi a 8 bit salvate in formato .tiff.- Aprire l'immagine utilizzando ImageJ.
- Impostare la scala di un'immagine su pixel (Analyze Imposta scala; Rimuovi Scala e controlla Globale opzione).
- Includere il nome del file e l'area del ROI nelle opzioni di misurazione (Analyze Imposta misure...); selezionare Opzioni area e Visualizza etichette.
- Sottrarre lo sfondo (Processo Sottrai sfondo; impostare il parametro Raggio della palla rotante su 50 pixel; controllare l'opzione paraboloide scorrevole). Nel caso di immagini RGB pseudocolorate: dividi canali RGB, lascia il canale con le FA aperte, chiudi i canali rimanenti (Immagine Proprietà Color (Colore) Dividi canali).
- Determinare l'area dell'area di interesse più piccola (ROI). L'utilizzo di selezioni a mano libera o poligono delinea la più piccola adesione focale singola e ne misura l'area(Analyze Misura). Ripetere questo passaggio per diverse ROI (FU) da alcune immagini scelte casualmente (per un totale di 20 ROI). Calcolare e salvare la media dei risultati ottenuti.
NOTA: questo passaggio è necessario solo quando un determinato set di immagini viene analizzato per la prima volta (linea cellulare specifica, rivestimento diapositive con specifici componenti di matrice extracellulare, diverse condizioni di coltura). - Convertire l'immagine in binario utilizzando uno dei seguenti metodi:
- Impostare la soglia globale (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia; selezionare Le opzioni Predefinito, B&W e Sfondo scuro, regolare la soglia manualmente o impostarla automaticamente).
- Impostare la soglia locale (Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia locale automatica...; set Metodo su Phansalkar e controllare gli oggetti bianchi su sfondo nero opzione. Successivamente, invertire l'immagine (Modifica Inverti).
- Misurare il numero e l'area dei ROI. Selezionare Analizza . Analizzare le particelle; Selezionare Unità pixel, Visualizza risultati, Cancella risultati e Opzioni riepiloga ,impostare Parametro dimensione, come limite inferiore, utilizzare la media dei ROI più piccoli del passaggio 2.1.5. Il limite superiore può essere impostato al 25% di un'area cellulare tipica.
- Trasferire i dati (che includono il nome dell'immagine, il numero di FA, l'area totale e media di FA; rispettivamente Slice, Count, Total Area, Average Size) dalla finestra Riepilogo al programma di gestione dei dati scelto.
- Determinare il numero di cellule per immagine contando i nuclei macchiati DAPI. Il conteggio può essere fatto manualmente (Plugins Proprietà Analyze . Cell Counter) o come nei protocolli disponibili come: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
- In alternativa, per facilitare il conteggio delle fu, utilizzare la macro ImageJ associata (FAs.ijm).
- Spostare il file .ijm con la macro in plugin o nella cartella macro che si trova nelle cartelle dei file di origine di ImageJ.
- Determinare un'area del ROI più piccolo come descritto nel passaggio 2.1.4.
- Aprire il file di macro(Plugins Macros Modifica...).
- Prima di eseguire la macro impostare il valore di tre variabili: valore di riempimento di area_of_the_smallest_region_of_interest con un numero acquisito durante il passaggio 2.1.4. Impostare threshold_type valore su manuale o automatico.
- Salvare le modifiche (la macro deve essere pronta per l'uso).
- Chiamare la macro dal pannello ImageJ o creare una scorciatoia ad esso. La macro inizia con la finestra di dialogo aperta standard. Selezionare l'immagine da elaborare.
NOTA: in caso di regolazione manuale della soglia, sarà necessaria la conferma manuale del valore di soglia (evitando di accettare le modifiche utilizzando il pulsante Applica nella finestra di dialogo Soglia, utilizzare invece la finestra di dialogo personalizzata Azione richiesta). I risultati ottenuti utilizzando la macro sono gli stessi descritti nel passaggio 2.1.8 (incluso nella finestra di dialogo Riepilogo). Inoltre, nel caso di regolazione manuale della soglia Livello soglia inferiore viene visualizzato in una finestra di dialogo Registro, come questo valore consente di riprodurre i risultati ottenuti in futuro, se necessario. Le figure supplementari S1 e S2 sono state incluse come set di dati di training per la macro FAs.ijm.
- Analisi della forma delle celle
- Manuale
- Aprire un'immagine in ImageJ o in un altro software di elaborazione delle immagini con un set di funzioni simile (ulteriori istruzioni riguardano ImageJ). Scegliere i parametri da misurare selezionando dal menu Analisi . Impostare Misure e deselezionando i descrittori Forma nella casella visualizzata.
- Delinea manualmente i bordi delle cellule, contrassegnati da proteine di giunzione scelte, utilizzando l'icona Selezioni a mano libera. I parametri scelti vengono calcolati automaticamente per ogni cella. Memorizzare i risultati dopo aver delineato ogni cella facendo clic su Modifica Proprietà Selection . Aggiungi al gestore. Devono essere conteggiate solo celle complete interamente visibili, con bordi ininterrotti.
- Una volta delineate tutte le celle del campo visivo, effettuare la misurazione contrassegnando tutti i numeri visualizzati nella casella di sinistra di Gestione ROI (corrispondente alle celle) e facendo clic su Misura I risultati vengono visualizzati nella casella Risultati e possono essere trasferiti al foglio di calcolo preferito.
- Automatizzato
NOTA: Per facilitare la quantificazione dei descrittori di forma cellulare (CSI, proporzioni, rotondità, solidità) è stata preparata e allegata una macro ImageJ (CSI.ijm). La macro si basa principalmente sul plugin ImageJ chiamato MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)5. La macro esegue i seguenti passaggi: 1) Estensione di ogni bordo dell'immagine di 10 pixel neri [MorpholibJ]; 2) Cicli di dilatazioni ed erosioni - filtro morfologico [MorpholibJ]; 3) Generazione di immagine binaria dei confini delle cellule per segmentazione morfologica [MorpholibJ]; 4) Dilatazione dei confini cellulari; 5) Inversione del valore dei pixel; 6) Generazione di selezioni e misurazione dell'area e del perimetro delle celle sull'immagine; e 7) Salvare l'immagine con le celle delineate e le selezioni del ROI ImageJ in un nuovo file.- Spostare il file .ijm con la macro nella cartella plugins o macro che si trova nelle cartelle dei file di origine ImageJ. Chiamate la macro dal pannello ImmagineJ o fatevi una scorciatoia.
- Prima della quantificazione di un nuovo set di dati, determinare i valori delle aree più piccole e più grandi di interesse. Contorno (selezione a mano libera o poligono) alcuni (3-10) esempi delle celle più piccole e più grandi dell'immagine e quindi misurare la loro area (Analisi Misura).
- In alternativa, eseguire la macro con le impostazioni predefinite (il limite di dimensione inferiore è impostato su 0 e il limite superiore è impostato su infinito), attendere il completamento della macro e selezionare l'opzione Imposta i limiti delle dimensioni delle celle. Misurare l'area delle celle più piccole e più grandi facendo clic sulla relativa etichetta e quindi premere Misura in ImageJ ROI Manager. Impostare il valore delle variabili the_smallest_cell e the_biggest_cell. Salvare le modifiche, chiudere tutte le finestre di dialogo della macro ed eseguire nuovamente la macro.
NOTA: la macro può essere utilizzata senza impostare i limiti delle dimensioni del ROI, ma non è consigliata perché aumenta in modo significativo la possibilità di misurare frammenti di cellule o cluster di cellule inappropriati. - Avviare la macro con la finestra di dialogo Apri standard. Selezionare l'immagine da elaborare (gradazioni di grigio).
- Analizzare i risultati. L'output fornito dalla macro è costituito da: tabella dei risultati (etichetta della cella, etichetta immagine, area della cella [pixel2],perimetro della cella [pixel2],circolarità [CSI], proporzioni, rotondità, solidità), immagine con celle contornate e elenco selezioni del ROI (che verrà salvato anche nel nuovo file nella sottocartella Risultati). La tabella dei risultati verrà copiata automaticamente negli Appunti dell'utente.
NOTA: le figure supplementari S3 e S4 sono state incluse come set di dati di training per la macro CSI.ijm.
- Manuale
3. Quantificazione
- Quantificazione delle FA
- Calcolare il numero medio di cespiti e la dimensione media fa per cellula/nuclei.
NOTA: per alcune linee cellulari è possibile contare le FU separatamente in celle distinte. Per le linee cellulari che hanno forti contatti cellulari e crescono come monostrati come MCF7, il numero e le dimensioni delle FA per cella possono essere calcolati dividendo i valori ottenuti da FA contando per il numero di nuclei nell'intera immagine. - Valutare il significato statistico delle potenziali differenze tra le popolazioni (gruppi sperimentali). A seconda della distribuzione e della varianza dei dati, per il confronto dei due diversi gruppi utilizzare Student t-test (distribuzione normale) o non-parametrico U-test (Mann-Whitney). Per il confronto di più gruppi utilizzare unidirezionale ANOVA o Kruskal-Wallis in combinazione con i test post-hoc appropriati.
- Calcolare il numero medio di cespiti e la dimensione media fa per cellula/nuclei.
- Analisi della forma delle celle
- Calcolo dei descrittori di forma
- Analisi manuale: Calcolare l'indice della forma della cella (CSI, chiamata anche circolarità o forma cellulare) nel foglio di calcolo di scelta per ogni cella misurata dall'area e dal perimetro appropriati utilizzando la formula:
NOTA: CSI assume valori compresi tra 1 (circolare) e 0 (allungato). Gli esempi di varie forme di cella (con la stessa area) e le rispettive CSI sono presentati nella Figura 2. Nell'analisi automatizzata i valori dei descrittori di forma (inclusi e definiti di seguito) vengono calcolati automaticamente e visualizzati nella casella dei risultati:
(1) CSI - 4om/area/perimetro)2
(2) AR - Asse maggiore/asse minore
(3) Rotondità - 4oarea / z (asse principale)2
(4) Solidità : area/area convessa
- Analisi manuale: Calcolare l'indice della forma della cella (CSI, chiamata anche circolarità o forma cellulare) nel foglio di calcolo di scelta per ogni cella misurata dall'area e dal perimetro appropriati utilizzando la formula:
- Istogrammi della distribuzione delle forme cellulari
- Tracciare la distribuzione della forma della cella come istogramma di circolarità (CSI). Classificare le celle in base al loro valore CSI (calcolato per un minimo di 200-400 celle), a uno dei dieci intervalli uniformi (intervallo: 0-1, larghezza del contenitore: 0,1). L'istogramma visualizza il numero di celle in ogni categoria.
NOTA: l'istogramma che mostra la distribuzione della forma del tipico livello di cella MCF7 mostra un picco di circa 0,7-0,8 CSI. Se la forma delle cellule è distorta da qualche fattore (ad esempio il trattamento paclitaxel, che causa l'arresto di fase G2/M e in conseguenza più cellule sono rotonde) dovrebbe essere riflessa sull'istogramma.
- Tracciare la distribuzione della forma della cella come istogramma di circolarità (CSI). Classificare le celle in base al loro valore CSI (calcolato per un minimo di 200-400 celle), a uno dei dieci intervalli uniformi (intervallo: 0-1, larghezza del contenitore: 0,1). L'istogramma visualizza il numero di celle in ogni categoria.
- Grafici di distribuzione cumulativi
- Confrontare le distribuzioni CSI cumulative per ogni linea cellulare, perché è il modo migliore per valutare le differenze statisticamente importanti nei cambiamenti di forma delle cellule (o qualsiasi altro cambiamento nella distribuzione. Ad esempio, può essere applicato per tenere traccia della distribuzione mutevole delle FA.
- Calcolare la funzione di distribuzione cumulativa (CDF) per confrontare le distribuzioni. CDF assegna per un determinato valore CSI (stampato sull'asse X) la percentuale (o conteggio relativo) per la quale tutti i valori sono minori o uguali a questo valore CSI (stampato sull'asse Y). Pertanto, man mano che il valore CSI aumenta, anche la percentuale del set di valori minori o uguali a questo valore diventa più alta. CDF può essere calcolato dal software statistico di scelta, o manualmente.
- Per l'analisi statistica, utilizzare Kolgomorov-Smirnov test non parametrico.
- Calcolo dei descrittori di forma
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Representative Results
Analisi dell'adesione focale
L'abbattimenti del gene HAX1 è stato precedentemente dimostrato che influisce sulle aderene focali6. Le cellule sono state coltivate sulla superficie rivestita di collagene I per 48 h. Le immagini delle cellule di controllo MCF7 e MCF7 con un knockdown HAX1 (HAX1 KD) da tre esperimenti indipendenti macchiati con la colossione della proteina aderente paxillin sono stati ottenuti utilizzando un microscopio confocale (immagine da singolo piano focale / fetta z dalla regione basale). Le F da circa 2.000-2.500 cellule di ogni linea cellulare sono state quantificate utilizzando il protocollo descritto. Il valore medio per la più piccola adesione focale è stato impostato su 50 (pixel2). Le immagini rappresentative di F contano con ImageJ, inclusi i contorni finali numerati e la sovrapposizione dei contorni fAs con l'immagine originale, sono mostrate per entrambe le linee di cella sulla figura 3A. Le differenze nel numero e nelle dimensioni delle FU in entrambe le linee cellulari sono presentate nella figura 3B.
Analisi della forma delle celle
Valutazione manuale: Le cellule MCF7 sono state coltivate per 24 h, il mezzo è stato scambiato con lo stesso mezzo fresco (non trattato) o il mezzo con il paclitaxel da 0,1 M (PTX) - per indurre l'arrotondamento delle cellule - e coltivato per altri 24 h. Le immagini dei monostrati MCF7 confluenti macchiati con anti-plakoglobine e DAPI sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale confocale (sezione singola) . Sono state documentate circa 200-400 celle (2-3 campi di visualizzazione) di ogni esperimento (non trattate/trattate) (obiettivo 40x) e le immagini sono state valutate utilizzando il software di elaborazione delle immagini ImageJ (Figura 4A). Le regioni rappresentative di ogni livello cellulare con cellule delineate sono mostrate nella Figura 4A (cellule non trattate e trattate con PTX). Tutte le celle sono state classificate in base ai valori CSI (10 intervalli, larghezza del contenitore 0.1) e presentate nei rispettivi istogrammi (Figura 4B), che mostrano un aumento dell'ultimo contenitore (0,9-1) e dell'appiattimento dei picchi principali (0,6-0,9) per le cellule trattate da PTX, rispetto al controllo non trattato. Le differenze nella distribuzione cumulativa della CSI sono state calcolate per la significatività statistica utilizzando il test Kolgomorov-Smirnov (K-S), un test non parametrico dell'uguaglianza delle distribuzioni di probabilità unidimensionale. Gli istogrammi di distribuzione della frequenza e i grafici di distribuzione cumulativi (Figura 4C) sono stati generati con il software.
Valutazione automatizzata: Le cellule MCF7 sono state coltivate per 24 h, fissate e macchiate con phalloidina coniugata a fluoroforo per visualizzare l'actina. Le immagini sono state scattate utilizzando un microscopio confocale (singola fetta z dalla regione apicale). Le immagini in scala di grigi dei monostrati sono state analizzate utilizzando il file macro allegato, secondo il protocollo incluso (Figura 5A-C). Complessivamente, sono state quantificate 512 celle provenienti da 12 campi visivi. I risultati sono stati tracciati come un istogramma che presenta la distribuzione della circolarità (Figura 5D).
Figura 1: colorazione actina con phalloidin afluoforo coniugato, due diverse fette a z dallo stesso campo visivo. (A) La regione apile con actin corticale. (B) La regione basale con fibre di stress di actina. Barra: 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Esempi di valori CSI (Cell Shape Index) diversi per le forme con perimetri distinti, ma della stessa area. La forma molto allungata a sinistra ha CSI vicino a 0, mentre il cerchio ideale a destra ha CSI di 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione dell'adesione focale. (A) Immagini rappresentative delle linee cellulari basate su MCF7: CONTROL e HAX1 KD macchiate di paxillin; da sinistra a destra: (1) paxillin e nuclei (2) contornate e numerate FAs (3) sovrapposizione dei contorni delle FU e dell'immagine originale. Barra: 20 m. I rientri (sotto ogni immagine) mostrano le aree ingrandite con box. (B) Grafici che mostrano la differenza tra le dimensioni e il numero delle fu tra le due righe di cella. La significatività statistica è stata valutata utilizzando il test t student. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cambiamenti nella forma delle cellule indotti dal paclitaxel (PTX) nello strato di cella MCF7; conteggio manuale. (A) Regioni rappresentative dei monostrati MCF7, cellule non trattate e trattate con PTX, macchiate con plakoglobina proteica di giunzione e DAPI, barretta: 20 m. Il pannello a destra mostra l'immagine elaborata in ImageJ; i bordi delle celle sono delineati e tutte le celle contate sono numerate. (B) Istogrammi che mostrano la distribuzione CSI in cellule non trattate e ptX trattate, 200-400 cellule in ogni esperimento (non trattato/trattato), larghezza del contenitore: 0,1. I grafici sono stati generati utilizzando l'analisi della distribuzione di frequenza con frequenze relative come frazione. (C) La trama della distribuzione cumulativa per i monostrati non trattati e trattati con PTX. Differenza statistica calcolata utilizzando Kolgomorov-Smirnov test non parametrico (KS). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Forma cellulare nei monostrati MCF7 valutata utilizzando il metodo automatico. (A-C) Un esempio dell'analisi automatica delle immagini che illustra i passaggi successivi eseguiti dalla macro allegata. (A) Immagine di input; atto corticale; scala di grigi, barra in scala 10 m (per scopi informativi; le barre della scala non devono essere incorporate nelle immagini analizzate). (B) Strato di celle dopo la segmentazione; bordi delle celle delineati; celle senza bordi completi eliminati. (C) Sovrapposizione dei contorni della cella sull'immagine originale. (D) Un istogramma che mostra la distribuzione di CSI nel set di dati analizzato, 512 celle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare S1, S2: cellule MCF7, paxillin e DAPI-colorato per visualizzare FA e nuclei. Fornito come set di dati di training per la macro FAs.ijm.
Figura S1: Fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura S2: Fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare S3, S4: cellule MCF7, plakoglobina e MACCHIE DAPI per visualizzare le giunzioni cellulari e i nuclei. Fornito come set di dati di training per la macro CSI.ijm.
Figura S3: Fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura S4: Fare clic qui per scaricare questa figura.
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Discussion
L'adesione cellulare e substrato cellulare costituiscono attributi intrinseci delle cellule epiteliali e svolgono il ruolo critico nella morfogenesi dei tessuti e nell'embriogenesi. Nei tessuti adulti la corretta regolazione delle proprietà meccaniche dello strato cellulare è cruciale per mantenere l'omeostasi e prevenire le risposte patologiche come la progressione del tumore e la metastasi. La dimensione e il numero di adere focali dipendono dalla forza dell'adesione delle cellule-substrato, mentre la forma cellulare dipende dalle forze contrattuali ed è correlata allo stato dei contatti tra cellule.
Qui, descriviamo due semplici metodi di analisi quantitativa dell'area, il numero e la forma delle strutture cellulari macchiate dall'immunofluorescenza, in questo caso le adesioni focali e l'intera cellula nello strato cellulare. Tuttavia, gli strumenti proposti possono essere riutilizzati per la quantificazione di qualsiasi struttura scelta. La questione chiave di queste analisi è la qualità della colorazione immunofluorescente e dell'imaging confocale. Questi metodi possono essere implementati in qualsiasi laboratorio standard dotato di un'unità di coltura cellulare e di un microscopio confocale. Sono progettati per confrontare le linee cellulari, soprattutto quando le differenze (naturali o indotte da un trattamento specifico) nei parametri misurati sono sostanziali. Non sono raccomandati per misurare le differenze minime o per stabilire misurazioni assolute, perché sono sensibili a modifiche minime nelle impostazioni arbitrarie iniziali, soprattutto nel caso di adere focali. Questo metodo di quantificazione delle FU è inferiore a metodi più avanzati e specifici come la microscopia TIRF, ma ha il vantaggio di non richiedere attrezzature sofisticate.
Metodi simili di misurazione dell'adesione focale sono stati descritti primadi 7,8,9,10. Qui, abbiamo specificato le impostazioni e creato una macro ImageJ gratuita, con diverse opzioni, per facilitare le misurazioni.
L'analisi della forma cellulare è stata descritta molte volte, includendo metodi molto complessi e dettagliati11,12. Qui, presentiamo un metodo semplice per monitorare i cambiamenti nei monostrati cellulari epiteliali, che potrebbe essere molto importante per confrontare la morfologia cellulare o i cambiamenti dello sviluppo. Il metodo manuale di analisi della forma delle cellule nei monostrati presentati in questo protocollo è stato descritto in un rapporto precedente6. La formula CSI come un modo per descrivere e confrontare la forma di un oggetto (s) è ampiamente utilizzata in diverse discipline13,14, compresa la geologia da cui ha avuto origine. La presentazione dei risultati sotto forma di istogramma e/o come funzione di distribuzione cumulativa è comunemente utilizzata per confronti di distribuzioni di qualsiasi tipo8,10,15.
In particolare, presentiamo qui uno strumento per l'analisi automatica della forma delle cellule basata sul plugin ImageJ MorhpLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ). Forniamo un file macro, che può eseguire questa analisi in modo rapido ed efficiente. Questo metodo non riconosce sempre i bordi cellulari corretti, ma la percentuale di misurazioni difettose (presenti in ogni analisi automatizzata) è minima e non dovrebbe influire in modo significativo sul risultato finale, soprattutto se viene analizzato un numero sufficiente di celle. Le celle senza bordi completi vengono eliminate. L'analisi automatizzata della forma cellulare presenta innegabili vantaggi e presentiamo questo metodo in modo che possa essere apprezzato dalla comunità scientifica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Nazionale Scientifico Polacco sotto la concessione n. 2014/14/M/ NÀ1/00437.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
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