Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse af Human Natural Killer Cell Metabolisme

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466

Summary

I dette papir beskriver vi en metode til at måle glykolyse og mitokondriel respiration i primære humane Natural Killer (NK) celler isoleret fra perifert blod, i hvile eller efter IL15-induceret aktivering. Den beskrevne protokol kan let udvides til primære humane NK-celler, der aktiveres af andre cytokiner eller opløselige stimuli.

Abstract

Natural Killer (NK) celler mægle hovedsagelig medfødte anti-tumor og anti-viral immunrespons og reagere på en række cytokiner og andre stimuli at fremme overlevelse, cellulære spredning, produktion af cytokiner såsom interferon gamma (IFNγ) og / eller cytotoksicitet programmer. NK celle aktivering ved cytokin stimulation kræver en betydelig remodeling af metaboliske veje til at støtte deres bioenergetiske og biosyntetiske krav. Der er en stor mængde af beviser, der tyder på, at nedsat NK cellemetabolisme er forbundet med en række kroniske sygdomme, herunder fedme og kræft, som fremhæver den kliniske betydning af tilgængeligheden af en metode til at bestemme NK cellemetabolisme. Her beskriver vi brugen af en ekstracellulær flux analysator, en platform, der tillader real-time målinger af glykolyse og mitokondrielt iltforbrug, som et redskab til at overvåge ændringer i energimetabolismen af humane NK celler. Den metode, der er beskrevet her, giver også mulighed for overvågning af metaboliske ændringer efter stimulering af NK-celler med cytokiner som IL-15, et system, der i øjeblikket undersøges i en lang række kliniske forsøg.

Introduction

Natural Killer (NK) celler er medfødte lymfocytter, der mægle anti-tumor og anti-virale reaktioner. NK celler udgør 5-15% af alle lymfocytter i humant perifert blod, og kan også findes i milt, lever, knoglemarv og lymfeknuder. NK-celler udtrykker ikke polymorfe clonotypiske receptorer, såsom T-cellereceptorer (TCR) eller B-cellereceptorer (BCR). I modsætning hertil er aktiveringen af deres cytolytiske funktioner foranlediget af engagement af receptorer, der genkender invariable ligander på overfladen af et mål celle1,2.

Hvilende humane NK celler isoleret fra perifert blod kan overleve i flere dage i kultur medium suppleret med humant serum. Aktivering af NK-celler med cytokiner som IL-15 eller IL-2 driver cellerne til spredning og til en forøgelse af deres aflivningsevne, blandt andeteffekt 3,4,5. Flere undersøgelser har vist en direkte sammenhæng mellem NK celleaktivering og ændringer i deres metaboliske aktivitet6. Disse metaboliske ændringer er bestemt til at opfylde de særlige krav i cellerne med hensyn til energi og biosyntese.

Aerob celler og organismer opnå energi gennem en række kemiske reaktioner, der involverer katabolisme og oxidation af kulhydrater, fedt og proteiner. Gennem en kombination af glykolyse, tricarboxylsyre (TCA) cyklus og oxidativ fosforylering, eukaryote celler opfylder størstedelen af deres ATP efterspørgsel og opnå mellemprodukter kræves som byggesten til makromolekyler afgørende for cellevækst og spredning. Processen med glykolyse (figur 1A) starter med indtræden af glukose i cellen. I cytosolen er glukose fosforyleret og omdannet til pyruvat (med en nettoproduktion af 2 molekyler AF ATP pr. glukosemolekyle), som kan reduceres til laktat eller transporteres ind i mitokondrierne for at blive omdannet til Acetyl-CoA og indgå i TCA-cyklussen. TCA cyklus fortsætter cykling næret med flere molekyler af Acetyl-CoA og producerer CO2 (der i sidste ende vil sprede uden for cellen, og ved at reagere med H2O i mediet, vil generere kulsyre, der vil føre til forsuring af mediet) og NADH, molekylet med ansvar for at donere elektroner til elektron transportkæden (ETC). Elektronerne bevæger sig gennem forskellige proteinkomplekser og accepteres endelig af ilt. Disse komplekser (I, III og IV) pumper også H+ fra mitokondrielle matrix ind i det intermembrane rum. Som en konsekvens af den elektrokemiske gradient genereret, vil H+ igen komme ind i matrixen gennem komplekset V (ATP-syntase), investere den potentielle energi akkumuleret i produktionen af ATP.

Både glykolyse og mitokondrielt åndedræt kan blokeres på forskellige steder ved hjælp af inhibitorer. Viden og brug af disse hæmmere var grundlaget for udviklingen af den ekstracellulære flux assay. Ved at måle to enkle parametre i realtid, såsom pH og ilt, den ekstracellulære flux analysator udleder hastigheden af glykolyse og mitokondriel respiration i en 96-brønd plade. Glykolysestresstesten udføres i et basalt medium uden glucose (Figur 1B)7. De første målinger af den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) er tegn på glykolyseuafhængig forsuring. Det kaldes ikke-glykolytisk forsuring og korrelerer med CO2 produceret af TCA, der, som forklaret før, kombinerer med H2O i mediet for at generere H+ (TCA-forbundet ECAR). Den første injektion er glukose til at fremkalde glukose udnyttelse og øge glykolyse. Den anden injektion kombinerer både rotenon, en kompleks I-hæmmer, og antimycin A, en kompleks III-hæmmer sammen, at blokere ETC. Celler reagere på denne dramatiske fald i mitokondriel ATP produktion ved at aktivere glykolyse til at opretholde cellulære ATP niveauer, og dette repræsenterer mængden af glykolyse, der ikke anvendes af cellen i basal tilstand, men kunne potentielt rekrutteres som reaktion på stigninger i ATP efterspørgsel (kompenserende glycolyse). Den tredje injektion er glukose analog 2-Deoxyglucose (DG), som konkurrerer med glukose som et substrat for enzymet hexokinase. Produktet af denne fosforylering, 2-deoxyglucose-6-fosfat kan ikke omdannes til pyruvat, og glykolyse blokeres derfor, hvilket sænker ECAR til sit minimum. Den ECAR, der måles på dette tidspunkt, omfatter andre kilder til ekstracellulær forsuring, som ikke tilskrives glykolyse eller respiratorisk aktivitet, samt eventuelle resterende glykolyse, der ikke er fuldt hæmmet af 2-GD (post 2-DG-forsuring).

Mitokondriel stresstest udføres i et medium med glucose (Figur 1C)8. De første målinger af iltforbruget (OCR) svarer til basislinjen af mitokondrielt åndedræt (basal respiration). Den første injektion er oligomycin, som hæmmer tilbagelevering af protoner gennem ATP syntase (kompleks V), blokerer ATP syntese og dermed hurtigt hyperpolarize mitokondrielle membran, som forhindrer yderligere proton pumpe gennem respiratoriske komplekser, og fører til et fald i OCR. Sammenligningen mellem baseline respiration og den værdi, der gives ved tilsætning af oligomycin repræsenterer ATP-forbundet respiration. Den resterende oligomycin-ufølsomme sats af iltforbrug kaldes proton lækage, som repræsenterer strømmen af protoner gennem lipid tolags eller proteiner i den indre mitokondrie membran såsom adenin nukleotid translocase9. Den anden injektion er uncoupler 2,4-dinitrophenol (DNP), en ionophore, der inducerer en massiv indtræden af H+ i mitokondrielle matrix, hvilket fører til depolarisering af mitokondrielle membran og afbrydelse af mitokondriel ATP syntese. Celler reagerer på spredningen af proton-drivkraft kraft ved at øge hastigheden af elektron transport og iltforbrug til maksimale niveauer i et forgæves forsøg på at inddrive membran potentiale (maksimal respiratorisk kapacitet). Forskellen mellem den maksimale respiratoriske kapacitet og de basale respiration er den ekstra respiratoriske kapacitet af cellen, som repræsenterer mængden af respiration, der ikke anvendes af cellen til at generere ATP i basaltilstand, men potentielt kunne rekrutteres som reaktion på stigninger i ATP efterspørgsel eller under forhold med stress8. Den tredje injektion er en kombination af rotenon og antimycin A. Denne injektion stopper helt ETC og OCR falder til det laveste niveau, med det resterende iltforbrug er ikke-mitokondrielle (forårsaget af NADPH-oxidaser, osv.).

Ændringer i metaboliske veje kunne en eller anden måde forudsige funktionen af NK celler, da det er blevet foreslået, at kontinuerlig aktivering af NK celler med cytokiner in vitro kunne føre til NK celle udmattelse ved undersøgelse af forskellige metaboliskeveje 10,11. Sammenhængen mellem NK celle metabolisk status og funktion er meget vigtigt ud fra synspunkt kræft immunterapi. På dette område er aktivering af NK-celler med infusion af IL-15, alene eller i kombination med monoklonale terapeutiske antistoffer, blevet testet for at forbedre tumorcelledrab12,,13,14. Kendskabet til NK-cellernes metaboliske status som reaktion på disse behandlingsstrategier ville give en værdifuld indikator for NK-celleaktiveringsstatus og drabsfunktion.

Undersøgelsen af metaboliske veje i andre myeloide og lymfoide celler såsom monocytter, T og B-celler er blevetbeskrevet 15 og optimerede metoder er blevet offentliggjort16. I denne protokol leverer vi en metode, der kombinerer både en NK isolationsprotokol, der giver et stort antal rene og levedygtige NK-celler og en optimeret protokol til måling af metabolisk aktivitet ved hjælp af en ekstracellulær fluxanalysator. Her viser vi, at dette er en gyldig metode til undersøgelse af metaboliske ændringer i hvile og IL-15 aktiverede humane NK celler. For den ekstracellulære fluxanalyse er parametre som cellenummer og lægemiddelkoncentrationer blevet testet og optimeret. Sammenlignet med andre respirometriske metoder, den ekstracellulære flux analysator er fuldt automatiseret og i stand til at teste i realtid, med meget lave mængder af celler, op til 92 prøver samtidigt, og dermed giver mulighed for høj gennemløb screeninger (med flere prøver og replikater) i en relativt hurtig måde17.

Denne metode kan anvendes af forskere interesseret i at vurdere NK cellefunktion ved at studere NK cellemetabolisme. Det kunne anvendes samt til celler, der aktiveres af andre cytokiner, antistoffer eller opløselige stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgene blev udført i overensstemmelse med Helsinkis erklæring om etiske principper for medicinsk forskning. Perifere blodprøver fra donorer blev indhentet fra NIH Department of Transfusion Medicine under 99-CC-0168 IRB godkendt protokol, med patienten skriftligt informeret samtykke.

1. Fremstilling af reagenser

  1. Reagenser til isolering af NK-celler
    NOTER: Forbered disse reagenser i en cellekulturhætte.
    1. NK-separationsbufferen forbered: Tillægget PBS (pH 7.4) med 1 mM EDTA og 2% Fokal kalveserum (FCS), som tidligere er varmeinaktiveret (ved 56 °C i 30 min. ).
    2. Forbered NK kultur medium: Supplement Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) med 10% Human Serum (HS). Sterilt filter og opbevares ved 2-8 °C. Mediumn opvarmes til 37 °C, før der tilsættes til cellerne.
    3. Resuspend Human IL-15 i PBS ved 200 μg/mL.
  2. Reagenser til ekstracellulær fluxanalyse
    1. Forbered analysemedier: For mitokondriel stresstestmedium tilsættes 1 mM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin og 10 mM glukose til basismediet. for glykolyse stresstest medium, tilsæt 2 mM L-glutamin til basismediet.
      BEMÆRK: Koncentrationerne af glukose, pyruvat og glutamin leveres som anbefalet af producenten af den ekstracellulære fluxanalysator. Men, medier sammensætning kan ændres af forskere til perfekt matche den, kulturmediet, hvis det ønskes.
    2. PH for begge medier justeres til 7,4 med 0,1 N NaOH ved hjælp af en pH-måler på bordpladen, sterilt filter gennem en 0,2 μM porestørrelse og opbevares ved 2-8 °C. Varme medier til 37 °C, kontroller pH og justeres til 7.4 før brug, hvis det er nødvendigt.
      BEMÆRK: Kun omgivende CO2 er indeholdt i atmosfæren af den ekstracellulære flux analysator, brugen af medier uden bikarbonat er kritisk.
    3. Forbered lageropløsninger til reagenser: Oligomycin (ATP-syntasehæmmer), 10 mM lageropløsning i DMSO; 2,4-dinitrophenol (DNP, uncoupler), 1 M lager løsning i DMSO; antimycin A (kompleks III-hæmmer), 10 mM lageropløsning i DMSO; rotenon (kompleks I-hæmmer), 10 mM lageropløsning i DMSO. Der foretages 30 μL aliquots af alle reagenser og opbevares ved -20 °C.
      BEMÆRK: Disse retningslinjer er beregnet til reagenser, der købes individuelt og er udarbejdet af forskeren. Hvis der i stedet købes reagenser hos analyseproducenten, skal du følge deres retningslinjer for tilberedningen af reagenser.

2. NK celler isolering fra perifert blod

  1. Perifere blodmonukleare celler (PBM)-præparat fra humant blod
    BEMÆRK: Udfør disse trin i en cellekulturhætte. Dekontaminere alle rester og materiale, der kommer i kontakt med blod med blegemiddel, og kassér dem i den beholder, der skal forbrændes.
    1. Pipette 20 ml lymfocyt separation medium (LSM) i en 50 ml konisk rør.
    2. Forsigtigt, mens du holder røret i en 30 ° vinkel, pipette 20 ml blod over LSM, meget forsigtigt og røre væggen af røret. Undgå blanding af blod med LSM og skabe en synlig og veldefineret interfase mellem de to væsker.
      BEMÆRK: Perifert blod eller berigede leukafereseprodukter kan anvendes.
    3. Centrifuge rørene i 25 min, 1000 x g ved stuetemperatur. Brug ikke bremse, da det kan gøre begge faser i røret (LSM og blod) mix.
    4. Tag forsigtigt rørene ud af centrifugen, og læg dem i et stativ. Kontroller for tilstedeværelsen af et iøjnefaldende lag af celler (mononukleare celler), der vil dannes på interfasen mellem LSM (klar) og plasma (gul), mens røde blodlegemer pellet i bunden af røret.
    5. Inspirer forsigtigt det mononukleare cellelag med en 10 ml plastpipette (ca. 5-8 ml) og læg det i et nyt 50 ml konisk rør. Lymfocyt interfasen af op til 2 forskellige rør kan samles.
    6. De mononukleare celler 2x vaskes ved resuspending i 45 ml PBS og centrifugeres ved 800 x g i 5 min. ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Efter dette trin opnås en pellet af perifere blodmonukleare celler (PBM), og forskeren kan gå videre til NK isolationstrinnet.
  2. NK isolering fra PBMCs
    1. Tæl cellerne fra 2.1.6, og opslæmm dem igen i NK Separationsbuffer (1x 108 PBMCs/ml).
    2. Tag 10 ml af cellens resuspension (109 PBPC'er) og læg dem i et 50 ml rør.
    3. Der tilsættes 500 μL (50 μL/ml buffer) af NK-celleisolationsantistofblanding og 10 μL (1 μL/ ml buffer) af anti-CD3-positiv isolationsantistofblanding til PBM'erne og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min.
    4. Vortex de magnetiske perler og tilsæt 1 ml til blandingen af PBPC'er med antistoffer (100 μL perler / ml PBMCs). Inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur under lejlighedsvis omrøring.
    5. Der tilsættes 35 ml NK-isolationsbuffer (3,5 ml buffer/ml PBM'er), blandes og placeres på magneten i 15 min (2,2 x 107 PBM'er/ml). Efter dette tidspunkt vil perlerne og cellerne positivt udvalgt (alle undtagen NK celler) har holdt sig til væggene i røret.
    6. Opsaml forsigtigt supernatanten (indeholdende NK-celler) med en 50 ml plastpipette uden at røre siderne eller bunden af røret.
    7. Tæl cellerne ved hjælp af en celletæller og centrifuge ved 800 x g i 5 min.
    8. Resuspend isolerede NK-celler ved 5 x 106 celler/ml i IMDM indeholdende 10% HS og placere dem i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2, indtil forsøget udføres.
      BEMÆRK: Denne NK isolation protokol hedder cellenumre og reagensmængder tilpasset til brug af et 50 ml rør og en stor magnet. Denne protokol kan skaleres op (hvis der opnås flere PBPC'er) ved at gentage isolationstrinnene i forskellige rør eller skaleres ned ved at reducere lydstyrken i røret. For slutvolumener på 14-45 ml anvendes et 50 ml polystyrenrør, for volumen 4-14 anvendes et 15 ml polystyrenrør, og til volumen 1-4 ml anvendes et 5 ml polystyrenrør. Magneten er forskellig og passer til det relevante rør i hvert enkelt tilfælde. Mængden af antistofblanding og magnetperler kan også skaleres i henhold til antallet af celler og det endelige volumen.
  3. NK celle population farvning for flow cytometri
    1. Der udtages 0,25 x 106 celler pr. prøve fra trin 2.2.8, og mediet skal centrifugeres ved 800 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og cellepelletpen skal opbruges igen i 500 μL PBS.
    2. Der tilsættes levedygtighedsfarve i henhold til fabrikantens anbefaling (1 μL DMSO-rekonstitueret farvestof til 1 ml genpension af celler) og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min.
    3. 2x vaskes ved resuspending i 5 ml PBS og centrifugering ved 800 x g i 5 min. ved stuetemperatur.
    4. Plet med de tilsvarende anti-humane antistoffer i 100 μL IMDM indeholdende 10% HS i 30 min på is beskyttet mod lys (se tabel 1). Alle antistoffer kan kombineres og anvendes i et enkelt farvningstrin.
    5. Analysér prøverne efter flowcytometri for at vurdere renheden af den opnåede NK-cellepopulation. Brug den cellegating- og analysemetode, der tidligere er beskrevet18,19.
  4. NK celler stimulation med opløselige IL-15
    1. Resuspend 0,75 x 106 celler fra trin 2.2.8 eller 2.4.3 i 100 μL IMDM indeholder 10% HS i en brønd af en 96 brøndplade (rund bund).
    2. Human IL-15 til 1 μg/ml fortyndes i IMDM indeholdende 10% HS. Der tilsættes 100 μL af det fortyndede humane IL-15 til cellerne for at nå en endelig koncentration på 0,5 μg/ml.
      BEMÆRK: 0,5 μg/ml er en mættende koncentration af IL-15. Lavere koncentrationer af IL-15 eller andre cytokiner såsom IL-2, IL-12 eller IL-18 kan testes af forskere, hvis det ønskes.
    3. Cellerne hældes i inkubatoren ved 37 °C og stimuleres i 48 timer, før den ekstracellulære fluxanalyse udføres. Resuspenderede ustimerede (kontrol) celler i samme koncentration og volumen i IMDM indeholdende 10% HS uden IL-15, og læg dem i samme kuvøse i 48 timer.

3. Hydrering af sensorpatron

BEMÆRK: Sensorpatronens 96 sondespidser indeholder individuelle solid state-fluorofobre til O2 og H+, som skal hydreres for at detektere O2- og pH-ændringer.

  1. Tænd analysatoren og lad den varme op til 37 °C.
  2. Åbn sensorpatronen, og adskliner sensorpatronen fra brugspladen. Der tilsættes 200 μL kalikalopløsning i hver brønd på brugspladen, og sensorpatronen sættes tilbage på pladen, hvilket bekræfter, at sensorerne er helt nedsænket i opløsningen. For at opnå optimale resultater inkuberes patronen natten over ved 37 °C i en CO2-friinkubator, der er korrekt befugtet for at forhindre fordampning. Undgå bobledannelse under sensorerne under hydrering.
    BEMÆRK: Den mindste hydreringstid for patroner er 4 timer ved 37 °C i en CO2-friinkubator. Alternativt kan der anvendes hydrering natten over af sensorpatronen med 200 μL sterilt vand ved 37 °C i en CO2-friinkubator efterfulgt af inkubation af sensorpatronen med 200 μL forvarmet kalivideropløsning 45 – 60 min før kørslens start.

4. Ekstracellulær flux analyse

  1. Fremstilling af selvklæbende plader
    BEMÆRK: Da målingen af metaboliske parametre finder sted i et mikrokammer dannet i bunden af 96-brønden analyseplade, skal suspensionsceller først tilsluttes bunden af brønden. En celle lim udvundet af muslingen Mytilus edulis er ansat. Producenten af celleklæbemidlet anbefaler en belægningskoncentration på 1 til 5 μg/cm2. Brønden af analysatorcellekulturen mikroplade har en overflade på ca. 0,110 cm2. For en koncentration på 5 μg/cm2 kræves der således ca. 0,55 μg klæbemiddel. Da 25 μL af den klæbende opløsning vil blive brugt til at belægge hver brønd, er den optimale klæbeopløsningskoncentration for analysatorcellekulturmikropladerne omkring 22,4 μg/ml (22,4 μg/ml x 0,025 ml = 0,56 μg).
    1. Der klargøres 2,5 ml celleklæbeopløsning (22,4 μg/ml) i 0,1 M natriumbikarbonat, pH 8.0. Bikarbonat giver den optimale pH-klæbende ydeevne, som ifølge producenten er mellem 6,5 og 8,0.
    2. Pipette 25 μL af celleklæbeopløsningen til hver brønd af analysepladen og inkubere ved stuetemperatur i 20 min. Derefter fjernes opløsningen, og 2x vaskes med 200 μL sterilt vand/brønd. Lad brøndene tørre ved at holde pladen åben i 15 minutter inde i en cellekulturhætte.
      BEMÆRK: Overtrukkete plader kan opbevares i op til 1 uge ved 4 °C.
  2. Cellesåning i plader belagt med klæbemiddel
    1. Centrifugeceller fra trin 2.4.3 ved 200 x g i 5 min ved stuetemperatur. Fjern supernatanter og vask celler i opvarmet mitokondriel stresstest medium (hvis en mitokondriel stresstest udføres) eller glykolyse stresstest medium (hvis en glykolyse stresstest udføres). Pelletceller igen og suspenderet til den foretrukne cellekoncentration i samme medium (resuspension volumen vil afhænge af den valgte cellekoncentration; da hver brønd vil indeholde 180 μL af cellesuspensionen, forberede 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106,2,08 x 106,4,17 x 106 og 8,33 x 106 celler/ml cellesuspensioner til 10 0,047 x 106, 0,094 x 106, 0,187 x 106,0,375 x 106, 0,75 x 106 og 1. 5 x 106 celler pr. brønd).
    2. Plade 180 μL celleaffjedring pr. brønd langs siden af hver brønd. En multikanalpipette anbefales. Brug brønde A1, A12, H1 og H12 af analysatorkulturpladen som kontrolsystemer til baggrundskorrektion. Der tilsættes 180 μL analysemedium i disse brønde (ingen celler). Yderligere kontrol godts kan bruges, hvis det ønskes, og hvis der er nok plads i pladen.
      BEMÆRK: Tilstedeværelsen af serum kan forårsage dårlig celletilbehør.
    3. Pladen inkuberes i 30 minutter ved 37 °C i enCO 2-friinkubator. Forbered 10x forbindelser i mellemtiden (se trin 4.3 nedenfor).
    4. Skift centrifugeindstillingerne til nulbremsning. Centrifuge pladen ved 200 x g i 5 min. Overhold cellerne under mikroskopet for at kontrollere, at de danner et monolag i bunden af brønden. Pladerne overføres tilbage til CO2-friinkubator i 25 min. For at opnå de bedste resultater bør den samlede tid efter plating ikke være større end ca. 1 time.
  3. Forberedelse af 10x arbejdsløsninger til belastning i sensorpatron
    BEMÆRK: Hver af sensorpatronens 96 sondespidser har 4 porte (A, B, C og D), som kan bruges til at indsprøjte forbindelser sekventielt i individuelle brønde.
    1. For at udføre mitokondriel stresstest skal der forberedes 2,5 ml hver af 10 μM oligomycin, 1 mM DNP og en blanding af 10 μM rotenon og 10 μM antimycin A, i mitokondrielt stressanalysemedium (brug lageropløsningerne fra trin 1.2.3). Slutkoncentrationerne i brønden efter injektionen vil være 1 μM oligomycin, 0,1 mM DNP og 1 μM antimycin A/rotenone.
    2. For at udføre glykolyse stresstest, forberede 2,5 ml af en blanding af 10 μM rotenon og 10 μM antimycin A i glykolyse stress assay medium (brug bestanden løsninger fra trin 1.2.3). Glucose opløses i glykolysestresstestmedium for en 100 mM-opløsning og 2-deoxy-glucose (2-DG) i glykolysestresstestmedium til en 500 mM-opløsning. Slutkoncentrationerne i brønden efter injektionen vil være 10 mM glukose, 1 μM antimycin A/rotenon og 50 mM 2-DG.
    3. Varm opløsninger til 37 °C, kontroller pH og justeres til 7.4, hvis det er nødvendigt. Vejeforbindelser fremstillet i trin 4.3.1. (for en mitokondriel stresstest) eller 4.3.2 (for en glykolyse stresstest) i port A, B og C af den hydrerede sensorpatron (fra trin 3.2) ved hjælp af en multikanal mikropipettor og port-loading guider med patronen, som vist i tabel 2.
      BEMÆRK: For at sikre korrekt indsprøjtning i alle brønde under analysen skal hver serie af porte, der anvendes (f.eks. alle port A), indeholde samme indsprøjtningsvolumen på tværs af hele sensorpatronen. Dette gælder for baggrundskorrektionsting og endda for de brønde, der ikke anvendes i eksperimentet.
    4. Inkuber den indlæste sensorpatron ved 37 °C i en CO2-friinkubator under opsætning af programmet.
  4. Opsætning af ekstracellulære flux-analyseprotokoller
    1. Åbn den ekstracellulære fluxanalysatorsoftware, og ved hjælp af fanerne Gruppedefinitioner og pladekort angiver grupper af brønde, der har lignende forhold (f.eks. brønde med det samme antal celler eller brønde med enten hvilende celler eller IL-15-stimulerede celler). Angiv også baggrundskorrektionslys (som standard A1, A12, H1 og H12 indstilles, men der kan bruges yderligere brønde) og tomme brønde.
    2. Konfigurer det program, der er beskrevet i tabel 3 i softwaren, ved hjælp af fanen Protokol.
    3. Begynd programmet ved hjælp af fanen Kør analyse. Placer sensorpatronen (hydreret og læsset med 10x forbindelser) og brugspladen på bakken. Efter kalibreringstrinnet (15 – 20 min) udskiftes kalibreringspladen for analysepladen (uden låg) med påsatte celler, når du bliver bedt om det. Derefter er kørslen fuldt automatiseret (maskinen udfører alle målinger og injektioner).
      BEMÆRK: Det er muligt at udføre en mitokondriel stresstest og en glykolytisk stresstest i samme plade, så længe de specifikke forbindelser læsses i de rette porte (oligomycin, DNP og antimycin/rotenon i port A, B og C af de brønde, hvor der udføres en mitokondriel stresstest; glucose, antimycin/rotenon og 2-GD i henholdsvis havne A, B og C af de brønde, hvor der udføres en glykolysestresstest), anvendes de samme mængder til injektioner i hver række porte og brønde til hver test, der identificeres korrekt ved hjælp af softwarens gruppedefinitioner og pladefaner.
    4. Efter afslutningen af kørslen skal du hente dataene og analysere dem ved hjælp af softwaren.

5. Bestemmelse af celletal

BEMÆRK: Resultaterne kan normaliseres for at tage højde for mulige forskelle i cellenummer. Der kan anvendes to vigtige metoder, der er beskrevet nedenfor.

  1. Bestemmelse af DNA-indhold
    1. Fjern det resterende analysemed en pipette fra hver brønd. Når aspirating medium, passe på ikke at forstyrre cellerne. Pladen kan opbevares ved -20 °C indtil analyse.
      BEMÆRK: Frysetrinnet er vigtigt for bestemmelsen af cellerlys og DNA-indhold.
    2. Der klargøres en 1x opløsning af celleprolifererende analysecelle-lysis-buffer (20x) i destilleret vand (200 μL/brønd).
    3. Tilsæt celle proliferation assay farvestof lageropløsning (400x) i 1x celle-lysis buffer. Til påvisning af 50 til 50.000 celler pr. brønd anvendes 1x celleprolifererende analysefarvestof. For højere celletal anbefales det at anvende celleprolifererende analysefarvestof ved en endelig koncentration højere end 1x. I dette tilfælde anvendes celleprolifererende assayfarve i en 5x slutkoncentration (fortyndet celleprolifeionsanalyseanalyseopløsningen 80 gange i 1x celle-lysis buffer).
    4. Der tilsættes 200 μL af reagensen af celleprolifererende agenser til hver brønd. Prøverne inkuberes i 2-5 min ved stuetemperatur. Beskyt mod lys.
    5. Fluorescensen af prøverne ved excitation måles: 480 nm; emission: 520 nm ved hjælp af en fluorescensmikropladelæser i henhold til fabrikantens anbefalinger.
  2. Bestemmelse af proteinindhold
    1. Forsigtigt, aspirere helt analysen medium fra hver brønd uden at røre cellerne og fryse cellerne ved -20 °C i mindst 1 time. Alternativt kan cellerne holdes frosne i længere tid (op til 1 uge), indtil analysen udføres.
    2. Der tilsættes 50 μL radioimmunoprecipitationsanalyse (RIPA) lysismedium suppleret med 1x proteasehæmmere (fra en 100x lageropløsning) til hver brønd. Anfør pladen på en shaker i 5 min ved stuetemperatur, og inkuber derefter pladen på is i 30 min. for en komplet cellelysis.
    3. Centrifuge pladen i 5 min ved 200 x g ved stuetemperatur. Dette trin vil pellet cellulære snavs for at forhindre interferens med proteinmåling.
    4. Proteinkoncentrationen måles med bicinoninsyre (BCA) i henhold til producentens anbefalinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering af NK-celler fra perifert blod giver en ren og levedygtig population

Den ekstracellulære fluxanalyse er baseret på måling af H+ og O2 koncentration i brønden og vil ikke skelne mellem forskellige populationer af celler eller deres levedygtighed. Af denne grund var det vigtigste skridt at opnå en meget ren og levedygtig population af interessecellen til at lykkes i disse eksperimenter.

Isoleringen af NK-celler fra perifert blod blev udført som anført i afsnit 2. For at vurdere renheden og levedygtigheden af de opnåede NK-celler blev små aliquoter fra PMBCs og den isolerede NK-cellepopulation plettet og analyseret ved flowcytometri (Figur 2A). Mononukleare celler blev gated i plottet viser fremad (FSC-A) versus side scatter område (SSC-A). Inden for denne population blev enkelte celler gated langs diagonalen i plottet viser FSC-A versus fremad scatter højde (FSC-H). Inden for enkeltpopulationerne blev rentabiliteten vurderet og viste sig at være højere end 98 % i både PMBCs og NK-cellepopulationer. Renheden af NK-cellepopulationen isoleret blev fastslået ved dobbelt farvning mod CD3 (til stede i T-celler, den dominerende population blandt PBMCS) og CD56 eller NKp46 (Figur 2B). NK-celler defineres som populationen negative for CD3 og positive for CD56 eller NKp46. Ifølge disse kriterier var renheden af NK-cellerne ca. 88 %, hvilket svarer til en 18-dobling af NK-celler sammenlignet med dem, der findes i PBM-populationen.

OCR- og ECAR-værdier er afhængige af cellenummer

Til mitokondriel stresstest blev cellerne metabolisk forstyrret ved tilsætning af tre forskellige forbindelser: oligomycin, DNP og antimycin A + rotenone. For hver celletype blev antallet af celler pr. brønd omhyggeligt optimeret til et ekstracellulært fluxassayment. Figur 3A viser repræsentative parceller med mitokondrielt iltforbrug (OCR) ved hjælp af flere humane NK-celletal (0,75 x 106,0,375 x 106,0,187 x 106, 0,094 x 106 og 0,047 x 106). Alle målinger blev udført i tre eksemplarer. Celletal korrelerer lineært med mængden af DNA eller protein i brønden (Figur 3B). Som forventet viste høje celletal højere OCR-værdier, mens færre end 0,187 x 106 celler pr. brønd ikke gav robuste resultater. På den anden side var højere celletal (1,5 x 106) ikke optimale, da iltkoncentrationen i brønden ved tilsætning af DNP var fuldstændig udtømt i hver cyklus (figur 3C), hvilket udelukker en nøjagtig beregning af OCR. Koncentrationen af uncoupler skal titreres omhyggeligt for hver celletype, da der ikke tilsættes tilstrækkelige DNP-resultater i submaximal OCR, mens tilsætning af for meget også kan hæmme maksimal OCR. I humane NK-celler blev 100 μM DNP fundet at være den optimale dosis (Figur 3D). Andre afkoblede stoffer såsom carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazon (FCCP) eller carbonylcyanid m-chlorophenylhydrhanzin (CCCP) kan anvendes i stedet for DNP, men skal også titreres for hver celletype.

For glykolysestresstesten blev glukosesultede celler efter baseline måling af ECAR forstyrret af følgende forbindelser: glukose, antimycin A + rotenon og 2-DG. Figur 3E viser repræsentative plots af ECAR ved hjælp af flere NK-cellenumre (0,75 x 106,0,375 x 106, 0,187 x 106,0,094 x 106 og 0,047 x 106). Alle målinger blev udført i tre eksemplarer. Glykolyse stress assay var mest vellykket på den højeste plating tæthed, mens færre end 0,187 x 106 celler pr brønd ikke giver robuste resultater.

IL-15 behandling øger OCR og ECAR basal og maksimale værdier

Den optimale såningstæthed på 0,75 x 106 celler pr. brønd blev anvendt til efterfølgende eksperimenter. NK-cellerne blev dyrket i tilstedeværelse eller fravær af mættende koncentrationer af cytokin il-15 i 48 timer, hvorefter deres levedygtighed blev anset for at være henholdsvis 93,7 ± 4,8 % og 85,7 ± 12,0 %. Figur 4A,B viser et typisk mitokondrielt stresstesteksperiment med 0,75 x 106 NK-celler pr. brønd. I denne test fører oligomycin til et dramatisk fald i iltforbruget (Figur 4A) og til en stigning i ECAR, der repræsenterer et skift til glykolyse for at forsøge at opretholde cellulære ATP-niveauer (Figur 4B). Aktivering af NK-cellen ved IL-15 forårsagede en stigning i både mitokondrielt iltforbrug og ekstracellulær forsuring. Dette resultat var konsekvent, når flere forsøgspersoner blev sammenlignet( figur 4C). Basal, maksimal og ATP-forbundet respiration, men ikke proton lækage eller ikke-mitokondriel respiration, øget med IL-15 (Figur 4C, D). Ocr/ECAR-hastigheden faldt også, hvilket indikerer en tendens til at skifte til et glykolytisk metabolisme efter IL-15 stimulation (Figur 4E).

Figur 4F,G viser et typisk glykolysetesteksperiment med 0,75 x 106 NK-celler pr. brønd. Tilsætning af glukose triggerred en enorm stigning i ECAR på grund af glykolyse aktivering, mens efterfølgende tilsætning af antimycin A og rotenone kørte kompenserende glykolyse, og 2-GD forårsaget en hæmning af vejen og et fald i ECAR til et minimum (Figur 4F). Parallelt hermed forårsagede glukose konsekvent et mindre fald i iltforbruget, muligvis ved Crabtree-effekten20, mens antimycin A og rotenone fuldstændigt blokerede respirationen, og 2-GD ikke giver yderligere virkninger (figur 4G). Aktivering af både ekstracellulær forsuring og mitokondrielt iltforbrug med IL-15 kunne også observeres i denne test, og igen er dette konsekvent, når der anvendes celler fra flere donorer (Figur 4H).

Figure 1
Figur 1: Skematiske ekstracellulære fluxanalyser.
a) Skematisk glykolyse, tricarboxylsyrecyklussen (TCA) og elektrontransportkæden (ETC). Hæmmere af forskellige trin er skrevet med rødt. Elektronffluksen i ETC er repræsenteret med grønt med NADH som donor og O2 som endelig acceptor. bB) Glycolyse stresstest skematisk profil, der repræsenterer den ekstracellulære forsuring sats (ECAR) versus tid. cC) Mitokondriel stresstest skematisk profil, der repræsenterer iltforbrug sats (OCR) versus tid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Naturlige dræberceller (NK) renses fra perifere mononukleare celler (PBMCs).
aA) Gating-strategien fulgte for at vurdere renheden og levedygtigheden af NK-celler (højre kolonne) i forhold til summen af PBPC'er (venstre kolonne). Fra porten af mononukleare celler (toppaneler), blev enkeltceller valgt (midterste paneler) og levedygtighed blev målt (bundpaneler). (B) Levende celler blev plettet for CD3 og CD56 eller NKp46. Tallene i panelerne angiver procentdelen af celler i de valgte områder. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Optimering af mitokondrielle og glukose stresstest i aktiverede menneskelige NK celler.
(A) Mitokondriel stresstest: OCR for hver platingtæthed (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 og 0,047 x 106) vises. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet på 3 brønde med standardafvigelse. Resultaterne er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. (B)DNA (øverste panel) og protein (lavere panel) niveauer i brønden ved forskellige plettering. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige eksperimenter. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet på 3 brønde med standardafvigelse. Resultaterne er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. (C) Rå iltniveau spor i brønde, der ikke indeholder celler (sort spor), 0,75 x 106 celler (blå spor) eller 1,5 x 106 celler (grøn spor). I den grønne spor efter tilsætning af DNP, ilt er helt opbrugt i hver cyklus. dD) Den ekstra respiratoriske kapacitet på 0,75 x 106 celler blev testet ved tilstedeværelse af flere DNP-koncentrationer. (E) Glycolyse Stresstest: ECAR for hver platingtæthed (0,75 x 106,0,375 x 106,0,187 x 106,0,094 x 106 og 0,047 x 106) vises. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet på 3 brønde med standardafvigelse. Resultaterne er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Påvisning af metaboliske ændringer efter NK celleaktivering ved IL-15.
Mitokondriel stresstest: OCR (A) og ECAR (B) parceller er vist for 0,75 x 106 hvilende eller IL-15 aktiverede celler. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet på 3 brønde med standardafvigelse. Resultaterne er repræsentative for 5 uafhængige eksperimenter. Ændringer i basal- og maksimal respiration for individuelle humane donorer er vist i (C), mens ATP-forbundet respiration, protonlæk, ikke-mitokondriel respiration (NMR) er vist i (D) og OCR/ECAR-forholdet er vist i (E). Glykolyse Stresstest: ECAR (F) og OCR (G) observationsområder er vist for 0,75 x 106 hvilende eller IL-15 aktiverede celler. Hvert datapunkt repræsenterer gennemsnittet på 3 brønde med standardafvigelse. Resultaterne er repræsentative for 5 uafhængige eksperimenter. Ændringer i forsuring af ekstra og maksimal ekstracellulære forsuring for den enkelte menneskelige donor er vist i (H). ns: ikke væsentlig; * p ˂ 0,05; ** p ˂ 0,01; p ˂ 0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: TCA's bidrag og glykolyse på ECAR.
De første målinger af ECAR svarer i høj grad til forsuring på grund af den CO2, der produceres i TCA-cyklussen. Efter tilsætning af glukose til brændstofglykolyse falder bidraget fra TCA-afledt forsuring til ECAR. Injektion af Antimycin A og Rotenone blokerer TCA, og glykolyse kompenserer for stigningen i ATP-efterspørgslen ved at øge sit maksimale niveau (kompenserende glykolyse). Blokaden af glykolyse med 2-GD mindsker ECAR til et minimalt niveau svarende til forsuring, der ikke tilskrives glykolyse eller respiratorisk aktivitet, samt eventuel restglykolyse, der ikke er fuldt hæmmet af 2-GD (post 2-DG-forsuring). Klik her for at se en større version af dette tal.

Reagens Koncentration Klon (for antistoffer) Endelig farvningsvolumen
Mus anti-menneskelige CD3 BV711 50 ng/ml UCHT1 100 μl
Mus anti-menneskelige CD56 PE 1/50 fortynding kr. 100 μl
Mus anti-menneskelige NkP46 PE 1/50 fortynding 9/E2 100 μl
Levedygtighed Farvestof 1/1000 fortynding 500 μl

Tabel 1: Reagenser og antistoffer, der anvendes til flowcytometri.

Mitokondriel stresstest
Port Volumen Sammensatte 10x lager Endelig koncentration i analysen
A 20 μl oligomycin 10 μM 1 μM
B 22 μl Dnp 1 mM 0,1 mM
C 25 μl antimycin A + rotenone 10 μM hver 1 μM hver
Glycolyse stresstest
Port Volumen Sammensatte 10x lager Endelig koncentration i analysen
A 20 μl Glukose 100 mM 10 mM
B 22 μl antimycin A + rotenone 10 μM hver 1 μM hver
C 25 μl 2-GD 500 mM 50 mM

Tabel 2: Sammenblanding.

Trin Loop Gentag (tider)
Mix Vent Foranstaltning
Kalibrering ––
Ligeudvædning ––
Oprindelig læsning 3 minutter 0 minutter 3 minutter 3
Afslut løkke ––
Injicer port A ––
Målinger 3 minutter 0 minutter 3 minutter 3
Afslut løkke ––
Injicer port B ––
Målinger 3 minutter 0 minutter 3 minutter 3
Afslut løkke ––
Injicer port C ––
Målinger 3 minutter 0 minutter 3 minutter 3
Afslut løkke ––
program ––

Tabel 3: Programlayout.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papir har vi etableret en protokol for effektivt at isolere og dyrke rene og levedygtige primære menneskelige NK celler fra perifert blod. Vi har også optimeret betingelserne for måling af den metaboliske aktivitet af disse NK celler vurderet efter iltforbrug sats og ekstracellulær forsuring sats ved hjælp af en ekstracellulær flux analysator. Sammenlignet med andre respirometriske metoder, den ekstracellulære flux analysator er hurtig, kræver et lille antal celler, og giver mulighed for høj gennemløb screeninger. Men, dens reagenser er dyre, og injektioner af forbindelser er begrænset til kun fire. Metabolisk remodellering og aktivering af glykolyse og oxidativ fosforylering ved cytokiner i NK-cellen er afgørende for robuste NK-celleresponser21, og de teknikker, der er beskrevet her, gør det muligt at studere NK-cellernes metaboliske profil i realtid. Denne protokol kan udvides til at omfatte celler, der aktiveres af andre cytokiner, såsom IL-2, IL-12 og IL-18, eller antistoffer, der binder sig til aktiverende receptorer. Vi har taget fat på flere vigtige trin, der ofte overses, såsom plating cellerne ved den optimale sammenløb eller ved hjælp af den optimale koncentration af uncoupler at stimulere maksimal iltforbrug. Ikke desto mindre anbefaler vi at kontrollere de faktiske O2 niveau kurver(Figur 3C), hvis andre stimuli anderledes end IL-15 er givet til cellerne, for at sikre, at O2 ikke er opbrugt i brøndene. Hvis det var tilfældet, skal cellenummeret reduceres, indtil der observeres et lineært O2-forbrug for at forhindre en undervurdering af den reelle OCR.

Basal respiration afspejler de basale metaboliske tilstand af cellen, som i vid udstrækning kontrolleres af aktiviteten af mitokondrielle ATP synthase8, og er en indikation af basal ATP efterspørgsel (for proteinsyntese, cytoskeleton dynamik, ATPases såsom Na+/ K+-ATPase, osv.). Typisk, i nærvær af tilstrækkelige substrater denne parameter stiger i metabolisk aktive eller stressede celler. Tilsætning af oligomycin, som blokerer ATP synthase, afslører ATP-forbundet respiration og proton lækage, som kan ske på tværs af lipid tolags eller proteiner i den indre mitokondrielle membran, men kan også være induceret gennem proteiner såsom undioing Proteiner (UCPs) 9 , impliceret ireguleringenaf adaptive termogenese og dermed konvertere mitokondrie energipotentiale til varme i brune adipocyt. Maksimal respiration bestemmes af faktorer, herunder tilgængeligheden af substrater til mitokondrielle respiratoriske kæde og mængden og aktiviteten af respiratoriske komplekser. Mitokondrielle respiratoriske komplekser og deres aktivitet kan også ændres ved posttranslationale ændringer såsom acetylation eller fosforylering22,23. Denne parameter kan også indikere cellernes sundhed og deres evne til at reagere på akutte fornærmelser. I situationer med mitokondriel dysfunktion falder det maksimale åndedræt, og dette begrænser cellens evne til at reagere på ændringer i ATP-efterspørgslen og fører til celledød24.

Det er meget vigtigt at bemærke, at for hver tidspunktet af mitokondrielle og glykolyse stresstest, ECAR er summen af glykolyseafledt forsuring (via generering af laktat + H+) og respiratorisk afledt forsuring (via produktion af CO2, som opløses i H2O for at generere HCO3- og H+), og vigtigst af alt kan respiratorisk afledt forsuring tegne sig for en betydelig del af den samlede ECAR i nogle celletyper25. For interesserede forskere, der er offentliggjort protokoller til at beregne faktiske glykolytiske satser. Med henblik herpå kan iltforbrugshastigheder under den glykolytiske stresstest (figur 4G) anvendes til at beregne protonproduktionen ved respiration på hvert tidspunkt, og denne værdi kan trækkes fra den samlede protonproduktionshastighed, som opnås ved hjælp af ECAR-værdier og buffereffekten af mediet7,25,26.

En vigtig ændring af denne protokol i forhold til producentens anbefaling er den anden injektion af glykolyse stresstest. Antimycin A og rotenon foretrækkes frem for oligomycin af flere årsager, der allerede er beskrevet7:1) nogle celler udviser en høj glykolytisk kapacitet, der fuldt ud kan opfylde cellens basale ATP-efterspørgsel, selv i mangel af oxidativ fosforylering; 2) blokering af ETC med antimycin A og rotenone kunstigt øger ATP efterspørgsel af cellen, da det forårsager ATP hydrolyse af ATP syntase (mitokondrierne bliver en ATP vask), som vender til at pumpe protoner i et forsøg på at inddrive mitokondrielle membran potentiale, der kollapser efter respiratorisk hæmning; 3) blokering af ETC forhindrer respiratorisk forsuring af mediet (respiratorisk CO2 genereret i TCA cyklus, der omdannes til HCO3- og H+), som kan forvirre ECAR resultater. Således kan observeret maksimal ECAR med antimycin A og rotenon kun tilskrives glykolyse. Interessant, Det er blevet rapporteret, at ECAR observeret med luftvejshæmmere alene kan stadig være submaximal7, og en yderligere mekanisme til at øge cellulære ATP efterspørgsel (og derfor maksimal ECAR) er blevet beskrevet: tilføjelsen af ionophore monensin, hvilket øger importen af Na+ i celle27 og stimulerer hastigheden af ATP hydrolyse af plasmamembranen Na+/ K+-ATPase, til blandingen af antimycin A og rotenon7.

Et andet vigtigt begreb er, at vi ikke anbefaler subtraktion af ikke-glykolytisk forsuring, som sandsynligvis svarer til respiratorisk CO2, der omdannes til HCO3- og H+, fra hele sporet til at beregne glykolytiske parametre som anbefalet af producenten, da denne mængde ændringer betydeligt i hver fase af Glycolyse Stress Test (det er højest i basaltilstand, falder efter tilsætning af glukose på grund af Crabtree effekt20, og er næsten afskaffet med anticinmy A og rotenon) (Figur 5).

For at opsummere, denne protokol viser et simpelt og effektivt værktøj til at teste den metaboliske aktivitet af menneskelige naturlige dræberceller med en ekstracellulær flux analysator. Denne metode kan bruges til at afhøre den metaboliske tilstand i disse celler, som er kendt for at ændre sig med celleaktivering ved cytokin stimulation eller under visse patologiske tilstande, herunder fedme, kræft eller virusinfektioner28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, og Blood Institute) for støtte og diskussion. Denne undersøgelse blev støttet af Intramural ForskningSprogrammer af National Institutes of Health, National Cancer Institute og National Heart, Lung, og Blood Institute. JT er støttet af Ramon y Cajal program (tilskud RYC2018-026050-I) af MICINN (Spanien).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Tags

Immunologi og infektion Natural Killer celler stofskifte ekstracellulære flux glykolyse mitokondrier respiration elektron transport kæde flow cytometri
Analyse af Human Natural Killer Cell Metabolisme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton,More

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter