Summary
在这张纸上，我们描述了一种测量从周围血液分离的原生人类自然杀手（NK）细胞中的糖解和线粒体呼吸的方法，在休息时或IL15诱导的活化之后。所述协议可以很容易地扩展到由其他细胞因子或可溶性刺激激活的原发性人类NK细胞。
Abstract
自然杀手（NK）细胞主要调解先天抗肿瘤和抗病毒免疫反应，并响应各种细胞因子和其他刺激，以促进生存，细胞增殖，细胞因子的生产，如干扰素伽马（IFN+）和/或细胞毒性程序。细胞因子刺激的NK细胞活化需要大量重塑代谢途径，以支持其生物能量和生物合成要求。大量证据表明，NK细胞代谢受损与包括肥胖和癌症在内的许多慢性疾病有关，这突出了确定NK细胞代谢方法的临床重要性。在这里，我们描述了使用细胞外通量分析仪，一个平台，允许实时测量糖解和线粒体氧气消耗，作为一个工具，监测人类NK细胞的能量代谢变化。此处描述的方法还允许使用细胞因子（如 IL-15）刺激NK细胞后监测代谢变化，该系统目前正在广泛的临床试验中研究。
Introduction
自然杀手（NK）细胞是先天淋巴细胞，调解抗肿瘤和抗病毒反应。NK细胞占人类周围血中所有淋巴细胞的5-15%，也可以在脾脏、肝脏、骨髓和淋巴结中发现。NK细胞不表达多态克隆性受体，如T细胞受体（TCR）或B细胞受体（BCR）。相比之下，细胞解功能的激活是由识别目标细胞1，2表面不变配体受体的接合促使2。
从外周血液中分离出的休息人类NK细胞可以在培养基中存活数天，并辅以人体血清。细胞因子（如IL-15或IL-2）激活NK细胞，推动细胞增殖，并增加其杀杀能力，除其他影响3、4、5,等。3,几项研究表明NK细胞活化与其代谢活性6的变化有直接关系。这些代谢变化注定要满足细胞在能量和生物合成方面的特殊要求。
有氧细胞和生物体通过一系列化学反应获得能量，这些化学反应涉及碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢和氧化。通过糖解、三分子酸 （TCA） 循环和氧化磷酸化的组合，真核细胞满足其大多数 ATP 需求，并获得作为大分子构建基块所需的中间体，这些中间体对于细胞生长和增殖至关重要。糖解过程 （图1A） 从葡萄糖进入细胞开始.在细胞醇中，葡萄糖被磷酸化并转化为丙酮酸盐（每葡萄糖分子净产生2个ATP分子），可降为乳酸或被运送到线粒体中，转化为乙酰-CoA并进入TCA周期。TCA循环继续循环使用更多的乙酰-CoA分子燃料，产生CO2（ 最终扩散到细胞外，并在介质中与H2O反应，将产生碳酸，导致介质酸化）和NADH，负责向电子传输链（ETC）捐赠电子的分子。电子通过不同的蛋白质复合物，最终被氧气接受。这些复合物（I、III 和 IV）也将H+ 从线粒体矩阵泵入膜间空间。由于产生的电化学梯度，H+ 将再次通过复杂的V（ATP-合成酶）进入矩阵，将积累到ATP生成中的潜在能量。
糖解和线粒体呼吸都可以使用抑制剂在不同的点阻塞。这些抑制剂的知识和用法是细胞外通量测定发展的基础。通过实时测量 pH 和氧气等两个简单的参数，细胞外通量分析仪推断出 96 井板中的糖解和线粒体呼吸速率。糖解压力测试在无葡萄糖的基础介质中进行（图1B）7。Figure 1B细胞外酸化率（ECAR）的第一次测量表明糖解与酸化无关。它被称为非糖解酸化，与TCA产生的CO2相关，如前所述，在介质中与H2O结合，产生H+（TCA链接ECAR）。第一注射是葡萄糖，以诱导葡萄糖利用和促进糖解。第二次注射结合了罗泰酮，一种复杂的一种抑制剂，以及一种复杂的III抑制剂，以阻止EC。细胞通过激活糖解来对线粒体ATP产量的急剧下降作出反应，以保持细胞ATP水平，这代表了细胞在基底状态下未使用，但可能为响应ATP需求增加（补偿性糖解）而招募的糖解量。第三种注射是葡萄糖模拟2-脱氧葡萄糖（DG），它与葡萄糖竞争作为酶六核酸酶的基质。磷酸化的产物，2-脱氧葡萄糖-6-磷酸盐不能转化为丙酮酸盐，因此糖解被阻断，从而将ECAR降低至最低。此时测量的 ECAR 包括其他细胞外酸化来源，这些来源不归因于糖解或呼吸活动，以及任何未完全抑制 2-DG 的残余糖解（2-DG 酸化后）。
线粒体应激测试在具有葡萄糖的介质中进行（图1C）8。8首次测量耗氧率 （OCR） 对应于线粒体呼吸（基础呼吸）的基准线。第一注射是寡霉素，它通过ATP合成酶（复合V）抑制质子的返回，阻止ATP合成，从而迅速超极化线粒体膜，防止质子进一步通过呼吸复合物泵送，并导致OCR的减少。基线呼吸与添加寡霉素给出的值之间的比较表示 ATP 链接的呼吸。剩余的寡糖霉素不敏感耗氧率称为质子泄漏，它表示质子流经内线粒体膜中的脂质双层体或蛋白质，如腺苷核苷酸转包9。第二次注射是未合成器2，4-二钙酚（DNP），一种离子磷酸盐，诱导H+大量进入线粒体，导致线粒体膜去极化和线粒体ATP合成中断。细胞通过将电子传输速率和氧气消耗率提高至最高水平来响应质子动力的耗散，这是试图恢复膜电位（最大呼吸能力）的徒劳尝试。最大呼吸能力与基础呼吸之间的区别在于细胞的备用呼吸能力，它表示细胞未用于生成基础状态的ATP的呼吸量，但可能会因ATP需求增加或在压力8条件下而招募。第三次注射是罗酮和抗霉素 A 的组合。这种注射完全停止 ETC 和 OCR 降至最低水平，剩余耗氧量为非线粒体（由 NADPH-氧化等引起）。
代谢通路的变化可以以某种方式预测NK细胞的功能，因为有人建议，连续激活NK细胞与细胞因子在体外可能导致NK细胞衰竭，通过研究不同的代谢途径10，11。10,从癌症免疫治疗的角度来看，NK细胞代谢状态与功能的相关性非常重要。在这一领域，激活NK细胞与输注IL-15，单独或结合单克隆治疗抗体已经测试，以改善肿瘤细胞杀死12，13，14。12,13,14了解NK细胞的代谢状态，以响应这些治疗策略将提供NK细胞活化状态和杀功能的宝贵预测。
其他骨髓细胞和淋巴细胞（如单核细胞、T细胞和B细胞）代谢途径的研究已经描述了15种，优化方法已发表16种。在该协议中，我们提供一种结合了NK隔离协议的方法，该协议产生大量纯和可行的NK细胞，并优化了使用细胞外通量分析仪测量代谢活性的协议。在这里，我们表明，这是一个有效的方法，研究代谢变化在休息和IL-15激活人类NK细胞。对于细胞外通量测定，对细胞数和药物浓度等参数进行了测试和优化。与其他复方测量方法相比，细胞外通量分析仪完全自动化，能够实时测试，电池数量非常低，同时多达92个样本，因此允许以相对快速的方式进行高通量筛选（具有多个样品和复制）。
这种方法可用于有兴趣通过研究NK细胞代谢来评估NK细胞功能的研究人员。它也可以应用于由其他细胞因子、抗体或可溶性刺激激活的细胞。
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Protocol
所有实验都是根据《赫尔辛基医学研究伦理原则宣言》进行的。根据99-CC-0168 IRB批准的方案，从NIH输血医学部获得捐赠者的外周血样，并征得患者书面知情同意。
1. 试剂制备
-
用于隔离NK细胞的试剂
注：在细胞培养罩中准备这些试剂。- 准备NK分离缓冲液：补充PBS（pH 7.4），用1 mM EDTA和2%胎儿小牛血清（FCS），以前已经热灭活（在56°C下30分钟）。
- 准备NK培养基：补充伊斯科夫的修改杜尔贝科的介质（IMDM）与10%的人血清（HS）。无菌过滤器，储存在2-8°C。 在加入细胞之前，将介质加热至37°C。
- 以 200 μg/mL 在 PBS 中重新发送人类 IL-15。
-
用于细胞外通量测定的试剂
- 准备检测介质：对于线粒体压力测试介质，在基介质中加入1 mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺和10mM葡萄糖;对于糖解压力测试介质，在基介质中加入2 mM L-谷氨酰胺。
注：葡萄糖、丙酮酸酯和谷氨酰胺的浓度由细胞外通量分析仪制造商推荐。然而，如果需要，研究人员可以改变媒体成分，以完全匹配培养媒介。 - 使用台式 pH 计将两种介质的 pH 调整为 7.4，使用台式 pH 计，通过 0.2 μM 孔径进行无菌过滤器，并在 2-8 °C 下储存。 将介质加热至 37 °C，检查 pH 值，必要时在使用前重新调整至 7.4。
注：只有环境CO2 包含在细胞外通量分析仪的大气中，使用无碳酸氢盐的介质至关重要。 - 为试剂准备库存溶液：寡霉素（ATP合成酶抑制剂），DMSO中10mM库存溶液;2，4-二甲醇（DNP，未Coupler），100万库存溶液在DMSO;抗霉素 A（复合III抑制剂），DMSO中10mM库存溶液;rotenone（复合 I 抑制剂），DMSO 中的 10 mM 库存溶液。制作所有试剂的 30 μL 等分，储存在 -20 °C。
注：这些指南适用于研究人员单独购买和准备的试剂。如果从分析仪制造商处购买了试剂，请遵循其试剂制备指南。
- 准备检测介质：对于线粒体压力测试介质，在基介质中加入1 mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺和10mM葡萄糖;对于糖解压力测试介质，在基介质中加入2 mM L-谷氨酰胺。
2. NK细胞与外周血分离
- 从人类血液中制备外周血单核细胞（PBMC）
注：在细胞培养罩中执行这些步骤。用漂白剂清除与血液接触的所有残留物和材料，并丢弃到适当的容器中进行焚烧。- 移液 20 mL 淋巴细胞分离介质 （LSM） 进入 50 mL 锥形管中。
- 小心，同时保持管在30°角，移液器20 mL的血液在LSM，非常轻轻地和触摸管壁。避免血液与LSM混合，并在两种液体之间创建一个可见且定义明确的相位。
注：可以使用外周血或富集的白血病产品。 - 在室温下离心管25分钟，1000 x g。不要使用制动器，因为它可以使管子（LSM和血液）的两个阶段混合。
- 小心地从离心机中拿出管子，放在机架中。检查是否存在在LSM（透明）和血浆（黄色）之间的相间形成明显细胞层（单核细胞），而红血球在管底形成颗粒。
- 用 10 mL 塑料移液器（约 5-8 mL）轻轻吸气单核细胞层，并放在新的 50 mL 锥形管中。淋巴细胞间相，最多2个不同的管可以汇集在一起。
- 在45 mL PBS中重新储存单核细胞2倍，在室温下以 800xg 离心5分钟。
注：在此步骤之后，获得一粒外周血单核细胞（PBMC），研究人员可以继续进入NK分离步骤。
- 与 PBMC 隔离
- 从2.1.6中计算细胞数，并在NK分离缓冲液（1x 108 PBMC/mL）中重新填充它们。
- 服用10 mL的细胞再依赖（109 PBMC），并把它们放入50mL管中。
- 将500μL（50 μL/mL缓冲液）的NK细胞分离抗体混合物和10μL（1 μL/mL缓冲液）的抗CD3阳性分离抗体混合物加入PBMC，并在室温下孵育10分钟。
- 将磁珠旋涡，将1 mL加入含有抗体（100μL珠/毫升PBMC）的PBMC混合物中。在室温下孵育10分钟，偶尔搅拌。
- 加入 35 mL 的 NK 隔离缓冲液（3.5 ml 缓冲液/ml PBMC），在磁铁上混合并放置 15 分钟（2.2 x 107 PBMC/mL）。之后，正选的珠子和细胞（所有NK细胞）将粘附在管壁上。
- 使用 50 mL 塑料移液器小心收集上清液（包含 NK 细胞），无需接触管的两侧或底部。
- 使用细胞计数器和离心机在800 x g计数 5分钟。
- 在含有10%HS的 IMDM 中，以 5 x 106 6 细胞/mL 重新发送分离的 NK 细胞，并在 37 °C 下以 5% CO2 将细胞箱中放置，直到实验进行。
注：此 NK 隔离协议指出适合使用 50 mL 管和大磁铁的细胞数量和试剂体积。通过在不同的管中重复隔离步骤或通过减少管中的体积来缩小此协议（如果获得更多 PBMC），可以扩展此协议。对于 14-45 mL 的最终体积，使用 50 mL 聚苯乙烯管;对于卷 4-14，使用 15 mL 聚苯乙烯管;对于卷 1-4 mL，使用 5 mL 聚苯乙烯管。磁铁是不同的，并适合适当的管在每种情况下。抗体混合和磁珠的量也可以根据细胞数量和最终体积进行缩放。
- NK细胞群体染色流动细胞学
- 从步骤2.2.8中，从步骤2.2.8中每样本取出0.25 x 106 个细胞，在室温下以800 x g 离心5分钟，将细胞颗粒重新在500μL的PBS中去除。
- 根据制造商的建议添加可行性染料（1 μL 的 DMSO 重组染料到 1 mL 的细胞再增），并在室温下孵育 30 分钟。
- 在 5 mL PBS 中重新储存 2 倍，在室温下以 800 x g 离心 5 分钟。
- 在100μL的 IMDM 中染色，含有 10% HS，在防光的冰上 30 分钟（见表 1）。所有抗体都可以组合在一个染色步骤中使用。
- 通过流式细胞分析样品，评估获得的NK细胞基的纯度。使用前面描述的18、19的细胞门控和分析方法。
- NK细胞刺激可溶性IL-15
- 在 96 井板（圆底）的井6中，从步骤 2.2.8 或 2.4.3 在 100 μL 的 IMDM 中重新发送 0.75 x 10 6 细胞，包含 10% HS。
- 在含有10%HS的 IMDM 中稀释人体 IL-15 至 1 μg/mL。将稀释的人类IL-15的100μL加入到细胞中，最终浓度达到0.5微克/mL。
注：0.5 μg/mL是IL-15的饱和浓度。IL-15或其他细胞因子（如IL-2、IL-12或IL-18）的浓度较低，如果需要，研究人员可进行测试。 - 将细胞在37°C下放在培养箱中，在进行细胞外通量测定之前刺激48小时。在 IMDM 中以相同的浓度和体积重新暂停未刺激（控制）细胞，不含 IL-15，并在同一培养箱中放置 48 小时。
3. 传感器盒的水化
注：传感器盒的 96 探针尖端包含用于 O2 和 H + 的单独固态荧光团， 需要水合才能检测 O2 和 pH 变化。
- 打开分析仪，让它加热到37°C。
- 打开传感器盒包，将传感器墨盒与公用板分离。在公用板的每个井中加入 200 μL 的校准液，并将传感器盒放回板上，验证传感器是否完全浸入溶液中。为了获得最佳效果，在37°C下将墨盒孵育为无CO2培养箱，该培养箱经过适当加湿以防止蒸发。在水化过程中防止传感器下形成气泡。
注：在无CO2-2培养箱中，最小墨盒水化时间是4小时，在37°C下。或者，在无 CO2-2-2培养箱中用 37 °C 的 200 μL 无菌水液对传感器盒进行隔夜水化，然后使用 200 μL 预热校准液孵育 45 ~ 60 分钟，在运行开始前使用。
4. 细胞外通量测定
- 胶涂层板的制备
注：由于代谢参数的测量发生在96井测定板底部形成的微室中，因此首先必须粘附在井底的悬浮细胞。使用从贝类 Mytilus edulis 中提取的细胞粘合 剂。电池胶粘剂制造商建议涂层浓度为 1 至 5 μg/cm2。分析仪细胞培养微孔板的孔面约为0.110厘米2。因此，对于 5 μg/cm2 浓度，需要约 0.55 μg 的胶粘剂。由于 25 μL 的粘合液将用于涂覆每个孔，分析仪细胞培养微孔板的最佳粘合液浓度约为 22.4 μg/mL（22.4 μg/mL x 0.025 mL = 0.56 μg）。- 在 0.1 M 碳酸氢钠中制备 2.5 mL 的细胞粘合液（22.4 μg/mL），pH 8.0。碳酸氢盐为细胞粘附性能提供了最佳的 pH 值，据制造商说，其性能介于 6.5 和 8.0 之间。
- 移液器25μL的细胞胶粘剂溶液到检测板的每个井，并在室温下孵育20分钟。之后，取出溶液，用200μL的无菌水/井洗涤2x。让水井在细胞培养罩内保持板开15分钟，让油井干燥。
注：涂层板可储存长达1周，在4°C。
- 用胶粘剂涂覆的板中细胞播种
- 在室温下，从步骤2.4.3的离心机，在200 x g下，5分钟。在温暖的线粒体压力测试介质（如果进行线粒体应激测试）或糖解压力测试介质（如果进行糖解压力测试）中去除超天然和洗涤细胞。再次将细胞中，再悬浮到同一介质中的首选细胞浓度（再悬浮量将取决于所选的细胞浓度;因为每一个井将含有180μL的细胞悬浮液， 准备 0.26 x 106，0.52 x 106， 1.04 x 106， 2.08 x 106， 4.17 x 106 和8.33 x 106细胞/mL 细胞悬浮液 0.047 x 106、0.094 x 106、 0.187 x 106、0.375 x 10 6、0.75 x 106 和1.5 x10 6细胞/6
- 每井每井的板180μL的电池悬浮液沿每一个井的一侧。建议使用多通道移液器。使用分析仪培养板的 A1、A12、H1 和 H12 井作为背景校正的控制井。在这些孔中加入180μL的测定介质（无细胞）。如果需要，如果板内有足够的空间，可以使用额外的控制井。
注：血清的存在可能会导致细胞附着不良。 - 在无CO 2-2-培养箱中，在37°C下孵育板30分钟。在此期间准备10倍化合物（参见下面的步骤4.3）。
- 将离心机设置更改为零制动。以 200 x g 离心 板 5 分钟。观察显微镜下的细胞，检查它们在井底形成单层。将板转回无 CO2的培养箱 25 分钟。为获得最佳效果，电镀后的总时间不应大于 1 小时左右。
- 准备 10 倍工作解决方案，将负载加载到传感器盒中
注：传感器盒的 96 个探针尖端每个探针都具有 4 个端口（A、B、C 和 D），可用于按顺序将化合物注入单个孔中。- 要执行线粒体应激测试，在线粒体压力测定介质中制备 10 μM 寡霉素、1 mM DNP 和 10 μM rotenone 和 10 μM 抗霉素 A 的混合物（使用步骤 1.2.3 中的库存溶液）。中每 2.5 mL。注射后井中的最终浓度为1 μM寡霉素、0.1 mM DNP和1μM抗霉素 A/rotenone。
- 要执行糖解压力测试，在糖解压力测定介质中制备 2.5 mL 的 10 μM rotenone 和 10 μM 抗霉素 A 的混合物（使用步骤 1.2.3 中的库存溶液）。将葡萄糖溶解在糖解压力测试介质中，用于 100 mM 溶液和 2-脱氧葡萄糖（2-DG）在糖解压力测试介质中，用于 500 mM 溶液。注射后井中的最终浓度为10 mM葡萄糖、1μM抗霉素 A/rotenone 和 50 mM 2-DG。
- 将溶液加热至37°C，检查pH值，必要时重新调整至7.4。在步骤 4.3.1 中准备的负载化合物。（用于线粒体压力测试）或 4.3.2（用于糖解应力测试）使用多通道微管和墨盒提供的端口加载导轨进入水合传感器盒的端口 A、B 和 C（从步骤 3.2 开始），如表 2所示。
注：为确保检测期间所有孔中正确喷射，使用的每个端口系列（例如，所有端口 A）必须在整个传感器盒中包含相同的喷射量。这适用于背景校正井，甚至适用于实验中未使用的井。 - 在设置程序时，在 37 °C 的 CO2培养箱中孵育加载的传感器盒。
- 设置细胞外通量测定协议
- 打开细胞外通量分析仪软件， 并使用"组定义" 和 "板图" 选项卡指示具有类似条件的井组（例如，具有相同细胞数的孔，或具有休息细胞或 IL-15 刺激细胞的孔）。此外，指示背景校正井（默认情况下为 A1、A12、H1 和 H12 将设置，但可以使用其他孔）和空井。
- 使用"协议"选项卡在软件中设置表 3 中描述的程序 。
- 使用"运行分析 "选项卡开始 程序。将传感器墨盒（水合并装载 10 倍化合物）和公用板放在托盘上。校准步骤（15 ~ 20 分钟）后，当提示时，将检测板的校准板（无盖）更换为连接的电池。在此之后，运行是完全自动化的（机器将执行所有测量和喷射）。
注：只要将特定化合物加载到适当的端口中（寡霉素、 在进行线粒体应力测试的孔中，DNP和抗霉素/罗泰诺分别位于孔的A、B和C;在进行糖解应力测试的孔中，葡萄糖、抗霉素/罗泰诺和2-DG分别使用软件的组定义和板图选项卡。 Group Definitions - 运行完成后，检索数据并使用软件对其进行分析。
5. 细胞号确定
注：结果可以规范化，以考虑单元格数中可能的差异。可以使用下面介绍的两种主要方法。
-
DNA含量测定
- 从每一个井中拆下剩余的检测介质，用移液器。吸气介质时，注意不要打扰细胞。板可以储存在-20°C，直到分析。
注：冷冻步骤对于有效的细胞解解和DNA含量测定非常重要。 - 在蒸馏水（200μL/井）中制备1x细胞增殖测定细胞-解液缓冲液（20倍）。
- 将细胞增殖测定染料库存溶液（400倍）加入1x细胞解液缓冲液。对于每井50至50.000个细胞的检测，请使用1x细胞增殖测定染料。对于较高的细胞数，建议在最终浓度高于1倍时使用细胞增殖测定染料。在这种情况下，使用细胞增殖测定染料在5倍的最终浓度（稀释细胞增殖测定库存溶液80倍到1x细胞解液缓冲）。
- 将200μL的细胞增殖测定试剂添加到每一个井中。在室温下孵育样品2~5分钟。防止光线。
- 测量样品在激发时的荧光：480 nm;发射：520 nm 使用荧光微孔板读取器，根据制造商的建议。
- 从每一个井中拆下剩余的检测介质，用移液器。吸气介质时，注意不要打扰细胞。板可以储存在-20°C，直到分析。
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蛋白质含量测定
- 小心地，从每一个井中完全吸出检测介质，而不接触细胞，并在-20°C˚下将细胞冷冻至少1小时。或者，细胞可以冻结更长时间（长达1周），直到执行分析。
- 将 50 μL 的放射性免疫沉淀测定 （RIPA） 裂解介质与 1x 蛋白酶抑制剂（来自 100 倍库存溶液）补充到每口井中。在室温下将板放在摇床上5分钟，然后在冰上孵育板30分钟，进行完整的细胞解解。
- 在室温下，在 200 x g 下将板离心 5 分钟。此步骤将颗粒细胞碎片，以防止干扰蛋白质测量。
- 根据制造商的建议，通过双辛辛酸（BCA）测定蛋白质浓度。
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Representative Results
从外周血分离NK细胞提供了一个纯净和可行的种群
细胞外通量测定基于对井中H+和 O2 浓度的测量，不会区分不同细胞群体或其生存能力。因此，获得一个高度纯净和可行的兴趣细胞群体是这些实验成功的关键步骤。
如第2节所述，从外周血中分离NK细胞。为了评估获得的NK细胞的纯度和可行性，通过流式细胞学对来自PMBC和分离的NK细胞群体中的小等等素进行染色和分析（图2A）。单核细胞被封闭在显示向前（FSC-A）与侧散射区（SSC-A）的图中。在此总体中，单个单元沿显示 FSC-A 与正向散射高度 （FSC-H） 的图中的对角线进行门控。在单身人群中，对生存能力进行了评估，发现在PMB和NK细胞群体中，其生存能力均高于98%。分离的NK细胞种群的纯度通过双染色CD3（存在于T细胞中，PBMCS中的显性群体）和CD56或NKp46（图2B）而建立。NK 细胞定义为 CD3 的人口负值，CD56 或 NKp46 的正值。根据这些标准，NK细胞的纯度约为88%，与PBMC群体中的富集相比，NK细胞的富集率是18倍。
OCR 和 ECAR 值取决于单元格号
在线粒体应激测试中，细胞因添加三种不同化合物而代谢扰动：寡霉素、DNP和抗霉素 A+ rotenone。对于每个细胞类型，每井的细胞数量都经过仔细优化，用于细胞外通量测定实验。 图 3A 显示了线 粒体耗氧率 （OCR） 的代表性图图，使用多个人类 NK 细胞数 （0.75 x 106，0.375 x 106，0.187 x 106，0.094 x10 6 和 0.047 x 106） 。所有测量都是三次完成的。细胞数与井中的DNA或蛋白质量呈线性关联（图3B）。正如预期的那样，高细胞数显示较高的OCR值，而每井小于0.187 x10 6 个细胞没有提供可靠的结果。另一方面，较高的细胞数（1.5 x 106）不是最佳的，因为加入DNP后，井中的氧浓度在每个周期中完全耗尽（图3C），这排除了OCR的精确计算。对于每种细胞类型，必须仔细滴定不组子的浓度，因为不添加足够的DNP会导致亚最大OCR，而添加太多可能抑制最大OCR。在人类NK细胞中，100μM DNP是最佳剂量（图3D）。其他非耦合器，如碳基氰化物-4-（三氟甲氧氧）苯乙烯（FCCP）或碳化氰化物m-氯苯乙烯（CCCP）可以使用，但需要为每种细胞类型滴定。
对于糖解压力测试，在对ECAR进行基线测量后，葡萄糖缺乏细胞被以下化合物干扰：葡萄糖、抗霉素 A+ rotenone 和 2-DG。图 3E 显示了使用多个 NK 单元格编号（0.75 x 10 6、0.375 x 106、0.187x 106、0.094x 106和 0.047 x 106）的 ECAR 代表性绘图。6所有测量都是三次完成的。糖解应力测定在最高电镀密度下最成功，而每井少于0.187 x10 6个细胞没有提供可靠的结果。
IL-15 治疗增加 OCR 和 ECAR 基底和最大值
每井0.75×106细胞的最佳播种密度用于后续实验。NK细胞在细胞因子IL-15存在或不存在饱和浓度时培养48小时，之后发现其生存能力分别是93.7±4.8%和85.7~12.0%。图4A，B显示了一个典型的线粒体应激试验实验，每孔有0.75 x10 6 NK细胞。在此测试中，寡霉素导致氧气消耗的显著减少（图4A）和ECAR的增加，ECAR表示切换到糖解，以尝试保持细胞ATP水平（图4B）。IL-15激活NK细胞导致线粒体耗氧量和细胞外酸化增加。当比较了几个人类受试者时，这个结果是一致的（图4C）。基础，最大和ATP链接呼吸，但不是质子泄漏或非线粒体呼吸，增加与IL-15（图4C，D）.此外，OCR/ECAR率下降，表明在IL-15刺激后向糖解代谢转变的趋势（图4E）。
图4F，G显示了一个典型的糖解压力试验实验，每井有0.75 x10 6 NK细胞。葡萄糖的添加由于糖解激活而触发了ECAR的大量增加，而随后添加的抗霉素A和罗泰诺驱动补偿性糖解，2-DG导致通路抑制，ECAR减少至最小（图4F）。同时，葡萄糖持续导致氧气消耗略有下降，可能是蟹树效应20，而抗霉素A和罗泰诺完全阻断呼吸和2-DG不提供任何进一步的影响（图4G）。在本次测试中，也可以观察到IL-15的细胞外酸化和线粒体耗氧量的激活，在使用来自多个捐献者细胞时，这也是一致的（图4H）。
图1：细胞外通量测定的示意图。
（A） 糖解的原理图、三箱酸循环 （TCA） 和电子传输链 （ETC）。不同步骤的抑制器用红色书写。ETC 中的电子通量以绿色表示，NADH 为供体，O2 表示 为最终接受方。（B） 糖解压力测试示意图图图图图，表示细胞外酸化率（ECAR）与时间。（C） 线粒体压力测试示意图图图配置文件表示耗氧率 （OCR） 与时间. 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：从外周单核细胞（PBMC）纯化的自然杀伤光（NK）细胞。
（A） 遵循的浇注策略用于评估NK细胞（右列）与PBMC（左列）的纯度和生存能力。从单核细胞（顶板）的闸门，选择单细胞（中间面板）和可行性测量（底部面板）。（B） 活细胞被染色为CD3和CD56或NKp46。面板中的数字指示选定区域中的单元格百分比。研究结果代表了三个独立的实验。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：激活的人类NK细胞中线粒体和葡萄糖应激测试的优化。
（A） 线粒体压力测试：显示每个电镀密度的OCR（0.75 x 10 6、0.375 x10 6、0.187x 106、0.094x 106和0.047 x 1066）。每个数据点表示 3 个标准差井的平均值。结果代表了3个独立的实验。（B） DNA（上面板）和蛋白质（下面板）水平在井中处于不同的电镀密度。结果至少代表三个独立的实验。每个数据点表示 3 个标准差井的平均值。结果代表了3个独立的实验。（C） 不含细胞（黑色痕迹）、0.75 x 106细胞（蓝色痕迹）或1.5 x 106细胞（绿色微量）的井中的原始氧水平痕迹。在添加DNP后的绿色痕迹中，氧气在每个循环中完全耗尽。（D） 在存在若干DNP浓度的情况下测试了0.75 x 106个细胞的备用呼吸能力。（E） 糖解压力测试：显示每个电镀密度（0.75 x 10 6、0.375 x 106、0.187x 106、0.094x 106和 0.047 x 1066）的 ECAR。每个数据点表示 3 个标准差井的平均值。结果代表了3个独立的实验。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：通过IL-15检测NK细胞激活后代谢变化。
线粒体应激测试：OCR （ A ）和ECAR （B） 图显示为0.75 x 106 休息或IL-15激活细胞。每个数据点表示 3 个标准差井的平均值。结果代表了5个独立的实验。单个人类供体的基础和最大呼吸变化显示在（C）， 而 ATP 相关呼吸、质子泄漏、非线粒体呼吸 （NMR） 显示在（D）中，OCR/ECAR 比率显示在（E） 中。糖解压力测试： ECAR （F） 和OCR （G） 图显示为0.75 x 106 休息或IL-15活性细胞.每个数据点表示 3 个标准差井的平均值。结果代表了5个独立的实验。单个人类供体的基础和最大细胞外酸化变化见于 （H）。ns： 不显著;* p ˂ 0.05;** p ˂ 0.01;p ˂ 0.001。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：TCA和糖解对ECAR的贡献。
ECAR 的第一次测量在很大程度上与 TCA 周期中产生的 CO2 的酸化相对应。在添加葡萄糖加入燃料糖解后，TCA衍生酸化对ECAR的贡献减少。注射抗霉素A和Rotenone阻止TCA，糖解通过增加到其最大水平（补偿性糖解）来补偿ATP需求的增加。2-DG 对糖解的封锁可将 ECAR 降低至最低水平，对应于不归因于糖解或呼吸活动的酸化，以及任何未完全由 2-DG 抑制的残余糖解（2-DG 后酸化）。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 试剂 | 工作集中度 | 克隆（用于抗体） | 最终染色体积 |
| 鼠标防人 CD3 BV711 | 50纳克/毫升 | UCHT1 | 100 μl |
| 鼠标防人 CD56 PE | 1/50 稀释 | B159 | 100 μl |
| 鼠标防人 NkP46 PE | 1/50 稀释 | 9/E2 | 100 μl |
| 活力染料 | 1/1000 稀释 | 500 μl |
表1：用于流式细胞测定的试剂和抗体。
| 线粒体压力测试 | ||||
| 港口 | 体积 | 复合 | 10x 库存 | 测定的最终浓度 |
| A | 20 μl | 奥利戈米辛 | 10 μM | 1 μM |
| B | 22 μl | Dnp | 1 米 | 0.1 mM |
| C | 25 μl | 抗霉素 A + 罗泰诺 | 每个 10 μM | 每个 1 μM |
| 糖解压力测试 | ||||
| 港口 | 体积 | 复合 | 10x 库存 | 测定的最终浓度 |
| A | 20 μl | 葡萄糖 | 100 mM | 10 mM |
| B | 22 μl | 抗霉素 A + 罗泰诺 | 每个 10 μM | 每个 1 μM |
| C | 25 μl | 2-DG | 500 米 | 50 米 |
表2：复合载荷。
| 步 | 环 | 重复（时间） | ||
| 混合 | 等 | 措施 | ||
| 校准 | –– | |||
| 平衡 | –– | |||
| 基线读数 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | 3 |
| 结束循环 | –– | |||
| 注入端口 A | –– | |||
| 测量 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | 3 |
| 结束循环 | –– | |||
| 注入端口 B | –– | |||
| 测量 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | 3 |
| 结束循环 | –– | |||
| 注入端口 C | –– | |||
| 测量 | 3 分钟 | 0 分钟 | 3 分钟 | 3 |
| 结束循环 | –– | |||
| 结束计划 | –– | |||
表3：程序布局。
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Discussion
本文建立了一种协议，从外周血中有效隔离和培养纯和可行的原人类NK细胞。我们还利用细胞外通量分析仪，优化了这些NK细胞的代谢活性测量条件，这些细胞的代谢活性按耗氧率和细胞外酸化率进行评估。与其他再测量方法相比，细胞外通量分析仪速度快，需要少量细胞，并允许高通量筛选。然而，它的试剂是昂贵的，和注射化合物仅限于四。NK细胞细胞因子对糖解和氧化磷酸化的代谢重塑和激活对于健壮的NK细胞反应21至关重要，此处描述的技术允许实时研究NK细胞的代谢特征。该协议可以扩展到由其他细胞因子激活的细胞，如IL-2、IL-12和IL-18，或与激活受体结合的抗体。我们已经解决了几个经常被忽视的关键步骤，例如在最佳汇合时电镀细胞或使用非共体的最佳浓度来刺激最大耗氧量。然而，我们建议检查实际的O2 水平曲线（图3C），如果其他刺激不同于IL-15被给予细胞，以确保O2 没有耗尽在井中。如果是这样的话，应该减少细胞数，直到观察到线性O2 消耗，以防止低估真正的OCR。
基础呼吸反映了细胞的基底代谢状态，这主要受线粒体ATP合成酶8的活性控制，是基础ATP需求（蛋白质合成、细胞骨架动力学、ATPases如Na+/K =-ATPase等）的指示。+通常，在存在足够的基质的情况下，此参数在代谢活性细胞或压力细胞中增加。添加的寡霉素，阻止ATP合成酶，揭示了ATP链接的呼吸和质子泄漏，这可能发生在脂质双层或蛋白质的内部线粒体膜，但也可以通过蛋白质，如未合成蛋白（UCPs）9，涉及调节适应性热发生，从而转换线粒体能量潜力到棕色脂肪细胞热。最大呼吸是由各种因素决定的，包括线粒体呼吸链的基质可用性以及呼吸复合物的数量和活性。线粒体呼吸复合物及其活性也可以通过翻译后修饰（如乙酰化或磷酸化22、23）,进行修饰。此参数还可以指示细胞的健康状况及其应对急性侮辱的能力。在线粒体功能障碍的情况下，最大呼吸减少，这限制了细胞对ATP需求变化作出反应的能力，并导致细胞死亡24。
说这话很重要， 对于线粒体和糖解压力测试的每个时间点，ECAR 是糖解衍生酸化（通过乳酸酯生成 + H+ ）和呼吸源酸化的总和（通过生成 CO2，溶解在H2O 中生成 HCO3和H+），重要的是，呼吸衍生酸化可能在某些细胞类型25中占总 ECAR 的很大比例。对于感兴趣的研究人员，有已公布的协议来计算实际糖解率。为此，糖解应激测试期间的,耗氧率（图4G）可用于计算每个时间点通过呼吸的质子生产速率，并且该值可以从使用ECAR值和介质7、25、26,25的缓冲功率获得的总质子生产速率中减去该值。
与制造商的建议相比，此协议的一个重要修改是第二次注射糖解应激测试。抗霉素 A 和 rotenone 优先于寡霉素，原因如下：1）有些细胞表现出高糖解能力，即使不存在氧化磷酸化，也可能完全满足细胞的基底 ATP 需求;2） 用抗霉素 A 和 rotenone 人为地阻断 ETC，从而增加细胞的 ATP 需求，因为它会导致 ATP 水解由 ATP 合成酶（线粒体变成 ATP 接收器），它反转以泵送质子，试图恢复呼吸抑制后崩溃的线粒体球菌电位;3） 阻断 ETC 可防止介质的呼吸酸化（TCA 周期中产生的呼吸CO2转换为 HCO3-和 H+），从而混淆 ECAR 结果。因此，观察到的最大ECAR与抗霉素 A 和 rotenone 只归因于糖解。有趣的是，据报道，仅使用呼吸抑制剂观察到的ECAR可能仍然是低于最大7，并描述了增加细胞ATP需求（因此最大ECAR）的附加机制：添加离子磷莫纳辛， 这增加了Na+进入细胞27，刺激ATP水解率由血浆膜Na+/K=-ATPase，到抗霉素A和罗泰诺7的混合物。+
第二个重要概念是，我们不建议减去非糖解酸化， 这可能对应于呼吸CO2，转换为HCO3和H+，从整个微量计算糖解参数，由制造商建议，因为这个量在糖解压力测试的每个阶段发生相当大的变化（它是最高的基体状态，减少后葡萄糖添加由于蟹树效应20，并几乎废除与抗霉素A和罗泰诺）（图5）。
总之，该协议展示了一个简单而有效的工具，用细胞外通量分析仪测试人体自然杀伤细胞的代谢活性。此方法可用于检测这些细胞的代谢状态，已知通过细胞因子刺激或在某些病理条件下，包括肥胖、癌症或病毒感染28，随着细胞激活而变化。
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Disclosures
提交人宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者感谢MichaelN.Sack博士（国家心脏、肺和血液研究所）的支持和讨论。这项研究得到了国家卫生研究院、国家癌症研究所和国家心脏、肺和血液研究所的校内研究项目的支持。JT 由 MICIN（西班牙）的 Ramon y Cajal 计划（授予 RYC2018-026050-I）支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |
References
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