Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analys av människans naturliga Killer Cell Metabolism

Published: June 22, 2020 doi: 10.3791/61466
Automatic Translation
1,2, 3, 3
1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Summary

I detta dokument beskriver vi en metod för att mäta glykolys och mitokondriell respiration i primära mänskliga Natural Killer (NK) celler isolerats från perifert blod, i vila eller efter IL15-inducerad aktivering. Det protokoll som beskrivs skulle lätt kunna utvidgas till primära mänskliga NK celler aktiveras av andra cytokiner eller lösliga stimuli.

Abstract

Natural Killer (NK) celler medla främst medfödda anti-tumör och anti-viral immunsvar och svara på en mängd olika cytokiner och andra stimuli för att främja överlevnad, cellulära spridning, produktion av cytokiner såsom interferon gamma (IFNγ) och /eller cytotoxicitet program. NK cell aktivering av cytokin stimulering kräver en betydande ombyggnad av metaboliska vägar för att stödja deras bioenergetiska och biosyntetiska krav. Det finns en stor mängd bevis som tyder på att nedsatt NK cell metabolism är associerad med ett antal kroniska sjukdomar inklusive fetma och cancer, som belyser den kliniska betydelsen av tillgången till en metod för att bestämma NK cell metabolism. Här beskriver vi användningen av en extracellulär fluxanalysator, en plattform som möjliggör realtidsmätningar av glykolys och mitokondriell syreförbrukning, som ett verktyg för att övervaka förändringar i energimetabolismen hos mänskliga NK-celler. Den metod som beskrivs här möjliggör också övervakning av metaboliska förändringar efter stimulering av NK-celler med cytokiner som IL-15, ett system som för närvarande undersöks i ett brett spektrum av kliniska prövningar.

Introduction

Natural Killer (NK) celler är medfödda lymfocyter som medla anti-tumör och anti-viral svar. NK-celler omfattar 5-15% av alla lymfocyter i humant perifert blod, och kan också hittas i mjälte, lever, benmärg och lymfkörtlar. NK-celler uttrycker inte polymorfiska clonotypic-receptorer, såsom T-cellsreceptorer (TCR) eller B-cellsreceptorer (BCR). Däremot är aktiveringen av deras cytolytiska funktioner föranledd av engagemang av receptorer som känner igen invariable ligander på ytan av en målcell1,2.

Vila mänskliga NK celler isolerats från perifert blod kan överleva i flera dagar i kultur medium kompletteras med humant serum. Aktivering av NK-celler genom cytokiner som IL-15 eller IL-2 driver cellerna till spridning och till en ökning av deras avlivningsförmåga, bland andraeffekter 3,4,5. Flera studier har visat ett direkt samband mellan NK-cellaktivering och förändringar i deras metaboliska aktivitet6. Dessa metaboliska förändringar är avsedda att uppfylla de särskilda krav som finns i cellerna när det gäller energi och biosyntes.

Aeroba celler och organismer erhåller energi genom en serie kemiska reaktioner som involverar katabolism och oxidation av kolhydrater, fett och proteiner. Genom en kombination av glykolys, trikarboxylsyra (TCA) cykel och oxidativ fosforylering, eukaryota celler möta majoriteten av deras ATP efterfrågan och få intermediärer som krävs som byggstenar för makromolekyler väsentliga för celltillväxt och spridning. Processen för glykolys (Figur 1A) börjar med inträde av glukos i cellen. I cytosolen fosforyleras glukos och omvandlas till pyruvat (med en nettoproduktion av 2 molekyler atp per glukosmolekyl), som kan reduceras till laktat eller transporteras in i mitokondrierna för att omvandlas till Acetyl-CoA och gå in i TCA-cykeln. TCA cykeln fortsätter cykling drivs med fler molekyler av Acetyl-CoA och producerar CO2 (som så småningom kommer att diffusa utanför cellen och, genom att reagera med H2O i mediet, kommer att generera kolsyra som kommer att leda till försurning av mediet) och NADH, molekylen som ansvarar för att donera elektroner till elektrontransportkedjan (ETC). Elektronerna färdas genom olika proteinkomplex och accepteras slutligen av syre. Dessa komplex (I, III och IV) pumpar också H+ från den mitokondriematrisen in i intermembraneutrymmet. Som en följd av den elektrokemiska gradienten som genereras, kommer H+ in igen till matrisen genom den komplexa V (ATP-syntas), investera den potentiella energi som samlats in i generering av ATP.

Både glykolys och mitokondriell andning kan blockeras på olika punkter genom att använda inhibitorer. Kunskapen om och användningen av dessa hämmare låg till grund för utvecklingen av den extracellulära fluxanalysen. Genom att mäta två enkla parametrar i realtid som pH och syre, den extracellulära flux analysatorn härda till hastigheten av glykolys och mitokondriell andning i en 96-brunnsplatta. Glykolysstresstestet utförs i ett basalt medium utan glukos (Figur 1B)7. De första mätningarna av extracellulär försurningsgraden (ECAR) är indikativ för glykolysoberoende försurning. Det benämns icke-glykolytisk försurning och korrelerar med CO2 som produceras av TCA som, som förklarats tidigare, kombinerar med H2O i mediet för att generera H+ (TCA-linked ECAR). Den första injektionen är glukos för att inducera glukosutnyttjande och öka glykolys. Den andra injektionen kombinerar både rotenon, en Komplex I-hämmare, och antimycin A, en Complex III-hämmare tillsammans, för att blockera ETC. Cellerna svarar på denna dramatiska minskning av mitokondriell ATP-produktion genom att aktivera glykolys för att upprätthålla cellulära ATP-nivåer, och detta representerar mängden glykolys som inte används av cellen i basalt tillstånd men som potentiellt skulle kunna rekryteras som svar på ökningar i ATP-efterfrågan (kompenserande glys). Den tredje injektionen är glukosanalogin 2-Deoxyglukos (GD), som konkurrerar med glukos som substrat för enzymet hexokinas. Produkten av denna fosforylering, 2-deoxyglukos-6-fosfat kan inte omvandlas till pyruvat, och därför är glykolys blockerad, vilket sänker ECAR till sitt minimum. Ecar som mäts på denna punkt omfattar andra källor till extracellulär försurning som inte tillskrivs glykolys eller andningsaktivitet samt eventuell kvarvarande glykolys som inte helt hämmas av 2-DG (post 2-DG-acidification).

Mitokondriellt stresstestet utförs i ett medium med glukos (Bild 1C)8. De första mätningarna av syreförbrukningshastigheten (OCR) motsvarar baslinjen för mitokondriell respiration (basal respiration). Den första injektionen är oligomycin, som hämmar avkastningen av protoner genom ATP-syntas (komplexa V), blockerar ATP-syntes och därmed snabbt hyperpolarisera mitokondriellt membran, vilket förhindrar ytterligare protonpumpning genom andningskomplex, och leder till en minskning av OCR. Jämförelsen mellan respirationen vid baslinjen och det värde som ges genom tillsats av oigoycin representerar den ATP-kopplade respirationen. Den återstående oligomycin-okänsliga syreförbrukningens hastighet kallas protonläcka, som representerar flödet av protoner genom lipidbilayern eller proteiner i det inre mitokondriella membranet såsom transloosan adeninnukleotal9. Den andra injektionen är den uncoupler 2,4-dinitrofenol (DNP), en jonofor som inducerar en massiv inträde av H+ i mitokondriell matris, vilket leder till depolarisering av mitokondriellt membran och störningar av mitokondriellt ATP syntes. Celler svarar på proton-motivets avledning genom att öka elektrontransportens och syreförbrukningens hastighet till högsta nivåer i ett fruktlöst försök att återvinna membranpotentialen (maximal andningskapacitet). Skillnaden mellan den maximala luftvägarna kapacitet och den basala andningen är den extra respiratoriska kapaciteten av cellen, som föreställer beloppet av respiration som inte används av cellen för att frambringa ATP i det basala statligt men kunde vara potentiellt rekryterat som svar på förhöjningar i ATP-begäran eller under villkorar av spänning8. Den tredje injektionen är en kombination av rotenon och antimycin A. Denna injektion stoppar helt ETC och OCR minskar till sin lägsta nivå, med den återstående syreförbrukningen är icke-mitokondriell (orsakas av NADPH-oxidaser, etc.).

Förändringar i metaboliska vägar skulle på något sätt kunna förutsäga funktionen av NK-celler, eftersom det har föreslagits att kontinuerlig aktivering av NK-celler med cytokiner in vitro skulle kunna leda till NK-cellutmattning genom studier av olika metaboliskavägar 10,11. Korrelationen mellan NK-cellens metaboliska status och funktion är mycket viktig ur cancerimmunterapins synvinkel. I detta fält har aktivering av NK-celler med infusion av IL-15, ensam eller i kombination med monoklonala terapeutiska antikroppar testats i syfte att förbättra tumörcellsdödandet12,13,14. Kunskapen om NK-cellernas metaboliska status som svar på dessa behandlingsstrategier skulle ge en värdefull prediktor för NK-cellaktiveringsstatus och avlivningsfunktion.

Studien av metaboliska vägar i andra myeloisk och lymfoida celler såsom monocyter, T och B-celler har beskrivits15 och optimerade metoder har publicerats16. I detta protokoll tillhandahåller vi en metod som kombinerar både ett NK-isoleringsprotokoll som ger ett stort antal rena och livskraftiga NK-celler och ett optimerat protokoll för att mäta metabolisk aktivitet med hjälp av en extracellulär fluxanalysator. Här visar vi att detta är en giltig metod för studier av metaboliska förändringar i vila och IL-15 aktiverat mänskliga NK celler. För den extracellulära fluxanalysen har parametrar som celltal och läkemedelskoncentrationer testats och optimerats. Jämfört med andra respirometriska metoder, extracellulära flux analysator är helt automatiserad och kunna testa i realtid, med mycket låga mängder celler, upp till 92 prover samtidigt, och därmed tillåter hög genomströmning screenings (med flera prover och replikat) på ett relativt snabbt sätt17.

Denna metod kan användas av forskare som är intresserade av att bedöma NK-cellens funktion genom att studera NK-cellmetabolism. Det kan tillämpas också på celler som aktiveras av andra cytokiner, antikroppar eller lösliga stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Samtliga experiment utfördes i enlighet med deklarationen av Helsingfors etiska principer för medicinsk forskning. Perifera blodprov från givare erhölls från NIH Institutionen för transfusionsmedicin enligt 99-CC-0168 IRB godkänt protokoll, med patientens skriftliga informerat samtycke.

1. Reagenspreparat

  1. Reagenser för isolering av NK-celler
    ANMÄRKNINGAR: Förbered dessa reagenser i en cellkulturhuva.
    1. Förbered NK-separationsbuffert: Tillägg PBS (pH 7.4) med 1 mM EDTA och 2% Fetal Calf Serum (FCS) som tidigare har värme-inaktiverats (vid 56 °C i 30 min).
    2. Förbered NK kulturmedium: Komplettera Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) med 10% Human Serum (HS). Sterilt filter och förvara vid 2-8 °C. Värm mediet till 37 °C innan du lägger till i cellerna.
    3. Resuspend Human IL-15 i PBS vid 200 μg/mL.
  2. Reagenser för extracellulär fluxanalys
    1. Förbered analysmedia: För mitokondriellt stresstestmedium, tillsätt 1 mM natriumpyuvat, 2 mM L-glutamin och 10 mM glukos till basmediet; för glykolys stresstestmedium, tillsätt 2 mM L-glutamin till basmediet.
      OBS: Koncentrationerna av glukos, pyruvat och glutamin tillhandahålls enligt rekommendation från extracellulära fluxanalysator tillverkaren. Men mediesammansättning kan ändras av forskare för att perfekt matcha den i odlingsmediet, om så önskas.
    2. Justera pH-värdet för båda medierna till 7,4 med 0,1 N NaOH med hjälp av en pH-mätare på bänkskiva, sterilt filter genom en 0,2 μM porstorlek och förvara vid 2–8 °C. Varma medier till 37 °C, kontrollera pH och justera till 7,4 före användning om det behövs.
      OBS: Endast omgivande CO2 finns i atmosfären av extracellulära flux analysatorn, är användningen av media utan bikarbonat kritisk.
    3. Förbered stamlösningar för reagenser: Oligomycin (ATP syntashämmare), 10 mM stamlösning i DMSO; 2,4-dinitrofenol (DNP, uncoupler), 1 M stamlösning i DMSO; antimycin A (komplex III-hämmare), 10 mM stamlösning i DMSO; rotenon (komplex I-hämmare), 10 mM stamlösning i DMSO. Gör 30 μL alikvoter av alla reagenser och förvara vid -20 °C.
      OBS: Dessa riktlinjer är avsedda för reagenser som köps in individuellt och bereds av forskaren. Om reagenser köps från analysatortillverkaren istället, följ deras riktlinjer för reagenspreparering.

2. NK-celler isolering från perifert blod

  1. Mononukleära celler för perifert blod (PBMCs) preparat från humant blod
    OBS: Utför dessa steg i en cellkultur huva. Dekontaminera alla rester och material som är i kontakt med blod med blekmedel och kasta dem i lämplig behållare som ska förbrännas.
    1. Pipett 20 mL av Lymfocytseparationsmedel (LSM) till ett koniskt rör på 50 mL.
    2. Försiktigt, samtidigt som röret vid en 30° vinkel, pipettera 20 mL blod över LSM, mycket försiktigt och vidröra väggen i röret. Undvik blandning av blod med LSM och skapa en synlig och väldefinierad interfas mellan de två vätskorna.
      OBS: Perifert blod eller anrikade leukaferesprodukter kan användas.
    3. Centrifugera rören i 25 min, 1000 x g vid rumstemperatur. Använd inte broms, eftersom det skulle kunna göra båda faserna i röret (LSM och blod) blanda.
    4. Ta försiktigt ut rören från centrifugen och placera dem i ett rack. Kontrollera om det finns ett iögonfallande lager av celler (mononukleära celler) som kommer att bildas vid interfasen mellan LSM (klar) och plasma (gul), medan röda blodkroppar pellet i botten av röret.
    5. Aspirera försiktigt det mononukleära celllagret med en 10 mL plastpipett (runt 5-8 mL) och placera den i ett nytt koniskt rör på 50 mL. Lymfocyt interfas på upp till 2 olika rör kan poolas tillsammans.
    6. Tvätta de mononukleära cellerna 2x genom resuspending i 45 mL PBS och centrifugering vid 800 x g i 5 min, vid rumstemperatur.
      OBS: Efter detta steg erhålls en pellet av mononukleära celler av perifert blod (PBMC) och forskaren kan gå vidare till NK-isoleringssteget.
  2. NK-isolering från PBMCs
    1. Räkna cellerna från 2.1.6 och resuspend dem i NK Separation Buffert (1x 108 PBMCs/mL).
    2. Ta 10 mL av cellens återfpension (109 PBMC) och placera dem i ett 50 mL-rör.
    3. Tillsätt 500 μL (50 μL/mL buffert) av NK-cellsisoleringsantikroppsblandning och 10 μL (1 μL/ mL buffert) av anti-CD3-blandning av antikroppsblandning med positiv isolering till PBMC:erna och inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
    4. Vortexa de magnetiska pärlorna och tillsätt 1 mL till blandningen av PBMC med antikroppar (100 μL pärlor/ml PBMC). Inkubera i 10 min vid rumstemperatur med emellanåt omrörning.
    5. Tillsätt 35 mL av NK-isoleringsbuffert (3,5 ml buffert/ml PBMC), blanda och lägg på magneten i 15 min (2,2 x 107 PBMCs/mL). Efter den tiden kommer pärlorna och cellerna positivt utvalda (alla utom NK-celler) att ha anslutit sig till rörets väggar.
    6. Samla försiktigt upp supernatanten (innehållande NK-celler) med en 50 mL plastpipett utan att röra sidorna eller rörets botten.
    7. Räkna cellerna med hjälp av en cellräknare och centrifug vid 800 x g i 5 min.
    8. Resuspend isolerade NK celler vid 5 x 106 celler/mL i IMDM som innehåller 10% HS och placera dem i en inkubator vid 37 °C med 5% CO2 tills försöket utförs.
      OBS: Detta NK-isoleringsprotokoll anger cellnummer och reagensvolymer anpassade för användning av ett 50 mL-rör och en stor magnet. Detta protokoll kan skalas upp (ifall fler PBMC:er erhålls) genom att isoleringsstegen upprepas i olika rör eller skalas ned genom att minska volymen i röret. För slutvolymer på 14-45 mL används ett 50 mL polystyrenrör, för volymerna 4-14 används ett 15 mL polystyrenrör och för volymerna 1-4 mL används ett 5 mL polystyrenrör. Magneten är olik och passformen anslåröret i varje fall. Mängden av antikroppsblandning och magneter pärlor kan också skalas efter antalet celler och den slutliga volymen.
  3. NK-cellpopulationen färgning för flödescytometri
    1. Ta 0,25 x 106 celler per prov från steg 2.2.8, avlägsna mediet genom centrifugering vid 800 x g i 5 min i rumstemperatur och gör om cellpelleten i 500 μL PBS.
    2. Tillsätt bärgningsfärgämne enligt tillverkarens rekommendation (1 μL DMSO-rekonstituerat färgämne till 1 mL av cellresuspension) och inkubera i rumstemperatur i 30 min.
    3. Tvätta 2x genom resuspending i 5 mL PBS och centrifugering vid 800 x g i 5 min, vid rumstemperatur.
    4. Fläck med motsvarande anti-humana antikroppar i 100 μL av IMDM innehållande 10% HS för 30 min på is skyddad från ljus (se tabell 1). Alla antikroppar kan kombineras och användas i ett enda färgningssteg.
    5. Analysera proverna efter flödescytometri för att utvärdera renheten hos den NK-cellpopulation som erhålls. Använd den cell gating och analysmetod som tidigare har beskrivits18,19.
  4. NK-celler stimulering med lösliga IL-15
    1. Resuspend 0,75 x 106 celler från steg 2.2.8 eller 2.4.3 i 100 μL IMDM som innehåller 10% HS i en brunn av en 96 brunn-platta (rund botten).
    2. Späd ut human IL-15 till 1 μg/mL i IMDM innehållande 10% HS. Tillsätt 100 μL av den utspädda humana IL-15 till cellerna för att nå en slutlig koncentration på 0,5 μg/mL.
      OBS: 0,5 μg/mL är en mättande koncentration av IL-15. Lägre koncentrationer av IL-15 eller andra cytokiner som IL-2, IL-12 eller IL-18 kan testas av forskare om så önskas.
    3. Placera cellerna i inkubatorn vid 37 °C och stimulera i 48 h innan du utför den extracellulära fluxanalysen. Resuspend ostimulerade (kontroll)celler vid samma koncentration och volym i IMDM som innehåller 10% HS utan IL-15, och placera dem i samma inkubator för 48 h.

3. Hydrering av sensorns patron

OBS: Sensorpatronens 96 probspetsar innehåller individuella solid state-fluoroforer för O2 och H+ som behöver hydreras för att det ska kunna upptäckas O2 och pH-förändringar.

  1. Slå på analysatorn och låt den värmas upp till 37 °C.
  2. Öppna sensorkassettpaketet och separera sensorkassetten från bruksplattan. Tillsätt 200 μL av calibrantlösningen i varje brunn av bruksplattan och sätt tillbaka sensorpatronen på plattan, med en validering av att sensorerna är helt nedsänkta i lösningen. För optimala resultat inkubera patronen över natten vid 37 °C i en CO2-fri inkubator som är ordentligt befuktad för att förhindra avdunstning. Förhindra bubbelbildning under sensorerna vid återfuktning.
    OBS: Den minsta patronens hydreringstid är 4 h vid 37 °C i en CO2-fri inkubator. Alternativt kan hydrering av sensorpatronen med 200 μL sterilt vatten vid 37 °C i en CO2-fri inkubator, följt av en inkubation av sensorpatronen med 200 μL för varmkammad calibrantlösning 45 – 60 min före körningens start användas.

4. Extracellulär fluxanalys

  1. Beredning av limbelagda plattor
    OBS: Eftersom mätningen av metaboliska parametrar sker i en mikrokammare som bildas i botten av 96-well assay-plattan, måste suspensionsceller först följas till brunnens botten. En cell lim som utvinns ur musslan Mytilus edulis är anställd. Tillverkaren av celllimet rekommenderar en beläggningskoncentration på 1 till 5 μg/cm2. Brunnen av analysatorcellkulturens mikroplatta har en yta på ungefär 0,110 cm2. För en 5 μg/cm2-koncentration krävs således omkring 0,55 μg lim. Eftersom 25 μL av limlösningen kommer att användas för att belägga varje brunn, är den optimala självhäftande lösningskoncentrationen för analysatorcellsodlingsmikroplattorna runt 22,4 μg/mL (22,4 μg/mL x 0,025 mL = 0,56 μg).
    1. Bered 2,5 mL cellslimlösning (22,4 μg/mL) i 0,1 M natriumbikarbonat, pH 8,0. Bikarbonat ger det optimala pH för cellens vidhäftande prestanda som enligt tillverkaren är mellan 6,5 och 8,0.
    2. Pipett 25 μL av celllimlösningen till varje brunn av analysplattan och inkubera i rumstemperatur i 20 min. Därefter tar du bort lösningen och tvättar 2x med 200 μL sterilt vatten/brunn. Låt brunnarna torka genom att hålla plattan öppen i 15 minuter inuti en cellkultur huva.
      OBS: Belagda plattor får förvaras i upp till 1 vecka vid 4 °C.
  2. Cellsådd i plattor belagda med klister
    1. Centrifugera celler från steg 2.4.3 vid 200 x g i 5 min vid rumstemperatur. Ta bort supernatanter och tvätta celler i värmt mitokondriellt stresstestmedium (om ett mitokondriellt stresstest utförs) eller glykolys stresstestmedium (om ett glykolys stresstest håller på att utföras). Pelletsceller igen och återanvänd till den föredragna cellkoncentrationen i samma medium (resuspension-volymen kommer att bero på den valda cellkoncentrationen; eftersom varje brunn kommer att innehålla 180 μL av cellfjädringen, förbered 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 och 8,33 x 10 6 celler/mL-cellsupphängningar för 4,17 x 106 0,047 x 106, 0,094 x 106, 0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 och 1. 5 x 106 celler per brunn respektive).
    2. Plate 180 μL av cell suspension per brunn längs sidan av varje brunn. En flerkanalig pipett rekommenderas. Använd brunnarna A1, A12, H1, och H12 av analysatorkulturplattan som styr brunnar för bakgrundskorrigering. Tillsätt 180 μL av analysmediet i dessa brunnar (inga celler). Ytterligare kontroll brunnar kan användas om så önskas och om det finns tillräckligt med utrymme i plattan.
      OBS: Förekomst av serum kan orsaka dålig celltillbehör.
    3. Inkubera plattan i 30 min vid 37 °C i en CO2-fri inkubator. Förbered 10x föreningar under tiden (se steg 4.3 nedan).
    4. Ändra centrifugeringsinställningarna till nollbromsning. Centrifugera plattan vid 200 x g i 5 min. Observera cellerna under mikroskopet för att kontrollera att de bildar ett monolayer längst ner på brunnen. Överför tillbaka plattorna till CO2-free inkubatorn i 25 min. För bästa resultat bör total tid efter plätering inte vara större än runt 1 h.
  3. Förberedelse av 10x arbetslösningar för att ladda in i sensorkassett
    OBS: Var och en av sensorkassettens 96 probspetsar hamnar 4 portar (A, B, C och D) som kan användas för att injicera föreningar sekventiellt i enskilda brunnar.
    1. För att utföra mitokondriellt stresstest, preparera 2,5 mL vardera av 10 μM oligomycin, 1 mM DNP, och en blandning av 10 μM rotenon och 10 μM antimycin A, i mitokondriellt stressanalysmedium (använd stamlösningarna från steg 1.2.3). Slutliga koncentrationer i brunnen efter injektionen blir 1 μM oligomycin, 0,1 mM DNP och 1 μM antimycin A/rotenone.
    2. För att utföra glykolysstresstest, preparera 2,5 mL av en blandning av 10 μM rotenon och 10 μM antimycin A i glykolysstressanalysmedium (använd stamlösningarna från steg 1.2.3). Lös upp glukos i glykolys stresstestmedium för en 100 mM-lösning och 2-deoxy-glukos (2-DG) i glykolys stresstestmedium för en 500 mM-lösning. Slutkoncentrationerna i brunnen efter injektionen blir 10 mM glukos, 1 μM antimycin A/rotenon och 50 mM 2-DG.
    3. Varma lösningar till 37 °C, kontrollera pH och justera till 7,4 om så krävs. Lastföreningar preparerade i steg 4.3.1. (för ett mitokondriellt stresstest) eller 4.3.2 (för ett glykolysstresstest) i portarna A, B och C i den hydrerade sensorpatronen (från steg 3.2) med hjälp av en flerkanalig mikropipetator och de port-loading guider som medföljer patronen, enligt tabell 2.
      OBS: För att säkerställa korrekt injektion i alla brunnar under analysen måste varje serie av portar som används (t.ex. alla portar A) innehålla samma injektionsvolym över hela sensorkassetten. Detta gäller för bakgrundskorrigerings brunnar och även för de brunnar som inte används i experimentet.
    4. Inkubera den belastade sensorkassetten vid 37 °C i en CO2-fri inkubator medan du ställer upp programmet.
  4. Ställa in extracellulära fluxanalysprotokoll
    1. Öppna programvaran för extracellulär fluxanalysator, och med hjälp av flikarna Gruppdefinitioner och plåtkarta anger grupper av brunnar som har liknande förhållanden (t.ex. brunnar med samma antal celler, eller brunnar med antingen vilande celler eller IL-15-stimulerade celler). Ange också brunnar för bakgrundskorrigering (som standard A1, A12, H1 och H12 kommer att ställas in, men ytterligare brunnar kan användas) och tomma brunnar.
    2. Ställ in programmet som beskrivs i tabell 3 i programvaran med hjälp av fliken Protokoll.
    3. Påbörja programmet med fliken Kör analys. Placera sensorpatronen (hydrerad och laddad med 10x-föreningar) och nyttoplatta på facket. Efter kalibreringssteget (15 – 20 min), när du uppmanas, byt ut calibrantplattan för analysplattan (utan lock) mot bifogade celler. Efter detta är körningen helt automatiserad (maskinen kommer att utföra alla mätningar och injektioner).
      OBS: Det är möjligt att utföra ett mitokondriellt stresstest och ett glykolytisk stresstest i samma platta, så länge de specifika föreningarna lastas i rätt portar (oligoomycin, DNP och antimycin/rotenone i portarna A, B respektive C av de brunnar där ett mitokondriellt stresstest utförs; glukos, antimycin/rotenon och 2-DG i portarna A, B respektive C av de brunnar där ett glykolysstresstest utförs), samma volymer för injektioner används i varje serie av portar och brunnar för varje test identifieras korrekt med hjälp av programvarans gruppdefinitioner och plåtkarta.
    4. Efter slutförandet av körningen, hämta data och analysera dem med hjälp av programvaran.

5. Bestämning av cellnummer

OBS: Resultat kan normaliseras för att ta hänsyn till möjliga skillnader i cellnummer. Två större tillvägagångssätt som beskrivs nedan kan användas.

  1. DNA-innehållsbestämning
    1. Ta bort det återstående analysmediet med en pipett från varje brunn. Vid aspirerande medium, var noga med att inte störa cellerna. Plattan kan förvaras vid -20 °C fram till analys.
      OBS: Fryssteget är viktigt för den effektiva celllys- och DNA-innehållsbestämningen.
    2. Bered en 1x lösning av cellproliferationsanalyscell-lysbuffert (20x) i destillerat vatten (200 μL/brunn).
    3. Tillsätt cellproliferationsanalysens färgämneslagerlösning (400x) i 1x-cell-lysbufferten. För detektion av 50 till 50.000 celler per brunn, använd 1x cell spridning assay färgämne. För högre cellnummer rekommenderas användning av cellsproliferationsanalysfärgämnet vid en slutkoncentration högre än 1x. I detta fall, använd cellen spridningsanalys färgämnet vid en 5x slutlig koncentration (späd cellen spridningsanalys stamlösning 80-faldig till 1x cell-lysbuffert).
    4. Tillsätt 200 μL av cellsproliferationsreagensen för analys till varje brunn. Inkubera proverna för 2–5 min i rumstemperatur. Skydda mot ljus.
    5. Mät provens fluorescens vid excitering: 480 nm; utsläpp: 520 nm med hjälp av en fluorescensmikroplattläsare enligt tillverkarens rekommendationer.
  2. Proteinhalt bestämning
    1. Försiktigt, aspirera helt assaymediet från varje brunn utan att vidröra cellerna och frysa cellerna vid -20 °C i minst 1 h. Alternativt kan cellerna hållas frysta längre gånger (upp till 1 vecka) tills analysen utförs.
    2. Tillsätt 50 μL radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysmedium kompletterat med 1x proteashämmare (från en 100x stamlösning) till varje brunn. Placera plattan på en shaker i 5 min i rumstemperatur, och sedan inkubera plattan på is i 30 min för en komplett celllys.
    3. Centrifugera plattan i 5 min vid 200 x g vid rumstemperatur. Detta steg kommer pellet cellulära skräp för att förhindra störningar i proteinet mätning.
    4. Mät proteinkoncentration genom bicinchoninsyra (BCA) analys enligt tillverkarens rekommendationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av NK-celler från perifert blod ger en ren och livskraftig population

Den extracellulära fluxanalysen baseras på mätningen av H+ och O2-koncentrationen i brunnen och kommer inte att skilja mellan olika populationer av celler eller deras livsduglighet. Av denna anledning var det viktiga steget att lyckas med dessa experiment att få en mycket ren och livskraftig population av den cell som var av intresse.

Isoleringen av NK celler från perifert blod utfördes som anges i avsnitt 2. För att bedöma renheten och livskraften hos de NK-celler som erhölls, färgades och analyserades små alikvoter från PMBCs och den isolerade NK-cellpopulationen och analyserades genom flödescytometri (figur 2A). Mononuclear celler var gated i tomten visar framåt (FSC-A) kontra sidan scatter area (SSC-A). Inom denna population, var enstaka celler gated längs diagonalen i tomten visar FSC-A kontra framåt scatter höjd (FSC-H). Inom singlet populationerna bedömdes lönsamheten, och befanns vara högre än 98% i båda, PMBCs och NK cell populationer. Renheten av NK-cellen befolkningen isolerade fastställdes genom dubbel färgning mot CD3 (närvarande i T-celler, den dominerande befolkningen bland PBMCS) och CD56 eller NKp46 (Figur 2B). NK-celler definieras som populationsnegativt för CD3 och positivt för CD56 eller NKp46. Enligt dessa kriterier var renheten hos NK-cellerna omkring 88%, vilket motsvarar en 18-faldig anrikning på NK-celler jämfört med de som finns i PBMCs befolkningen.

OCR- och ECAR-värden är beroende av cellnummer

För mitokondriellt stresstest var cellerna metaboliskt störd av tillsats av tre olika föreningar: oligomycin, DNP och antimycin A + rotenone. För varje celltyp, var antalet celler per brunn noggrant optimerad för en extracellulär flux analys experiment. Figur 3A visar representativa tomter av mitokondriell syreförbrukningshastighet (OCR) med hjälp av flera mänskliga NK-cellnummer (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 och 0,047 x 106). Alla mätningar gjordes i tre exemplar. Cellnummer korrelerar linjärt med mängden DNA eller protein i brunnen (Bild 3B). Som förväntat visade höga celltal högre OCR-värden, medan färre än 0,187 x 106 celler per brunn inte gav robusta resultat. Å andra sidan var högre celltal (1,5 x 106) inte optimala, som vid tillsats av DNP, syrekoncentrationen i brunnen var helt uttömd i varje cykel (Figur 3C), vilket utesluter en korrekt beräkning av OCR. Koncentrationen av uncoupler måste titrerad noggrant för varje celltyp, som inte lägga till tillräckliga DNP resultat i submaximal OCR, medan lägga till för mycket kan hämma maximal OCR också. I humana NK-celler visade sig 100 μM DNP vara den optimala dosen (Figur 3D). Andra uncouplers såsom karbonylcyanid-4-(trifluorometoxi) fenylhydrazon (FCCP) eller karbonylcyanid m-klorophenyl hydrazin (CCCP) kan användas i stället för DNP men skulle behöva titreras för varje celltyp också.

För glykolysstresstestet stördes efter en baslinjemätning av ECAR, glukossvultna celler av följande föreningar: glukos, antimycin A + rotenon och 2-DG. Bild 3E visar representativa tomter av ECAR med hjälp av flera NK-cellers nummer (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 och 0,047 x 106). Alla mätningar gjordes i tre exemplar. Den glykolys stress analysen var mest framgångsrika på högsta plätering densitet, medan färre än 0,187 x 106 celler per brunn inte gav robusta resultat.

IL-15-behandlingen ökar OCR- och ECAR-basala och maximala värden

Den optimala sådddensiteten på 0,75 x10 6 celler per brunn användes för efterföljande experiment. NK-celler odlades i närvaro eller frånvaro av mättande koncentrationer av cytokin IL-15 för 48 h, varefter deras livskraft konstaterades vara 93,7 ± 4,8% och 85,7 ± 12,0%, respektive. Figur 4A,B visar ett typiskt mitokondriellt stresstestförsök med 0,75 x 106 NK-celler per brunn. I detta test leder oligomycin till en dramatisk minskning av syreförbrukningen (Figur 4A) och till en ökning av ECAR som representerar en övergång till glykolys för att försöka upprätthålla cellulära ATP-nivåer (Figur 4B). Aktivering av NK-cellen genom IL-15 orsakade en ökning av både mitokondriell syreförbrukning och extracellulär försurning. Detta resultat var konsekvent när flera försökspersoner för människor jämfördes (Figur 4C). Basal, maximal och ATP-kopplad andning, men inte protonläckage eller icke-mitokondriell andning, ökade med IL-15 (Figur 4C,D). Även, OCR / ECAR-hastighet minskade, vilket tyder på en trend att övergå till en glykolytisk metabolism efter IL-15 stimulering (Figur 4E).

Figur 4F,G visar ett typiskt glykolys stresstestförsök med 0,75 x 106 NK-celler per brunn. Tillägg av glukos utlöste en enorm ökning av ECAR på grund av glykolys aktivering, medan efterföljande tillsats av antimycin A och rotenon körde kompenserande glykolys, och 2-DG orsakade en hämning av vägen och en minskning av ECAR till minimum (Figur 4F). Parallellt orsakade glukos konsekvent en liten minskning av syreförbrukningen, eventuellt genom Crabtree-effekten20, medan antimycin A och rotenon helt blockerade andningen och 2-DG inte ger några ytterligare effekter (Figur 4G). Aktivering av både extracellulär försurning och mitokondriell syreförbrukning med IL-15 kunde observeras också i detta test, och återigen är detta konsekvent när man använder celler från flera givare (Figur 4H).

Figure 1
Bild 1: Schematisk av Extracellulära fluxanalyser.
(A) Schematisk av glykolys, trikarboxylsyracykeln (TCA) och elektrontransportkedjan (ETC). Hämmare av olika steg är skrivna i rött. Elektronflussen i ETC:et är representerat i grönt med NADH som givare och O2 som slutlig acceptor. (B) Glykolys stresstest schematisk profil som representerar extracellulär försurningsgrad (ECAR) kontra tid. (C) Mitokondriell stresstest schematisk profil som representerar syreförbrukningshastigheten (OCR) kontra tid. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: NK-celler (Natural Killer) som renas från perifera mononukleära celler (PBMCs).
(A) Gating strategi som följs för att bedöma renhet och bärkraft av NK celler (höger kolumn) kontra den totala PBMCs (vänster kolumn). Från porten av mononukleära celler (topppaneler), valdes enstaka celler (mitten paneler) och lönsamhet mättes (botten paneler). (B) Liveceller var färgas för CD3 och CD56 eller NKp46. Siffrorna i panelerna anger procentandelen celler i de valda regionerna. Resultaten är representativa för tre oberoende experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Optimering av mitokondriella och glukosstresstesterna i aktiverade humana NK-celler.
(A) Mitokondriellt Stresstest: OCR för varje pläteringsdensitet (0,75 x10 6, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 och 0,047 x 106) visas. Varje datapunkt representerar medelvärdet av 3 brunnar med standardavvikelse. Resultat är representativa för 3 oberoende experiment. (B) DNA (övre panelen) och protein (nedre panelen) nivåer i brunnen vid olika plätering tätheter. Resultaten är representativa för minst tre oberoende experiment. Varje datapunkt representerar medelvärdet av 3 brunnar med standardavvikelse. Resultat är representativa för 3 oberoende experiment. (C) Rå syrgasnivåspår i brunnar som inte innehåller några celler (svarta spår), 0,75 x 106 celler (blå spår) eller 1,5 x 106 celler (gröna spår). I den gröna spår efter tillsats av DNP, syre är helt uttömda i varje cykel. (D) Den outnyttjade luftvägarna kapacitet 0,75 x 106 celler testades i närvaro av flera DNP koncentration. (E) Glykolys Stress Test: ECAR för varje pläteringsdensitet (0,75 x 106, 0,375 x 106, 0,187 x 106, 0,094 x 106 och 0,047 x 106) visas. Varje datapunkt representerar medelvärdet av 3 brunnar med standardavvikelse. Resultat är representativa för 3 oberoende experiment. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Detektering av metaboliska förändringar efter NK-cellaktiveringen av IL-15.
Mitokondriellt Stresstest: OCR (A) och ECAR (B) tomter visas för 0,75 x 106 vila eller IL-15 aktiverade celler. Varje datapunkt representerar medelvärdet av 3 brunnar med standardavvikelse. Resultaten är representativa för 5 oberoende experiment. Basala och Maximal Respirationsförändringar för individuell humandonator visas i (C), medan ATP-länkad andning, protonläcka, icke-mitokondriell respiration (NMR) visas i (D) och OCR/ECAR-förhållandet visas i (E). Glykolys Stresstest: ECAR (F) och OCR (G) tomter visas för 0,75 x 106 vilande eller IL-15 aktiverade celler. Varje datapunkt representerar medelvärdet av 3 brunnar med standardavvikelse. Resultaten är representativa för 5 oberoende experiment. Basala och Maximal extracellulära försurningsförändringar för enskilda mänskliga donatorer visas i (H). ns: inte betydande; * p ˂ 0,05; ** p ˂ 0,01; p ˂ 0,001. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: TCA:s och glykolysens bidrag på ECAR.
De första mätningarna av ECAR motsvarar till stor del försurningen på grund av den CO2 som produceras i TCA-cykeln. Efter tillsats av glukos till bränsle glykolys bidraget av TCA-härledda försurning till ECAR minskar. Injektion av Antimycin A och Rotenone blockerar TCA, och glykolys kompenserar ökningen av ATP efterfrågan genom att öka till dess maximal nivå (kompensatorisk glykolys). Blockad av glykolys av 2-DG minskar ECAR till minimala nivåer, motsvarande försurning som inte tillskrivs glykolys eller andningsaktivitet samt eventuell kvarvarande glykolys som inte helt hämmas av 2-DG (post 2-DG-acidification). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Reagens Fungerande koncentration Klon (för antikroppar) Slutlig färgningsvolym
Mus anti-mänskliga CD3 BV711 50 ng/ml UCHT1 100 μl
Mus anti-mänskliga CD56 PE 1/50 utspädning B159 100 μl
Mus anti-mänskliga NkP46 PE 1/50 utspädning 9/E2 100 μl
Livskraft Dye 1/1000 utspädning 500 μl

Tabell 1: Reagenser och antikroppar som används för flödescytometri.

Mitokondriellt stresstest
Port Volym Sammansatta 10x Lager Slutlig Koncentration i analysen
A 20 μl oligomalcin 10 μM 1 μM
B 22 μl Dnp 1 mM 0,1 mM
C 25 μl antimycin A + rotenon 10 μM var 1 μM var
Glykolys stresstest
Port Volym Sammansatta 10x Lager Slutlig Koncentration i analysen
A 20 μl Glukos 100 mM 10 mM
B 22 μl antimycin A + rotenon 10 μM var 1 μM var
C 25 μl 2-GD 500 mM 50 mM

Tabell 2: Sammansatt lastning.

Steg Loop Upprepa (gånger)
Mix Vänta Åtgärd
Kalibrering ––
Jämvikt ––
Utgångsvärden 3 minuter 0 minuter 3 minuter 3
Slutslinga ––
Injicera port A ––
Mätningar 3 minuter 0 minuter 3 minuter 3
Slutslinga ––
Injicera port B ––
Mätningar 3 minuter 0 minuter 3 minuter 3
Slutslinga ––
Injicera port C ––
Mätningar 3 minuter 0 minuter 3 minuter 3
Slutslinga ––
Avsluta programmet ––

Tabell 3: Programlayout.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta dokument har vi etablerat ett protokoll för att effektivt isolera och culturing ren och livskraftig primära mänskliga NK celler från perifert blod. Vi har också optimerat förutsättningarna för mätning av den metaboliska aktiviteten hos dessa NK-celler bedömda genom syreförbrukningshastighet och extracellulär försurningshastighet genom att använda en extracellulär fluxanalysator. Jämfört med andra respirometriska metoder, den extracellulära flux analysator är snabb, kräver ett litet antal celler, och tillåter hög genomströmning screenings. Emellertid, dess reagenser är dyra, och injektioner av föreningar är begränsade till bara fyra. Metabolisk ombyggnad och aktivering av glykolys och oxidativ fosforylering genom cytokiner i NK-cell är avgörande för robusta NK-cellsvar21, och de tekniker som beskrivs här möjliggör studier av NK-cellernas metaboliska profil i realtid. Detta protokoll skulle kunna utvidgas till celler som aktiveras av andra cytokiner, såsom IL-2, IL-12 och IL-18, eller antikroppar som binder till aktiverande receptorer. Vi har tagit upp flera viktiga steg som ofta förbises, såsom plätering cellerna på optimal sammanflödet eller använda den optimala koncentrationen av uncoupler att stimulera maximal syreförbrukning. Trots det rekommenderar vi att man kontrollerar de faktiska O 2-nivåkurvorna (Figur 3C), om andra stimuli som skiljer sig från IL-15 ges till cellerna, för att se till att O2 2 inte är uttömda i brunnarna. Om så var fallet bör cellnumret minskas tills en linjär O2-förbrukning observeras för att förhindra en underskattning av den verkliga OCR.

Basal respiration återspeglar det basala metaboliska tillståndet i cellen, som till stor del styrs av aktiviteten hos den mitokondriella ATP-syntas8, och är en indikation på den basala ATP-efterfrågan (för proteinsyntes, cytoskelettdynamik, ATPases som Na+/K+-ATPase, etc). Typiskt, i närvaro av tillräckliga substrat denna parameter ökar i metaboliskt aktiva eller stressade celler. Tillsats av oligomalcin, som blockerar ATP-syntas, avslöjar ATP-linked andning och protonläckan, som kan hända över lipid bilayer eller proteiner i det inre mitokondriella membranet, men kan också vara inducible genom proteiner såsom Uncoupling Proteiner (UCPs)9, inblandad i regleringen av adaptiv thermogenesis och därmed konvertera mitokondriell energi potential att värma i bruna adipocyter. Maximal respiration bestäms av faktorer som bland annat tillgången på substrat för den mitokondrie andningskedjan och mängden och aktiviteten av andningskomplex. Mitokondriellt andningskomplex och deras aktivitet kan också modifieras genom posttranslationella modifieringar som acetylering eller fosforylering22,23. Denna parameter kan också ange cellernas hälsa och deras förmåga att svara på akuta förolämpningar. Under situationer av mitokondriell dysfunktion, maximal respiration minskar, och detta begränsar kapaciteten hos cellen för att svara på förändringar i ATP efterfrågan och leder till celldöd24.

Det är mycket viktigt att påpeka att, för varje tid punkt i mitokondriella och glykolys stresstester, ECAR är summan av glykolys-härledda försurning (via generering av laktat + H+) och respiratorisk-härledda försurning (via generation av CO2, som löser sig i H2O för att generera HCO3- och H+), och viktigt, andnings-härledda försurning kan stå för en betydande del av den totala ECAR i vissa celltyper25. För intresserade forskare finns det publicerade protokoll för att beräkna faktiska glykolytiska priser. För det ändamålet kan syreförbrukningshastigheter under glykolytisk stresstest (Figur 4G) användas för att beräkna protonproduktionstakten genom respiration vid varje tidpunkt, och det värdet kan subtraheras från den totala protonproduktionsgraden, som erhålls med hjälp av ECAR-värden och buffertningseffekten för mediet7,25,26.

En viktig modifiering av detta protokoll jämfört med tillverkarens rekommendation är den andra injektionen av glykolysen stresstest. Antimycin A och rotenon är att föredra framför oligomycin, av flera skäl som redan har beskrivits7: 1) vissa celler visar en hög glykolytisk kapacitet som fullt ut kan uppfylla den basala ATP efterfrågan av cellen, även i avsaknad av oxidativ fosforylering; 2) blockerar ETC med antimycin A och rotenon artificiellt ökar ATP efterfrågan av cellen, eftersom det orsakar ATP hydrolys av ATP syntas (mitokondrierna blir en ATP diskbänk), som vänder till pump protoner i ett försök att återvinna mitokondriellt membran potential som kollapsar efter luftvägarna hämning; 3) blockering av ETC förhindrar andningsförsurning av mediet (respiratorisk CO2 som genereras i TCA-cykeln som omvandlas till HCO3- och H+) som kan förvirra ECAR-resultaten. Således är observerade maximal ECAR med antimycin A och rotenon endast kan hänföras till glykolys. Intressant nog har det rapporterats att ECAR observerats med enbart respiratoriska hämmare kan fortfarande vara submaximal7, och en ytterligare mekanism för att öka cellulära ATP efterfrågan (och därför maximal ECAR) har beskrivits: tillsats av jonofor monensin, vilket ökar importen av Na+ icellen 27 och stimulerar graden av ATP-hydrolys genom plasmamembranet Na+/K+-ATPase, till blandningen av antimycin A och rotenon7.

Ett andra viktigt begrepp är att vi inte rekommenderar subtraktion av den icke-glykolytiska försurningen, som förmodligen motsvarar andningsorganen CO2 som omvandlas till HCO3- och H+, från hela spår för att beräkna glykolytiska parametrar som rekommenderas av tillverkaren, eftersom detta belopp ändras avsevärt under varje steg av Glykolys stresstest (det är högst i det basala tillståndet, minskar efter tillsats av glukos på grund av Crabtree effekt20, och är praktiskt taget avskaffas med antimycin A och rotenon) (Figur 5).

För att sammanfatta, detta protokoll visar ett enkelt och effektivt verktyg för att testa den metaboliska aktiviteten hos mänskliga naturliga mördarceller med en extracellulär fluxanalysator. Denna metod kan användas för att förhöra det metaboliska tillståndet i dessa celler, som är känt för att ändra med cellaktivering genom cytokinstimulering eller under vissa patologiska tillstånd, inklusive fetma, cancer eller virusinfektioner28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar Dr Michael N. Sack (National Heart, Lung, och Blood Institute) för stöd och diskussion. Denna studie stöddes av intramural Research Programs av National Institutes of Health, National Cancer Institute och National Heart, Lung, och Blood Institute. JT stöds av Ramon y Cajal-programmet (grant RYC2018-026050-I) av MICINN (Spanien).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) MilliporeSigma D8375-5G Glycolyisis stress test injector compound
2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) MilliporeSigma D198501 ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound
96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid Costar 3799 NK cell culture
Antimycin A MilliporeSigma A8674 Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
BD FACSDIVA Software BD Biosciences Flow data acquisition
BD LSR Fortessa BD Biosciences Flow data acquisition
Cell-Tak Corning 354240 Cell adhesive
CyQUANT cell proliferation assay ThermoFisher Scientific C7026 Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II Stemcell technologies 17851 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Human NK cell Enrichment Kit Stemcell technologies 19055 NK cell isolation from PBMCs
EasySep Magnet Stemcell technologies 18001 NK cell isolation from PBMCs
EDTA 0.5 M, pH 8 Quality Biological 10128-446 NK sell separation buffer
FACS tubes Falcon-Fisher Scientific 352235 Flow cytometry experiment
Falcon 50 ml Conical tubes Falcon-Fisher Scientific 14-432-22 NK cell separation
Fetal Calf Serum (FCS) Gibco 10437-028 NK cell separation buffer
FlowJo Software BD Biosciences Flow data analysis
Glucose MilliporeSigma G8270 Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound
Halt Protease Inhibitor Cocktail ThermoFisher Scientific 78429 Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer
Human IL-15 Peprotech 200-15-50ug NK cell stimulation
Human serum (HS) Valley Biomedical 9C0539 NK cell culture medium supplement
IMDM Gibco 12440053 NK cell culture medium
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030-081 Component of stress test media
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34965 Viability dye for flow cytometry staining
LSM mpbio 50494X PBMCs separation from human blood
Mouse anti-human CD3 BV711 BD Biosciences 563725 T cell flow cytometry staining
Mouse anti-human CD56 PE BD Pharmingen 555516 NK flow cytometry staining
Mouse anti-human NKp46 PE BD Pharmingen 557991 NK flow cytometry staining
Oligomycin MilliporeSigma 75351 Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound
PBS pH 7.4 Gibco 10010-023 NK cell separation buffer
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225 For determination of protein concentration
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115 Cell lysis
Rotenone MilliporeSigma R8875 Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound
Seahorse Wave Controller Software Agilent Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer
Seahorse Wave Desktop Software Agilent For data analysis
Seahorse XF Base Medium Agilent 102353-100 Extracellular Flux assay base medium
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent Extracellular Flux Analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent 102416-100 Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml).
Sodium bicarbonate MilliporeSigma S5761 To prepare the Cell-Tak solution
Sodium pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360-070 Component of mitochondrial stress test medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
  4. Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
  5. Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
  6. Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
  7. Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
  8. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  9. Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
  10. Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
  11. Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
  12. Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
  13. Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
  14. Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
  15. Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
  16. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  17. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  18. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
  19. Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
  20. Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
  21. O'Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
  22. Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
  23. Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
  24. Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
  25. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  26. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
  27. Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
  28. Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).

Tags

Immunologi och infektion Natural Killer celler metabolism extracellulära fluss glykolys mitokondrier respiration elektrontransportkedjan flödescytometri
Analys av människans naturliga Killer Cell Metabolism
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton,… More

Traba, J., Waldmann, T. A., Anton, O. M. Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism. J. Vis. Exp. (160), e61466, doi:10.3791/61466 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter