Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד

Published: June 24, 2020 doi: 10.3791/61464
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1,4
1Division of Neonatology, Stead Family Department of Pediatrics, University of Iowa, 2Division of Maternal Fetal Medicine, Department of Obstetrics & Gynecology, University of Iowa, 3Division of Neonatology, Department of Pediatrics, Vanderbilt University, 4Department of Microbiology & Immunology, University of Iowa

Summary

פיתחנו מודל של chorioamnionitis כדי לדמות חשיפה עוברית לדלקת אימהית (FEMI) ללא סיבוכים של אורגניזמים חיים כדי לבחון את ההשפעות של FEMI על התפתחות מערכת העיכול של הצאצאים. זה מאפשר מחקר של סיבות מכניות להתפתחות של פגיעה במעיים בעקבות chorioamnionitis.

Abstract

Chorioamnionitis הוא משקע נפוץ של לידה מוקדמת והוא קשור עם רבים של תחלואה של פגות, כולל אנטריוקוליטיס נמק (NEC). עם זאת, קשר מכני בין שני תנאים אלה עדיין לא התגלה. אימצנו מודל מורין של chorioamnionitis מעורבים lipopolysaccharide (LPS)-induced חשיפה עוברית לדלקת אימהית (FEMI). מודל זה של FEMI גורם למפל דלקתי סטרילי אימהי, שליה ועובר, אשר קיים גם במקרים רבים של chorioamnionitis קלינית. למרות שקיימים מודלים המשתמשים בחיידקים חיים ומחקים בצורה מדויקת יותר את הפתופיזיולוגיה של זיהום עולה וכתוצאה מכך chorioamnionitis, שיטות אלה עלולות לגרום להשפעות עקיפות על התפתחות מערכת העיכול הלא בוגרת ועל המיקרוביום המתפתח המשויך. באמצעות פרוטוקול זה, הוכחנו כי תוצאות FEMI הנגרמת על ידי LPS לעלייה תלוית מינון אובדן הריון ולידה מוקדמת, כמו גם שיבוש של התפתחות מעיים נורמלית בצאצאים. יתר על כן, הוכחנו כי FEMI מגביר באופן משמעותי פגיעה במעיים ציטוקינים בסרום בצאצאים, ובו זמנית הפחתת גביע ותאי Paneth, שניהם מספקים שורה ראשונה של חסינות מולדת נגד דלקת מעיים. למרות מודל דומה של FEMI הנגרמת על ידי LPS שימש כדי מודל הקשר בין chorioamnionitis ואת החריגות הבאות של מערכת העצבים המרכזית, למיטב ידיעתנו, פרוטוקול זה הוא הראשון לנסות להבהיר קשר מכני בין chorioamnionitis והפרעות מאוחר יותר בהתפתחות המעי כקשר פוטנציאלי בין chorioamnionitis ו NEC.

Introduction

הקרומים הכוריוניים ממלאים תפקיד אינטגרלי בהריון יונקים. הם כוללים את chorion ו amnion, אשר משרתים פונקציות מרובות. הם מקיפים ומגנים על העובר, מקלים על איתות פרוקרין בין התאים האימהיים והעובריים1, ויוצרים לולאות משוב מקומיות בתוך הקרומים הכוריוניים, אשר עשויים להיות מעורבים בייזום parturition1. ההבנה הנוכחית של הממברנות מצביעה על כך שהאמוניון מספק תפקוד מחסום מבני, והכוריון מספק חיץ חיסוני בעיקר כדי להגן על העובר המתפתח ממערכת החיסון האימהית2. דלקת של ממברנות אלה ידועה בשם chorioamnionitis. מבחינה היסטורית, האבחנה של chorioamnionitis קליני נעשה בעקבות נוכחות של קדחת אימהית בתוספת אחד או יותר ממצאים קליניים עובריים או אימהיים3,4. עם זאת, בעוד הגדרה זו שימושית קלינית, חוסר הדיוק שלה עשה מחקר chorioamnionitis מאתגר. בשנת 2015, בניסיון להבהיר את האבחנה, סדנת פאנל מומחים של המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם של יוניס קנדי שרייבר הגדירה את chorioamnionitis כדלקת תוך רחמית, או זיהום, או שניהם (משולש I)3. הבהרה זו חשובה כי בעוד זיהום המושרה מיקרוביאלית היא גורם חשוב של דלקת הרחם / מי השפיר, זה קורה פחות נפוץ מאשר דלקת הרחם / מי השפירסטרילית 5,6,7. בסך הכל, chorioamnionitis נשאר בעיה משמעותית בריאות הציבור, כפי שהוא נראה 2\u20124% של משלוחים לטווח ו 25 \u201230% של משלוחים פגים8,9.

Chorioamnionitis יכול להיות השפעות משמעותיות על העובר ניאונט. זה תועד היטב בספרות כי chorioamnionitis קשורה לסיכון מוגבר של רבים של תחלואה של פגות, כולל דיספלסיה ברונכופולמונארית10, פגיעה חומר לבן מוחי11, דימום תוך חדרי12, רטינופתיה של קדם בגרות13, ושניהם חשד ואישרו אלח דם יילודים תחילת מוקדם14,15. כפי שאנו מעוניינים במנגנוני פציעה ותיקון של מערכת העיכול בשלה, חשוב לציין כי chorioamnionitis קשורה גם עם התפתחות מאוחרת יותר של enterocolitis נמק (NEC)15,16. NEC היא מחלה הרסנית במערכת העיכול של פגים שתוצאתה תגובת מארח dysregulated לדלקת נמק מעיים הבאים17. בכל שנה, NEC משפיע על מעל 4000 תינוקות בארצות הברית, ועד שליש מהתינוקות האלה מתים מהמחלה18. הפתוגנזה של NEC ככל הנראה כרוכה בשילוב של חוסר בגרות במעיים, dysregulation של המערכת החיסונית בשלה, דלקת מעיים, טרנסלוקציה חיידקית19, שהגיע לשיאו במסלול משותף סופי של נמק מעיים. חשוב לציין, הופעת NEC מתרחשת לעתים קרובות שבועות לאחר הלידה וחשיפה פוטנציאלית chorioamnionitis, מה שהופך את הקשר המכניסטי בין chorioamnionitis ופיתוח לאחר מכן של NEC לא ברור20. מנגנון פוטנציאלי אחד שבאמצעותו chorioamnionitis עשוי לתרום הפתופיזיולוגיה של NEC היא באמצעות upregulation של המערכת החיסונית האימהית, לאחר מכן לייצר תגובה דלקתית עוברית חזקה אשר עלול לשבש דפוסים התפתחותיים עוברייםנורמליים 21,22,23.

דגמי יונקים מרובים של chorioamnionitis קיימים מכרסמים וכבשים24,25,26,27,28,29,30,31,32. עם זאת, נתונים מעטים קיימים לגבי התפתחות מערכת העיכול מעבר לתקופת היילוד הראשונית לאחר חשיפה עוברית הנגרמת על ידי chorioamnionitis לדלקת אימהית (FEMI). על מנת לחקור את הקשר בין FEMI לבין ההתפתחות הבאה של פגיעה במערכת העיכול הלא בוגרת, התאמנו את מודל ה- FEMI המושרה על ידי Lipopolysaccharide (LPS). Lipopolysaccharides הם מרכיב מרכזי של פני השטח החוץ תאיים על חיידקים שליליים גרם והם ממריץ חזק של המערכת החיסונית המולדת של מינים אוקריוטיים מרובים, כולל בני אדם33. תוצאות הזרקת LPS אימהית מפל דלקתי סטרילי ללא ההשפעות המבלבלות של חיידקים חיים, וזה מודל מבוסס היטב עבור אינדוקציה של לידה מוקדמת34, כמו גם מודל של chorioamnionitis חריפה ותסמונת התגובה הדלקתית העוברית (FIRS), שהיא הצורה החמורה ביותר של chorioamnionitis24,35. זה גם הוכח לגרום הן פגיעה חומר לבן ואפור מוחי בדגם כבשים36 ומודל מורין37,38,39,40. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אנו הראשונים להשתמש במודל זה של chorioamnionitis ו FEMI כדי לחקור את השפעותיו על התפתחות מערכת העיכול בעבר הלידה, כמו גם לחקור קשר מכני אפשרי בין chorioamnionitis ופיתוח מאוחר יותר של NEC41,42.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת איווה (פרוטוקול #8041401). כל בעלי החיים שוכנו באגודה להערכה והסמכה של מעבדה לטיפול בבעלי חיים (AALAC) אישר vivarium באוניברסיטת איווה. כל העכברים היו סוג פראי זן C57Bl/6J.

1. הקמת FEMI בעכברים בהריון

  1. הכנת LPS
    1. השתמש LPS נגזר Escherichia קולי O55:B5 (ריכוז מלאי 2 מ"ג / מ"ל).
    2. לדלל את ריכוז מלאי LPS 1:100 עם מלוחים סטריליים עבור ריכוז עבודה של 20 מיקרוגרם / מ"ל.
  2. הזרקת LPS אימהית
    1. להזריק סכרים בהריון ביום ההריון e15. נקודת זמן זו היא כ 75% דרך ההריון מורין, מה שהופך את המודל הזה מבחינה התפתחותית דומה השליש השלישי המוקדם של הריונות אנושיים, וזה כאשר רוב לידות פגים עקב chorioamnionitis להתרחש.
    2. לשקול עכברים בהריון מיד לפני ההזרקה כדי לקבוע מנון LPS המתאים.
    3. לחשב את המינון של ריכוז עבודה באמצעות הנוסחה הבאה: 5 μL x משקל גוף גרם (gbw), עבור מנה כוללת של LPS של 100 מיקרוגרם / קילוגרם. עבור חיות בקרה, השתמש בנפח שווה ערך של מלוחים רגילים להזרקה.
    4. פתרון LPS Vortex שלוש פעמים במשך 15 שניות על גבוה לפני כל זריקה.
    5. צייר עוצמת LPS למזרק של 1 מ"ל.
    6. לרסן את העכבר בהריון עם טכניקת קשקוש. להחזיק בתנוחת נסיוב הגב ולבצע את הזריקה.
      1. הכנס 30 מד 8 מ"מ המחט משופע מעל הרבע התחתון הימני של הבטן (כדי למנוע שלפוחית השתן וכלי הבטן) בזווית 30 \u201240°. הכנס על 1/4 כדי 1/2 את אורך המחט.
      2. משוך בחזרה על בוכנה מזרק כדי להבטיח לחץ שלילי לפני הזרקה. המשך עם הזרקה אם קיים לחץ שלילי.
      3. לאחר ההזרקה, לפקח על עכברים במשך כ 30 דקות ולאחר מכן לחזור לכלובים למשך שארית ההריון.

2. משלוח וטיפול בצאצאים, וקציר מעיים

  1. לספק גורים בדרך כלל באמצעות משלוח הנרתיק ב e20.
    הערה: לדגם זה יש שיעור אובדן עוברי תלוי מינון שניתן לראות באיור 1 והוא נדון בתוצאות שלהלן.
  2. אפשר גורים להישאר עם אמהות ולקבל הזנות libitum המודעה.
  3. ביום הקציר, בדרך כלל לאחר יום הלידה 14 (P14), המתת חסד גורים באמצעות נקע בצוואר הרחם בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים של ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים.
  4. באמצעות מספריים ומלקחיים, לבצע חתך אנכי לאורך קו האמצע של הבטן, דרך העור הצפק, לכל אורך הבטן. מוציאים את המעי הדק מהקיבה אל הסקום עם המספריים ומסירים את המזנטריה במלקחיים.
  5. לבודד ולשמור על דיסטלי 1/3 של המעי הדק (נציג סעיף של איליום אנושי), השלכת המעי הדק הפרוקסימלי, cecum, ואת המעי הגס.
  6. מחלקים את חלק האילום לשניים באמצעות מספריים.
  7. מניחים את החצי הפרוקסימלי בתמיסת ייצוב RNA לכימות RNA מאוחר יותר.
  8. מקם את החצי הדיסטלי בפורמלין אגירה ניטרלי 10% להכנת שקופית.

3. ניקוד פציעות מעיים

  1. סעיף רקמה מוטבעת פרפין לפרוסות 5 מיקרומטר עבה הרכבה על שקופיות זכוכית.

    הערה: אנו שולחים את הדגימות לליבת היסטולוגיה להטמעת פרפין, חתך והרכבה על שקופיות.
  2. נקה שקופיות בהתאם לנהלים סטנדרטיים.
  3. כתמים עם המטוקסילין ואאוסין על פי נהלים סטנדרטיים.
  4. קטעי ציון בסולם של 3 נקודות עבור פגיעה במעיים כפי שתואר קודם לכן42,43.
    1. באמצעות מיקרוסקופיה קלה, להעריך פגיעה במעיים כללית על ידי שני חוקרים עיוורים נפרדים בסולם של 3 נקודות הערכת שלמות villus והפרדה מן קרום המרתף43 (איור משלים 1). פגיעה במעיים מוערכת בצורה הטובה ביותר בהגדלה של 20x וצמצם מספרי 0.50.
    2. להקצות ציון של 0 כדי לתאר רירית נורמלית.
    3. להקצות ציון של 1 לתאר פציעה קלה הכוללת את הפיתוח של החלל של גרואנהאגן subepithelial, vacuolization או הרמה subepithelial מוגבל לנמינה פרופריה או טיפים של וילי.
    4. להקצות ציון של 2 כדי לתאר פציעה חמורה, המצוין על ידי הרמת אפיתל ו vacuolization גדול ממחצית הווילי, עיוות וילי, או כיב רירית והתפוררות של פרופריה למינה.

4. כימות של פאנת ותאי גביע

  1. לאחר deparaffinization, כתמים שקופיות של מקטעי רקמה משלב 2.8 עם כתם כחול /תקופתי Alcian שיף כדי לציין הן גביע תאים Paneth כפי שתואר קודם לכן44,45 על פי השלבים הבאים.
    הערה: בעוד כתם Alcian כחול / תקופתי חומצה שיף אינו ספציפי או Paneth או תאים גביע, מניסיוננו, חוקרים מנוסים עיוורים יש כימות הסלולר שווה ערך באמצעות כתם זה לעומת נוגדנים ממוקדים הסלולר, עם משמעותית פחות כתמי רקע46.
  2. Deparaffinize, כתם, ומייבש שקופיות כדלקמן.
    1. שקוע שקופיות בקסילן במשך 10 דקות פעמיים.
      התראה: Xylene יש להשתמש במכסה המנוע אדים.
    2. יש לשטוף עם 100% אט"ו.
    3. שקופיות שקועות ב- 100 % EtOH למשך 3 דקות, ולאחר מכן ב- 90% EtOH למשך 3 דקות, ואחריהן 70% EtOH למשך 3 דקות, ולבסוף שקופיות שקועות ב- 50% EtOH למשך 3 דקות.
    4. לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 5 דקות.
      התראה: כוון את המקטע הרחק מהמים הזורמים כדי למנוע אובדן של דגימת רקמה.
    5. סנן פתרון כתם כחול אלקיאני עם מסנן קפה סטנדרטי.
    6. כתמים מחליקים בכתם כחול אלסי במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 2 דקות.
    7. לדלל 1 מ"ג של חומצה תקופתית ב 200 מ"ל של מים מזוקקים כפולים. שקוע שקופיות בפתרון זה במשך 5 דקות. ואז לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 1 דקות.
    8. כתם עם ריאגנט של שיף במשך 10 דקות. לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך 5 דקות.
    9. הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין במשך דקה אחת ולאחר מכן שטפו תחת מי ברז זורמים במשך 2 דקות.
    10. לטבול אותם אלכוהול חומצה (1 מ"ל של חומצה הידרוכלורית מעורבב 99 מ"ל של 70% EtOH) במשך 1 דקות.
    11. שקועים במי הברז של סקוט (0.1% ריכוז NaHCO3 במי ברז) במשך דקה ולאחר מכן לשטוף תחת מי ברז זורמים במשך דקה.
    12. לייבש את השקופיות.
      1. טובלים כל שקופית 10 פעמים ב-70% EtOH, ואז טובלים 10 פעמים ב-90% EtOH, ו-10 פעמים ב-100% EtOH.
      2. שקופיות שקועות ב- 100% EtOH למשך 10 דקות, ולאחר מכן שקועות פעמיים בקסילן טרי במשך 3 דקות כל אחת.
    13. מניחים טיפה של מדיה הרכבה על הדגימה ומניחים כיסוי על זה.
  3. ספירת תאי גביע
    1. באמצעות מיקרוסקופיה קלה, לספור תאי גביע (איור משלים 2). עבור כל פיסת רקמת מעיים, לספור את מספר תאי הגביע ו 500 תאי אפיתל ויחס תא גביע אקספרס כיחס לכל 100 תאי אפיתל. תאי גביע נספרים בצורה הטובה ביותר בהגדלה פי 20 וצמצם מספרי 0.5.
  4. ספירת תאים בחלונית
    1. באמצעות מיקרוסקופיה קלה, לספור תאים Paneth (איור משלים 2). עבור כל פיסת רקמת מעיים, להביע כיחס של תאים Paneth לכל קריפטה מעיים. לספור 100 קריפטות מעיים לכל פיסת רקמת מעיים. התאים החלונית נספרים בצורה הטובה ביותר בהגדלה של 20x-60x ובצמצם מספרי 0.50-1.30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חשיפה ל-FEMI ביום העוברי 15 מובילה לאובדן הריון תלוי מינון ולשיעור תלוי מינון של לידה מוקדמת (איור 1)42. עבור הניסויים, בחרנו להשתמש במינון LPS של 100 מיקרוגרם / קילוגרם כדי למזער את אובדן ההריון ואת פגות (50% אובדן בין פגות ומוות עוברי תוך רחמי) תוך חשיפת העוברים עלבון דלקתי משמעותי.

באמצעות גישה זו, בדקנו את ההשפעות של FEMI על הפציעה הבאה של הצאצאים. באמצעות סולם היסטולוגי של 3 נקודות למדידת פגיעה כללית במעיים, מצאנו פגיעה משמעותית בלידה (P0) ובבגרות (P56 או 8 שבועות שלחיים) (איור 2). חשוב לציין כי פציעה זו התרחשה בהיעדר גירויים נוספים לבעלי החיים שאינם FEMI, דבר המצביע על כך ש- FEMI לבדו משבש את הומאוסטזיס הרגיל של מערכת העיכול המורינית שזה עתה נולדה. כמו העכבר נולד עם מעי בשל יחסית שממשיך להתפתח במהלך 4 השבועות הראשונים של החיים47,48, זה רלוונטי פגים שיש להם גם דרכי מעיים לא בוגרות.

כדי להבין עוד יותר את ההשפעה של FEMI הן על ההתפתחות הנורמלית של אפיתל המעי והן על מנגנוני ההגנה של מערכת העיכול הלא בוגרת, כימתנו את מספר תאי הגביע המייצרים מוצין ותאי פפטיד מיקרוביאליים המייצרים פאנת בשליש הדיסטלי של מערכת העיכול הקטנה הדומה לאילום האנושי. מצאנו כי FEMI שיבש את ההרכב התקין של אפיתל המעי על ידי גרימת אובדן של תאי גביע ותאי Paneth בהשוואה לבעלי חיים ללא FEMI (איור 3).

כדי לחקור את ההשפעות של FEMI על התגובה הדלקתית של יילודים, באמצעות ELISA עם אלקטרוכימיהאומינציה, כימתנו מגוון סמנים דלקתיים בסרום, שכללו IL-1β, IL-10, KC-GRO (המקבילה המורינית של IL-8), ו IL-6, מן הסרום של גורים עם ובלי FEMI (איור 4). מצאנו כי FEMI הגדיל באופן משמעותי את מפל דלקתי עבור כל ציטוקינים ב P0. מפל דלקתי בגילאים מאוחרים יותר (P7 \u2012P56) שונה בהתבסס על נקודת זמן ציטוקינים. המעניין ביותר, עבור IL-6, היו רמות דומות ב P7 \u2012P28 בקבוצות FEMI ו sham, אבל למרות שום התערבות משנית, היו רמות גבוהות משמעותית בקבוצת FEMI ב P56. זה חשוב במיוחד כפי שהוכחנו כי IL-6 הוא ציטוקינים קריטיים להתפתחות של פגיעה במעיים לאחר הלידה במודל FEMI.

Figure 1
איור 1: השפעת מינון FEMI על תוצאות ההריון. הישרדות של פסולת הריון תלויה במינונים גבוהים יותר הגורמים לשיעורים גבוהים יותר של אובדן הריון (A) ושיעורים גבוהים יותר של לידה מוקדמת (B). הדמות מותאמת באישור פריק ואח'42. FEMI באמצעות מינון LPS של 100 מיקרוגרם / קילוגרם יוצר הישרדות 50% עבור גורים על ידי שבוע אחד של חיים. כל נקודת נתונים מייצגת n > 8 הריונות ולפחות שלושה ניסויים בודדים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: השפעת FEMI על דפוסי פגיעה במעיים דיסטליים קטנים לאורך זמן. דגימות מעיים נקצרו בלידה, שבוע אחד של חיים, 2 שבועות של חיים, ו 8 שבועות של חיים מעכברים שנחשפו FEMI (100 מיקרוגרם / קילוגרם של LPS) או שליטה מזויפת. דגימות הובקעו באמצעות סולם פציעה של 3 נקודות על ידי חוקרים עיוורים42,43. FEMI לבד ללא עלבון נוסף גרם כמות משמעותית של פציעה בלידה, 1 שבוע של חיים, וב 8 שבועות של חיים. הדמות הותאמה באישור פריק ואח'42. כל נקודת נתונים מייצגת n > 10 גורים ולפחות שלושה ניסויים בודדים מלפחות 3 סכרים בהריון. מאן-ויטני לא פרמטרי T-בדיקות שימש כדי להשוות ציונים פגיעה במעיים בכל נקודת זמן. כוכבית מציין p < 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: FEMI גורם לשינויים של כמויות נורמליות של גביע ותא Paneth במעי הדק במהלך הפיתוח. דגימות מעיים נקצרו בלידה, 1, 2, 4, ו 8 שבועות של חיים מעכברים שנחשפו FEMI (100 מיקרוגרם / קילוגרם LPS) או שליטה מזויפת. דגימות הוכתמו בכתם חומצה שיפ כחולה/תקופתית אלסית כדי לזהות הן את הגביע והן את תאי Paneth ואלה כמתו על ידי חוקר עיוור. הן תאי גביע והן תאי Paneth מבעלי חיים עם FEMI הראו מגמה או ירידה משמעותית בהשוואה לבקרות מזויפות בכל הגילאים. איור מותאם באישור אלגין ואח '41. כל נקודת נתונים מייצגת n > 10 גורים ולפחות שלושה ניסויים בודדים. קווי שגיאה מייצגים שגיאת תקן של הממוצע. בדיקות T של תלמידים שימשו להשוואת כמויות של גביע ותאי Paneth בכל נקודת זמן. כוכבית מציין p < 0.05. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: FEMI גורם להתפרצות דלקתית עולמית של יילודים עבור כל הציטוקינים מיד לאחר הלידה ב-P0, עם זינוק מאוחר של IL-6 ב-P56. ציטוקינים בסרום כמתו ב P0, P7, P14, ו P28 באמצעות ELISA עם electrochemiluminescence על פי הוראות היצרן, צלחות נקראו ב 620 ננומטר. ערכי ציטוקינים מיוצגים כאן בעלילת מכ"ם, וכל הציטוקינים מותווים כאחוז מהערך המקסימלי. היו עליות משמעותיות בכל הציטוקינים (IL-1β, IL-10, KC-GRO ו- IL-6) ב- P0 בקבוצת FEMI בהשוואה לקבוצת הביקורת (כל p < 0.05). כמו כן חלה עלייה מחודשת ברמות IL-6 ב- P56 בגורים עם FEMI בהשוואה ללא FEMI (p < 0.05 על ידי בדיקות Kruskal-Wallis לא פרמטריות), שהיה הציטוקינים היחידים שהועלו באופן משמעותי בקבוצת FEMI בהשוואה לשליטה בנקודת זמן מאוחרת זו. איור מותאם באישור אלגין ואח '41. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: ניקוד פגיעה במעיים של רקמת אריחים מוכתמת H&E. ציוני הפציעה נקבעים על ידי סולם ניקוד של שלוש נקודות מעיים (0=רגיל, 1=פציעה קלה, 2=פציעה חמורה) בהתבסס על מידת הוילי וקוליזציה, כיב רירית, נזק ללמינה פרופריה, ונוכחות דימום בתוך וילי כפי שתואר קודםלכן 43. איור מותאם באישור אלגין ואח '41. אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

איור משלים 2: מראה מייצג של כתמי כחול/PAS אלסיים של גביע ותאי פאנת'. כחול אלסי / PAS כתמים של רקמות מעיים מאפשר הדמיה ברורה של תאי גביע, נוכח villi מעיים (הלוח העליון מסומן עם חצים לבנים, תמונה שצולמה בהגדלה 20x), ותאי Paneth, נוכח בקריפטות של Lieberkuhn, הממוקם מתחת villi מעיים ב פרופריה למינה (הלוח התחתון מסומן חצים צהובים, תמונה שצולמה בהגדלה 60x). אנא לחץ כאן כדי להוריד נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chorioamnionitis משפיע 2\u20124% של המונח ו 25\u201230% של משלוחי פגים8,9. עם זאת, ההשפעה של chorioamnionitis יכול להאריך זמן רב לידת העבר כפי שהוכח יש השפעות משמעותיות על העובר ניאונט10,11,12,13,14,15,16. חשוב לציין, chorioamnionitis הוכח להיות קשור להתפתחות הבאה של NEC15,16. אמנם זה עדיין מובן לחלוטין, הפתוגנזה של NEC ככל הנראה כרוך בשילוב של חוסר בגרות במעיים, dysregulation של המערכת החיסונית בשלה, דלקת מעיים, טרנסלוקציה חיידקית, שהגיע לשיאו במסלול נפוץ סופי של נמק מעיים19. עם זאת, קשר מכני בין chorioamnionitis ופיתוח הבא של NEC עדיין לא ברור20, מודלים קודמים של בעלי חיים של chorioamnionitis לא היו מספיק כדי לבחון את הקשר הזה. כדי לטפל בפער זה בידע, שינינו את המודל המורין הנפוץ הנגרמת על ידי LPS של chorioamnionitis ולידה מוקדמת34,37,38,39,40 כדי לאפשר לידה והישרדות של יילודים. בעשותנו כך, יצרנו מודל המשוער את המצב הדלקתי לראות chorioamnionitis42 כדי ללמוד את ההשפעה של חשיפה לעובר לדלקת אימהית (FEMI) על התפתחות המעי הבאים.

עם פרוטוקול זה, הוכחנו כי מודל זה murine של chorioamnionitis, באמצעות FEMI הנגרמת על ידי LPS, תוצאות הן פגיעה במעיים לטווח קצר וארוך, כמו גם הפרעה להתפתחות מעיים נורמלית, בעיקר downregulation של שני גביע ותאי Paneth, שניהם מספקים שורה ראשונה של חסינות מולדת נגד דלקת מעיים. הפגיעה במעיים והשינויים התאיים ההיסטולוגיים הנראים במודל זה מצביעים על כך שזה מודל יעיל לחקות את הפציעה שנראתה ב- NEC. הסיבה לכך היא בעיקר כי downregulation של תאים Paneth ותאי גביע שניהם היו מעורבים בפתוגנזה של NEC, ואת הדפוסים של פגיעה היסטולוגית דומים למה שנראה במקרים אנושיים של NEC41,42,49. לכן, מודל זה FEMI הנגרמת על ידי LPS של chorioamnionitis הוא מודל אידיאלי לחקירת הקשר המכניסטי בין chorioamnionitis ופגיעה מעיים מאוחר יותר, במיוחד את הפיתוח של NEC, כמו גם השפעות פוטנציאליות של chorioamnionitis על המיקרוביום המתפתח, אשר לא יהיה אפשרי עם מודלים קיימים המשתמשים בחיידקים חיים.

ב vivo, chorioamnionitis לעתים קרובות כרוך זיהום חיידקי עולה כי לעתים קרובות תוצאות קרע preterm של ממברנות ואת פנוטיפ קליני של chorioamnionitis, מודלים בעלי חיים של chorioamnionitis קיימים אשר משקפים בצורה מדויקת יותר את הפתופיזיולוגיה25,28,30,32. עם זאת, מכיוון שמחקרי המעבדה שלנו מתפתחים במעיים, כולל המיקרוביום המתפתח, נוכחותם של חיידקים חיים במודל של chorioamnionitis תבלבל את ניתוח המיקרוביום. לכן, מודלים קיימים של chorioamnionitis ניצול חיידקים חיים אינם מעשיים לחקירת הקשר המכניסטי בין chorioamnionitis ופיתוח מאוחר יותר של NEC. בנוסף, LPS-induced מודלים של chorioamnionitis כבר היו יעילים דוגמנות פגיעה מוחית חומר לבן ואפור לאחר הלידה36, הוכחת כי שיטה זו היא דרך יעילה מודל תחלואה של פגות הקשורים לחשיפה chorioamnionitis בזמן הלידה.

חשוב גם לציין כי מודל זה תלוי מאוד במינון של LPS המשמש כדי לגרום FEMI. הצעד הקריטי העיקרי בפרוטוקול זה הוא אינדוקציה של FEMI בסכרים בהריון עם הזרקה תוך-פרטית של LPS; לכן, באופן לא מפתיע, מצאנו כי המינון של LPS המשמש כדי לגרום FEMI חשוב מאוד בתוצאות של ניסויים אלה. עם ניסויים ראשוניים, מנה של 100 מיקרוגרם / קילוגרם של LPS שימש, כמו מינון LPS זה לא היה קשור לתמותה אימהית והביא כ 50% הישרדות יילודים, כמו גם פגיעה משמעותית במעיים בצאצאים41,42.

LPS נקשר לקולטן דמוי אגרה 4 (TLR4) קומפלקס, וכתוצאה מכך הצטברות של חלבוני איתות תאיים, ייצור ציטוקינים, ואת החניכה של איתות פרו דלקתי50. קולטנים דמויי אגרה (TLRs) כולל TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 ו- TLR9 חשובים באינדוקציה של התגובה הדלקתית הנראית עם מגוון פתוגנים ומיקרואורגניזמים כגון וירוסים, חיידקים ופטריות51. מעניין, upregulation של TLR3 הוכח גם בקורלציה עם נזק מעיים היסטולוגי מוגבר שפיכה ויראלית במודל rotavirus מורין יילודים; יתר על כן, נוקאאוט של TLR3 ameliorated אפקטים אלה52. לכן, בעוד המודל עושה שימוש במסלולי TLR4, סביר להניח כי גירוי של TLRs אחרים עשוי להעניק ממצאים דומים.

באמצעות מתודולוגיה זו, הצלחנו להראות כי הזרקת LPS בסכרים בהריון גורמת לעלייה בסמנים דלקתיים אימהיים, שליה ועוברים תוך חסכון בנוזל מי השפיר, כמו גם גרימת נזק ישיר לשליה42. מעניין, מתודולוגיה זו לא הראתה שום שינוי של התנגדות בעורקי הרחם. מודל FEMI יש גם השפעה משמעותית על הצאצאים כפי שהראינו כי גורים חשופים יש פגיעה במעיים משמעותית42 דרך מסלול תלוי IL-641 והוא יכול להשפיע על מנגנוני הגנה חשובים של המעי כגון תאי גביע ותאי Paneth41. פציעה זו הופכת את צאצאי יילודים רגישים יותר ויותר לפגיעה במעיים הנגרמת על ידי LPS ודלקת41 אשר עשוי להסביר מדוע תינוקות שנחשפו chorioamnionitis יש רגישות מוגברת לפתח NEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות המכונים הלאומיים לבריאות (DK097335 & T32AI007260) והמחלקה לרפואת ילדים באוניברסיטת איווה סטד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin Sigma HT501128
Alcian blue stain Newcomer supply 1003A
C57Bl6/J mice Jackson Laboratories 664
Ethanol Decon labs 2701
HCl Sigma H1758
Hematoxylin stain Leica 381562
LPS Sigma L2880
NaHCO3 Sigma S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope Nikon 2CE-MQVJ-1
Periodic Acid ACROS H5106 CAS# 10450-59-9
RNAlater Thermofisher Am7021
Schiff's reagent Sigma S5133
Secor Imager 2400 Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene Sigma 534056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Myatt, L., Sun, K. Role of fetal membranes in signaling of fetal maturation and parturition. International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 545-553 (2010).
  2. Verbruggen, S. W., Oyen, M. L., Phillips, A. T., Nowlan, N. C. Function and failure of the fetal membrane: Modelling the mechanics of the chorion and amnion. PLoS One. 12 (3), 0171588 (2017).
  3. Higgins, R. D., et al. Evaluation and Management of Women and Newborns With a Maternal Diagnosis of Chorioamnionitis: Summary of a Workshop. Obstetrics & Gynecology. 127 (3), 426-436 (2016).
  4. Peng, C. C., Chang, J. H., Lin, H. Y., Cheng, P. J., Su, B. H. Intrauterine inflammation, infection, or both (Triple I): A new concept for chorioamnionitis. Pediatrics and Neonatology. 59 (3), 231-237 (2018).
  5. Romero, R., et al. Prevalence and clinical significance of sterile intra-amniotic inflammation in patients with preterm labor and intact membranes. American Journal of Reproductive Immunology. 72 (5), 458-474 (2014).
  6. Romero, R., et al. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal. , 1-17 (2014).
  7. Romero, R., et al. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. 28 (12), 1394-1409 (2015).
  8. Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D., Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371 (9606), 75-84 (2008).
  9. Erdemir, G., et al. Histological chorioamnionitis: effects on premature delivery and neonatal prognosis. Pediatrics and Neonatology. 54 (4), 267-274 (2013).
  10. Metcalfe, A., Lisonkova, S., Sabr, Y., Stritzke, A., Joseph, K. S. Neonatal respiratory morbidity following exposure to chorioamnionitis. BMC Pediatrics. 17 (1), 128 (2017).
  11. Anblagan, D., et al. Association between preterm brain injury and exposure to chorioamnionitis during fetal life. Scientific Reports. 6, 37932 (2016).
  12. Villamor-Martinez, E., et al. Corrigendum: Chorioamnionitis Is a Risk Factor for Intraventricular Hemorrhage in Preterm Infants: A Systematic Review and Meta-Analysis. Frontiers in Physiology. 10, 102 (2019).
  13. Villamor-Martinez, E., et al. Chorioamnionitis as a risk factor for retinopathy of prematurity: An updated systematic review and meta-analysis. PLoS One. 13 (10), 0205838 (2018).
  14. Randis, T. M., et al. Incidence of early-onset sepsis in infants born to women with clinical chorioamnionitis. Journal of Perinatal Medicine. 46 (8), 926-933 (2018).
  15. Rodrigo, F. G. M., Henriquez F, G. G., Aloy, F. J., Perez, G. A. A. Outcomes of very-low-birth-weight infants exposed to maternal clinical chorioamnionitis: a multicentre study. Neonatology. 106 (3), 229-234 (2014).
  16. Been, J. V., Lievense, S., Zimmermann, L. J., Kramer, B. W., Wolfs, T. G. Chorioamnionitis as a risk factor for necrotizing enterocolitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Pediatrics. 162 (2), 236-242 (2013).
  17. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: modeling the innate immune response. American Journal of Pathology. 185 (1), 4-16 (2015).
  18. Fitzgibbons, S. C., et al. Mortality of necrotizing enterocolitis expressed by birth weight categories. Journal of Pediatric Surgery. 44 (6), 1075-1076 (2009).
  19. Vongbhavit, K., Underwood, M. A. Prevention of Necrotizing Enterocolitis Through Manipulation of the Intestinal Microbiota of the Premature Infant. Clinical Therapeutics. 38 (4), 716-732 (2016).
  20. Yee, W. H., et al. Incidence and timing of presentation of necrotizing enterocolitis in preterm infants. Pediatrics. 129 (2), 298-304 (2012).
  21. Gantert, M., et al. Chorioamnionitis: a multiorgan disease of the fetus. Journal of Perinatology. 30, 21-30 (2010).
  22. Hudalla, H., et al. LPS-induced maternal inflammation promotes fetal leukocyte recruitment and prenatal organ infiltration in mice. Pediatric Research. 84 (5), 757-764 (2018).
  23. Yamada, N., et al. Histological severity of fetal inflammation is useful in predicting neonatal outcome. Placenta. 36 (12), 1490-1493 (2015).
  24. Wolfe, K. B., et al. Modulation of lipopolysaccharide-induced chorioamnionitis in fetal sheep by maternal betamethasone. Reproductive Sciences. 20 (12), 1447-1454 (2013).
  25. Normann, E., et al. A novel mouse model of Ureaplasma-induced perinatal inflammation: effects on lung and brain injury. Pediatric Research. 65 (4), 430-436 (2009).
  26. Burd, I., Brown, A., Gonzalez, J. M., Chai, J., Elovitz, M. A. A mouse model of term chorioamnionitis: unraveling causes of adverse neurological outcomes. Reproductive Sciences. 18 (9), 900-907 (2011).
  27. Dell'Ovo, V., et al. An animal model for chorioamnionitis at term. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 387 (2015).
  28. Randis, T. M., et al. Group B Streptococcus beta-hemolysin/cytolysin breaches maternal-fetal barriers to cause preterm birth and intrauterine fetal demise in vivo. Journal of Infectious Diseases. 210 (2), 265-273 (2014).
  29. Breen, K., et al. TLR-4-dependent and -independent mechanisms of fetal brain injury in the setting of preterm birth. Reproductive Sciences. 19 (8), 839-850 (2012).
  30. Burd, I., Balakrishnan, B., Kannan, S. Models of fetal brain injury, intrauterine inflammation, and preterm birth. American Journal of Reproductive Immunology. 67 (4), 287-294 (2012).
  31. Agrawal, V., et al. Role of Notch signaling during lipopolysaccharide-induced preterm labor. Journal of Leukocyte Biology. 100 (2), 261-274 (2016).
  32. Filipovich, Y., Klein, J., Zhou, Y., Hirsch, E. Maternal and fetal roles in bacterially induced preterm labor in the mouse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 214 (3), 381-389 (2016).
  33. Alexander, C., Rietschel, E. T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. Journal of Endotoxin Research. 7 (3), 167-202 (2001).
  34. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: suggested assessment and reporting guidelines. Biology of Reproduction. 99 (5), 922-937 (2018).
  35. Rueda, C. M., et al. Lipopolysaccharide-Induced Chorioamnionitis Promotes IL-1-Dependent Inflammatory FOXP3+ CD4+ T Cells in the Fetal Rhesus Macaque. Journal of Immunology. 196 (9), 3706-3715 (2016).
  36. Gavilanes, A. W., et al. Chorioamnionitis induced by intraamniotic lipopolysaccharide resulted in an interval-dependent increase in central nervous system injury in the fetal sheep. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 200 (4), 431-438 (2009).
  37. Boksa, P. Effects of prenatal infection on brain development and behavior: a review of findings from animal models. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (6), 881-897 (2010).
  38. Knuesel, I., et al. Maternal immune activation and abnormal brain development across CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 10 (11), 643-660 (2014).
  39. Garay, P. A., Hsiao, E. Y., Patterson, P. H., McAllister, A. K. Maternal immune activation causes age- and region-specific changes in brain cytokines in offspring throughout development. Brain, Behavior, and Immunity. 31, 54-68 (2013).
  40. Smith, S. E., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  41. Elgin, T. G., et al. Fetal exposure to maternal inflammation interrupts murine intestinal development and increases susceptibility to neonatal intestinal injury. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  42. Fricke, E. M., et al. Lipopolysaccharide-induced maternal inflammation induces direct placental injury without alteration in placental blood flow and induces a secondary fetal intestinal injury that persists into adulthood. American Journal of Reproductive Immunology. 79 (5), 12816 (2018).
  43. Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2627-2635 (2016).
  44. Brown, K. S., et al. Tumor necrosis factor induces developmental stage-dependent structural changes in the immature small intestine. Mediators of Inflammation. 2014, 852378 (2014).
  45. McElroy, S. J., et al. The ErbB4 ligand neuregulin-4 protects against experimental necrotizing enterocolitis. American Journal of Pathology. 184 (10), 2768-2778 (2014).
  46. McElroy, S. J., et al. Tumor necrosis factor receptor 1-dependent depletion of mucus in immature small intestine: a potential role in neonatal necrotizing enterocolitis. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (4), 656 (2011).
  47. Stanford, A. H., et al. A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns. Pediatric Research. , (2019).
  48. McElroy, S. J., Weitkamp, J. H. Innate Immunity in the Small Intestine of the Preterm Infant. NeoReviews. 12 (9), 517-526 (2011).
  49. McElroy, S. J., Underwood, M. A., Sherman, M. P. Paneth cells and necrotizing enterocolitis: a novel hypothesis for disease pathogenesis. Neonatology. 103 (1), 10-20 (2013).
  50. Park, B. S., Lee, J. O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes. Experimental & Molecular Medicine. 45, 66 (2013).
  51. Lester, S. N., Li, K. Toll-like receptors in antiviral innate immunity. Journal of Molecular Biology. 426 (6), 1246-1264 (2014).
  52. Pott, J., et al. Age-dependent TLR3 expression of the intestinal epithelium contributes to rotavirus susceptibility. PLOS Pathogens. 8 (5), 1002670 (2012).

Tags

החודש ב JoVE בעיה 160 Lipopolysaccharide (LPS) חשיפה עוברית לדלקת אימהית (FEMI) Chorioamnionitis התפתחות מעיים תא Paneth תא גביע
מודל מורין של חשיפה עוברית לדלקת אימהית כדי ללמוד את ההשפעות של Chorioamnionitis חריפה על התפתחות מעיים שזה עתה נולד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke,… More

Juber, B. A., Elgin, T. G., Fricke, E. M., Gong, H., Reese, J., McElroy, S. J. A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development. J. Vis. Exp. (160), e61464, doi:10.3791/61464 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter