Summary
Artikkelen beskriver kvantifisering av 1) størrelsen og antall fokale adhesjoner og 2) celleformindeks og dens distribusjon fra konsantbilder av de sammenføyte monolagerne til MCF7-celler.
Abstract
Metodene som presenteres her kvantifisere noen parametere for samflytende tilhengercellemonolag fra flere passende fargede konsernbilder: vedheft til substratet som en funksjon av antall og størrelse på fokale adhesjoner, og celleform, preget av celleformindeksen og andre formbeskrivelser. Fokale adhesjoner ble visualisert av paxillin farging og cellecellegrenser var preget av kobling plakoglobin og actin. Metodene for cellekultur og farging var standard; bilder representerer enkelt fokale plan; bildeanalyse ble utført ved hjelp av offentlig tilgjengelig bildebehandlingsprogramvare. De presenterte protokollene brukes til å kvantifisere antall og størrelse på fokale adhesjoner og forskjellene i celleformfordeling i monolayers, men de kan brukes på nytt for kvantifisering av størrelsen og formen på enhver annen distinkt cellulær struktur som kan farges (f.eks mitokondrier eller kjerner). Å vurdere disse parametrene er viktig i karakteriseringen av de dynamiske kreftene i tilhengercellelag, inkludert celleadhesjon og actomyosin-kontraktilitet som påvirker celleformen.
Introduction
Epitelcellemonolag fungerer som et kollektiv der cellecelle- og cellesubstratvedheft samt kontraktile krefter og spenninger representerer viktige parametere, og deres riktige balanse bidrar til enhetens samlede integritet1,,2,,3. Dermed representerer vurdering av disse parametrene en måte å etablere gjeldende status for cellelaget.
De to metodene som er beskrevet her representerer en todimensjonal analyse av de samfalter monolager av tilhenger, epitelceller (i dette tilfellet MCF7 brystkreftcellelinje). Analysen utføres ved hjelp av konfuserte bilder (enkelt Z-skiver) fra forskjellige regioner på Z-aksen; basalområdet nær et substrat for fokale vedheft (FA) målinger og apikal region for celleform målinger. De presenterte metodene er relativt enkle og krever standard laboratorieteknikker og åpen kildekode-programvare. Konfisk mikroskopi er tilstrekkelig for denne protokollen, slik at den kan utføres uten å bruke mer spesialisert TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopi. Dermed kan protokollen implementeres i en relativt standard laboratorieinnstilling. Selv om nøyaktigheten av metodene er begrenset, kan de skille grunnleggende forskjeller i fokal vedheft og celleform.
Begge metodene som er beskrevet her består av standard eksperimentelle prosedyrer som cellekultering, immunstoppnåelse, konfikal bildebehandling og bildeanalyse utført ved hjelp av ImageJ. Imidlertid kan enhver bildebehandlingsprogramvare med de riktige funksjonene brukes. De presenterte metodene kan spore og sammenligne endringer påført av farmakologisk behandling eller minimal genetisk modifikasjon. Å skaffe bestemte verdier anbefales ikke, på grunn av den begrensede presisjonen til disse metodene. To automatiserte makroer ble inkludert, for å lette målingene av mange bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedende trinn
- Cellesåing for å oppnå samløpet monolag
- Før seeding, belegge brønnene i en 4-brønns kammer lysbilde med kollagen I (eller annen ECM komponent av valget). For kollagen jeg belegg, følg en kommersiell protokoll: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html med en konsentrasjon på 8 μg/cm2.
- Seed 400.000 celler til en brønn av en 4-brønn kammer lysbilde.
- Kultur cellene i 24 timer (eller lenger, avhengig av de eksperimentelle endepunktene) før farging, i en inkubator ved 37 °C, 5 % CO2. Dette trinnet gir mulighet for modning av cellecellekontakter og dannelsen av monolagere.
- Bruk et optisk, invertert mikroskop for å verifisere samløpet (ca. 90 % er nødvendig) og en generell tilstand av monolag. Ikke fortsett hvis cellene flyter eller ser stresset ut.
- Immunfluorescerende flekker
MERK: Celler kan farges med en protokoll av valget. Her inne ble immunofluorescens utført som tidligere beskrevet4.- For fokal vedheftanalyse, flekker cellene med et fokalt vedheftprotein av valget (i denne protokollen paxillin). For celleform analyse flekk med celle-celle junction protein av valget (i denne protokollen desmosomal protein plakoglobin).
- For prosedyren bruker du 0,5 ml spesifiserte løsninger med mindre annet er angitt.
- Fiks celler i 4% formaldehyd i PBS i 30 min på is.
- Inkuber med 0,1 M ammoniumklorid (i PBS) i 10 min for å slukke autofluorescens.
- Tilsett 0,5% Triton X-100 (i PBS) i 30 min (permeabilisering).
- Blokk med 5 % melk (eller 1 % BSA) i TBS-T i 1 timer.
- Inkuber med primær antistoff ved 4 °C over natten (anti-paxillin: kanin, 1:250, anti-plakoglobin: kanin, 1:400)
- Inkuber med sekundært antistoff i 30 min (Alexa Fluor 594 geit anti-kanin, 1:500, 1:500)
- Flekk med 300 nM DAPI i 1-5 min, beskyttet mot lys.
MERK: Eventuelt kan ytterligere farging av actin med fluorescerende phalloidin konjugater (konkus 1:400) utføres; phalloidin bør tilsettes på samme trinn som det sekundære antistoffet.
- Konfikal avbildning
- Ta bilder av enkelt Z-skiver ved hjelp av et konfusibelt mikroskop (f.eks. Zeiss LSM800).
MERK: Valgfri actin farging kan bidra til å vurdere riktig fokalplan. Kortikal actin farging er til stede i den apikale regionen mens actin stressfibre er til stede i basalområdet, nær substratet, som illustrert på figur 1. - Fokal vedheft avbildning
- Velg Z-skiver for fokal vedheftanalyse fra basalområdet, nær underlaget.
- Bruk en målsetting med høyest numerisk blenderåpning tilgjengelig (foretrekke 63x N.A.: 1.4).
MERK: Formen på FA er veldig spesifikk og lett gjenkjennelig. Dermed anbefales det å starte skanningen fra et fokalplan under celler og deretter sakte skanne mot dem, til FAs er tydelig synlige. Bildeanalyse vil være mer nøyaktig fra mindre synsfelt, som har en tendens til å være mer ensartet, men dette innebærer at færre celler vil bli beregnet i ett enkelt synsfelt.
- Bilde av cellecellekontakter
- Bruk en 40x eller 63x mål.
- Velg kanaler for kjernefysisk farging og foretrukket kobling protein farging.
- Velg Z-skiver for celleformanalyse fra det apikale området til monolagene.
- Ta bilder for minst 3 forskjellige synsfelt (200-400 celler).
- Ta bilder av enkelt Z-skiver ved hjelp av et konfusibelt mikroskop (f.eks. Zeiss LSM800).
2. Bildeanalyse
MERK: Forutsatt at makroer fungerer optimalt på ImageJ versjon 1.50f eller nyere. Brukes kun til kvantifisering av bilder med høyt signal-til-støy-forhold og uten under- eller overmetettede piksler. De beskrevne metodene inkluderer trinn som krever manuell parameterjustering. Dermed anbefales en blind analyse / blindet eksperiment oppsett. For kryptering av bildefilnavn kan ImageJ-programtillegg som "Blind Analysis Tool" (tilgjengelig på: https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) brukes.
- Fokal vedheft analyse
MERK: De anbefalte inndatafilene for følgende metoder er: bilder av FAer representert i 8-biters gråtoner lagret i TIFF-format.- Åpne bildet ved hjelp av ImageJ.
- Angi skalaen for et bilde til piksler (Analyser | Angi skala; Fjern Skaler og sjekk Global alternativ).
- Inkluder filnavnet og området for avkastning i målealternativer (Analyser | Sett målinger ...); kontroll område og vis etikett alternativer.
- Trekk fra bakgrunn (Prosess | Trekk fra bakgrunn; angi parameteren Rolling ball radius til 50 piksler. sjekk Sliding paraboloid alternativ). Når det gjelder pseudocolored RGB-bilder: split RGB-kanaler, la kanalen med FAs åpnet, lukk gjenværende kanaler (Bilde | Farge | Delte kanaler).
- Bestem området for det minste interesseområdet (ROI). Ved hjelp av frihånds- eller polygonvalg skisserer du den minste enkeltfokusvedheftet og måler området (Analyser | Mål). Gjenta dette trinnet for forskjellige ROM-er fra noen tilfeldig valgte bilder (for totalt 20 ROM).Repeat this step for different ROIs (FAs) from a few randomly selected images (for a total 20 ROIer). Beregn og lagre gjennomsnittet av oppnådde resultater.
MERK: Dette trinnet er bare nødvendig når et gitt sett med bilder analyseres for første gang (spesifikk cellelinje, belegglysbilder med bestemte ekstracellulære matrisekomponenter, forskjellige kulturforhold). - Konverter bildet til binær ved hjelp av en av følgende metoder:
- Angi den globale terskelen (Bilde | Juster | Terskel; sjekk Standard,B&W og Mørk bakgrunn alternativer, justere terskelen manuelt eller angi den automatisk).
- Angi den lokale terskelen (Bilde | Juster | Automatisk lokal terskel...; angi Metode til Phansalkar og sjekk Hvite objekter på svart bakgrunn alternativ. Deretter kan du invertere bildet (Rediger | Inverter).
- Mål tallet og området for ROIer. Velg Analyser | Analysere partikler; sjekk Pixel-enheter, Vis resultater, Fjern resultater og Oppsummer alternativer, angi Størrelse-parameter ,som en lavere grense, bruk gjennomsnittet for de minste ROIene fra trinn 2.1.5. Den øvre grensen kan settes til 25% av et typisk celleområde.
- Overfør data (som inkluderer bildenavn, antall FAer, totalt og gjennomsnittlig område for henholdsvis Del, Antall, Totalt område, Gjennomsnittsstørrelse) fra Sammendrag-vinduet til det foretrukne databehandlingsprogrammet.
- Bestem antall celler per bilde ved å telle DAPI-fargede kjerner. Telling kan gjøres manuelt (Plugins | Analysere | Celleteller) eller som i tilgjengelige protokoller som: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
- Du kan også gjøre det enklere å telle FAs vedlagte ImageJ-makroen (FAs.ijm).
- Flytt IJM-fil med makroen til plugins eller makromappe i ImageJ-kildefilmapper.
- Bestem et område av den minste avkastningen som beskrevet i trinn 2.1.4.
- Åpne makrofil (Plugins | Makroer | Rediger...).
- Før du kjører makroen, angi verdien for tre variabler: fyllverdien på area_of_the_smallest_region_of_interest med et tall som er anskaffet i trinn 2.1.4. Sett threshold_type-verdien til manuell eller automatisk.
- Lagre endringer (makroen skal være klar til bruk).
- Ring makroen fra ImageJ-panelet eller ta en snarvei til den. Makroen starter med standard åpen dialogvindu. Velg bildet som skal behandles.
MERK: Hvis det er nødvendig med manuell terskeljustering, kreves manuell bekreftelse av terskelverdien (unngå å godta endringer ved hjelp av Bruk-knappen i dialogboksen Terskel, bruk Handling Kreves egendefinert dialogvindu i stedet). Resultater som oppnås ved å arbeide med makroen, er de samme som de som er beskrevet i trinn 2.1.8 (inkludert i dialogboksen Sammendrag). I tillegg vises i tilfelle manuell terskeljustering lavere terskelnivå i et loggdialogvindu, da denne verdien tillater å reprodusere oppnådde resultater i fremtiden om nødvendig. Log Supplerende tall S1 og S2 ble inkludert som et treningsdatasett for FAs.ijm-makroen.
- Analyse av celleform
- Manuell
- Åpne et bilde i ImageJ eller en annen bildebehandlingsprogramvare med et lignende sett med funksjoner (ytterligere instruksjoner gjelder ImageJ). Velg parameterne som skal måles ved å velge fra menyen Analyse | Angi målinger og merke av figurbeskrivelser i boksen som vises.
- Manuelt avgrense cellekantlinjer, merket med koblingsprotein(er) av valget, ved hjelp av Freehand-valgikon. De valgte parameterne beregnes automatisk for hver celle. Lagre resultatene etter at hver celle er skissert ved å klikke Rediger | Utvalg | Legg til i leder. Bare fullstendige, helt synlige celler, med uavbrutte kantlinjer skal telles.
- Når alle cellene i visningsfeltet er skissert, gjør du målingen ved å merke alle tallene som vises i boksen til venstre i ROI Manager (tilsvarende celler) og klikker på Mål Resultatene vises i Resultater-boksen og kan overføres til regnearket du velger.
- Automatisert
MERK: For å lette kvantifiseringen av celleformbeskrivelser (CSI, sideforhold, rundhet, soliditet) er en ImageJ-makro utarbeidet og knyttet til denne artikkelen (CSI.ijm). Makroen er hovedsakelig basert på ImageJ plugin kalt MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)5. Makroen utfører følgende trinn: 1) Utvidelse av hver kantlinje av bildet med 10 svarte piksler [MorpholibJ]; 2) Runder av utvidelser og erosjoner - morfologiske filter [MorpholibJ]; 3) Generasjon av binære bildet av celler grenser ved morfologiske segmentering [MorpholibJ]; 4) Utvidelse av cellegrenser; 5) Inversjon av piksler verdi; 6) Generasjon av valg og måling av areal og omkrets av celler på bildet; og 7) Lagre bilde med skisserte celler og ImageJ ROI valg til en ny fil.- Flytt IJM-filen med makroen til plugins- eller makromappen i imagej-kildefilmappene. Ring makroen fra ImageJ-panelet eller ta en snarvei til den.
- Før kvantifiseringen av et nytt datasett, må du bestemme verdier av de minste og de største interesseområdene. Disposisjon (frihånds- eller polygonvalg) noen få (3-10) eksempler på de minste og de største cellene på bildet og deretter måle deres område (Analyser | Mål).
- Du kan også kjøre makroen med standardinnstillinger (nedre størrelsesgrense er satt til 0 og øvre grense er satt til uendelig), vent til makroen er ferdig og velg Angi alternativ for cellestørrelsesgrenser. Mål området for de minste og de største cellene ved å klikke på etiketten og trykk deretter Mål i ImageJ ROI Manager. Angi verdien for the_smallest_cell og the_biggest_cell variablene. Lagre endringer, lukk alle makrodialogvinduer og kjør makroen på nytt.
MERK: Makroen kan brukes uten å angi grenser for ROI-størrelse, men det anbefales ikke fordi den øker sjansen for å måle upassende cellefragmenter eller celleklynger betydelig. - Start makroen med standard åpne dialogvinduet. Velg bildet som skal behandles (gråtoner).
- Analyser resultatene. Utdataene fra makroen består av: tabell over resultatene (celleetikett, bildeetikett, celleområde [piksler2], celleområde [piksler2], sirkularitet [CSI], sideforhold, rundhet, soliditet), bilde med skisserte celler og roi-valgliste (som også lagres i ny fil i undermappen Resultater). Resultattabellen kopieres automatisk til brukerens utklippstavle.
MERK: Supplerende tall S3 og S4 ble inkludert som et treningsdatasett for CSI.ijm-makroen.
- Manuell
3. Kvantifisering
- Kvantifisering av FAs
- Beregn gjennomsnittlig FAs-tall og gjennomsnittlig aktivastørrelse per celle/kjerner.
MERK: For noen cellelinjer er det mulig å telle FAs separat i forskjellige celler. For cellelinjer som har sterke cellecellekontakter og vokser som monolagere som MCF7, kan antall og størrelse på FAer per celle beregnes ved å dele verdiene som er hentet fra FAer som teller med antall kjerner i hele bildet. - Vurdere statistisk signifikans av potensielle forskjeller mellom populasjoner (eksperimentelle grupper). Avhengig av distribusjon og varians av dataene, for sammenligning av de to forskjellige gruppene bruker Student t-test (normal distribusjon) eller ikke-parametrisk U-test (Mann-Whitney). Til sammenligning av flere grupper bruker enveis ANOVA eller Kruskal-Wallis i forbindelse med de riktige post-hoc-testene.
- Beregn gjennomsnittlig FAs-tall og gjennomsnittlig aktivastørrelse per celle/kjerner.
- Analyse av celleform
- Beregning av formbeskrivelser
- Manuell analyse: Beregn celleformindeks (CSI, også kalt sirkularitet eller cellefigur) i det foretrukne regnearket for hver målte celle fra riktig område og omkrets ved hjelp av formelen:
MERK: CSI forutsetter verdier mellom 1 (sirkulær) og 0 (langstrakt). Eksemplene på ulike celleformer (med samme område) og deres respektive CSIer presenteres i figur 2. I automatisert analyse beregnes verdiene for formbeskrivelser (vervet og definert nedenfor) automatisk og vises i resultatboksen:
(1) CSI = 4π*område/(perimeter)2
(2) AR = stor akse/mindre akse
(3) Rundhet = 4*område/π*(hovedakse)2
(4) Soliditet = område/konveks område
- Manuell analyse: Beregn celleformindeks (CSI, også kalt sirkularitet eller cellefigur) i det foretrukne regnearket for hver målte celle fra riktig område og omkrets ved hjelp av formelen:
- Histogrammer av celleformfordeling
- Plott celleformfordeling som et histogrammet av sirkularitet (CSI). Klassifisere celler i henhold til CSI-verdien (beregnet for minimum 200–400 celler), til ett av de ti ensartede intervallene (område: 0-1, hyllebredde: 0,1). Histogrammet viser antall celler i hver kategori.
MERK: Histogrammet som viser formfordeling av det typiske MCF7-cellelaget, viser en topp på rundt 0,7-0,8 CSI. Hvis cellenes form er forvrengt av en eller annen faktor (for eksempel paklitakselbehandling, som forårsaker G2/M-fasestans og i den konsekvens flere celler er runde) bør det gjenspeiles på histogrammet.
- Plott celleformfordeling som et histogrammet av sirkularitet (CSI). Klassifisere celler i henhold til CSI-verdien (beregnet for minimum 200–400 celler), til ett av de ti ensartede intervallene (område: 0-1, hyllebredde: 0,1). Histogrammet viser antall celler i hver kategori.
- Kumulative distribusjonsplott
- Sammenlign kumulative CSI-distribusjoner for hver cellelinje, fordi det er den beste måten å vurdere statistisk viktige forskjeller i cellefigurendringer (eller andre endringer i distribusjonen. Den kan for eksempel brukes til å spore den endrede distribusjonen av FAer.
- Beregn den kumulative distribusjonsfunksjonen (CDF) for å sammenligne distribusjoner. CDF tilordner for en gitt CSI-verdi (plottet på X-aksen) prosentandelen (eller relativ antall) som alle verdier er mindre eller lik denne CSI-verdien (plottet på Y-aksen). Dermed, som CSI-verdien blir høyere, prosentandelen av settet av verdier som er mindre eller lik denne verdien blir også høyere. CDF kan beregnes av den statistiske programvaren du velger, eller manuelt.
- Bruk Kolgomorov-Smirnov ikke-parametrisk test for statistisk analyse.
- Beregning av formbeskrivelser
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fokal vedheft analyse
Knockdown av HAX1 genet ble tidligere vist å påvirke fokal adhesjoner6. Celler ble dyrket på kollagen I-belagt overflate for 48 h. Bilder av MCF7 kontrollceller og MCF7 celler med en HAX1 knockdown(HAX1 KD) fra tre uavhengige eksperimenter farget med fokal vedheft protein paxillin ble oppnådd ved hjelp av et konfusikalt mikroskop (bilde fra enkelt fokal plan / Z-skive fra basal region). FAs fra ca 2000-2500 celler fra hver cellelinje ble kvantifisert ved hjelp av den beskrevne protokollen. Gjennomsnittsverdien for den minste fokale vedheftet ble satt til 50 (piksel2). Representative bilder av FAs teller med ImageJ, inkludert de endelige, nummererte konturene og overlegget av FAs-konturene med det opprinnelige bildet, vises for begge cellelinjene på figur 3A. Forskjeller i antall og størrelse på FAer i begge cellelinjene presenteres på figur 3B.
Analyse av celleform
Manuell vurdering: MCF7-celler ble dyrket i 24 timer, mediet ble byttet mot samme friske medium (ubehandlet) eller mediet med 0,1 μM paklitaksel (PTX) – for å indusere celleavrunding - og dyrket for ytterligere 24 h. Bilder av de sammenflettede MCF7 monolagene farget med anti-plakoglobin antistoff og DAPI ble oppnådd ved hjelp av et konfusalt mikroskop (enkelt Z-skive fra apikal region). Omtrent 200-400 celler (2-3 synsfelt) fra hvert eksperiment (ubehandlet/behandlet) ble dokumentert (40x mål) og bildene ble vurdert ved hjelp av ImageJ bildebehandling programvare (Figur 4A). Representative områder for hvert cellelag med skisserte celler vises i figur 4A (ubehandlede og PTX-behandlede celler). Alle celler ble kategorisert i henhold til deres CSI-verdier (10 intervaller, hyllebredde 0,1) og presentert i de respektive histogrammene (figur 4B), som viser en økning i den siste beholderen (0,9-1) og utflatingen av hovedtoppene (0,6-0,9) for PTX-behandlede celler, sammenlignet med den ubehandlede kontrollen. Forskjeller i den kumulative fordelingen av CSI ble beregnet for statistisk signifikans ved bruk av Kolgomorov-Smirnov test (K-S), en ikke-parametrisk test av likestilling av endimensjonale sannsynlighetsfordelinger. Frekvensdistribusjon histogrammer og kumulative distribusjonsplott(Figur 4C)ble generert med programvare.
Automatisert vurdering: MCF7 celler ble dyrket i 24 h, fast og farget med fluorophore-konjugert phalloidin å visualisere actin. Bilder ble tatt ved hjelp av et konfusalt mikroskop (enkelt Z-skive fra apikal region). Gråtonebildene av monolagene ble analysert ved hjelp av den vedlagte makrofilen, i henhold til den inkluderte protokollen (Figur 5A-C). Totalt ble 512 celler fra 12 synsvinkelfelt kvantifisert. Resultatene ble plottet som et histogram presentere distribusjon av sirkularitet (Figur 5D).
Figur 1: Actin farging med fluorophore-konjugert phalloidin, to forskjellige Z-skiver fra samme synsfelt. (A)Den apikale regionen med kortikale actin. (B)Basalområdet med actin stressfibre. Bar: 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempler på forskjellige verdier for cellefigurindeks (CSI) for figurene med distinkte omkretser, men det samme området. Den svært langstrakte formen til venstre har CSI nær 0, mens den ideelle sirkelen til høyre har CSI på 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Fokal vedheft kvantifisering. (A)Representative bilder av MCF7-baserte cellelinjer: CONTROL og HAX1 KD farget med paxillin; fra venstre til høyre: (1) paxillin og kjerner (2) skissert og nummerert FAs (3) overlegg av FAs skisser og det opprinnelige bildet. Bar: 20 μm. Innfelt (under hvert bilde) viser zoomede boksede områder. (B)Tomter som viser forskjellen i FAs størrelse og tall mellom de to cellelinjene. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av Student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Endringer i celleform indusert av paklitaksel (PTX) i MCF7-cellelag; manuell telling. (A) Representative regioner av MCF7 monolag, celler ubehandlet og behandlet med PTX, farget med avkobling protein plakoglobin og DAPI, bar: 20 μm. Panelet til høyre viser bildet behandlet i ImageJ; cellekanter er skissert og alle tellede celler er nummerert. (B)Histogrammer som viser CSI-fordeling i ubehandlede og PTX-behandlede celler, 200-400 celler i hvert eksperiment (ubehandlet/behandlet), hyllebredde: 0,1. Tomter ble generert ved hjelp av frekvensfordelingsanalyse med relative frekvenser som en brøk. (C) Tomten for kumulativ fordeling for de ubehandlede og PTX-behandlede monolagene. Statistisk forskjell beregnet ved bruk av Kolgomorov-Smirnov ikke-parametrisk test (KS). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Celleform i MCF7 monolag vurdert ved hjelp av den automatiserte metoden. - Jeghar ikke noe valg. Et eksempel på den automatiserte bildeanalysen som illustrerer etterfølgende trinn utført av den vedlagte makroen. (A)Inndatabilde; kortikal actin; gråtoner, skala bar 10 μm (for informative formål; skala barer bør ikke bygges inn i analyserte bilder). (B) Cellelag etter segmentering; cellegrenser skissert; celler uten fullstendige grenser eliminert. (C)Overlegg av cellen skisserer på det opprinnelige bildet. (D)Et histogrammet som viser fordelingen av CSI i det analyserte datasettet, 512 celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur S1, S2: MCF7-celler, paxillin og DAPI-farget for å visualisere FAer og kjerner. Leveres som et treningsdatasett for FAs.ijm-makroen.
Figur S1: Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Figur S2: Klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur S3, S4: MCF7-celler, plakoglobin og DAPI-farget for å visualisere cellecellekryss og kjerner. Leveres som et treningsdatasett for CSI.ijm-makroen.
Figur S3: Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Figur S4: Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellecelle- og cellesubstratadhesjon utgjør iboende attributter av epitelcellene og spiller den kritiske rollen i vevmorfogenese og embriogenese. I voksent vev er riktig regulering av mekaniske egenskaper av cellelaget avgjørende for å opprettholde homeostase og forhindre patologiske reaksjoner som tumorprogresjon og metastase. Størrelsen og antall fokale adhesjoner avhenger av styrken av celle-substrat vedheft, mens celleform avhenger av kontraktile krefter og er relatert til statusen for celle-celle-kontakter.
Her beskriver vi to enkle metoder for kvantitativ analyse av området, antall og form av cellulære strukturer farget av immunofluorescens, i dette tilfellet fokale adhesjoner og hele cellene i cellelaget. Imidlertid kan de foreslåtte verktøyene brukes om igjen for kvantifisering av enhver valgt struktur. Hovedproblemet for disse analysene er kvaliteten på immunfluorescerende farging og konfikal avbildning. Disse metodene kan implementeres i ethvert standardlaboratorium utstyrt med en cellekulturenhet og et konfusisk mikroskop. De er utformet for å sammenligne cellelinjer, spesielt når forskjellene (naturlig eller indusert av spesifikk behandling) i de målte parametrene er betydelige. De anbefales ikke å måle små forskjeller eller for å etablere absolutte målinger, fordi de er følsomme for minimale endringer i de første vilkårlige innstillingene, spesielt når det gjelder fokale adhesjoner. Denne metoden for FAs kvantifisering er dårligere enn mer avanserte og spesifikke metoder som TIRF-mikroskopi, men den har en fordel av ikke å kreve sofistikert utstyr.
Lignende metoder for fokal vedheft målinger ble beskrevet før7,8,9,10. Her spesifiserte vi innstillingene og opprettet en gratis ImageJ-makro, med flere alternativer, for å lette målingene.
Celleformanalyse ble beskrevet mange ganger, inkludert svært komplekse og detaljerte metoder11,12. Her presenterer vi en enkel metode for å spore endringene i epitelcellemonolag, noe som kan være svært viktig for å sammenligne cellemorfologi eller utviklingsendringer. Den manuelle metoden for celleformanalyse i monolagene som presenteres i denne protokollen, ble beskrevet i en tidligere rapport6. CSI-formelen som en måte å beskrive og sammenligne formen på et objekt(er) er mye brukt i ulike disipliner13,14, inkludert geologi som det oppsto fra. Presentasjon av resultatene i en form for et histogrammet og/eller som en kumulativ distribusjonsfunksjon brukes vanligvis til sammenligninger av distribusjoner av noe slag8,10,15.
Spesielt presenterer vi her et verktøy for den automatiserte celleformanalysen basert på ImageJ plugin MorhpLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ). Vi tilbyr en makrofil, som kan utføre denne analysen raskt og effektivt. Denne metoden gjenkjenner ikke alltid de riktige cellegrensene, men prosentandelen av defekte målinger (som finnes i hver automatisert analyse) er minimal og bør ikke påvirke det endelige resultatet betydelig, spesielt hvis nok antall celler analyseres. Celler uten fullstendige grenser elimineres. Automatisert celleformanalyse har ubestridelige fordeler, og vi presenterer denne metoden slik at den kan verdsettes av det vitenskapelige samfunnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det polske nasjonale vitenskapssenteret under tilskudd nr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, Pt 18 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, Pt 2 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
