Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Stabilitet och struktur av Fladdermus Major Histocompatibility Complex Klass I med heterologous β2-Microglobulin

Published: March 10, 2021 doi: 10.3791/61462
Automatic Translation
*1,2, *3,4, *2,5, 1,2, 1,2, 2, 2, 4, 1, 4, 1,2
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Protokollet beskriver experimentella metoder för att erhålla stabila stora histocompatibility komplexa (MHC) klass I genom potentiella β2-mikroglobulin(β2m) substitutioner från olika arter. Den strukturella jämförelsen av MHC jag stabiliseras av homologa och heterologa β2m undersöktes.

Abstract

Det stora histokompatibilitet komplexa (MHC) spelar en central roll i antigen peptid presentation och T cell immun svar mot infektionssjukdomar och tumör utveckling. Hybrid MHC I komplex med heterologa β2-mikroglobulin(β2m) ersättning från olika arter kan stabiliseras in vitro. Detta är ett genomförbart sätt att studera MHC I av däggdjur, när den homologa β2m inte är tillgänglig. Samtidigt anges att däggdjurs β2m substitution inte signifikant påverkar peptidpresentationen. Det finns dock begränsad summering av metoden och tekniken för hybrid MHC I komplex med heterologt β2-mikroglobulin (β2m). Häri presenteras metoder för att utvärdera genomförbarheten av β2m substitution i MHC I studie. Dessa metoder inkluderar förberedelse av uttryckskonstruktioner; Rening av inklusionsorgan och omdubblning av MHC-komplexet. Bestämning av proteintermostabilitet. kristallscreening och strukturbestämning. Denna studie ger en rekommendation för att förstå funktion och struktur av MHC I, och är också signifikant för T-cells svar utvärdering under infektionssjukdomar och tumör immunterapi.

Introduction

Det stora histokompatibilitetskomplexet (MHC) finns i alla ryggradsdjur och är en uppsättning gener som bestämmer den cellmedierade immuniteten mot infektiösa patogener. MHC klass I presenterar endogena peptider, såsom viruskomponenter som produceras vid virusinfektion, till T-cellsreceptorer (TCR) på ytan av CD8+ T-celler för att medla cellulär immunitet och delta i immunreglering1. En strukturell studie av MHC I som binder till peptider ger information om peptidbindningsmotiv och presentationsfunktioner av MHC I-molekyler, som spelar viktiga roller vid utvärdering av CD8+ T-cellsimmunsvar och vaccinutveckling.

Sedan den första kristalliseringen och strukturella bestämningen av MHC I molekylär av Björkman et al.2, kristallstrukturanalysen av MHC I molekyler har kraftigt främjat förståelsen av hur peptider binder till MHC I molekyler, och hjälper till att förstå interaktionen mellan lätta kedjor med tunga kedjor och peptider. En serie uppföljande studier visade att även om generna som kodar för ljuskedjan inte är associerade med MHC, är ljuskedjan ett nyckelprotein för montering av MHCI-molekyler 3,4. Det interagerar med de tre domänerna i MHC klass I molekyler på flera ytor. När ljuskedjan är frånvarande kan MHC-molekyler av klass I inte uttryckas korrekt på ytan av antigen-presenterande celler och kan inte interagera med TCR för att utöva sina immunologiska funktioner.

MHC I består av en tung kedja (H-kedja) och ljuskedja (dvs. β2-mikroglobulin(β2m)) och monteras genom bindning till en lämplig peptid5. Det extracellulära segmentet i H-kedjan består av α1-, α2- och α3-domäner6. Domänerna α1 och α2 bildar peptidbindningsspåret (PBG). Den β 2 mkedjanfungerar som en strukturell underavdelning av monteringskomplexet i MHC I, stabiliserar konformationen av komplexet och är ett molekylärt förkläde för MHC I H-kedjevikning7,8,9. En serie studier har visat att MHC I H kedjor från olika däggdjur såsom fladdermus (Chiroptera) (Ptal-N *01:01)10, rhesus makaker (Primater) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mus (Rodentia) (H-2Kd) 14,1415, hund (Carnivora) (DLA-88*50801)16, nötkreatur (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 och häst (Peris (Eqca-N*00602 och Eqca-N*00601)18 kan kombineras med heterologt β2m(tabell 1). Dessa hybridmolekyler används ofta i strukturella och funktionella studier. Metoden för funktionell och strukturell studie av hybrid MHC I med heterologa β2m är dock ännu inte sammanfattad. Samtidigt är den strukturella grunden för den utbytta β2m mellan olika taxa fortfarande oklar.

Häri sammanfattas proceduren för MHC I uttryck, om dukning, kristallisering, kristall data insamling och struktur bestämning. Dessutom analyseras potentiella substitutioner av β2m från olika arter genom att jämföra den strukturella konformationen av MHC I stabiliseras av homologa och heterologa β2m. Dessa metoder kommer att vara till hjälp för ytterligare MHC I strukturstudie och CD8+ T cell immunsvar utvärdering i cancer och infektionssjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse av uttryckskonstruktioner

  1. Hämta sekvenserna av MHC-klass I-gener (inklusive förutsagda gener) från fladdermöss från NCBI-databasen.
  2. Hämta högre däggdjur MHC I tunga kedjesekvenser från Immuno Polymorphism Database (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) och UniProt-databasen (www.uniprot.org).
  3. För att få lösliga MHC-komplex, mutagenisera sekvenserna för att ta bort cytosoliska och transmembrane regioner.
  4. Klona generna som kodar för ectodomains av fladdermusen Ptal-N *01:01 (GenBank nr. KT98792919) (rester 1–277) och fladdermus β2m (GenBank nr. XP_006920478.1) (rester 1–98) till pET-28a vektorer (Novagen, Peking, Kina).
  5. Infoga de optimerade (för Escherichia coli)sekvenserna sattes in mellan NcoI och EcoR1 platser av en modifierad pET-28a vektor.
  6. Konstruera β2m uttrycksplasmider som tidigare beskrivits20.

2. Peptidsyntes

  1. Peptider förutsägelse
    1. Som beskrivitstidigare 10, för att screena för peptider som kan binda till Ptal-N * 01: 01, förutsäga kandidatpeptider med hjälp av proteinkropparna av fladdermusrelaterade virus hendravirus (HeV). För att erhålla peptider med hög affinitet baserad på den strukturella modellen från onlineservern förutspådde NetMHCpan 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 och Rosetta FlexPepDock22 potentiell bindning i den valda peptidfraktionen. Dessutom har annan programvara och databaser inklusive BIMAS, Immune Epitope Database (IEDB), NetCTL 1.2 och SYFPEITHI kan också användas, alla integrerar förutsägelse av peptid-MHC klass I bindande affinitet, transportör associerad med antigen bearbetning (TAP) transporteffektivitet, proteasomal C-terminal klyvning och halvtid av dissociation av peptid-HLA klass I molekyler i sina avläsningar.
    2. För att förutsäga högbindande peptider, använd både NetMHCpan- och Rosetta FlexPepDock-servern.
      OBS: Tyvärr matchade varken producerade förutsägelser de experimentella data. Detta kan tyda på att nuvarande MHC bindande peptid förutsägelser inte var lämpliga för icke-mänskliga och icke-mus däggdjur såsom fladdermöss, som kan ha ett annat sätt att peptidbindning. Därför måste vi kombinera olika förutsägelseprogram och experimentella resultat för omfattande analys för att få hög affinitetspeptider.
  2. Peptider beredning och konservering
    1. I stället för att generera anpassade peptider, använd specialiserade tjänsteleverantörer. Köp alla peptider kommersiellt enligt peptidförutsägelseverktyg, som har en högre bindningspoäng. Peptid renhet fastställdes vara >95% av HPLC och masspektrometri.
    2. Förvara alla inköpta peptider som frystorkat pulver vid −80 °C och lös upp i dimetylsulfoxid (DMSO) före användning.

3. Rening av inklusionsorgan

  1. Omvandling av E. coli
    1. Transformera 10 ng plasmid som innehåller fladdermus MHC I Ptal-N*01:01 H-kedja, eller mänsklig β2m eller fladdermus β2m till 100 μL BL21(DE3) E. coli. Bada i is i 30 min.
    2. Värmestöt vid 42 °C i 90 s, följt av bad i is i 2 minuter.
    3. Tillsätt 800 μL lysogenbuljong (LB: jästextrakt, tryptone och NaCl; se materialförteckningen)till steg 3.1.2 och skaka vid 200 rotationer per minut (varvtal) på en gungplattform vid 37 °C i 20 min.
    4. Applicera 100 μL bakteriell suspension på plattan som innehåller motsvarande antibiotikaresistens (ampicillin: 100 ng/ml), som är samma som tidigare konstruktioner.
  2. Inokulera kulturer
    1. Välj en enda nyligen omvandlad bakterieklon till 3 ml LB med antibiotikamedium (ampicillin: 100 ng/mL) och kultur vid 37 °C, samtidigt som du skakar vid 200 varv/min på en gungplattform för att aktivera bakterierna. Kulturer kan vaccinelas sent på natten, för att vara redo för induktion nästa morgon.
    2. En natt i förväg, överför 500 μL av det aktiverade bakteriebeståndet till 50 ml LB med antibiotikamedium (ampicillin: 100 ng/mL) och inkubera över natten vid 37 °C och skaka vid 200 varv/min. För bekvämlighet vid beredning av nästa inokulera, frys det återstående aktiverade bakteriebeståndet i 1 ml alikvoter (500 μL kultur med 500 μL 40% glycerol) vid −80 °C tills nästa beredning behövs.
    3. För att generera stora mängder rekombinant protein, överför bakteriepreparatet till 2 L LB med antibiotikamedium (ampicillin: 100 ng/mL) vid ett förhållande av 1:100, inkubera vid 37 °C medan du skakar vid 200 varv/min. Kultur tills en absorbans på 0,6 vid 600 nm uppnås. Tillsätt 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (variera koncentrationen av IPTG för olika MHC, mestadels mellan 0,1 mM-1 mM) till kolven för induktion av proteinuttryck.
  3. Skörda bakterier
    1. Överför bakterierna till centrifugflaskor och centrifugera vid 5000 x g i 20 min vid 4 °C. Alla steg från och med nu bör utföras vid 4 °C.
    2. Återanvänd bakterierna i 60 ml fosfatbuffert saltlösning (PBS) och frigör det uttryckta rekombinanta proteinet med ultraljud cell disruptor.
      OBS: I allmänhet är programmet vi ställer in på denna maskin ultraljud 6S, intervall 12S, 300 W, 99 gånger).
  4. Rening av inklusionsorgan
    1. Centrifugera den soniska bakteriesuspensionen vid 12 000 x g i 30 min. Kassera supernatanten och återanvänd pelleten i en lämplig volym tvättbuffert (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Upprepa den här processen en gång till.
    2. Centrifug vid 12 000 x g i 10–20 min. Kassera supernatanten och återanvänd de inklusionsorganen i återsuspensionsbufferten (50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Ta bort ett 20 μL-prov (införandeorgan i återsuspensionsbuffert) för SDS-PAGE för att testa renheten hos inklusionsorganen.
    3. Centrifugera den återstående förberedelsen på 12 000 x g i 10–20 minuter. Kassera supernaten. Väg pelleten som innehåller inneslutningsorganen och tillsätt upplösningsbuffert (6 M Gua-HCl, 10% glycerin, 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) till en slutlig koncentration på 30 mg/ml. Rör om långsamt med en magnetomrörare vid 4 °C tills inklusionskropparna löses upp i upplösningsbufferten.
    4. Centrifug 12 000 x g i 10–20 min. Kassera fällorna. Förvara de inklusionskropparna vid −20 °C eller −80 °C.
      OBS: Innan du fortsätter med rening av införande organ, bekräfta att induktion och uttryck av rekombinant protein var framgångsrika. Kör prover från varje odling (tagna före och efter IPTG-induktion) på en proteingel; 15% SDS-PAGE (SDS-PAGE koncentrerat tuggummi: H2O, 30% akrylamid, 1 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 10% APS och TEMED; SDS-PAGE separationsgel: H2O, 30% akrylamid, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS och TEMED; se materialförteckningen) för β2m, 10% SDS-PAGE för H-kedjan.

4. Omdubbling av MHC-komplex

OBS: Effektiviteten hos de återveckade inklusionsorganen kommer att påverka utbytet av protein som erhålls. Vikning konkurrerar med polymerisation, så det är allmänt accepterat att omviktning vid låga proteinkoncentrationer är den mest framgångsrika metoden. I detta dokument är koncentrationen av inklusionskroppar 30 mg/ml.

  1. Förbered ommappningsbufferten.
    1. Variera sammansättningen av omdubblningsbufferten beroende på proteinet. Till exempel kommer pH, jonisk styrka, redoxförhållanden och närvaron av ligands att påverka omställningarna. Det vanligaste är att använda Tris- eller HEPES-baserade buffertar vid ett neutralt pH med NaCl-koncentrationen 50-500 mM, men detta beror också på målproteinet. Följande är den omformel av buffert som används i den här artikeln.
    2. Förbered vikbufferten med 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA-2Na.
    3. Kyl bufferten till 4 °C i en 250–300 ml kolv och tillsätt sedan 5 mM reducerad glutation (GSH) och 0,5 mM oxiderad glutation (GSSG). Rör om långsamt med en magnetomrörare vid 4 °C i ytterligare 10–20 minuter innan du lägger till inklusionskroppar och peptider.
  2. Injektion och utspädning av MHC H-kedjan och β2m
    OBS: Temperaturen vid vilken omställningar utförs kan variera, men i allmänhet, för att minimera aggregering, är 4 °C bäst. Vi använder utspädning för att omdubbla proteinerna.
    1. Använd en nål från en 1 ml spruta, injicera 1 ml hβ2m inneslutningskroppar eller bβ2m inneslutningskroppar i två omdubblningsbuffertar (1 liter vardera). Injicera nära den kraftigt roterande omrörningsstången för att få snabb och effektiv utspädning. β2m omdubblas relativt enkelt och förblir stabil även i avsaknad av H-kedjan.
    2. Efter att β2m har lösts upp i ommappningslösning, lös upp peptider (5 mg/ml) i DMSO och injicera snabbt 200 μL i ommappningslösningen. Rör om långsamt i 10–20 minuter innan du lägger till H-kedjan.
    3. Injicera H-kedjan med samma procedur som beskrivs ovan β2m. H-kedjan är mycket instabil; Därför är injektionsordningen ganska viktig. Injicera 3 ml H-kedjeinkluderingskroppar i två olika omdubblningsbuffertar (1 liter vardera) med hβ2m respektive bβ2m. Den på varandra följande injektionen av små alikvoter i stället för den enda tillämpningen av hela mängden protein ökar utbytet av refolded MHC. Låt omdubblningen fortsätta vid 4 °C i 8–10 timmar.
  3. Koncentration av omveckat protein
    1. Använd ultrafiltrering i en tryckkammare med 10 kDa MMCO-membran för koncentration av omviktningsproteinerna. Denna metod är bekväm och kan kombineras med buffertutbyte. Tillsätt utbytesbuffert (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8.0) i kammaren och koncentrera till en slutlig volym på 30–50 ml.
    2. Överför omdubblningslösningen till ett centrifugrör, snurra vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C för att avlägsna fällningar.
    3. Överför försiktigt supernaten och koncentrera dig ytterligare till en slutlig volym på ~ 1 ml.
    4. Centrifug vid 12 000 xg i 10–20 min. Överför supernatanten till ett sterilt rör och rena proteinerna med en 10/300 GL storleksuteslutningskolonn.
    5. Samla proverna på toppen och analysera dem med SDS-PAGE (15% polyakrylamidgel).
    6. Samla MHC-komplextoppen och koncentrera till en slutlig koncentration på 15 mg/ml.
    7. Späd komplexet till 7,5 mg/ml och 15 mg/ml för kristallisering.

5. Kristallisering, datainsamling och behandling

  1. Utför kristallisering av komplex MHC och peptid med hjälp av sittande droppånga diffusionsteknik.
  2. Screena Ptal-N*01:01/peptidkomplex med kommersiella kristallsatser (t.ex. Crystal Screen kit I/II, Index Screen kit, PEGIon kit I/II och PEGRx kit).
  3. Försegla den resulterande lösningen och jämvikt mot 100 μL reservoarlösning vid 4 eller 18 °C.
  4. Observera kristalltillväxten i kulturen i 3 dagar, 1 vecka, 2 veckor, 1 månad, 3 månader och 6 månader. Använd ett mikroskop för att se om varje droppe i kristallplattan har kristaller.
    OBS: Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) kristaller observerades i 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) och 25% (w/v) polyetylenglykol 3,350 vid en koncentration av 7,5 mg/mL. Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) kristaller observerades i 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2% w/v polyetylenglykol 3,350 vid en koncentration av 7,5 mg/mL.
  5. För kryogent skydd, överför kristallerna till en lagringslösning som innehåller 20% glycerol och kyl sedan snabbt i en 100 K gasformig kväveström.
  6. Samla in röntgendiffraktionsdata från strållinjen BL19U från Shanghai synkrotronstrålningsanläggning (Shanghai, Kina).

6. Konstruktionsbestämning och analyser

  1. Med högupplösta strukturella data, bearbeta och skala styrkan i samlingen med Hjälp av Denzo-programmet och HKL2000-programvarupaketet (https://hkl-xray.com/)23.
  2. Efter att ha valt en bättre initial modell i Protein Data Bank (PDB), bestäm strukturerna med molekylär ersättning med programmet Phaser MR i CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Modellen som användes var strukturkoordinaterna med Protein Data Bank (PDB) kod 5F1I.
  3. Använd den förfinade röntgenmodellen för den första gemensamma förfiningen. Använd Phenix-förfining ensam och foglägen enbart för röntgen och den gemensamma neutron- respektive röntgenförfiningen.
  4. Efter varje omgång förfining, kontrollera manuellt modellen mot Fo − Fc och 2Fo − Fc positiva kärntäthetskartor i Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Detta underlättar korrekt placering av vatten och vissa D-atomer. Alla figurer av strukturer skapades av PyMOL (http://www.pymol.org/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidigare arbete rapporterade att HeV-härledda HeV1 (DFANTFLP) peptiden presenterades av Ptal-N * 01: 0110,19. Häri utvärderades bindningskapaciteten hos denna peptid till Ptal-N*01:01 med homolog fladdermus β2m (bβ2m) och heterolog human β2m (hβ2m) (Figur1C,1D). Kristaller med högre upplösning bildades ( figur1E,1F). En kristall bildas av Ptal-N*01:01/HeV1-komplexet, som bildades genom renaturation med bβ2m, och upplösningen är 2,31 Å. En kristall bildas av Ptal-N*01:01/HeV1-komplexet, som bildades genom renaturation med hβ2m, och upplösningen är 1,6 Å. Ptal-N*01:01/HeV1-komplexet bildades framgångsrikt genom ombyte med både bβ2m och hβ2m (Figur 1C,1D). I detta sammanhang visade vi att Ptal-N*01:01/HeV1-komplexet inte bildades utan närvaro av β2m (figur 1A) och H-2Kd som viks korrekt genom hβ2m (Figur 1B).

Strukturerna i Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m och Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m analyserades sedan. I strukturen Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m, rester R3, H31, Q34, D53, W60, Y63 av bβ2m bundna till H-kedjeresterna genom botten av PBG och rester Q8, Y10, R12, N24, Y28, N98, N99 bundna till H-kedjans α3-domän. Liknar Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m komplex, i Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m struktur, bevarade restprodukter H31, D53, W60, Y63 av hβ2m som motsvarar bβ2m, fick kontakt med pbg-botten och bevarade restprodukter Q8, Y10, R12, N24 som motsvarar bβ 2 mbundettill α3-domänen(figur 2A,2B).

I de övergripande strukturerna Ptal-N*01:01/HeV1/bβ2m och Ptal-N*01:01/HeV1/hβ2m, Den genomsnittliga rot-medelvärdet-kvadratavvikelsen (RMSD) av rester 1–184 av H-kedjorna (som utgör α1α2 PBG) var 0,248 under alla Cα-atomer superposition ( Figur3A). Detta konstaterande visade att det inte fanns någon skillnad mellan dessa två komplex. Konformationerna av liknande peptider i komplexen med olika β2m jämfördes sedan. Peptidjusteringens struktur visade att konformationerna av HeV1-peptider i dessa två komplex var ganska lika (figur 3B). Dessutom var strukturerna i gp33 (KAVYNFATM) presenteras av H-2Db och komplexa med musen β2m (mβ2m) eller hβ2m i linje. RMSD för α1α2 PBG av H-2Db var 0,283 och de övergripande konformationerna av peptider i dessa två strukturer var också likartade (Figur 3C,3D). Dessa data tyder på att β2m ersättning mellan bβ2m och hβ2m och mβ2m och hβ2m inte påverkar konformationerna av presenterade peptider.

Sekvensjusteringen visade att aminosyrorna i β2m från olika arter är mycket bevarade (figur 4). Efter analys av β2m från olika arter visade att de flesta aminosyrorna på β2m som bildade vätebindningarna med H-kedjan av MHC I bevarades (figur 4, tabell 2). Under tiden var de olika resterna också aminosyror med liknande kemiska egenskaper hos däggdjur. De viktigaste resthalterna i β2m bindning till H-kedjan av MHC I visade dock polymorfism hos kycklingar, fiskar och amfibier (figur 4).

Tabell 1: De olika däggdjuren kombineras med heterologa β2m. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 2: Vätebindningsinteraktioner mellan β2m och tung kedja i MHC I av olika arter. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Figure 1
Figur 1: Rening av de lösliga och omveckade Ptal-N*01:01/HeV1 komplexa proteinerna och fotografierna av kristallen som används för diffraktionsanalys. M är molekylviktsmarkörer i kDa. P1 är aggregaten. P2 är MHC-komplexet. P3 är β2m.(A) Ptal-N * 01: 01 / HeV1-komplexet bildades inte utan närvaron av β2m. (B) H-2Kd-komplexet bildades genom ombyte med hβ2m. (C) Ptal-N * 01: 01 / HeV1-komplexet bildades genom ombyte med bβ2m. Profilen är märkt med de ungefärliga positionerna för de molekylära massstandarderna 75,0, 44,0 och 13,7 kDa. (D) Ptal-N*01:01/ HeV1-komplexet bildades genom renaturation med hβ2m.(E)Kristallen bildas av Ptal-N*01:01/HeV1-komplexet, som bildades genom ombyte med bβ2m. Den svarta pilen representerar kristallen som används för att samla in data under röntgendiffraktion. (F) Kristallen bildas av Ptal-N*01:01/HeV1-komplexet som bildades genom renaturering med hβ2m. Den svarta pilen representerar kristallen som används för att samla in data under röntgendiffraktion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Vätgasbindning mellan β2m och tung kedja i hybrid MHC I-komplex. Vätebindning mellan β2m och H-kedja i(A)Ptal-N*01:01/bβ2m/HeV1 och (B) Ptal-N*01:01/hβ2m/HeV1 MHC-komplex. Vätebindningsinteraktioner representeras av en svart prickad linje. Fyrkanten representerar det område som zoomats in och visas till höger i motsvarande färgade rutor. Den röda representerar att den homologa β2m och den heterologa β2m använder samma aminosyror för att bilda vätebindningar med H-kedjan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Liknande konformation av MHC-komplexet och de antigena peptiderna i hybrid MHC I-komplex. (A) Superimpositionen av α1α2-domäner av Ptal-N*01:01/bβ2m (grön) och Ptal-N*01:01/hβ2m (grå). (B) Superpositionen av HeV1-peptid med superimpositionen av α1α2-domänen för varje Ptal-N *01:01-molekyl. HeV1 Peptid representeras som rosa i Ptal-N*01:01/bβ2m och som gul i Ptal-N*01:01/hβ2m. (C) Superimpositionen av α1α2-domäner av H-2Db /mus β2m (mβ2m) (grön) och H-2Db /hβ2m (grå). (D) Superpositionen av gp33-peptid med superimpositionen av α1α2-domänen för varje H-2Db-molekyl. Peptid gp33 representeras som blå i H-2Db /mβ2m och som rosa i H-2Db /hβ2m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Strukturbaserad sekvensjustering av hβ2m med β2m av andra arter. De svarta pilarna betecknar β-strängar. Resterna som markeras i rött är helt bevarade, och resterna i blå lådor är mycket (>80%) Bevarad. De gula trianglar representerar de viktigaste aminosyrorna för interaktionen mellan β2m och H kedjor. Sekvensjusteringen genererades med Clustal X32 och ESPript33. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Byggandet av ett hybridproteinkomplex genom heterolog substitution från olika taxa är en gemensam strategi för funktionella och strukturella undersökningar när det homologa komplexet inte är tillgängligt, till exempel i MHC I och dess ligands. Det finns dock begränsad summering av metoden och tekniken. Herein, strukturen av fladdermus MHC I, Ptal-N * 01: 01, stabiliseras av bβ2m eller hβ2m analyserades. De viktigaste aminosyrorna i β2m bindning till Ptal-N *01:01 konstaterades vara bevarade mellan fladdermus och människa. Vid ytterligare analys konstaterades de viktigaste resterna i β 2 m bindning tillH-kedjanav MHC I bevaras hos däggdjur men polymorf hos kycklingar, fiskar och amfibier. Dessa data tyder på att β2m ersättning är ett genomförbart sätt att studera däggdjurens MHC I. Det är dock inte möjligt att ersätta däggdjur och fåglar, fiskar eller amfibier.

Strukturella studier spelar avgörande roller för att förstå de molekylära mekanismerna för peptidpresentation av MHC I-molekyler. Heterologa β2m substitution används ofta i MHC I strukturella studier14,16,17,18,26,27,28. Tidigare arbeten har visat att murin β2m och bovint β2m uppträdde på samma sätt vid bindning till α1α2-domänerna i N*01801 H-kedjan 17 i bovin MHC I, N*01801. Häri analyserades strukturen hos en enda peptid som presenteras av samma H-kedja av MHC I men olika β2m. Dessa data visar att peptidens konformationer är likartade när de stabiliseras av cross-taxa β2m, vilket indikerar att heterolog β2m substitution inte påverkar peptidpresentationen.

Antigenpeptider som presenteras av MHC I känns igen av TCR för att medla T-cellsaktivering29. Under virusinfektion kommer utvärdering av antigenspecifika T-cells immunsvar att avsevärt förbättra förståelsen av virusinfektioner och vara värd för immunsvar. Peptid-MHC-tetramern är en viktig teknik för att utvärdera T-cellssvar; det är en teknik för att tetramerisera MHC monomer molekylen, förbättra dess affinitet och kombinera den med flera TCRS på T-celler. Tetramerer används ofta i forskning och klinisk diagnos14,29,30. Nyligen har TCR-konstruerade T-celler (TCR-T) blivit ett hett ämne inom tumörimmunterapi för deras potentiella effekt vid behandling av maligna tumörer31. MHC I tetramerfärgning är en avgörande metod för screening av specifika TCR-bindning till cancerrelaterade antigenpeptider som presenteras av MHCI-molekyler 29. Därför spelar MHC I tetramer förberedelse en viktig roll i TCR screening. Förutom bindning av MHC IH-kedjanbinder β 2 m också till CD8 på T-cellsytan, vilket kan leda till icke-specifik färgning under TCR-screening genom MHC I tetramerfärgning. Heterologa β2m ersättning kan minska denna icke-specifika bindning av MHC I tetramer.

Det finns dock vissa begränsningar i protokollet. För det första, även om E. coli fortfarande är den dominerande uttrycksvärden för rekombinanta proteiner, kan många post-translationella modifieringar inte utföras och de uttryckta proteinprodukterna bildar olösliga inneslutning organ. Sedan, på grund av liknande ersättning av vissa icke-däggdjur β2m med däggdjur β2m, är det inte känt om icke-däggdjur β2m kan ersättas av heterolog β2m för att hjälpa och stabilisera deras MHC-struktur. I protokollet har vi inkluderat en beskrivning av våra beprövade analyser med både NetMHCpan- och Rosetta FlexPepDock-servern. Tyvärr matchade ingen av de producerade förutsägelserna de experimentella data. Detta kan tyda på att nuvarande MHC bindande peptid förutsägelser inte var lämpliga för icke-mänskliga och icke-mus däggdjur såsom fladdermöss, som kan ha ett annat sätt att peptidbindning. Därför måste vi kombinera olika förutsägelseprogram och experimentella resultat för omfattande analys för att få hög affinitetspeptider.

I protokollet som beskrivs här är det viktigaste steget att MHC kan bytas ut korrekt. Det är mycket viktigt att få ett MHC-komplex med hög omdubblningseffektivitet. Därför är det viktigt att vara uppmärksam på att välja lämpliga peptider och öka renheten hos inkluderingskroppar.

Sammanfattningsvis sammanfattas häri ett protokoll för MHC I uttryck, om dukning, kristallisering, kristall data insamling och struktur bestämning. Dessutom analyserades genomförbarheten av heterologa β2m substitution i MHC I studie. Denna studie ger en bra referens för att förstå MHC I i strukturella och funktionella studier. Dessutom är dessa data också signifikanta för utvärdering av T-cellssvar under infektionssjukdom och tumörimmunterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att deklarera.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av den öppna fonden för det statliga nyckellaboratoriet för farmaceutisk bioteknik, Nan-jing University, Kina (Anslag nr. KF-GN-201905), Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (bidrag 81971501). William J. Liu stöds av NSFC:s utmärkta unga vetenskapsprogram (81822040) och Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa MMCO membrane Merck millipore PLGC07610
30% Acrylamide LABLEAD A3291-500ml*5
5×Protein SDS Loading Novoprotein PM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoff Merck millipore UFC901096
Ampicillin Inalco 1758-9314
APS Sigma A3678-100G
BL21(DE3) strain TIANGEN CB105-02
DMSO MP 219605580 Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
DTT Solarbio D1070 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen. In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice.
EDTA-2Na KeyGEN BioTECH KGT515500
Glycerin HUSHI 10010618
GSH Amresco 0399-250G
GSSG Amresco 0524-100G
Guanidine hydrochloride Amresco E424-5KG
hβ2m our lab Zhang, S. et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTG Inalco 1758-1400
L-Arginine Hydrochloride Amresco 0877-5KG
NaCl Solarbio S8210
Protein Marker Fermentas 26614
SDS Boao Rui Jing A112130
Superdex Increase 200 10/300 GL GE Healthcare 28990944
TEMED Thermo 17919 Gloves and goggles should be worn and operated in a ventilated kitchen.
Tris-HCl Amresco 0497-5KG
Triton X-100 Bioruler RH30056-100mL
Tryptone Oxoid LP0042
Yeast extract Oxoid LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
  2. Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
  3. Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
  4. Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
  5. Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
  6. Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
  7. Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
  8. Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
  9. Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
  10. Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436 (2019).
  11. Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
  12. Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
  13. Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
  14. Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
  15. Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
  16. Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
  17. Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
  18. Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
  19. Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
  20. Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
  21. Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
  22. Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934 (2011).
  23. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  24. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  26. Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
  27. Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017 (2018).
  28. McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432 (2012).
  29. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  30. Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
  31. Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250 (2019).
  32. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  33. Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).

Tags

Immunologi och infektion Utgåva 169 Större histokompatibilitetsantigenkomplex (MHC) klass I-molekyler β2-mikroglobulin(β2m) komplex struktur peptid TCR tetramer
Stabilitet och struktur av Fladdermus Major Histocompatibility Complex Klass I med heterologous β<sub>2</sub>-Microglobulin
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang,… More

Zhang, D., Liu, K., Lu, D., Wang, P., Zhang, Q., Liu, P., Zhao, Y., Chai, Y., Lyu, J., Qi, J., Liu, W. J. Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous β2-Microglobulin. J. Vis. Exp. (169), e61462, doi:10.3791/61462 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter