Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Анализ естественного метаболизма клеток-убийц человека

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

В этой статье мы описываем метод измерения гликолиза и митохондриального дыхания в первичных клетках естественного убийцы человека (НК), изолированных от периферической крови, в состоянии покоя или после активации, вызванной IL15. Описанный протокол может быть легко распространен на первичные клетки НК человека, активированные другими цитокинами или растворимыми стимулами.

Abstract

Естественные клетки Killer (NK) опосредуют главным образом врожденные противоопухолесные и противовирусные иммунные реакции и реагируют на различные цитокины и другие стимулы для содействия выживанию, клеточному распространению, выработке цитокинов, таких как гамма интерферона (ИФНЗ) и/или программы цитотоксичности. Активация НК-клеток при стимуляции цитокинов требует существенной реконструкции метаболических путей для поддержки их биоэнергетических и биосинтетических потребностей. Существует большое количество доказательств того, что нарушение метаболизма нк-клеток связано с рядом хронических заболеваний, включая ожирение и рак, что подчеркивает клиническую важность наличия метода для определения метаболизма нк-клеток. Здесь мы описываем использование внеклеточного анализатора потока, платформы, которая позволяет в режиме реального времени измерения гликолиза и митохондриального потребления кислорода, в качестве инструмента для мониторинга изменений в энергетическом метаболизме клеток НК человека. Описанный здесь метод также позволяет контролировать метаболические изменения после стимуляции НК-клеток с цитокинами, такими как IL-15, система, которая в настоящее время изучается в широком диапазоне клинических испытаний.

Introduction

Природные клетки Killer (NK) являются врожденными лимфоцитами, которые являются посредниками противоопухоленных и противовирусных реакций. НК-клетки составляют 5-15% всех лимфоцитов в периферической крови человека, а также могут быть найдены в селезенке, печени, костном мозге и лимфатических узлах. НК-клетки не выражают полиморфные клонотичные рецепторы, такие как Т-клеточные рецепторы (TCR) или B-клеточные рецепторы (BCR). В отличие от этого, активация их цитолитических функций вызвана вовлечением рецепторов, которые распознают неизменные лиганды на поверхностицелевой клетки 1,,2.

Отдыхающие клетки НК человека, изолированные от периферической крови, могут прожить несколько дней в культурной среде, дополненной сывороткой человека. Активация НК-клеток цитокинами, такими как IL-15 или IL-2, приводит клетки к пролиферации и увеличению их способности убивать,среди прочих эффектов 3,,4,,5. Несколько исследований показали прямую корреляцию между активацией НК-клеток и изменениями в их метаболическойактивности 6. Эти метаболические изменения предназначены для удовлетворения конкретных потребностей клеток с точки зрения энергии и биосинтеза.

Аэробные клетки и организмы получают энергию через ряд химических реакций, которые включают катаболизм и окисление углеводов, жиров и белков. Благодаря сочетанию гликолиза, трикарбоксиновой кислоты (TCA) цикла и окислительного фосфорилирования, эукариотические клетки отвечают большинству их спроса АТФ и получить промежуточные необходимые в качестве строительных блоков для макромолекул, необходимых для роста клеток и распространения. Процесс гликолиза(рисунок 1A) начинается с ввода глюкозы в клетку. В цитозоле глюкоза фосфорилируется и преобразуется в пируват (с чистым производством 2 молекул АТФ на молекулу глюкозы), которые могут быть сведены к лактату или транспортированы в митохондрии, чтобы быть преобразованы в Ацетил-КоА и войти в цикл TCA. Цикл TCA продолжает езда на велосипеде подпитывается больше молекул Ацетил-КоА и производит CO 2 (чтов конечном итоге будет распространяться за пределами клетки и, реагируя с H2O в среде, будет генерировать углеродную кислоту, которая приведет к подкислению среды) и NADH, молекула отвечает за пожертвование электронов в электронной транспортной цепи (ETC). Электроны проходят через различные белковые комплексы и, наконец, принимаются кислородом. Эти комплексы (I, III и IV) также перекачивают H- из митохондриальной матрицы в пространство с интермембрана. В результате генерируемого электрохимического+ градиента, H- снова войдет в матрицу через комплекс V (ATP-синтазы), инвестируя потенциальную энергию, накопленную в генерацию АТФ.

Как гликолиз, так и митохондриальное дыхание могут быть заблокированы в разных точках с помощью ингибиторов. Знание и использование этих ингибиторов было основой для развития внеклеточного анализа потока. Измеряя два простых параметра в режиме реального времени, таких как рН и кислород, экстраклеточный анализатор потока делает вывод о скорости гликолиза и митохондриального дыхания в 96-хорошо пластины. Стресс-тест на гликолиз проводится в базальной среде без глюкозы(рисунок 1B)7. Первые измерения уровня внеклеточного подкисления (ECAR) свидетельствуют о гликолиз-независимом подкислению. Он называется негликолитической подкисления и коррелирует с CO2 производства TCA, что, как уже объяснялось ранее, сочетается с H2O в среде длягенерации H q (TCA-связанных ECAR). Первая инъекция глюкозы, чтобы вызвать использование глюкозы и повысить гликолиз. Вторая инъекция сочетает в себе как ротенон, ингибитор комплекса I, так и антимицин А, ингибитор комплекса III вместе, чтобы блокировать ETC. Клетки реагируют на это резкое снижение производства митохондриального АТФ путем активации гликолиза для поддержания клеточного уровня АТФ, и это представляет собой количество гликолиза, который не используется клеткой в базальном состоянии, но потенциально может быть завербован в ответ на увеличение спроса на АТФ. Третьей инъекцией является аналог глюкозы 2-Deoxyglucose (DG), который конкурирует с глюкозой в качестве субстрата для фермента гексокиназы. Продукт этого фосфорилирования, 2-дезиглиглукозы-6-фосфат не может быть преобразован в пируват, и поэтому гликолиз блокируется, что снижает ECAR до минимума. ECAR измеряется на данный момент включает в себя другие источники внеклеточного подкисления, которые не связаны с гликолизом или дыхательной деятельности, а также любой остаточный гликолиз не полностью ингибируется 2-DG (пост 2-DG-подкисления).

Митохондриальный стресс-тест проводится в среде с глюкозой(рисунок 1C)8. Первые измерения скорости потребления кислорода (OCR) соответствуют базовой линии митохондриального дыхания (базального дыхания). Первая инъекция олигомицин, который препятствует возвращению протонов через синтазу АТФ (комплекс V), блокируя синтез АТФ и тем самым быстро гиперполяризирует митохондриальную мембрану, что предотвращает дальнейшую прокачку протонов через дыхательные комплексы, и приводит к снижению OCR. Сравнение базового дыхания и значения, данное добавлением олигомицина, представляет собой дыхание, связанное с АТФ. Оставшаяся олигомицин-нечувствительная скорость потребления кислорода называется протонной утечкой, которая представляет поток протонов через липидный билейзер или белки во внутренней митохондриальной мембране, такие как адениновым нуклеотиднымтранзислойдом 9. Вторая инъекция является uncoupler 2,4-динитрофенол (DNP), ионофотор, который вызывает массовое вступлениеH в митохондриальной матрицы, что приводит к деполяризации митохондриальной мембраны и нарушение митохондриального синтеза АТФ. Клетки реагируют на рассеивание протонно-мотивной силы, увеличивая скорость транспортировки электронов и потребления кислорода до максимального уровня в тщетной попытке восстановить мембранный потенциал (максимальная дыхательная способность). Разница между максимальной дыхательной способности и базального дыхания запасных дыхательной способности клетки, которая представляет собой количество дыхания, которое не используется клеткой для создания АТФ в базальной состоянии, но потенциально может быть набран в ответ на увеличение спроса АТФ или вусловиях стресса 8. Третья инъекция представляет собой сочетание ротенона и антимицина А. Эта инъекция полностью останавливает ETC и OCR уменьшается до самого низкого уровня, при этом оставшееся потребление кислорода не митохондриальное (вызванное NADPH-оксидами и т.д.).

Изменения в метаболических путей может каким-то образом предсказать функционирование НК-клеток, как было высказано предположение, что непрерывная активация НК-клеток с цитокинами в пробирке может привести к истощению НК клеток путем изучения различных метаболическихпутей 10,11. Корреляция между метаболическим статусом и функцией НК-клеток очень важна с точки зрения иммунотерапии рака. В этой области, активация НК-клеток с вливанием IL-15, в одиночку или в сочетании с моноклональными терапевтическими антителами были протестированы для того, чтобы улучшить опухолевыеклетки убийство 12,13,14. Знание метаболического статуса НК-клеток в ответ на эти стратегии лечения обеспечит ценный предиктор статуса активации нк-клеток и функции убийства.

Изучение метаболических путей в других миелоидных и лимфоидных клеток, таких как моноциты, Т и Вклетки были описаны 15 и оптимизированные методы былиопубликованы 16. В этом протоколе мы предоставляем метод, который сочетает в себе как протокол изоляции НК, который дает большое количество чистых и жизнеспособных НК-клеток, так и оптимизированный протокол для измерения метаболической активности с помощью внеклеточного анализатора потока. Здесь мы показываем, что это действительный метод для изучения метаболических изменений в отдыха и IL-15 активированных клеток человека НК. Для анализа внеклеточного потока были протестированы и оптимизированы такие параметры, как количество клеток и концентрации наркотиков. По сравнению с другими респирометрическими методами, экстраклеточный анализатор потока полностью автоматизирован и способен тестировать в режиме реального времени, с очень низким количеством клеток, до 92 образцов одновременно, и, таким образом, позволяет высокую пропускную способность скринингов (с несколькими образцами и репликациями)в относительно быстром порядке 17.

Этот метод может быть использован исследователями, заинтересованными в оценке функции НК-клеток путем изучения метаболизма НК-клеток. Он может быть применен также к клеткам, активированным другими цитокинами, антителами или растворимыми стимулами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с Хельсинкской декларацией этических принципов медицинских исследований. Образцы периферической крови у доноров были получены из Nih Департамент переливания медицины в соответствии с 99-CC-0168 IRB утвержденный протокол, с пациентом письменного информированного согласия.

1. Реагентная подготовка

  1. Реагенты для изоляции НК-клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте эти реагенты в капюшоне культуры клетки.
    1. Подготовка буфера разделения НК: Дополнение PBS (рН 7.4) с 1 мМ EDTA и 2% Фетальный теленка сыворотки (FCS), который ранее был тепло-инактивированных (при 56 градусов по Цельсию в течение 30 мин).
    2. Подготовка NK культуры среды: Дополнение Iscove модифицированных Dulbecco в средствах массовой информации (IMDM) с 10% человеческой сыворотки (HS). Стерильный фильтр и хранить при 2-8 градусов по Цельсию. Разогреть средний до 37 градусов по Цельсию, прежде чем добавлять в клетки.
    3. Повторное распределение человеческого Ил-15 в PBS при 200 мкг/мл.
  2. Реагенты для анализа внеклеточного потока
    1. Подготовка анализ средств массовой информации: Для митохондриального стресс-теста среды, добавить 1 мМ пируват натрия, 2 мМ Л-глутамин и 10 мМ глюкозы в базовую среду; для гликолиза стресс-тест среды, добавить 2 мМ L-глутамин в базовую среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации глюкозы, пирувата и глутамина обеспечиваются в том случае, если это рекомендовано производителем анализатора внеклеточного потока. Тем не менее, состав средств массовой информации может быть изменен исследователями, чтобы идеально соответствовать культуре среды, при желании.
    2. Отрегулируйте рН обоих средств до 7,4 с 0,1 N NaOH с помощью счетчика pH на скамейке, стерильный фильтр через размер поры 0,2 МКМ и хранить при 2-8 градусах Цельсия. Теплые средства массовой информации до 37 градусов по Цельсию, проверить рН и скорректировать до 7,4 перед использованием, если это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Только окружающий CO2 содержится в атмосфере внеклеточного анализатора потока, использование средств массовой информации без бикарбоната имеет решающее значение.
    3. Подготовка фондовых растворов для реагентов: олигомицин (ингибитор синтазы АТФ), 10 мМ в DMSO; 2,4-динитрофенол (DNP, uncoupler), 1 M стоковое решение в DMSO; антимицин А (комплексный ингибитор III), 10 мМ стокового раствора в ДМСО; ротенон (ингибитор комплекса I), 10-метровый стоковой раствор в ДМСО. Сделайте 30 алицитов всех реагентов и храните при -20 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти руководящие принципы предназначены для реагентов, приобретенных индивидуально и подготовленных исследователем. Если реагенты закупаются у производителя анализаторов, следуйте их рекомендациям по приготовлению реагентов.

2. НК-клетки изолированы от периферической крови

  1. Периферические моноядерные клетки крови (ПБМТ) препарат из крови человека
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги в капюшоне культуры клеток. Обеззараживать все остатки и материал в контакте с кровью с отбеливателем и выбросить их в соответствующий контейнер для сжигания.
    1. Pipette 20 мл лимфоцитов Разлука Средний (LSM) в 50 мл конической трубки.
    2. Осторожно, сохраняя трубку под углом 30 градусов, пипетка 20 мл крови над LSM, очень мягко и касаясь стенки трубки. Избегайте смешивания крови с LSM и создайте видимый и четко определенный интерфаз между двумя жидкостями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Периферическая кровь или обогащенные продукты лейкафереза могут быть использованы.
    3. Центрифуга труб в течение 25 мин, 1000 х г при комнатной температуре. Не используйте тормоз, так как он может сделать обе фазы в трубке (LSM и крови) смеси.
    4. Аккуратно вынюйте трубки из центрифуги и поместите их в стойку. Проверьте наличие заметного слоя клеток (моноядерных клеток), которые образуются на интерфазе между LSM (ясно) и плазмы (желтый), в то время как красные кровяные тельца гранулы в нижней части трубки.
    5. Аккуратно аспирировать моноядерный слой клетки с 10 мл пластиковой пипетки (около 5-8 мл) и поместить его в новую 50 мл конической трубки. Лимфоциты интерфазы до 2 различных труб могут быть объединились вместе.
    6. Вымойте моноядерные клетки 2x путем повторного перерасхода в 45 мл PBS и центрифугирования при 800 х г в течение 5 мин, при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага, гранулы периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) получено и исследователь может перейти к шагу изоляции НК.
  2. Изоляция Нагорного Карабаха от ПХМ
    1. Подсчитайте ячейки от 2.1.6 и повторно посчитайте их в буфере разделения НК (1x 108 PBMCs/mL).
    2. Возьмите 10 мл повторного деления клетки (109 PBMCs) и поместите их в трубку 50 мл.
    3. Добавьте 500 йл (50 йл/мл буфера) смеси антител изоляции нк-клеток и 10 йл (1 мл/мл буфера) анти-CD3 положительной изоляционные антитела смешиваются с ПКМК и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут.
    4. Вихрь магнитных бусин и добавить 1 мл в смесь ПКМК с антителами (100 йл бисер / мл ПКМК). Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре с иногда помешивая.
    5. Добавьте 35 мл буфера изоляции НК (3,5 мл буфера/мл ПБМТ), перемешайте и поместите на магнит на 15 мин (2,2 х 107 ПМХ/мл). После этого времени, бисер и клетки положительно выбраны (все, кроме НК-клеток) будут придерживаться стенок трубки.
    6. Тщательно соберите супернатант (содержащий НК-клетки) с пластиковой пипеткой 50 мл, не касаясь сторон или нижней части трубки.
    7. Подсчитайте клетки с помощью клеточного счетчика и центрифуги на 800 х г в течение 5 мин.
    8. Resuspend изолированных нк-клеток на 5 х 106 клеток / мл в IMDM, содержащих 10% СС и поместить их в инкубатор при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 до тех пор, пока эксперимент не будет выполнен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе изоляции НК говорится о количестве клеток и объемах реагентов, адаптированных для использования трубки объемом 50 мл и большого магнита. Этот протокол может быть расширен (в случае получения большего количества ПМГ) путем повторения этапов изоляции в различных трубках или уменьшен за счет уменьшения объема в трубке. Для конечных объемов 14-45 мл используется полистироловая трубка объемом 50 мл, для объемов 4-14 используется полистироловая трубка объемом 15 мл и для объемов 1-4 мл используется полистироловая трубка объемом 5 мл. Магнит отличается и подходят соответствующие трубки в каждом конкретном случае. Количество смеси антител и магнитных бусин также может быть уменьшено в зависимости от количества клеток и конечного объема.
  3. Окрашивание популяции НК-клеток для цитометрии потока
    1. Возьмите 0,25 х 106 клеток на образец из шага 2.2.8, удалите средний центрифугированием на 800 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и повторно посходит гранулы клетки в 500 МЛ PBS.
    2. Добавьте краситель жизнеспособности в соответствии с рекомендацией производителя (1 мл красителя DMSO-восстановленного до 1 мл повторного незаменимости клетки) и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
    3. Вымойте 2x путем повторного перерасхода в 5 мл PBS и центрифугирования при 800 х г в течение 5 минут, при комнатной температуре.
    4. Пятно с соответствующими анти-человеческими антителами в 100 МКЛ IMDM, содержащих 10% ГС в течение 30 мин на льду, защищенном от света (см. таблицу 1). Все антитела могут быть объединены и использованы в одном шаге окрашивания.
    5. Проанализируйте образцы по цитометрии потока, чтобы оценить чистоту полученной популяции нк-клеток. Используйте метод вымывания клеток и анализа, который ранее былописан 18,,19.
  4. Стимуляция НК-клеток растворимым ИЛ-15
    1. Resuspend 0.75 x 106 ячеек из шагов 2.2.8 или 2.4.3 в 100 йл IMDM, содержащих 10% HS в колодец 96 хорошо пластины (круглое дно).
    2. Разбавить человека IL-15 до 1 мкг/мл в IMDM, содержащий 10% ВТ. Добавьте 100 МКЛ разбавленного человеческого ИЛ-15 в клетки, чтобы достичь конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0,5 мкг/мл является насыщая концентрацией Ил-15. При желании исследователи могут протестировать более низкие концентрации ИЛ-15 или других цитокинов, таких как ИЛ-2, ИЛ-12 или ИЛ-18.
    3. Поместите клетки в инкубатор при 37 градусов по Цельсию и стимулировать в течение 48 ч, прежде чем выполнять внеклеточный анализ потока. Повторное несыходное нестимулированные (контрольные) клетки в той же концентрации и объеме в IMDM, содержащее 10% ВГ без ИЛ-15, и поместить их в тот же инкубатор на 48 ч.

3. Гидратация сенсорного картриджа

ПРИМЕЧАНИЕ: 96 наконечников зонда картриджа датчика содержат отдельные твердотопливныефлюорофоры для O 2и H, которые должны быть увлажнены для того, чтобы обнаружить O2 и рН изменений.

  1. Включите анализатор и дайте ему прогреться до 37 градусов по Цельсию.
  2. Откройте пакет картриджа датчика и отделяете сенсорный картридж от полезной пластины. Добавьте 200 мкл раствора калибранта в каждую колодец полезной пластины и положите обратно картридж датчика на пластину, проверяя, что датчики полностью погружены в раствор. Для достижения оптимальных результатов инкубировать картридж на ночь при 37 градусовпо Цельсию вCO 2-бесплатный инкубатор, который правильно увлажняется, чтобы предотвратить испарение. Предотвращение образования пузырьков под датчиками во время гидратации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальное время гидратации картриджа составляет 4 ч при 37 градусах цельсия в инкубаторе, свободном от CO2. Кроме того, можно использовать ночную гидратацию сенсорного картриджа с 200 мкл стерильной воды при37 градусов по Цельсиюв инкубаторе, свободном от CO 2, а затем инкубацию сенсорного картриджа с 200 МКЛ предварительно разогретого раствора калибранта 45 - 60 минут до начала пробега.

4. Анализ внеклеточного потока

  1. Приготовление клеевых пластин
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку измерение метаболических параметров происходит в микрокамере, сформированной в нижней части 96-хорошо анализной пластины, суспензиочные клетки должны сначала быть прилипли к нижней части хорошо. Используется клеточный клей, извлеченный из мидии Mytilus edulis. Производитель клея клетки рекомендует концентрацию покрытия от 1 до 5 мкг/см2. Колодец микроплюера культуры клеток анализатора имеет поверхность приблизительно 0.110 cm2. Таким образом, для концентрации 5мкг/см 2 требуется около 0,55 мкг клея. Поскольку для покрытия каждой хорошо будет использоваться 25 МКЛ клеевых растворов, оптимальная концентрация клеевых растворов для микропластиров культуры клеток анализатора составляет около 22,4 мкг/мл (22,4 мкг/мл х 0,025 мл и 0,56 мкг).
    1. Приготовьте 2,5 мл клеточного клея раствора (22,4 мкг/мл) в 0,1 м бикарбоната натрия, рН 8,0. Бикарбонат обеспечивает оптимальный рН для производительности адепта клеток, который, по словам производителя, составляет от 6,5 до 8,0.
    2. Пипетка 25 МКЛ клеточного клея раствора для каждой колодец анализной пластины и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого, удалить раствор и мыть 2x с 200 йл стерильной воды / хорошо. Пусть колодцы высохнут, сохраняя пластину открытой в течение 15 минут внутри капота культуры клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые пластины могут храниться до 1 недели при 4 градусах Цельсия.
  2. Посев клеток в тарелках, покрытых клеем
    1. Центрифуга клеток из шага 2.4.3 при 200 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатанты и мыть клетки в разогретой митохондриальной среде стресс-теста (если проводится митохондриальный стресс-тест) или гликолиз стресс-тест среды (если проводится стресс-тест на гликолиз). Пеллетные клетки снова и повторное увеличение предпочтительной концентрации клеток в той же среде (объем повторной суспензии будет зависеть от выбранной концентрации клеток; так как каждая хорошо будет содержать 180 МКЛ клеточной подвески, подготовить 0,26 х 106, 0,52 х10 6, 1,04 х 106, 2,08 х 106, 4,17 х 106 и 8,33 х 106 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл ячейки подвески для 8,33 х 10 6 ячеек / мл0.047 x 106, 0.094 x 106, 0.187 x 106, 0.375 x 106, 0.75 x 106 и 1. 5 x 106 ячеек на колодец соответственно).
    2. Плита 180 МКЛ клеточной суспензии на колодец вдоль стороны каждой хорошо. Рекомендуется многоканальный пипетка. Для коррекции фона используйте скважины A1, A12, H1 и H12 пластины культуры анализатора. Добавьте 180 МКЛ среды анализа в этих скважинах (без ячеек). При желании можно использовать дополнительные контрольные скважины и при достаточном пространстве в плите.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие сыворотки может привести к плохой привязанности клеток.
    3. Инкубировать пластину в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию в CO2-бесплатныйинкубатор. Подготовка 10x соединений в то же время (см. шаг 4.3 ниже).
    4. Измените настройки центрифуги до нулевого торможения. Центрифуга пластины на 200 х г в течение 5 мин. Наблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы проверить, что они образуют монослой в нижней части колодец. Перенесите пластины обратно в инкубатор CO2в течение 25 минут. Для получения наилучших результатов общее время после покрытия должно быть не более 1 ч.
  3. Подготовка 10-х рабочих решений для загрузки в сенсорный картридж
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый из 96 наконечников зонда картриджа датчик гавани 4 порта (A, B, C и D), которые могут быть использованы для инъекций соединений последовательно в отдельных скважин.
    1. Для выполнения митохондриального стресс-теста подготовьтесь к 2,5 мл каждого из 10 Олигомицинов, 1 мМ ДНП и смеси ротенона 10 МКМ и 10 МКМ антимицина А в среде анализа митохондриального стресса (используйте стоковые растворы из шага 1.2.3). Окончательные концентрации в колодец после инъекции будут 1 МКМ олигомицин, 0,1 мМ ДНП и 1 МКМ антимицин А/ротенон.
    2. Для выполнения стресс-теста на гликолиз подготовьтесь к 2,5 мл смеси из 10 ротенонов и 10 МКМ антимицина А в среде анализа стресса гликолиза (используйте фондовые растворы из шага 1.2.3). Растворите глюкозу в среде стресс-теста гликолиза для раствора 100 мМ и 2-дезикси-глюкозы (2-DG) в гликолизной среде стресс-теста для раствора 500 мМ. Окончательные концентрации в хорошо после инъекции будет 10 мМ глюкозы, 1 МКМ антимицин А / ротенон и 50 мм 2-DG.
    3. Теплые растворы до 37 градусов по Цельсию, проверить рН и скорректировать до 7,4, если это необходимо. Нагрузка соединений, подготовленных в шаге 4.3.1. (для митохондриального стресс-теста) или 4.3.2 (для стресс-теста на гликолиз) в порты A, B и C гидратированного сенсорного картриджа (от шага 3.2) с использованием многоканального микропайпютора и портовых направляющих, обеспеченных картриджем, как показано в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения надлежащего впрыска во всех скважинах во время анализа, каждая серия портов, которые используются (например, все порты А) должны содержать тот же объем впрыска по всему картриджу датчика. Это относится к фоновой коррекции скважин и даже к тем скважинам, которые не используются в эксперименте.
    4. Инкубировать загруженный картридж датчика при 37 градусов по Цельсию в CO2-бесплатныйинкубатор при настройке программы.
  4. Настройка протоколов анализа внеклеточного потока
    1. Откройте программное обеспечение для анализатора внеклеточного потока, и с помощью вкладок Group Definitions and Plate Map показаны группы скважин, которые имеют схожие условия (например, скважины с одинаковым количеством ячеек или колодцы с либо ячейками покоя, либо ИЛ-15-стимулируемыми ячейками). Также будут установлены фоновые коррекционые скважины (по умолчанию будут установлены A1, A12, H1 и H12, но могут быть использованы дополнительные скважины) и пустые скважины.
    2. Настройка программы, описанной в таблице 3 в программном обеспечении с помощью вкладки Протокол.
    3. Запустите программу с помощью вкладки Run Assay. Поместите сенсорный картридж (гидратированный и загруженный 10x соединениями) и утилиту пластины на лоток. После шага калибровки (15 - 20 мин), по запросу, замените калибрантную пластину на анализную пластину (без крышки) с прикрепленными клетками. После этого пробег полностью автоматизирован (машина будет выполнять все измерения и инъекции).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно выполнить митохондриальный стресс-тест и гликолитический стресс-тест в той же тарелке, до тех пор, как конкретные соединения загружаются в соответствующие порты (олигомицин, DNP и антимицин/ротенон в портах A, B и C соответственно скважин, где проводится митохондриальный стресс-тест; глюкоза, антимицин/ротенон Group Definitions и 2-DG в портах A, B и C соответственно скважин, где проводится стресс-тест гликолиза), одинаковые объемы для инъекций используются в каждой серии портов и скважин для каждого теста. Plate Map
    4. После завершения выполнения извлечения данных и анализа их с помощью программного обеспечения.

5. Определение номера ячейки

ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты могут быть нормализованны с учетом возможных различий в количестве клеток. Можно использовать два основных подхода, описанных ниже.

  1. Определение содержания ДНК
    1. Удалите оставшуюся среду анализа с пипеткой из каждой хорошо. При аспирации среды, заботиться, чтобы не беспокоить клетки. Пластина может храниться при -20 градусов по Цельсию до анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание шаг имеет важное значение для эффективного клеточного лиза и определения содержания ДНК.
    2. Подготовь 1x раствор буфера клеточного пролиферации клеточного лиза (20x) в дистиллированной воде (200 МКЛ/колодец).
    3. Добавьте раствор клеточного пролиферации красителя (400x) в буфер 1x cell-lysis. Для обнаружения от 50 до 50.000 клеток на колодец, используйте 1x клеточного пролиферации анализа красителя. Для более высоких номеров клеток рекомендуется использовать краситель для анализа пролиферации клеток в конечной концентрации выше 1x. В этом случае используйте краситель анализа пролиферации клеток в 5-кратной конечной концентрации (разбавляют раствор пролиферации клеток в 80 раз в буфер 1x клеточного лиза).
    4. Добавьте 200 МКЛ реагента пролиферации клеток к каждой хорошо. Инкубировать образцы в течение 2-5 минут при комнатной температуре. Защитите от света.
    5. Измерьте флуоресценцию образцов при возбуждении: 480 нм; выброс: 520 нм с использованием микроплеся флуоресценции в соответствии с рекомендациями производителя.
  2. Определение содержания белка
    1. Осторожно, аспирировать полностью анализ среды из каждого хорошо, не касаясь ˚клеток и заморозить клетки при -20 градусов по Цельсию, по крайней мере 1 ч. Кроме того, клетки могут быть заморожены в течение более длительного времени (до 1 недели) до тех пор, пока анализ не будет выполнен.
    2. Добавьте 50 МКЛ радиоиммунопреципийного анализа (RIPA) среды лиза, дополненной 1x ингибиторами протеазы (от 100x раствора запаса) к каждой хорошо. Поместите тарелку на шейкер в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем инкубировать пластину на льду в течение 30 минут для полного лиза клетки.
    3. Центрифуга пластины в течение 5 мин при температуре 200 х г при комнатной температуре. Этот шаг будет гранул клеточного мусора для предотвращения вмешательства в измерение белка.
    4. Измерьте концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) в соответствии с рекомендациями производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изоляция НК-клеток от периферической крови обеспечивает чистую и жизнеспособную популяцию

Анализ внеклеточного потока основан на измеренииконцентрации H и O2 в хорошо и не будет различать различные популяции клеток или их жизнеспособность. По этой причине, получение очень чистой и жизнеспособной популяции ячейки интересов было ключевым шагом, чтобы преуспеть в этих экспериментах.

Изоляция НК-клеток от периферической крови была выполнена, как указано в разделе 2. Для оценки чистоты и жизнеспособности полученных НК-клеток были окрашены и проанализированы цитометрия потока(рисунок 2A). Моноядерные ячейки были закрыты на участке, показывающем вперед (FSC-A) против области бокового рассеяния (SSC-A). В этой популяции одиночные ячейки были закрыты по диагонали на участке, показывающем высоту FSC-A по сравнению с форвардным рассеянием (FSC-H). В рамках единочисленных популяций была оценена жизнеспособность, которая, как было установлено, превышает 98% как в ПМБК, так и в популяциях нк-клеток. Чистота изолированной популяции клеток НК была установлена двойным окрашиванием против CD3 (присутствует в Т-клетках, доминирующей популяции среди PBMCS) и CD56 или NKp46(рисунок 2B). Нк-клетки определяются как популяция отрицательных для CD3 и положительных для CD56 или NKp46. В соответствии с этими критериями чистота НК-клеток составила около 88%, что представляет собой 18-кратное обогащение нк-клеток по сравнению с теми, которые присутствуют в популяции ПБМС.

Значения OCR и ECAR зависят от номера ячейки

Для митохондриального стресс-теста клетки были метаболически возмущены добавлением трех различных соединений: олигомицина, ДНП и антимицина А и ротенона. Для каждого типа клеток, количество клеток на колодец были тщательно оптимизированы для внеклеточного анализа потока эксперимента. Рисунок 3A показывает репрезентативные участки митохондриальной скорости потребления кислорода (OCR) с использованием нескольких человеческих6номеров НК клеток (0,75х 10 6, 0,187 х10 6, 0,094 х 106 и 0,047 х 106). Все измерения были выполнены в трихате. Номера клеток линейно коррелируют с количеством ДНК или белка в колодец(рисунок 3B). Как и ожидалось, высокие числа ячеек отображали более высокие значения OCR, в то время как менее 0,187 х 106 ячеек на колодец не дают надежных результатов. С другой стороны, более высокие числа клеток (1,5 х10 6) не были оптимальными, так как при добавлении DNP концентрация кислорода в оке была полностью истощена вкаждом цикле (рисунок 3C),что исключает точный расчет OCR. Концентрация uncoupler должна быть титрована тщательно для каждого типа клетки, как не добавляя достаточные результаты DNP в submaximal OCR, тогда как добавлять слишком много может ингибировать максимальный OCR также. В клетках НК человека, 100 МКМ DNP было установлено, что оптимальная доза (Рисунок 3D). Другие разъединения, такие как карбонил цианид-4-(trifluoromethoxy) фенилгидразон (FCCP) или карбонил цианид м-хлорофенил гидразин (CCCP) могут быть использованы вместо DNP, но должны быть титрован для каждого типа клеток, а также.

Для стресс-теста на гликолиз, после базового измерения ECAR, клетки, жаждут глюкозы, были возмущены следующими соединениями: глюкоза, антимицин А и ротенон и 2-DG. На рисунке 3E показаны репрезентативные участки ECAR с использованием нескольких номеров НК-клеток (0,75x 10 6,0,375x 106,0,094 x 106 и 0,047 x 106). Все измерения были выполнены в трихате. Анализ стресса гликолиза был наиболее успешным при самой высокой плотности покрытия, в то время как менее 0,187 х 106 клеток на колодец не дают надежных результатов.

Лечение ИЛ-15 повышает базальные и максимальные значения OCR и ECAR

Для последующих экспериментов использовалась оптимальная плотность посева 0,75х 10 6 клеток на колодец. НК-клетки были культурны при наличии или отсутствии насыщенных концентраций цитокинов IL-15 в течение 48 ч, после чего их жизнеспособность была признана 93,7 и 4,8% и 85,7 и 12,0%, соответственно. Рисунок 4A,B показывает типичный митохондриальный стресс-тест эксперимент с 0,75 х 106 НК-клеток на колодец. В этом тесте, олигомицин приводит к резкому снижениюпотребления кислорода (рисунок 4A) и увеличение ECAR, который представляет собой переход на гликолиз, чтобы попытаться сохранить клеточный уровень АТФ (Рисунок 4B). Активация НК-клеток ИЛ-15 вызвала увеличение как митохондриального потребления кислорода, так и внеклеточного подкисления. Этот результат был последовательным, когда несколько человеческих субъектов былисравнены ( Рисунок 4C). Базальное, максимальное и связанное с АТФ дыхание, но не протонная утечка или нехондриальное дыхание, увеличенное с ИЛ-15(рисунок 4C,D). Кроме того, снизилась скорость OCR/ECAR, что указывает на тенденцию к переходу к гликолитическому метаболизму после стимуляции IL-15(рисунок 4E).

Рисунок 4F,G показывает типичный эксперимент стресс-теста гликолиза с 0,75 х 106 НК клеток на колодец. Добавление глюкозы вызвало значительное увеличение ECAR из-за активации гликолиза, в то время как последующее добавление антимицина А и ротенона привело к компенсационной гликолизу, а 2-DG вызвало ингибирование пути и снижение ECAR до минимума(рисунок 4F). Параллельно глюкоза последовательно вызывала небольшое снижение потребления кислорода, возможно, эффектом Крабтри20, в то время как антимицин А и ротенон полностью блокировали дыхание и 2-DG не обеспечивают никаких дальнейших эффектов(рисунок 4G). Активация как внеклеточного подкисления, так и митохондриального потребления кислорода с ИЛ-15 также может наблюдаться в этом тесте, и опять же это согласуется при использовании клеток от несколькихдоноров (рисунок 4H).

Figure 1
Рисунок 1: Схема экстраклеточного потока анализов.
(A)Схема гликолиза, трикарбоксийного кислотного цикла (TCA) и электронной транспортной цепи (ETC). Ингибиторы различных шагов написаны красным цветом. Поток электронов в ETC представлен зеленым цветом с NADH в качестве донора и O2 в качестве окончательного приемлемого. (B) Гликолиз стресс-тест схематический профиль, представляющий внеклеточной скорости подкисления (ECAR) по сравнению со временем. (C)Митохондриальный схемный профиль стресс-теста, представляющий скорость потребления кислорода (OCR) по сравнению со временем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Естественные клетки Killer (NK), очищенные от периферийных моноядерных клеток (PBMCs).
(A)Стратегия Гэтинга следовала для оценки чистоты и жизнеспособности НК-клеток (правая колонка) по сравнению с общей суммой PBMCs (левая колонка). Из ворот моноядерных ячеек (верхних панелей) были выбраны одиночные ячейки (средние панели) и измерена жизнеспособность (нижние панели). (B) живые клетки были окрашены для CD3 и CD56 или NKp46. Цифры в панелях указывают процент ячеек в выбранных регионах. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Оптимизация митохондриальных и глюкозных стресс-тестов в активированных клетках НК человека.
(A) Митохондриальный стресс-тест: OCR для каждого покрытия плотности (0,75х 10 6, 0,375х 10 6, 0,187х 10 6, 0,094 х 106 и 0,047 х 106) показано. Каждая точка данных представляет среднее количество 3 скважин со стандартным отклонением. Результаты являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. (B) ДНК (верхняя панель) и белковые (нижняя панель) уровни в хорошо на различных плотности покрытия. Результаты являются репрезентативными по крайней мере в трех независимых экспериментах. Каждая точка данных представляет среднее количество 3 скважин со стандартным отклонением. Результаты являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. (C)Сырые следы уровня кислорода в скважинах, не содержащих клеток (черный след), 0,75 х10 6 клеток (синий след) или 1,5 х 106 клеток (зеленый след). В зеленом следе после добавления DNP, кислород полностью истощается в каждом цикле. (D) Запасная дыхательная способность 0,75 х 106 клеток была протестирована при наличии нескольких концентраций DNP. (E) Гликолиз Стресс-тест: ECAR для каждого покрытия плотности (0,75 х10 6, 0,375 х10 6, 0,187х 10 6, 0,094 х 106 и 0,047 х 106) показано. Каждая точка данных представляет среднее количество 3 скважин со стандартным отклонением. Результаты являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Обнаружение метаболических изменений после активации НК-клеток ИЛ-15.
Митохондриальный стресс-тест: OCR(A)и ECAR(B)участки показаны для 0,75 х10 6 отдыхающих или IL-15 активированных клеток. Каждая точка данных представляет среднее количество 3 скважин со стандартным отклонением. Результаты являются репрезентативными для 5 независимых экспериментов. Базальные и максимальные изменения дыхания для отдельных доноров человека показаны в (C), в то время как АТФ-связанное дыхание, утечка протонов, не митохондриальное дыхание(NMR) показаныв ( D ) и соотношение OCR/ECAR показано в (E). Гликолиз Стресс-тест: ECAR(F) и OCR (G) участки показаны для 0,75 х 106 отдыха или IL-15 активированных клеток. Каждая точка данных представляет среднее количество 3 скважин со стандартным отклонением. Результаты являются репрезентативными для 5 независимых экспериментов. Базальные и максимальные внеклеточные изменения подкисления для отдельных доноров человека показаны в (H). ns: не значительный; р-˂ 0,05; р-˂ 0,01; р ˂ 0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Вклад TCA и гликолиза на ECAR.
Первые измерения ECAR в значительной степени соответствуют подкислению из-за CO2, производимого в цикле TCA. После добавления глюкозы в топливный гликолиз вклад подкисления, полученного TCA, в ECAR уменьшается. Инъекции антимицина А и Ротенона блокируют ТЦА, а гликолиз компенсирует увеличение спроса на АТФ за счет увеличения до максимального уровня (компенсационный гликолиз). Блокада гликолиза на 2-DG уменьшает ECAR до минимальных уровней, соответствующих подкислению, которое не связано с гликолизом или дыхательной активностью, а также с любым остаточным гликолизом, не полностью ингибируется 2-DG (пост 2-DG-подкисление). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Реагента Рабочая концентрация Клон (для антител) Окончательный объем окрашивания
Мышь анти-человеческий CD3 BV711 50 нг/мл UCHT1 100 мкл
Мышь анти-человеческий CD56 PE 1/50 разбавления B159 100 мкл
Мышь анти-человека NkP46 PE 1/50 разбавления 9/E2 100 мкл
Жизнеспособность красителя 1/1000 разбавления 500 мкл

Таблица 1: Реагенты и антитела, используемые для цитометрии потока.

Митохондриальный стресс-тест
Порт Объем Составной 10x Акции Окончательная концентрация в анализе
A 20 мкл олигомицин 10 МКМ 1 МКМ
B 22 мкл Dnp 1 мМ 0,1 мМм
C 25 мкл антимицин А и ротенон По 10 МКМ каждый По 1 МКМ каждый
Стресс-тест на гликолиз
Порт Объем Составной 10x Акции Окончательная концентрация в анализе
A 20 мкл Глюкозы 100 мМ 10 мМ
B 22 мкл антимицин А и ротенон По 10 МКМ каждый По 1 МКМ каждый
C 25 мкл 2-DG 500 мМ 50 мМ

Таблица 2: Погрузка соединения.

Шаг Цикл Повторите (время)
Смесь Подожди Измерения
Калибровки ––
Эквилибрация ––
Базовые показания 3 минуты 0 минут 3 минуты 3
Конец цикла ––
Инжектор Порт А ––
Измерения 3 минуты 0 минут 3 минуты 3
Конец цикла ––
Инжектор Порт B ––
Измерения 3 минуты 0 минут 3 минуты 3
Конец цикла ––
Инжектор Порт C ––
Измерения 3 минуты 0 минут 3 минуты 3
Конец цикла ––
Окончание программы ––

Таблица 3: Макет программы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этой статье мы установили протокол для эффективной изоляции и культивирования чистых и жизнеспособных первичных клеток НК человека из периферической крови. Мы также оптимизировали условия для измерения метаболической активности этих НК-клеток, оцениваемых по скорости потребления кислорода и скорости внеклеточного подкисления с помощью экстраклеточного анализатора потока. По сравнению с другими респирометрическими методами, экстраклеточный анализатор потока быстро, требует небольшого количества клеток, и позволяет высокую пропускную способность скринингов. Тем не менее, его реагенты стоят дорого, и инъекции соединений ограничены только четыре. Метаболическая ремоделирование и активация гликолиза и окислительного фосфорилирования цитокинами в НК-клетке имеет важное значение для надежных ответовНК-клеток 21,а описанные здесь методы позволяют изучать метаболический профиль НК-клеток в режиме реального времени. Этот протокол может быть распространен на клетки, активированные другими цитокинами, такими как IL-2, IL-12 и IL-18, или антителами, которые связываются с активацией рецепторов. Мы рассмотрели несколько ключевых шагов, которые часто упускаются из виду, такие как покрытие клеток при оптимальном слиянии или использование оптимальной концентрации uncoupler для стимулирования максимального потребления кислорода. Тем не менее, мы рекомендуем проверить фактическиекривые уровня O 2(рисунок 3C), еслидругие стимулы, отличается от IL-15, даются клеткам,чтобы убедиться, что O 2 не истощается в скважинах. Если это так, то число ячеев должно быть уменьшено до тех пор,пока не будет наблюдаться линейное потребление O 2, чтобы предотвратить недооценку реального OCR.

Базальное дыхание отражает базальное метаболическое состояние клетки, которое в значительной степени контролируется активностью митохондриальнойсинтазы АТФ 8, и является признаком базального спроса на АТФ (для синтеза белка, цитоскелетной динамики,+ATPases, таких как Na q/K- ATPase и т.д.). Как правило, при наличии достаточного количества субстратов этот параметр увеличивается в метаболически активных или напряженных клетках. Добавление олигомицина, который блокирует синтазу АТФ, показывает, АТФ связанных дыхания и утечки протонов, которые могут произойти через липидный билейзер или белки внутренней митохондриальной мембраны, но также может быть невосполнимым через белки, такие как uncoupling белки (UCPs) 9 , причастных крегуляцииадаптивного термогенеза и, таким образом, преобразование митохондриального энергетического потенциала в коричневый Максимальное дыхание определяется такими факторами, как наличие субстратов для митохондриальной дыхательной цепи, количество и активность респираторных комплексов. Митохондриальные респираторные комплексы и их активность также могут быть изменены с помощью посттрансляционных модификаций, таких как ацетилированиеили фосфорилирование 22,,23. Этот параметр может также указывать на здоровье клеток и их способность реагировать на острые оскорбления. В ситуациях митохондриальной дисфункции, максимальное дыхание уменьшается, и это ограничивает способность клетки реагировать на изменения спроса АТФ и приводит к смертиклеток 24.

Очень важно отметить, что, для каждой точки времени митохондриального и гликолиза стресс-тестов, ECAR является сумма гликолиза полученных подкисления(черезгенерацию лактата и H )иреспираторного подкисления(через генерациюCO 2 , который растворяется в H2O для генерации HCO3- и H), и, что важно,респираторных подкисления может соотчитаться значительная доля Для заинтересованных исследователей, Есть опубликованные протоколы для расчета фактических гликолитических ставок. С этой целью, уровень потребления кислорода во время гликолитическогостресс-теста (рисунок 4G) может быть использован для расчета скорости производства протона путем дыхания в каждой точке времени, и это значение может быть вычтено из общей скорости производства протонов, которая получена с использованием значений ECAR и буферизациимощности среднего 7,25,26.

Важным изменением этого протокола по сравнению с рекомендацией производителя является вторая инъекция стресс-теста на гликолиз. Антимицин А и ротенон предпочитают олигомицин, по нескольким причинам, которыеуже были описаны 7: 1) Некоторые клетки отображают высокую гликолитической способности, которые могут полностью удовлетворить базальный спрос АТФ клетки, даже при отсутствии окислительного фосфорилирования; 2) блокирование ETC с антимицином А и ротеноном искусственно увеличивает спрос АТФ на клетку, так как это вызывает гидролиз АТФ с помощью синтазы АТФ (митохондрии становятся раковиной АТФ), которая меняется на насос протонов в попытке восстановить митохондриальный мембранный потенциал, который разрушается после торможения дыхания; 3) блокирование ETC предотвращает подкисление дыхательных путей среды (респираторный CO2, генерируемый в цикле TCA, который преобразуется в HCO3- иH ) которые могут запутать результаты ECAR. Таким образом, наблюдаемый максимальный ECAR с антимицином А и ротеноном объясняется только гликолизом. Интересно, что было сообщено, что ECAR наблюдается с респираторными ингибиторами только все еще может быть субмаксимальной7, и дополнительный механизм для увеличения спроса на клеточный АТФ (и, следовательно, максимальный ECAR) был описан: добавление ионофора monensin, что увеличивает импорт Na qв клетку27 и стимулирует скорость гидролиза АТФ плазменноймембранойNa q/K-ATPase, к смеси антимицина А и ротенона7.

Вторая важная концепция заключается в том, что мы не рекомендуем вычитать негликолитическое подкисление, что,вероятно,соответствует респираторным CO2, который преобразуется в HCO3- и H , от всего следа для расчета гликолитических параметров, как это рекомендовано производителем, так как это количество значительно меняется на каждом этапе стресс-теста гликолиза (это самый высокий в базальном состоянии,уменьшается после добавления глюкозыиз-за эффекта Крабтри20, и практически отменен с антицином) .

Подводя итог, этот протокол показывает простой и эффективный инструмент для проверки метаболической активности естественных клеток-убийц человека с помощью внеклеточного анализатора потока. Этот метод может быть использован для допроса метаболического состояния в этих клетках, которые, как известно, меняются с активацией клеток путем стимуляции цитокинов или при определенных патологических условиях, включая ожирение, рак иливирусные инфекции 28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят д-ра Майкла Н. Сака (Национальный институт сердца, легких и крови) за поддержку и обсуждение. Это исследование было поддержано интрамуральными исследовательскими программами Национальных институтов здравоохранения, Национального института рака и Национального института сердца, легких и крови. JT поддерживается программой Рамон у Cajal (грант RYC2018-026050-I) MICINN (Испания).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 160 Естественные клетки убийцы метаболизм внеклеточный поток гликолиз митохондрии дыхание электронная транспортная цепь цитометрия потока
Анализ естественного метаболизма клеток-убийц человека
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton,… More

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter