Summary
Makalede, 1) odak yapışıklıklarının büyüklüğü ve sayısı ile 2) hücre şekil indeksi ve MCF7 hücrelerinin eşzamanlı monolayers konfokal görüntülerinden dağılımının nicelikselleştirilmesi açıklanmaktadır.
Abstract
Burada sunulan yöntemler, birden fazla uygun şekilde boyanmış konfokal görüntülerden konfluent yapışık hücre monolayers bazı parametreleri ölçmek: odak yapışıklıkların sayısı ve boyutu bir fonksiyonu olarak substrat yapışma, ve hücre şekli, hücre şekli indeksi ve diğer şekil tanımlayıcıları ile karakterize. Fokal yapışıklıklar paxillin boyama ile görselleştirildi ve hücre-hücre sınırları birleştiğinde plakoglobin ve aktin ile işaretlendi. Hücre kültürü ve boyama yöntemleri standarttı; görüntüler tek odak düzlemlerini temsil; görüntü analizi kamuya açık görüntü işleme yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sunulan protokoller, odak yapışıklıklarının sayısını ve boyutunu ve monokatmanlarda hücre şekli dağılımındaki farklılıkları ölçmek için kullanılır, ancak boyanabilir (örneğin, mitokondri veya çekirdek) diğer farklı hücresel yapının boyut ve şeklinin ölçülmesi için yeniden kullanılabilir. Bu parametrelerin değerlendirilmesi, hücre adezyonu ve hücre şeklini etkileyen actomiyozin kontraktürü de dahil olmak üzere yapışık hücre tabakasındaki dinamik kuvvetlerin karakterizasyonunda önemlidir.
Introduction
Epitel hücre monolayers hücre-hücre ve hücre-substrat adezyon yanı sıra kontraktil kuvvetler ve gerginlikler önemli parametreleri temsil ve uygun denge birim1,2,3genel bütünlüğüne katkıda bir kolektif olarak hareket . Bu nedenle, bu parametrelerin değerlendirilmesi hücre tabakasının geçerli durumunu belirlemek için bir yol temsil eder.
Burada açıklanan iki yöntem yapışık, epitel hücrelerinin (bu durumda MCF7 meme kanseri hücre hattı) konfluent monolayers iki boyutlu bir analizitemsil eder. Analiz, Z ekseninde farklı bölgelerden gelen konfokal görüntüler (tek Z dilimleri) kullanılarak gerçekleştirilir; odak yapışma (FA) ölçümleri için bir substrata yakın bazal bölge ve hücre şekli ölçümleri için apikal bölge. Sunulan yöntemler nispeten basit ve standart laboratuvar teknikleri ve açık kaynak yazılım gerektirir. Konfokal mikroskopi bu protokol için yeterlidir, bu nedenle daha özel TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopi sayılmadan yapılabilir. Böylece protokol nispeten standart bir laboratuvar ortamında uygulanabilir. Yöntemlerin doğruluğu sınırlı olsa da, odak yapışması ve hücre şeklindeki temel farklılıkları ayırt edebilirler.
Burada açıklanan her iki yöntem de ImageJ kullanılarak yapılan hücre culturing, immunostaining, confokal görüntüleme ve görüntü analizi gibi standart deneysel prosedürlerden oluşmaktadır. Ancak, uygun işlevlere sahip herhangi bir görüntü işleme yazılımı kullanılabilir. Sunulan yöntemler farmakolojik tedavi veya minimal genetik modifikasyon tarafından meydana gelen değişiklikleri izleyebilir ve karşılaştırabilirsiniz. Bu yöntemlerin sınırlı hassasiyeti nedeniyle kesin değerlerin elde edilmesi önerilmez. Birçok görüntünün ölçümlerini kolaylaştırmak için iki otomatik makro dahil edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hazırlık adımları
- Enfluent monolayers elde etmek için hücre tohumlama
- Tohumlamadan önce, kollajen I (veya tercih edilen diğer ECM bileşeni) ile 4-wells oda slayt kuyuları kat. Kollajen I kaplama için ticari bir protokoluygulayın: 8 μg/cm2konsantrasyonda https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/collagen-product-protocols.html.
- Tohum 400.000 hücreleri bir kuyuya 4-iyi oda slayt.
- Kültür hücreleri için 24 saat (veya daha uzun, deneysel uç noktalara bağlı olarak) boyama önce, bir kuvözde 37 °C, 5% CO2. Bu adım hücre-hücre temaslarının olgunlaşmasını ve monolayers oluşumunu sağlar.
- Biraraya geldiğini doğrulamak için optik, ters mikroskop (yaklaşık %90 gereklidir) ve monokatmanların genel bir durumunu kullanın. Hücreler kayan veya stresli görünüyorsa devam etmeyin.
- İmmünofloresan boyama
NOT: Hücreler tercih edilen bir protokol ile boyanabilir. Burada, immünofluorescence daha önce açıklandığı gibi yapıldı4.- Fokal adezyon analizi için hücreleri tercih edilen bir fokal adezyon proteini ile lekeleyin (bu protokol paxillin'de). Hücre şekli analizi için hücre-hücre kavşak proteini ile leke tercih (Bu protokolde desmosomal protein plakoglobin).
- Yordam için, aksi belirtilmedikçe belirtilen çözümlerin 0,5 mL kullanın.
- PBS'deki %4 formaldehitteki hücreleri 30 dakika buz üzerinde sabitle.
- 0,1 M amonyum klorür ile inkübat (PBS) için 10 dakika otomatik floresan söndürmek için.
- 30 dakika (permeabilizasyon) için %0,5 Triton X-100 (PBS olarak) ekleyin.
- TBS-T'de %5 süt (veya %1 BSA) ile 1 saat boyunca bloke edin.
- Bir gecede 4 °C'de primer antikor ile inkübat (anti-paxillin: tavşan, 1:250, anti-plakoglobin: tavşan, 1:400)
- 30 dk ikincil antikor ile kuluçka (Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan, 1:500, 1:500)
- 1-5 dk için 300 nM DAPI ile leke, ışıktan korunur.
NOT: İsteğe bağlı olarak, floresan phalloidin konjugatları ile aktin ek boyama (conc. 1:400) yapılabilir; phalloidin ikincil antikor ile aynı adımda eklenmelidir.
- Konfokal görüntüleme
- Konfokal mikroskop (örneğin, Zeiss LSM800) kullanarak tek Z dilimlerinin görüntülerini alın.
NOT: İsteğe bağlı aktin boyama uygun odak düzleminin değerlendirilmesinde yardımcı olabilir. Kortikal aktin boyama apikal bölgede bulunurken, şekil 1'degösterildiği gibi, substrata yakın bazal bölgede aktin stres lifleri mevcuttur. - Fokal adezyon görüntüleme
- Substrata yakın bazal bölgeden odak yapışma analizi için Z dilimlerini seçin.
- Mevcut en yüksek sayısal diyafram açıklığına sahip bir hedef kullanın (tercih edilen 63x N.A.: 1.4).
NOT: FA şekli çok özel ve kolayca tanınabilir. Bu nedenle, hücrelerin altındaki bir odak düzleminden tazyik başlatmak ve fas açıkça görünür olana kadar, daha sonra yavaş yavaş onlara doğru tazyin önerilir. Görüntü analizi daha düzgün olma eğilimindedir görme küçük alanlardan daha doğru olacaktır, ancak bu daha az hücre görüş tek bir alanda hesaplanacaktır anlamına gelir.
- Hücre-hücre kontaklar görüntüleme
- 40x veya 63x hedefi kullanın.
- Nükleer boyama ve tercih edilen kavşak protein boyama için kanalları seçin.
- Tek katmanlı apikal bölgeden hücre şekli analizi için Z dilimlerini seçin.
- En az 3 farklı görme alanı (200-400 hücre) için fotoğraf çek.
- Konfokal mikroskop (örneğin, Zeiss LSM800) kullanarak tek Z dilimlerinin görüntülerini alın.
2. Görüntü analizi
NOT: Sağlanan makrolar ImageJ sürüm 1.50f veya daha yeni üzerinde en iyi şekilde çalışır. Yalnızca sinyal-gürültü oranına sahip ve düşük veya aşırı doymamış görüntülerin sayısallaştırılması için kullanın. Açıklanan yöntemler, el ile parametre ayarlaması gerektiren adımları içerir. Bu nedenle, kör bir analiz/kör deney kurulumu önerilir. Görüntü dosya adlarını şifrelemek için "Blind Analysis Tool" (şu https://imagej.net/Blind_Analysis_Tools) gibi ImageJ eklentileri kullanılabilir.
- Odak yapışma analizi
NOT: Aşağıdaki yöntemler için önerilen giriş dosyaları şunlardır: .tiff formatında kaydedilen 8 bitlik gri tonlamada temsil edilen FA'ların görüntüleri.- ImageJ kullanarak görüntüyü açın.
- Görüntünün ölçeğini piksellere ayarlama(Analiz Etme | Set Ölçeği; Ölçeği kaldır ve Genel seçeneğini işaretleyin).
- Ölçüm seçeneklerine dosya adını ve YG alanını ekleyin (Analiz | Ölçümleri Ayarla...); Alan ve Görüntü etiketi seçeneklerini kontrol edin.
- Arka planı çıkarma (İşlem | Arka Planı çıkarın; Rolling ball yarıçapı parametresini 50 piksele ayarlayın; sürgülü paraboloid seçeneğini kontrol edin). Sözde renkli RGB görüntüleri söz konusu olduğunda: RGB kanallarını böl, FAs açık kanalbırakın, kalan kanalları kapatın (Resim | Renk | Kanalları Böl).
- En küçük ilgi alanının (YG) alanını belirleyin. Freehand veya poligon seçimlerini kullanarak en küçük tek odak yapışmasını ana hatlarını ve alanını ölçün (Analiz | Ölçü). Rastgele seçilen birkaç resimden (toplam 20 ROI için) farklı ROI'lar (FAs) için bu adımı yineleyin. Elde edilen sonuçların ortalamasını hesaplayın ve kaydedin.
NOT: Bu adım yalnızca belirli bir görüntü kümesi ilk kez analiz edildiğinde (belirli hücre hattı, belirli hücre dışı matris bileşenleriyle kaplama slaytları, farklı kültür koşulları) gereklidir. - Aşağıdaki yöntemlerden birini kullanarak görüntüyü ikiliye dönüştürün:
- Genel eşiği ayarlama (Resim | Ayarla | Eşik; Varsayılan, B&W ve Koyu Arka Plan seçeneklerini kontrol edin, eşiği el ile ayarlayın veya otomatik olarak ayarlayın).
- Yerel eşiği ayarlama (Resim | Ayarla | Otomatik Yerel Eşik...; Phansalkar'a Yöntem'i ayarlayın ve siyah arka plan seçeneğinde Beyaz nesneleri denetleyin. Sonraki, görüntü ters (Edit | Ters çevir).
- ROI sayısını ve alanını ölçün. Analiz'i Seçin | Parçacıkları Analiz Et; piksel birimlerini kontrol edin, sonuçları göster, sonuçları temizle ve özetle seçenekleri, Boyut parametresiayarla , alt sınır olarak adım 2.1.5'ten en küçük ROI'ların ortalamasını kullanın. Üst sınır, tipik bir hücre alanının %25'ine ayarlanabilir.
- Veri aktarımı (görüntü adı, FAs sayısı, TOPLAM ve ORTALAMA FAs alanı; sırasıyla Dilim, Count, Toplam Alan, Ortalama Boyut) Özet penceresinden tercih edilen veri yönetim programına.
- DAPI lekeli çekirdekleri sayarak görüntü başına hücre sayısını belirleyin. Sayma elle yapılabilir (Eklentiler | Analiz Et | Hücre Sayacı) veya mevcut protokoller gibi: https://imagej.net/Nuclei_Watershed_Separation.
- Alternatif olarak, FAs sayma kolaylaştırmak için, ekli ImageJ makro (FAs.ijm) kullanın.
- .ijm dosyasını makroyla birlikte ImageJ kaynak dosyaları klasörlerinde bulunan eklentilere veya makrolara taşıyın.
- Adım 2.1.4'te açıklandığı gibi en küçük yg'nin alanını belirleyin.
- Makro dosyayı aç (Eklentiler | Makrolar | Edit...).
- Makroyu çalıştırmadan önce üç değişkenin değerini ayarlayın: adım 2.1.4 sırasında elde edilen bir sayıyla area_of_the_smallest_region_of_interest değerini doldurun. Threshold_type değeri manuel veya otomatikolarak ayarlayın.
- Değişiklikleri kaydet (makro kullanıma hazır olmalıdır).
- Macro'yu ImageJ panelinden arayın veya kısayol yapın. Makro standart açık iletişim penceresi ile başlar. İşlenecek resmi seçin.
NOT: Manuel eşik ayarlaması durumunda, eşik değerinin manuel olarak onaylanması gerekir (Eşik iletişim penceresinde Uygula düğmesini kullanarak değişiklikleri kabul etmekten kaçının, bunun yerine Action Required özel iletişim penceresini kullanın). Makroile çalışarak elde edilen sonuçlar, 2.1.8 adımında açıklananlarla aynıdır (Özet iletişim penceresine dahildir). Ayrıca, el ile eşik ayarı durumunda Alt Eşik Düzeyi, gerektiğinde elde edilen sonuçların gelecekte çoğaltılmasını sağladıklarından, Bir Günlük iletişim penceresinde görüntülenir. Ek Rakamlar S1 ve S2, FAs.ijm makrosu için bir eğitim veri seti olarak eklenmiştir.
- Hücre şekli analizi
- El ile
- Benzer bir işlev kümesine sahip bir görüntüyü ImageJ'de veya başka bir görüntü işleme yazılımında açın (diğer yönergeler ImageJ ile ilgilidir). Menüden Seçilerek ölçülecek parametreleri seçin Çözümlüanaliz | Ölçümleri ve görünen kutudaki Şekil tanımlayıcılarını işaretleyin.
- Freehand seçimleri simgesini kullanarak, tercih edilen bağlantı proteini(ler) ile işaretlenmiş hücre kenarlıklarını el ile açıkla. Seçilen parametreler her hücre için otomatik olarak hesaplanır. Her hücreyi anahatladıktan sonra Sonuçları Düzenle'yi tıklatarak depolayın | Seçim | Yöneticiye ekle. Yalnızca kesintisiz kenarlıklı tam, tamamen görünür hücreler sayılmalıdır.
- Görünüm alanındaki tüm hücreler ana hatlarıyla işaretlendiğinde, Yatırım Getirisi Yöneticisi'nin sol kutusunda görünen tüm sayıları işaretleyerek (hücrelere karşılık gelen) ve Ölçü Letık'ı tıklatarak Sonuçlar kutusunda görünen sonuçlar ve tercih edilen elektronik tabloya aktarılabilir.
- Otomatik
NOT: Hücre şekil tanımlayıcılarının (CSI, en boy oranı, yuvarlaklık, sağlamlık) sayısallaştırılmasını kolaylaştırmak için bir ImageJ makrosu hazırlandı ve bu makaleye (CSI.ijm) iliştirildi. Makro esas olarak MorphoLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ)5olarak adlandırılan ImageJ eklentisi dayanmaktadır. Makro aşağıdaki adımları yürütür: 1) Görüntünün her sınırının 10 siyah pikselle uzatılması [MorpholibJ]; 2) Genişlemeler ve erozyonlar Turlar - morfolojik filtre [MorpholibJ]; 3) Morfolojik segmentasyon [MorpholibJ] ile hücre sınırlarıikili görüntü üretimi; 4) Hücre sınırlarının genişlemesi; 5) Piksel değerinin ters çevrilmesi; 6) Görüntüdeki hücrelerin alan ve çevre lerinin seçimi ve ölçülmesi; ve 7) Özetlenen hücrelerle görüntüyü kaydetme ve Yeni bir dosyaya ImageJ Yatırım Getirisi seçimleri.- .ijm dosyasını makroyla birlikte ImageJ kaynak dosyaları klasörlerinde bulunan eklentilere veya makrolara taşıyın. Macro'yu ImageJ panelinden arayın veya kısayol yapın.
- Yeni bir veri kümesinin nicelemeönce, en küçük ve en büyük ilgi alanlarının değerlerini belirleyin. Anahat (serbest veya çokgen seçimi) görüntüdeki en küçük ve en büyük hücrelerin birkaç (3-10) örneği ve sonra kendi alanını ölçmek (Analiz | Ölçü).
- Alternatif olarak, makroyu varsayılan ayarlarla çalıştırın (alt boyut sınırı 0 olarak ayarlanır ve üst sınır sonsuza ayarlanır), makronun tamamlanmasını bekleyin ve hücre boyutu sınırlarını ayarla seçeneğini seçin. Etiketlerini tıklatarak en küçük ve en büyük hücrelerin alanını Measure ölçün ve Ardından ImageJ Yatırım Getirisi Yöneticisi'nde Ölçün'e basın. the_smallest_cell ve the_biggest_cell değişkenlerinin değerini ayarlayın. Değişiklikleri kaydedin, tüm makro iletişim pencerelerini kapatın ve makroyu yeniden çalıştırın.
NOT: Makro, YG boyutu sınırları ayarlanmadan kullanılabilir, ancak uygun olmayan hücre parçalarını veya hücre kümelerini ölçme şansını önemli ölçüde artırdığı için önerilmez. - Makroyu standart Aç iletişim penceresiyle başlatın. İşlenecek görüntüyü seçin (gri tonlama).
- Sonuçları analiz edin. Makro tarafından sağlanan çıktı oluşur: sonuçların tablosu (hücre etiketi, görüntü etiketi, hücre alanı [piksel2], hücre çevresi [piksel2], dairesellik [CSI], en boy oranı, yuvarlaklık, sağlamlık), özetlenen hücreleri ve YG seçimleri listesi ile görüntü (sonuçlar alt klasöründe yeni dosyada da kaydedilecektir). Sonuç tablosu otomatik olarak kullanıcının panosuna kopyalanır.
NOT: Ek Şekil S3 ve S4 CSI.ijm makro için bir eğitim veri seti olarak dahil edildi.
- El ile
3. Niceleme
- FAs'ın Sayısallaştırılması
- Hücre/çekirdek başına ortalama FAs sayısını ve ortalama FA boyutunu hesaplayın.
NOT: Bazı hücre hatları için farklı hücrelerde ayrı ayrı FAs saymak mümkündür. Güçlü hücre hücresi kontadayı olan ve MCF7 gibi monolayers olarak büyüyen hücre hatları için, hücre başına FAs sayısı ve boyutu, tüm görüntüdeki çekirdek sayısına göre sayma fas'lardan elde edilen değerlerin bölünmesiyle hesaplanabilir. - Popülasyonlar (deney grupları) arasındaki potansiyel farklılıkların istatistiksel önemini değerlendirin. Verilerin dağılımına ve varlığına bağlı olarak, iki farklı grubun karşılaştırılması nda Öğrenci t-testi (normal dağılım) veya parametrik olmayan U-testi (Mann-Whitney) kullanılır. Birden fazla grubun karşılaştırılması için uygun post-hoc testleri ile birlikte tek yönlü ANOVA veya Kruskal-Wallis kullanın.
- Hücre/çekirdek başına ortalama FAs sayısını ve ortalama FA boyutunu hesaplayın.
- Hücre şekli analizi
- Şekil tanımlayıcılarının hesaplanması
- Manuel analiz: Formülü kullanarak, ilgili alan dan ve çevreden ölçülen her hücre için tercih edilen elektronik tabloda hücre şekil indeksi (CSI, dairesellik veya hücre şekli olarak da adlandırılır) hesaplayın:
NOT: CSI 1 (dairesel) ve 0 (uzatılmış) arasındaki değerleri varsayar. Çeşitli hücre şekilleri (aynı alana sahip) ve ilgili CSI örnekleri Şekil 2'desunulmuştur. Otomatik analizde şekil tanımlayıcılarının değerleri (aşağıda kayıtlı ve tanımlanmış) otomatik olarak hesaplanır ve sonuç kutusunda görünür:
(1) CSI = 4π*alan/(çevre)2
(2) AR = ana eksen/minör eksen
(3) Yuvarlama = 4*alan/π*(ana eksen)2
(4) Katılık = alan/konveks alanı
- Manuel analiz: Formülü kullanarak, ilgili alan dan ve çevreden ölçülen her hücre için tercih edilen elektronik tabloda hücre şekil indeksi (CSI, dairesellik veya hücre şekli olarak da adlandırılır) hesaplayın:
- Hücre şekli dağılımının histogramları
- Dairesellik (CSI) bir histogram olarak çizim hücre şekil dağılımı. Hücreleri CSI değerine göre sınıflandırın (en az 200-400 hücre için hesaplanır), on tekdüze aralıktan birine (aralık: 0-1, depo genişliği: 0,1). Histogram her kategorideki hücre sayısını görüntüler.
NOT: Tipik MCF7 hücre tabakasının şekil dağılımını gösteren histogram, 0.7-0.8 CSI civarında bir zirve gösterir. Hücrelerin şekli bir faktör tarafından bozulursa (örneğin G2/M faz ına neden olan paklitaksel tedavi ve sonuç olarak daha fazla hücre yuvarlaktır) histograma yansıtılmalıdır.
- Dairesellik (CSI) bir histogram olarak çizim hücre şekil dağılımı. Hücreleri CSI değerine göre sınıflandırın (en az 200-400 hücre için hesaplanır), on tekdüze aralıktan birine (aralık: 0-1, depo genişliği: 0,1). Histogram her kategorideki hücre sayısını görüntüler.
- Kümülatif dağılım çizimleri
- Hücre şekli değişikliklerindeki (veya dağıtımdaki diğer değişiklikleri) istatistiksel olarak önemli farklılıkları değerlendirmenin en iyi yolu olduğundan, her hücre hattı için kümülatif CSI dağılımlarını karşılaştırın. Örneğin, FAs değişen dağıtımını izlemek için uygulanabilir.
- Dağılımları karşılaştırmak için Kümülatif Dağıtım İşlevini (CDF) hesaplayın. CDF, tüm değerlerin bu CSI değerine daha az veya eşit olduğu (Y ekseninde çizilmiş) belirli bir CSI değeri (X ekseninde çizilmiş) yüzdesini (veya göreli sayısını) atar. Böylece, CSI değeri arttıkça, bu değere eşit olan değerler kümesinin yüzdesi de yükselir. CDF, tercih edilen istatistiksel yazılımla veya el ile hesaplanabilir.
- İstatistiksel analiz için Kolgomorov-Smirnov parametrik olmayan testi kullanın.
- Şekil tanımlayıcılarının hesaplanması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Odak yapışma analizi
HAX1 geninin nakavt daha önce fokal yapışıklıkları etkilediği gösterilmiştir6. Hücreler kollajen I-kaplı yüzeyde 48 saat boyunca kültürlendi. Fokal yapışma proteini paxillin ile boyanmış üç bağımsız deneyden(HAX1 KD) MCF7 kontrol hücrelerinin ve MCF7 hücrelerinin görüntüleri konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi (bazal bölgeden tek odak düzleminden/Z-diliminden görüntü). Her hücre hattından yaklaşık 2.000-2.500 hücreden fa'lar açıklanan protokol kullanılarak ölçüldü. En küçük odak yapışmasının ortalama değeri 50 olarak ayarlanmıştır (piksel2). ImageJ ile fas temsilcisi görüntüler, son, numaralı anahatlar ve orijinal görüntü ile FAs anahatlarının bindirme de dahil olmak üzere, Şekil 3Aher iki hücre çizgileri için gösterilir. Her iki hücre hattındaki FA'ların sayı ve büyüklük farklılıkları Şekil 3B'de sunulmuştur.
Hücre şekli analizi
Manuel değerlendirme: MCF7 hücreleri 24 saat kültüre, orta aynı taze orta (işlenmemiş) veya 0.1 μM paklitaksel (PTX) ile orta ile değiştirildi - hücre yuvarlama ikna etmek için - ve başka bir 24 h. confluent MCF7 monolayers anti--oglobin antikor ve DAPI görüntüleri için kültürlü bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi (tek Z-dilim apikal bölge). Her deneyden yaklaşık 200-400 hücre (2-3 görüş alanı) (tedavi edilmemiş/tedavi edilmemiş) belgelenmiş (40x amacı) ve görüntüler ImageJ görüntü işleme yazılımı kullanılarak değerlendirilmiştir(Şekil 4A). Özetlenen hücrelere sahip her hücre tabakasının temsili bölgeleri Şekil 4A'da (tedavi edilmeyen ve PTX ile tedavi edilen hücreler) gösterilmiştir. Tüm hücreler CSI değerlerine (10 aralıklı, bin genişliği 0.1) göre sınıflandırılır ve ilgili histogramlarda(Şekil 4B)sunulmuştur ve bu da son depo kutusunda (0,9-1) artış ve PTX ile tedavi edilen hücreler için ana zirvelerin (0,6-0,9) düzlemeğini gösteren, işlenmemiş kontrolle karşılaştırılarak sunulmuştur. CSI'ın kümülatif dağılımındaki farklılıklar, tek boyutlu olasılık dağılımlarının eşitliğinin parametrik olmayan bir testi olan Kolgomorov-Smirnov testi (K-S) kullanılarak istatistiksel anlamlılık açısından hesaplandı. Frekans dağılımı histogramları ve kümülatif dağılım çizimleri(Şekil 4C)yazılımla oluşturulmuştur.
Otomatik değerlendirme: MCF7 hücreleri 24 saat boyunca kültüre alındı, sabit ve florofon konjuge phalloidin ile boyanmış aktin görselleştirmek için. Görüntüler konfokal mikroskop (apikal bölgeden tek Z-dilimi) kullanılarak çekilmiştir. Monolayers gri tonlama görüntüleri ekli makro dosyası kullanılarak analiz edildi, dahil protokolüne göre (Şekil 5A-C). Toplamda, 12 görüş alanından 512 hücre ölçüldü. Sonuçlar dairesellik dağılımını gösteren bir histogram olarak çizilmiştir (Şekil 5D).
Şekil 1: Florofor konjuge phalloidin ile aktin boyama, aynı görüş alanından iki farklı Z-dilimleri. (A) Kortikal aktinli apikal bölge. (B) Aktin stres lifli bazal bölge. Çubuk: 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Farklı çevreleri olan ancak aynı alana sahip şekiller için farklı Hücre Şekil Dizini (CSI) değerlerine örnekler. Soldaki çok uzatılmış şekil CSI 0'a yakın, sağdaki ideal dairede ise 1 CSI vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Odak yapışma niceliği. (A) MCF7 tabanlı hücre hatlarının temsili görüntüleri: CONTROL ve HAX1 KD paxillin ile boyanmış; soldan sağa: (1) paxillin ve çekirdekleri (2) özetlenen ve fas (3) fas overlay ve orijinal görüntü numaralandırılır. Bar: 20 μm. Insets (her resmin altında) yakınlaştırılmış kutulu alanları gösterir. (B) İki hücre çizgisi arasındaki FAs boyutu ve sayısı arasındaki farkı gösteren çizimler. Öğrenci t-testi kullanılarak istatistiksel anlamlılık değerlendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MCF7 hücre tabakasında paklitaksel (PTX) tarafından indüklenen hücre şeklindeki değişiklikler; (A) MCF7 monolayers temsilcisi bölgeleri, tedavi edilmeyen ve PTX ile tedavi hücreleri, kavşak protein plakoglobin ve DAPI ile boyanmış, bar: 20 μm. Sağdaki panel ImageJ'de işlenen görüntüyü gösterir; hücre kenarları ana hatlarıyla özetlenir ve tüm sayılan hücreler numaralanır. (B) Tedavi edilmeyen ve PTX ile tedavi edilen hücrelerde CSI dağılımını gösteren histogramlar, her deneyde 200-400 hücre (tedavi edilmemiş/tedavi edilmemiş), depo genişliği: 0.1. Çizimler bir kesir olarak göreli frekansları ile frekans dağılım analizi kullanılarak oluşturuldu. (C) Tedavi edilmeyen ve PTX ile tedavi edilen monolayers için kümülatif dağıtım arsa. Kolgomorov-Smirnov parametrik olmayan testi (KS) kullanılarak hesaplanan istatistiksel fark. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: MCF7 monolayers hücre şekli otomatik yöntem kullanılarak değerlendirildi. (A-C) Ekli makro tarafından yürütülen sonraki adımları gösteren otomatik görüntü analizi örneği. (A) Giriş görüntüsü; kortikal aktin; gri tonlama, ölçek çubuğu 10 μm (bilgilendirici amaçlar için; ölçek çubukları analiz edilen görüntülere katıştırılmamalıdır). (B) Segmentasyon sonrası hücre tabakası; hücre sınırları özetlenmiştir; tam sınırları olmayan hücreler ortadan kaldırıldı. (C) Hücrenin altlığı orijinal görüntüde ana hatlarını oluşturur. (D) Analiz edilen veri setinde CSI dağılımını gösteren bir histogram, 512 hücre. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1, S2: MCF7 hücreleri, paxillin ve DAPI-FAs ve çekirdekleri görselleştirmek için lekeli. FAs.ijm makrosu için bir eğitim veri kümesi olarak sağlanır.
Şekil S1: Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil S2: Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil S3, S4: MCF7 hücreleri, plakoglobin ve DAPI-hücre-hücre kavşakları ve çekirdekleri görselleştirmek için lekeli. CSI.ijm makrosu için bir eğitim veri kümesi olarak sağlanır.
Şekil S3: Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil S4: Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre-hücre ve hücre-substrat adezyonu epitel hücrelerinin doğal özelliklerini oluşturur ve doku morfogenezi ve embriogenezinde kritik rol oynar. Erişkin dokularda hücre tabakasının mekanik özelliklerinin uygun şekilde düzenlenmesi homeostazı korumada ve tümör progresyonu ve metastaz gibi patolojik yanıtların önlenmesinde çok önemlidir. Fokal yapışıklıkların boyutu ve sayısı hücre-substrat yapışıklığı gücüne bağlıdır, hücre şekli ise kontraktil kuvvetlere bağlıdır ve hücre-hücre temaslarının durumuyla ilişkilidir.
Burada, immünoresans ile boyanmış hücresel yapıların alanı, sayısı ve şekli, bu durumda odak yapışıklıkları ve hücre tabakasındaki tüm hücrelerin kantitatif analizinin iki basit yöntemini açıklıyoruz. Ancak, önerilen araçlar seçilen herhangi bir yapının nicelleştirilmesi için yeniden kullanılabilir. Bu analizlerin en önemli konusu immünofloresan boyama ve konfokal görüntülemenin kalitesidir. Bu yöntemler, hücre kültürü ünitesi ve konfokal mikroskop ile donatılmış herhangi bir standart laboratuvarda uygulanabilir. Özellikle ölçülen parametrelerdeki farklar (doğal veya spesifik tedavi ile indüklenen) önemli olduğunda, hücre hatlarını karşılaştırmak için tasarlanmıştır. Özellikle odak yapışıklıkları söz konusu olduğunda, ilk rasgele ayarlardaki en az değişike duyarlı olduklarından, dakika farklarını ölçmeleri veya mutlak ölçümler oluşturmaları önerilmez. FAs sayısallaştırma Bu yöntem TIRF mikroskobu gibi daha gelişmiş ve özel yöntemler aşağı, ama sofistike ekipman gerektirmeyen bir avantajı vardır.
Fokal adezyon ölçümlerinin benzer yöntemleri7,8,,9,10' dan önce tanımlanmıştır. Burada, ayarları belirttik ve ölçümleri kolaylaştırmak için çeşitli seçeneklerle birlikte ücretsiz bir ImageJ makrosu oluşturduk.
Hücre şekli analizi çok karmaşık ve ayrıntılı yöntemler11,,12dahil olmak üzere birçok kez açıklanmıştır. Burada, epitel hücre monokatmanlarındaki değişiklikleri izlemek için basit bir yöntem salıyoruz, bu da hücre morfolojisi veya gelişimsel değişiklikleri karşılaştırmak için çok önemli olabilir. Bu protokolde sunulan monokatmanlarda hücre şekil analizinin el ile yöntemi bir öncekiraporda6 açıklanmıştır. Csi formülü tanımlamak ve bir nesnenin (ler) şeklini karşılaştırmak için bir yol olarak yaygın olarak farklı disiplinlerde kullanılır13,14, hangi kökenli jeoloji dahil. Bir histogram şeklinde ve / veya kümülatif dağıtım fonksiyonu olarak sonuçların sunumu yaygın olarak her türlü dağılımları karşılaştırmaları için kullanılır8,10,15.
Özellikle, burada ImageJ eklentisi MorhpLibJ (https://imagej.net/MorphoLibJ) dayalı otomatik hücre şekli analizi için bir araç salıyoruz. Bu çözümlemesi hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirebilen bir makro dosyası salıyoruz. Bu yöntem her zaman doğru hücre kenarlıklarını tanımaz, ancak hatalı ölçümlerin yüzdesi (her otomatik çözümlemede bulunan) çok azdır ve özellikle yeterli sayıda hücre analiz edildiğinde nihai sonucu önemli ölçüde etkilememelidir. Tam kenarlıklar olmayan hücreler ortadan kaldırılır. Otomatik hücre şekli analizi nin yadsınamaz avantajları vardır ve bu yöntemi bilimsel topluluk tarafından takdir edilebilsin diye sıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından 2014/14/M/NZ1/00437 sayılı hibe kapsamında desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, Pt 18 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, Pt 2 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
